糖液的製造方法

2023-12-10 06:28:57

糖液的製造方法
【專利摘要】本發明的目的在於提供的糖液的製造方法，包括以下的工序(1)～(3)。工序(1)：在纖維素前處理物中添加來源於絲狀菌的纖維素酶，得到水解物的工序，工序(2)：在上述水解物中添加混合廢糖蜜，得到混合糖液的工序，工序(3)：將上述混合糖液進行固液分離，使所得的溶液成分通過超濾膜而進行過濾，作為非透過液回收來源於絲狀菌的纖維素酶，作為透過液得到糖液的工序。根據本發明，可以通過提高由纖維素水解物回收來源於絲狀菌的纖維素酶的酶的回收率，從而削減在糖液的製造工序中使用的纖維素酶使用量。另外，在本發明中，通過在纖維素水解物中添加廢糖蜜而製成混合糖液，從而不僅可以從纖維素回收糖成分，還可以從廢糖蜜回收糖成分。
【專利說明】糖液的製造方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及由生物質製造糖液的方法。
【背景技術】
[0002]近年來，將含纖維素的生物質用酸、熱水、鹼等進行前處理後，添加纖維素酶而水解，從而製造糖液的方法被廣泛研究。然而，作為這樣的使用纖維素酶的方法的缺點，存在由於纖維素酶的使用量多、且價格也高，因而糖液製造成本增大這樣的課題。
[0003]作為解決本課題的方法，提出了將在纖維素水解中使用的纖維素酶回收再利用的方法。例如，利用自旋過濾器進行連續固液分離，使所得的糖液通過超濾膜進行過濾，從而回收纖維素酶的方法(專利文獻I);通過在酶糖化的階段加入表面活性劑來抑制纖維素酶吸附，從而提高回收效率的方法(專利文獻2);將酶糖化後的殘渣進行通電處理從而回收纖維素酶成分的方法(專利文獻3)等，但都沒有根本性地解決課題。
[0004]現有技術文獻
[0005]專利文獻
[0006]專利文獻1:日本特開2006-87319號公報
[0007]專利文獻2:日本特開昭63-87994號公報
[0008]專利文獻3:日本特開2008-206484號公報

【發明內容】
.
[0009]發明要解決的課題
[0010]本發明要解決的課題如上所述，在於削減纖維素的水解中使用的纖維素酶的使用量。
[0011 ] 用於解決課題的方法
[0012]本
【發明者】為了解決上述課題而進行了深入研究，結果著眼於在纖維素水解物中混合廢糖蜜。其結果發現了提高纖維素水解物所含的纖維素酶的回收量，從而完成了本發明。
[0013]gp，本發明具有以下的[I]?[7]的構成。
[0014][I]糖液的製造方法，包括以下的工序⑴?(3)，
[0015]工序(I):在纖維素前處理物中添加來源於絲狀菌的纖維素酶，得到水解物的工序，
[0016]工序(2):在上述水解物中添加混合廢糖蜜，得到混合糖液的工序，
[0017]工序(3):將上述混合糖液進行固液分離，使所得的溶液成分通過超濾膜而進行過濾，作為非透過液回收來源於絲狀菌的纖維素酶，作為透過液得到糖液的工序。
[0018][2]根據[I]所述的糖液的製造方法，工序(I)的來源於絲狀菌的纖維素酶是來源於木黴屬的纖維素酶。
[0019][3]根據[I]或[2]所述的糖液的製造方法，工序⑴的纖維素前處理物是選自水熱處理、稀硫酸處理和鹼處理中的I種以上的處理物。[0020][4]根據[I]?[3]的任一項所述的糖液的製造方法，在工序⑵中，在水解物中添加混合廢糖蜜，將混合糖液的糖濃度調製在40?200g/L的範圍。
[0021][5]根據[I]?[4]的任一項所述的糖液的製造方法，在工序(2)中，包括將混合糖液在40?60°C的溫度範圍保溫的工序。
[0022][6]根據[I]?[5]的任一項所述的糖液的製造方法，包括:使工序(3)的糖液通過納濾膜和/或反滲透膜而進行過濾，作為透過液除去發酵抑制物質，作為非透過液得到糖濃縮液的工序。
[0023][7]化學品的製造方法，將具有以[I]?[6]的任一項所述的糖液的製造方法所得的糖液作為發酵原料而生產化學品的能力的微生物進行發酵培養。
[0024]發明的效果
[0025]根據本發明，通過提高由纖維素水解物回收來源於絲狀菌的纖維素酶的酶回收率，從而可以削減在糖液的製造工序中使用的纖維素酶使用量。另外，在本發明中，通過在纖維素水解物中添加廢糖蜜製成混合糖液，從而不僅可以從纖維素中回收糖成分，也可以從廢糖蜜中回收糖成分。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1是本發明的工序概略流程圖。
[0027]圖2是用於實施本發明的裝置略圖。
[0028]圖3是關於濃縮糖液的製造的裝置略圖。
[0029]圖4是以糖液和/或濃縮`糖液作為發酵原料製造化學品的略圖。
[0030]圖5是在現有製糖設備旁邊建設包含圖2的裝置的糖液製造設備時的裝置構成略圖。
【具體實施方式】
[0031 ] 關於用於實施本發明的方式，對每個工序詳細地進行說明。
[0032][工序(I)]
[0033]工序(I)中的纖維素前處理物是指進行了用於水解含纖維素的生物質的前處理後的物質。作為含纖維素的生物質的具體例，指甘蔗渣、柳枝稷、象草、蔗茅、玉米秸、稻秸、麥秸等草本系生物質、或樹木、廢建材等木質系生物質，還指藻類、海草等來源於水生環境的生物質。這樣的生物質，除了纖維素和半纖維素(以下作為纖維素與半纖維素的總稱，稱為「纖維素」)之外，還含有作為芳香族高分子的木質素等。特別是在本發明中，為了提高來源於絲狀菌的纖維素酶的生物質水解效率，進行含纖維素的生物質的前處理，將其結果得到的物質稱為纖維素前處理物。
[0034]作為前處理，可列舉酸處理、硫酸處理、稀硫酸處理、鹼處理、水熱處理、亞臨界水處理、微粉碎處理、蒸煮處理、乾燥處理，鹼處理、水熱處理或稀硫酸處理與其他方法相比，酶糖化效率優異、酶使用量較少即可完成，因而在本發明中優選水熱處理、稀硫酸處理或鹼處理。
[0035]水熱處理是添加水使得含纖維素的生物質為0.1?50重量％後，在100?400°C的溫度處理I秒?60分鐘。通過在這樣的溫度條件進行處理，可以得到易被纖維素酶水解的纖維素前處理物。對處理次數不特別限定，將該處理進行I次以上即可。特別是在將該處理進行2次以上的情況下，可以將第I次和第2次以後的處理在不同條件下實施。
[0036]稀硫酸處理中硫酸的濃度優選為0.1?15重量％，更優選為0.5?5重量％。反應溫度可以在100?300°C的範圍內設定，優選在120?250°C設定。反應時間可以在I秒?60分鐘的範圍設定。對處理次數不特別限定，將上述處理進行I次以上即可。特別是在將上述處理進行2次以上的情況下，可以將第I次和第2次以後的處理在不同條件下實施。通過稀硫酸處理而得到的水解物包含酸，為了進一步進行利用纖維素酶的水解反應，或者為了作為發酵原料使用，需要進行中和。
[0037]鹼處理是對含纖維素的生物質作用選自氫氧化鈉、氫氧化鈣、氨中的鹼的方法。作為鹼處理中使用的鹼，可以特別優選使用氨。這樣的氨處理可以通過日本特開2008-161125號公報、日本特開2008-535664號公報所記載的方法中的手法來實施。例如，使用的氨濃度相對於含纖維素的生物質以0.1?15重量％的範圍添加，在4?200°C、優選為90?150°C進行處理。添加的氨 可以是液體狀態、或氣體狀態的任一者。進而添加的方式可以是純氨也可以是氨水溶液的方式。對處理次數不特別限定，將上述處理進行I次以上即可。特別是在將上述處理進行2次以上的情況下，第I次與第2次以後的處理可以在不同條件下實施。為了進一步進行利用酶的水解反應，通過氨處理所得的處理物需要進行氨的中和或氨的除去。中和可以對從水解物通過固液分離而除去固體成分後的氨進行，也可以在含有固體成分的狀態下直接進行。對中和所使用的酸試劑不特別限定。氨的除去可以通過將氨處理物保持在減壓狀態下使氨以氣體狀態揮發而除去。另外除去的氨可以回收再利用。
[0038]關於所述的纖維素前處理物，在工序(I)中，以通過纖維素酶進行水解而得到水解物為特徵。纖維素的水解是指將纖維素低分子量化。另外，在纖維素的水解中，木聚糖、甘露聚糖、阿拉伯聚糖等半纖維素成分也同時被水解。作為水解物所含的單糖成分，為葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖等，主要的單糖成分是作為纖維素的水解物的葡萄糖。另外在水解不充分的情況下，包含纖維二糖、木二糖等2糖、纖維寡糖、木寡糖等。
[0039]在工序(I)中，用來源於絲狀菌的纖維素酶來水解纖維素前處理物。來源於絲狀菌的纖維素酶可例示木黴屬(Trichoderma)、麴黴屬(Aspergillus)、纖維單胞菌屬(Cellulomonas)、梭菌屬(Clostridium)、鏈黴菌屬(Streptomyces)、腐質黴屬(Humicola)、枝頂孢黴屬(Acremonium)、祀齒菌屬(Irpex)、毛黴屬(Mucor)、籃狀菌屬(Talaromyces)、平革菌屬(Phanerochaete)、白腐菌、褐腐菌等。在這樣的來源於絲狀菌的纖維素酶中，優選使用纖維素分解活性高的來源於木黴屬的纖維素酶。
[0040]來源於木黴屬的纖維素酶是以來源於木黴屬微生物的纖維素酶為主成分的酶組合物。對木黴屬微生物不特別限定，優選為裡氏木黴(Trichoderma reesei),具體可以例不裡氏木黴 QM9414 (Trichoderma reesei QM9414)、裡氏木黴 QM9123 (Trichodermareesei QM9123)、裡氏木黴 RutC-30 (Trichoderma reesei Rut C-30)、裡氏木黴PC3-7 (Trichoderma reesei PC3-7)、裡氏木黴 CL-847 (Trichoderma reeseiCL-847)、裡氏木黴 MCG77 (Trichoderma reesei MCG77)、裡氏木黴 MCG80 (Trichoderma reesei MCG80)、綠色木黴QM9123 (Trichoderma viride9123)。另外,還可以是對來源於上述木黴屬的微生物通過突變劑或紫外線照射等進行突變處理，從而纖維素酶生產性提高了的突變株。
[0041]本發明中使用的來源於木黴屬的纖維素酶，是包含纖維二糖水解酶、內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β -葡糖苷酶、木聚糖酶、木糖苷酶等多種酶成分的、具有將纖維素水解並糖化的活性的酶組合物。來源於木黴屬的纖維素酶在纖維素分解中，通過多種酶成分的協同效果或互補效果，從而可以進行有效的纖維素的水解。特別是本發明中使用的纖維素酶優選包含來源於木黴屬的纖維二糖水解酶和木聚糖酶。
[0042]纖維二糖水解酶是以從纖維素的末端部分開始水解下去為特徵的纖維素酶的總稱，作為EC編號:EC3.2.1.91記載了歸屬於纖維二糖水解酶的酶群。
[0043]內切葡聚糖酶是以從纖維素分子鏈的中央部分開始水解為特徵的纖維素酶的總稱，作為 EC 編號:EC3.2.1.4、EC3.2.1.6、EC3.2.1.39、EC3.2.1.73 記載了歸屬於內切葡聚糖酶的酶群。
[0044]外切葡聚糖酶是以從纖維素分子鏈的末端開始水解為特徵的纖維素酶的總稱，作為EC編號:EC3.2.1.74、EC3.2.1.58記載了歸屬於外切葡聚糖酶的酶群。
[0045]β -葡糖苷酶是以作用於纖維寡糖或纖維二糖為特徵的纖維素酶的總稱，作為EC編號:EC3.2.1.21記載了歸屬於β -葡糖苷酶的酶群。
[0046]木聚糖酶是以作用於半纖維素或特別作用於木聚糖為特徵的纖維素酶的總稱，作為EC編號:EC3.2.1.8記載了歸屬於木聚糖酶的酶群。
[0047]木糖苷酶是以作用於木寡糖為特徵的纖維素酶的總稱，作為EC編號:EC3.2.1.37記載了歸屬於木糖苷酶的酶群。
[0048]作為來源於木黴屬的纖維素酶，優選使用粗酶物。粗酶物來源於在為了使木黴屬的微生物產生纖維素酶而調製的培養基中將該微生物培養任意時間而得的培養上清。對使用的培養基成分不特別限定，為了促進纖維素酶的產生，一般可以使用添加了纖維素的培養基。並且作為粗酶物，優選.直接使用培養液，或使用僅除去了木黴屬菌體的培養上清。
[0049]對粗酶物中的各酶成分的重量比不特別限定，例如，來源於裡氏木黴的培養液中含有50?95重量％的纖維二糖水解酶，其餘成分包含內切葡聚糖酶、β -葡糖苷酶等。另夕卜，木黴屬的微生物在培養液中生產強的纖維素酶成分，另一方面關於β_葡糖苷酶，由於保持在細胞內或細胞表層，因而培養液中的β -葡糖苷酶活性低，因此可以在粗酶物中進一步添加異種或同種的β_葡糖苷酶。作為異種的β_葡糖苷酶，可以優選使用來源於麴黴屬的β_葡糖苷酶。作為來源於麴黴屬的β_葡糖苷酶，可以例示由VA社市售的Novozymel88等。作為在粗酶物中添加異種或同種的β _葡糖苷酶的方法，可以是培養以在木黴屬的微生物導入基因使其在其培養液中產生β_葡糖苷酶的方式進行基因重組而得的木黴屬的微生物，分離其培養液的方法。
[0050]來源於絲狀菌的纖維素酶的水解反應溫度優選為15?100°C的範圍，更優選為40?60°C，最優選為50°C。另外，水解反應時的pH值優選為pH值3?9的範圍，更優選為pH值4?5.5，最優選為pH值5。pH值調節中可以以成為目的的pH值的方式添加酸或者鹼進行調製。另外，還可以使用適宜緩衝液。
[0051]此外，在纖維素前處理物的水解中，為了促進纖維素前處理物與絲狀菌纖維素酶的接觸，另外為了使水解物的糖濃度均勻，優選進行攪拌混合。纖維素前處理物的固體成分濃度更優選為I?25重量％的範圍。特別在工序(I)中，優選將纖維素前處理物的固體物濃度設定在2?10重量％的範圍的低濃度。這是為了確保用於稀釋後段的工序(2)中的廢糖蜜的充分的水量。另外，作為其他優點，通過將固體物濃度設定在2?10重量％的低濃度，從而具有纖維素前處理物的水解效率提高這樣的效果。這是因為，來源於絲狀菌的纖維素酶具有由於作為水解的生成物的葡萄糖、纖維二糖等糖生成物而酶反應被抑制這樣的性質。
[0052]對本發明的工序(I)所得的水解物的糖濃度不特別限定，作為單糖濃度優選為10?100g/L的範圍，更優選為20?80g/L。因為如果是該糖濃度範圍，則作為後段工序與廢糖蜜混合時，可以調整至最適的糖濃度。
[0053]在本發明中，以在所述工序(I)所得的水解物中添加混合廢糖蜜為特徵。廢糖蜜(Morasess)是從作為製糖用作物的甘蔗、甜菜、糖用甜菜、甜菜、葡萄等的榨汁、或者將它們一次結晶化而得的粗糖的製糖過程中生成的副產物，是指製糖過程中的糖結晶化工序後所殘留的包含糖成分的溶液。一般地，糖結晶化工序通常進行多次，像作為進行第I次結晶化而得的結晶成分的I號糖、作為進一步進行I號糖的殘液(I號糖蜜)的結晶化而得的結晶成分的2號糖、作為進一步進行2號糖的殘液(2號糖蜜)的結晶化而得的3號糖這樣，反覆進行結晶化，將作為其殘液得到的最終階段的糖蜜稱為廢糖蜜。作為廢糖蜜所含的糖成分，包含蔗糖、葡萄糖、果糖作為主成分，有時還包含若干木糖、半乳糖等其他糖成分。另一方面，已知隨著結晶化的次數變多，還具有除糖成分以外的來源於製糖作物的成分在廢糖蜜中濃縮這樣的特徵，作為其結果，也含有較多發酵抑制物質。作為廢糖蜜中所含的發酵抑制成分，可以例示乙酸、甲酸、羥基甲基糠醛、糠醛、香草醛、香草酮、愈創木酚、各種無機物(離子)等。但是，關於廢糖蜜所含的糖和發酵抑制物質的成分或者量不特別限定。
[0054]作為工序(2)中使用的廢糖蜜，優選為經過多次結晶化次數後的糖蜜，具體地，是進行了優選至少2次以上、更優選3次以上結晶化後殘餘的廢糖蜜。另外，優選使用糖濃度為200g/L以上的廢糖蜜，更優選使用糖濃度為500g/L以上的廢糖蜜。如果廢糖蜜中的糖成分濃度低於200g/L，則來源於絲狀菌的纖維素酶的回收性不提高，因而不優選。另一方面，對於工序(2)中使用的廢糖蜜中的糖成分濃度的上限不特別限定，考慮通常的製糖工序中所得的廢糖蜜的上限為800g/L。此外，廢糖蜜中的糖濃度可以通過HPLC等的公知的測定方法來定量。另外廢糖蜜除了所述的糖`之外，優選包含K+離子。在本發明中可以優選使用包含K+離子的濃度為lg/L以上、更優選為5g/L以上、最優選為10g/L以上的廢糖蜜。
[0055]對工序(I)的水解物添加混合廢糖蜜，製成混合糖液。如果混合糖液的糖濃度過高則粘度變得過高，從而有時降低後段的超濾膜處理中的通量，因此混合糖液的糖濃度優選為200g/L以下，更優選為150g/L以下。另一方面，如果混合糖液的糖濃度低於40g/L，則有時最終得到的糖液濃度變低，因此混合糖液的糖濃度優選為40g/L以上，更優選為50g/L以上。即，混合糖液的糖濃度優選以40?200g/L的範圍、更優選以50?150g/L的範圍混合。另外混合糖液也可以是室溫(25°C )，但優選在40?60°C的溫度範圍保溫，進一步優選在50°C的溫度範圍保溫。通過這樣，後段能夠通過超濾膜回收的酶量增大，因此優選。
[0056]在使用廢糖蜜作為發酵原料的情況下，根據發酵中使用的微生物的種類，存在利用作為廢糖蜜的主要糖分的蔗糖作為碳源的效率低的微生物，將這樣的微生物用於化學品等的製造中時，優選使用預先將廢糖蜜中所含的蔗糖水解成葡萄糖和果糖而得的產物。作為廢糖蜜的水解處理，可以在酸性或鹼性條件下進行加熱處理。另外，還可以進行利用轉化酶和/或蔗糖酶的酶處理。轉化酶別名稱為β -呋喃果糖苷酶，是指將蔗糖水解成葡萄糖和果糖的酶。蔗糖酶也是指將蔗糖水解成葡萄糖和果糖的酶。在本發明中，關於使用的轉化酶不特別限定，來源於酵母的轉化酶由日本〃 4才^ >株式會社、三菱化學7— *株式會社售賣，可以購買使用它們。轉化酶處理的處理條件只要是通常有效的作用條件即可。對於使用的蔗糖酶也不特別限定，由和光純藥工業(株)、三菱化學7 — * (株)售賣，可以購買使用它們。蔗糖酶處理條件可以採用通常有效的反應條件。所述的轉化酶或者蔗糖酶處理可以單獨在廢糖蜜中預先添加而實施，也可以在工序(I)的水解物中添加廢糖蜜製成混合糖液後實施。如前所述製成混合糖液後，通過在40?60°C的溫度範圍保溫，從而回收酶量增大，因而如果此時添加好轉化酶或者蔗糖酶，則還可以實施蔗糖的水解反應。
[0057][工序⑶]
[0058]在工序(3)中，首先，將工序(2)所得的混合糖液進行固液分離而回收溶液成分。固液分離可以通過旋轉沉降器等離心分離法、加壓?吸引過濾等的過濾法、或者精濾等膜過濾法這樣的公知的固液分離方法來實施。這樣的固液分離可以I種以上的多種方法組合實施，只要是有效地除去固體物的方法就不限定。但是，從抑制後段超濾膜的結垢這樣的觀點考慮，優選固液分離後的溶液成分中儘量不含有固體物，具體地，優選在通過離心分離法或壓濾器等的過濾法進行第I次固液分離後，將所得的溶液成分進一步通過精濾膜進行膜過濾，完全地除去固體物。精濾膜也稱為膜過濾，是以壓力差作為驅動力，能夠從微粒懸浮液中分離除去0.01?10 μ m左右的粒子的分離膜。精濾膜的表面具有0.01?10 μ m的範圍的細孔，該細孔以上的微粒成分可以在膜側分離除去。精濾膜的材質可以例示乙酸纖維素、芳香族聚醯胺、聚乙烯醇、聚碸、聚偏1，1-二氟乙烯、聚乙烯、聚丙烯腈、陶瓷、聚丙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯(f 7 口 > (註冊商標))等，但不特別限定，從耐汙性、耐化學性、強度、過濾性等觀點考慮，優選為聚偏1，1-二氟乙烯制的精濾膜。
[0059]接著，將溶液成分進行超濾膜處理。超濾膜一般是指細孔徑在1.5納米至250納米的範圍，可以將分子量1，000?200，000的範圍的水溶性高分子作為非透過液阻止的分離膜。超濾膜只要是能夠回收來源於絲狀菌的纖維素酶的分級分子量即可，優選的分級分子量為1，000?100，OOODa、更優選為10，000?30，OOODa0作為超濾膜的材料，可以使用聚醚碸(PES)、聚1，1-二氟.乙烯(PVDF)、再生纖維素等材料的膜，但纖維素受到來源於絲狀菌的纖維素酶的分解，因而優選使用以PES、PVDF等合成高分子為材料的超濾膜。超濾膜形狀可以優選使用管狀式、螺旋元件、平膜等。超濾膜的過濾可以列舉錯流方式、死端過濾方式，在結垢或者通量的方面優選錯流過濾方式。
[0060]使溶液成分通過超濾膜而進行過濾，從而可以作為透過液得到糖液。所得的糖液是混合糖液中本來含有的固體物通過固液分離基本完全被除去而得的液體。另一方面，通過超濾膜進行過濾處理，從而在非透過液側，混合糖液中的著色物質、水溶性高分子被除去，但水溶性高分子中包含在工序(I)中使用的來源於絲狀菌的纖維素酶成分。對回收的來源於絲狀菌的纖維素酶成分不特別限定，但在用於水解的來源於絲狀菌的纖維素酶成分中，其全部成分或者一部分成分可以作為非透過液回收。此外，非透過液中還包含來源於混合糖液的糖成分，因此為了回收這樣的糖成分，可以重複在非透過液加水、進一步通過超濾膜進行過濾的操作。
[0061]作為工序(3)的結果，看到了與現有技術相比回收酶所含的來源於絲狀菌的纖維素酶酶量顯著增大的效果，特別是在來源於絲狀菌的纖維素酶成分中，纖維二糖水解酶和木聚糖酶以高效率被回收。被回收的來源於絲狀菌的纖維素酶通過在纖維素前處理物的水解中再利用，從而可以削減來源於絲狀菌的纖維素酶的使用量。被回收的來源於絲狀菌的纖維素酶可以單獨在水解中再利用，另外也可以與未使用的來源於絲狀菌的纖維素酶混合而再利用。另外，根據情況不同，也可以在纖維素的水解以外的用途中有效靈活利用。
[0062][糖濃縮工序]
[0063]工序(3)所得的糖液，可以進一步通過作為W02010/067785號所記載的方法，即使其通過納濾膜和/或反滲透膜進行過濾，從而可以作為非透過液得到糖成分被濃縮的濃縮糖液。
[0064]納濾膜也稱為納米過濾膜(nanof ilter，NF膜)，是一般被定義為「一價離子透過、阻止二價離子的膜」的膜。是考慮具有數納米左右的微小空隙的膜，主要用於阻止水中的微小粒子和/或分子、離子、鹽類等。
[0065]反滲透膜也被稱為RO膜，是一般被定義為「具有包含一價離子的脫鹽功能的膜」的膜。是考慮具有數埃至數納米左右的超微小空隙的膜，主要用於海水淡水化、超純水製造等離子成分除去。
[0066]本發明中使用的納濾膜或者反滲透膜的材料可以使用乙酸纖維素系聚合物、聚醯胺、聚酯、聚醯亞胺、乙烯基聚合物、聚碸等高分子材料，但不限於由上述I種材料構成的膜，也可以是包含多種膜材料的膜。
[0067]本發明中使用的納濾膜優選使用螺旋型的膜元件。作為優選的納濾膜元件的具體例，可列舉例如，作為乙酸纖維素系的納濾膜元件的GE Osmonics社制GEs印a、以聚醯胺為功能層的7 r ^ K &社制納濾膜元件NF99或NF99HF、以交聯哌嗪聚醯胺為功能層
^ iv L.r y 9 社制納濾膜元件 NF-45、NF-90、NF-200、NF-270 或 NF-400、或者包含以交聯哌嗪聚醯胺為主成分的東 > 株式會社制納濾膜UTC60的東 > 株式會社制納濾膜元件SU-210、SU-220、SU- 600 或 SU-610，更優選 NF99 或 NF99HF、NF-45、NF-90、NF-200 或 NF-400、或者 SU-210、SU-220、SU-600 或 SU-610，進一步優選 SU-210、SU-220、SU-600 或 SU-610。
[0068]作為本發明中使用的反滲透膜的材料，可列舉以乙酸纖維素系的聚合物為功能層的複合膜(以下也稱為乙酸纖維素系的反滲透膜)或以聚醯胺為功能層的複合膜(以下也稱為聚醯胺系的反滲透膜)。這裡，作為乙酸纖維素系的聚合物，可列舉使用單獨的乙酸纖維素、二乙酸纖維素、三乙酸纖維素、丙酸纖維素、丁酸纖維素等纖維素的有機酸酯或它們的混合物以及混合酯而得的。作為聚醯胺，可列舉以脂肪族和/或芳香族的二胺為單體的線狀聚合物或交聯聚合物。
[0069]作為本發明中使用的反滲透膜的具體例，可列舉例如，作為東 > 株式會社制聚醯胺系反滲透膜組件的超低壓型的SUL-G10、SUL-G20、低壓型的SU-710、SU-720、SU-720F、SU-710L、SU-720L、SU-720LF、SU-720R、SU-710P、SU-720P，以及作為反滲透膜包含 UTC80的高壓型的SU-810、SU-820、SU-820L、SU-820FA、東 > 株式會社乙酸纖維素系反滲透膜SC-L100R、SC-L200R、SC-1100、SC-1200、SC-2100、SC-2200、SC-3100、SC-3200、SC-8100、SC-8200、日東電工株式會社制 NTR-759HR、NTR-729HF、NTR-70SWC、ES10-D、ES20-D、ES20-U、ES15-D、ES15-U、LF10-D, r )V y 7 ^ > 制 R098pHt、R099、HR98PP、CE4040C-30D、GE 制GE Sepa, Filmtec 制 BW30-4040、TW30-4040, XLE-4040、LP-4040、LE-4040、SW30-4040、SW30HRLE-4040、KOCH 制 TFC-HR、TFC-ULP, TRISEP 制 ACM-1、ACM-2、ACM-4 等。
[0070]作為使用納濾膜和/或反滲透膜濃縮糖液的效果，具有在提高糖液中的糖濃度的同時，能夠作為透過液除去發酵抑制物質這樣的優點。這裡所說的發酵抑制物質，是指在後段發酵工序中抑制發酵的除糖以外的成分，具體可以例示芳香族化合物、呋喃系化合物、有機酸、I價無機鹽等。作為這樣的代表性芳香族化合物和呋喃系化合物的例子，可以例示糠醛、羥基甲基糠醛、香草醛、香草酸、丁香酸、松柏醛、香豆酸、阿魏酸等。作為有機酸、無機鹽，可以例示乙酸、甲酸、鉀、鈉等。濃縮糖液的糖濃度可以根據納濾膜和/或反滲透膜的處理條件在Og/L?400g/L的範圍任意設定，根據濃縮糖液的用途等任意設定即可。另外想進一步除去所述的發酵抑制物質的情況下，對糖液或者濃縮糖液加水，用納濾膜和/或反滲透膜濃縮至目的的糖濃度即可，此時，可以作為透過液除去發酵抑制物質。
[0071]此外，與反滲透膜相比，在使用納濾膜的情況下發酵抑制物質的除去效果高，因而優選。使用納濾膜還是使用反滲透膜，可以根據混合糖液所含的發酵抑制物質的濃度、或者後段發酵中的影響來選擇。
[0072]另外可以將所述的濃縮糖液進一步通過真空式蒸發罐、多重效用罐、凍結乾燥、噴霧乾燥、熱風乾燥 等進一步濃縮。
[0073][糖液.濃縮糖液]
[0074]通過本發明得到的糖液和/或濃縮糖液可以在食用、甜味料、飼料用途、發酵原料等用途中使用。
[0075][化學品製造工序]
[0076]通過以本發明所得的糖液和/或濃縮糖液作為發酵原料使具有生產化學品的能力的微生物生長，從而製造各種化學品。這裡所說的作為發酵原料使微生物生長，是指利用糖液中所含的糖成分或者氨基源作為微生物的營養素，進行微生物的增殖、生長維持。作為化學品的具體例，可列舉醇、有機酸、胺基酸、核酸等在發酵工業中大量生產的物質。這樣的化學品以糖液中的糖成分作為碳源，在其代謝過程中向生物體內外作為化學品蓄積生產。作為可以由微生物生產的化學品的具體例，可列舉乙醇、1，3-丙二醇、1，4-丁二醇、丙三醇等醇、乙酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸、蘋果酸、衣康酸、檸檬酸等有機酸、肌苷、鳥苷等核苷、肌苷酸、鳥苷酸等核苷酸、屍胺等胺化合物。進而，本發明的糖液還可以在酶、抗生素、重組蛋白質等的生產中應用。關於在這樣的化學品的製造中使用的微生物，只要是能夠有效地生產目的化學品的微生物即可，可以使用大腸桿菌、酵母、絲狀菌、擔子菌等微生物。
[0077]在將本發明的糖液和/或濃縮糖液在用於化學品製造的發酵原料中使用的情況下，可以根據需要適宜含有氮源、無機鹽類、和根據需要的胺基酸、維生素等有機微量營養素。進而根據情況，除了木糖之外，還可以補加葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、乳糖等糖類、含有這些糖類的澱粉糖化液、甘薯糖蜜、甜菜糖蜜、高級糖蜜、或者乙酸等有機酸、或者乙醇等醇類、甘油等作為碳源，從而作為發酵原料使用。作為氮源，可使用氨氣、氨水、銨鹽類、尿素、硝酸鹽類、其他輔助使用的有機氮源、例如油柏類、大豆水解液、酪蛋白分解物、其他胺基酸、維生素類、玉米漿、酵母或酵母提取物、肉提取物、腖等肽類、各種發酵菌體及其水解物等。作為無機鹽類，可以適宜添加磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽、鐵鹽、錳鹽等。
[0078]微生物的培養方法可以利用分批培養、補料分批培養、連續培養等公知的發酵培養方法。特別是本發明的糖液和/或濃縮糖液具有通過超濾膜等而固體物被完全除去這樣的特徵，可以將發酵中使用的微生物通過離心分離、膜分離等方法分離回收，進行再利用。這樣的微生物的分離回收和再利用可以在培養期間一邊添加新的糖液和/或濃縮糖液一邊連續地分離回收微生物，另外，也可以在培養結束後分離回收微生物，在下一批的培養中再利用。
[0079][糖液製造裝置構成]
[0080]接下來關於本發明的糖液的製造方法，對於使用的裝置，使用略圖進行說明。
[0081]圖1是本發明的工序概略流程圖，詳細如前所述。
[0082]圖2是實施本發明的裝置略圖。纖維素前處理物和來源於絲狀菌的纖維素酶被加入水解反應槽(2)，在這裡進行水解。為了有效地進行水解，優選水解槽(2)具備保溫裝置(I)和混合裝置(3)。水解結束後，對水解反應槽(2)添加廢糖蜜。考慮到操作的容易性，添加的廢糖蜜可以是事先稀釋過的。將廢糖蜜添加到水解物中之後，優選使用混合裝置(3)進行混合。另外，為了提高來源於絲狀菌的纖維素酶的回收效率，可以使用保溫裝置(I)將水解槽溫度保持在40?60°C的範圍。接著，將水解槽(2)中調製的混合糖液使用送液泵
(4)等移液手段加入到固液分離裝置(5)中。固液分離裝置(5)可以使用離心分離、壓濾機、螺旋壓榨機、轉鼓過濾機、帶式過濾機等公知的固液分離裝置。優選為使用分離膜的過濾法。使用固液分離裝置(5)，所得的溶液成分可以進一步使用精濾膜裝置(6)進行過濾。這樣作為固液分離工序，通過固液分離裝置(5)和精濾膜裝置(6)而得的溶液成分被回收至溶液回收槽(7)。溶液回收槽(7)通過超濾膜泵(8)與超濾膜(9)連接，在這裡分離成來源於絲狀菌的纖維素酶和糖液。超濾膜(9)可以優選使用被加工成螺旋組件等組件狀的。超濾膜(9)所分離的來源於絲狀菌的纖維素酶作為非透過液通過溶液回收槽(7)而被回收。另一方面，超濾膜(9)的透過液可以作為糖液回收，在化學品製造等中使用。
[0083]圖3是進一步濃縮本發明的糖液的裝置略圖。本發明的糖液被保持於糖液回收槽
(10)，通過高壓泵(11)與納濾 膜和/或反滲透膜(12)連接。本發明的糖成分作為納濾膜和/或反滲透膜(12)的非透過液被回收，在糖液回收槽(10)中作為濃縮糖液被回收。另夕卜，作為納濾膜和/或反滲透膜(12)的透過液，發酵抑制物質和剩餘水一起被除去。
[0084]圖4是使用本發明的糖液和/或濃縮糖液製造化學品的裝置略圖。本發明的糖液和/或濃縮糖液被加入具備攪拌裝置(15)和保溫裝置(13)的發酵槽(14)中。可以在微生物被加入發酵槽，通過生長而製造化學品的同時，在培養結束時或者培養過程中通過微生物分離裝置(16)而分離微生物和包含化學品的培養液。通過微生物分離裝置(16)而分離的微生物被回收至發酵槽(14)。
[0085]圖5是在現有製糖設備旁邊建設包含本發明的糖液製造裝置的糖液設備時的裝置構成略圖。作為現有製糖設備，是顯示作為製糖原料使用甘蔗時的實施方式的一例的圖。製糖設備中包含用於切斷甘蔗的撕碎機(切斷工序)(17)、用於榨汁甘蔗汁的壓榨機(榨汁工序)(18)、儲存甘蔗汁的汁罐(19)、濃縮甘蔗汁的效用罐(多重效用罐)(濃縮工序)
(20)、使濃縮液所含的糖結晶化的晶析裝置(結晶化工序)(21)、分離結晶化後的原料糖的分離裝置(22)。本發明中使用的廢糖蜜從晶析裝置(21)或者分離裝置(22)排出。由壓榨機(18)排出的甘蔗渣通過輸運機等輸送裝置(23)被輸送至糖液設備。甘蔗渣在前處理工序的前階段被粉碎機(24)粉碎。粉碎機可以使用塗料研磨機、絞磨機、錘磨機等，另外還可以是多種的組合。被粉碎的甘蔗渣用至少具有加熱功能的加熱裝置(25)進行前處理(前處理工序)。前處理如前所述，可以添加酸、鹼、稀硫酸、氨、苛性鈉等。纖維素前處理物通過所述的圖2的裝置進行利用來源於絲狀菌的纖維素酶的水解(工序I)。然後，將從製糖設備排出的廢糖蜜(Molasses)添加到工序(I)的水解物中。廢糖蜜用輸送線(26)連接至圖2的裝置即可。可以在圖2的裝置之後加入用於糖濃縮的圖3的裝置。另外，如前所述，本發明的糖液可以在食用、飼料用途、發酵原料等中使用。
[0086]實施例
[0087]以下，列舉實施例具體地說明本發明。但是，本發明不限於這些。
[0088](參考例I)纖維素前處理物的調製(水熱處理)
[0089]作為含纖維素的生物質使用甘蔗渣。將上述含纖維素的生物質浸潰在水中，一邊攪拌一邊在180°C進行20分鐘高壓釜處理(日東高壓株式會社制)。處理後使用離心分離(3000G)進行固液分離為溶液成分和纖維素前處理物。將所得的纖維素前處理物在以下實施例中使用。
[0090](參考例2)糖濃度的測定
[0091]糖液中所含的蔗糖、葡萄糖和木糖濃度在下述所示的HPLC條件下通過與標準品的比較來定量。
[0092]柱:LunaNH2 (Phenomenex 社制)
[0093]移動相:Mill1-Q:乙腈=25:75(流速 0.6mL/ 分鐘)
[0094]反應液:無
[0095]檢測方法:RI (差示折射率).[0096]溫度:30°C。
[0097](參考例3)發酵抑制物質的分析
[0098]芳香族化合物、呋喃系化合物在下述所示的HPLC條件下通過與標準品的比較來定量。此外各分析樣品以3500G進行10分鐘離心分離，將其上清成分供於下述分析。
[0099]柱:SynergiHidroRP4.6mm X 250mm (Phenomenex 制)
[0100]移動相:乙腈-0.1 % H3PO4 (流速1.0mL/分鐘)
[0101]檢測方法:UV(283nm)
[0102]溫度:40°C
[0103]乙酸、甲酸在下述所示的HPLC條件下通過與標準品的比較來定量。此外各分析樣品以3500G進行10分鐘離心分離，將其上清成分供於下述分析。
[0104]柱:Shim-Pack和Shim-Pack SCR101H(株式會社島津製作所制)的串聯
[0105]移動相:5mM對甲苯磺酸(流速0.8mL/分鐘)
[0106]反應液:5mM對甲苯磺酸、20mM Bis-Tris,0.1mM EDTA.2Na(流速 0.8mL/ 分鐘)
[0107]檢測方法:電導率
[0108]溫度:45°C。
[0109](參考例4)來源於木黴屬的纖維素酶的調製
[0110]來源於木黴屬的纖維素酶通過以下的方法調製。
[0111][前培養]
[0112]以玉米浸潰液5% (w/vol)、葡萄糖2% (w/vol)、酒石酸銨0.37% (w/vol)、硫酸銨0.14(w/vol)、磷酸二氫鉀0.2% (w/vol)、氯化I丐二水合物0.03% (w/vol)、硫酸鎂七水合物 0.03% (w/vol)、氯化鋅 0.02% (w/vol)、氯化鐵(III)六水合物0.01% (w/vol)、硫酸銅(II)五水合物 0.004% (w/vol)、氯化錳四水合物 0.0008% (w/vol)、硼酸 0.0006% (w/vol)、七鑰酸六銨四水合物0.0026% (w/vol)的方式添加至蒸懼水中，將IOOmL加入500mL帶擋板的三角燒瓶中，在121°C高壓釜滅菌15分鐘。放冷後，添加與其分別在121°C高壓釜滅菌15分鐘的PE-M和Tween80各0.01% (w/vol) 0在該前培養培養基中接種裡氏木黴PC3-7使其為I X IO5個/mL，以28°C、72小時、180轉/分鐘振蕩培養，作為前培養(振蕩裝置:TAITEC 社制 BIO-SHAKER BR-40LF)。
[0113][主培養]
[0114]以玉米浸潰液5% (w/vol)、葡萄糖2% (w/vol)、纖維素(艾維素)10% (w/vol),酒石酸銨0.37% (w/vol)、硫酸銨0.14% (w/vol)、磷酸二氫鉀0.2%(w/vol)、氯化I丐二水合物0.03% (w/vol)、硫酸鎂七水合物0.03 % (w/vol)、氯化鋅0.02% (w/vol)、氯化鐵
(III)六水合物0.01% (w/vol)、硫酸銅(II)五水合物0.004% (w/vol)、氯化猛四水合物 0.0008% (w/vol)、硼酸 0.0006% (w/vol)、七鑰酸六銨四水合物 0.0026% (w/vol)的方式添加至蒸餾水中，將2.5L加入5L容量的攪拌廣口瓶(ABLE社制DPC-2A)容器中，在121°C高壓釜滅菌15分鐘。放冷後，添加與其分別在121°C高壓釜滅菌15分鐘的PE-M和Tween80各0.1 %，接種250mL預先通過上述的方法在液體培養基中進行了前培養的裡氏木黴PC3-7。然後，以28°C、87小時、300轉/分鐘、通氣量Ivvm進行培養，離心分離後，將上清進行膜過濾(Millipore公司制^ ^」力〃 7° -GV材質:PVDF)。對以該上述條件製備的培養液，將葡糖苷酶(NOVOZymel88)作為蛋白質重量比添加1/100量，將所得產物作為來源於木黴屬的纖維素酶在以下實施例中使用。
[0115](參考例5)來源於絲狀菌的纖維素酶的回收酶量的測定方法
[0116]關於能夠在工序(3)中回收的來源於絲狀菌的纖維素酶的回收酶量，通過測定I)結晶纖維素分解活性、2)纖維二糖分解活性、3)木聚糖分解活性的3種分解活性(以下稱為活性值)來定量。
`[0117]I)結晶纖維素分解活性
[0118]針對酶液(在規定條件下調製)，添加作為結晶纖維素的艾維素(Avicel) (Merch社制、Cellulose Microcrystalline)至 lg/L、乙酸鈉緩衝液(pH 值 5.0)至 IOOmM,在 50°C反應24小時。反應液用ImL管調製,一邊在上述條件下進行旋轉混和一邊進行反應。反應後，將管進行離心分離，測定其上清成分的葡萄糖濃度。葡萄糖濃度依據參考例2所記載的方法進行測定。結晶纖維素分解活性使用生成的葡萄糖濃度(g/L)直接作為活性量，在回收酶量的比較中使用。
[0119]2)纖維二糖分解活性
[0120]對酶液，添加纖維二糖(和光純藥)至500mg/L，乙酸鈉緩衝液(pH值5.0)至IOOmM,在50°C反應0.5小時。反應液在ImL管中調製，在上述條件下一邊旋轉混和一邊進行反應。反應後，將管進行離心分離，測定其上清成分的葡萄糖濃度。葡萄糖濃度依據參考例2所記載的方法進行測定。纖維二糖分解活性使用生成的葡萄糖濃度(g/L)直接作為活性量，在回收酶量的比較中使用。
[0121]3)木聚糖分解活性
[0122]對酶液,添加木聚糖(Birch wood xylan、和光純藥)至10g/L,乙酸鈉緩衝液(pH值5.0)至IOOmM,在50°C反應4小時。反應液在ImL管中調製，在上述條件下一邊旋轉混和一邊進行反應。反應後，將管進行離心分離，測定其上清成分的木糖濃度。木糖濃度依據參考例2所記載的方法進行測定。木糖分解活性使用生成的木糖濃度(g/L)直接作為活性量，在回收酶量的比較中使用。
[0123](參考例6)無機離子濃度的測定
[0124]糖液所含的陽離子和陰離子濃度在下述所示的HPLC條件下通過與標準品的比較
來定量。
[0125]I)陽離子分析
[0126]柱:1nPac AS22 (DIONEX 社制)
[0127]移動相:4.5mM Na2CO3/1.4mM NaHCO3 (流速 1.0mL/ 分鐘)
[0128]反應液:無
[0129]檢測方法:電導率(使用抑制器)
[0130]溫度:30°C
[0131]2)陰離子分析
[0132]柱:1nPac CS12A(D10NEX 社制)
[0133]移動相:20mM甲磺酸(流速1.0mL/分鐘)
[0134]反應液:無
[0135]檢測方法:電導率(使用抑制器)
[0136]溫度:30°C
[0137](參考例7)廢糖蜜的成分分析
[0138]作為廢糖蜜，使用「廢糖蜜(Molasses Agri) 」(製造商:才一力'二 〃 ^ 5 > F株式會社)。本廢糖蜜的原料是來源於甘蔗的粗糖。廢糖蜜的糖成分、有機酸、芳香族.呋喃系化合物、無機離子的分析結果示於表I?表4。另外關於上述各成分，將各成分分別累計的濃度不於表5。此外各成分的分析按照參考例2、參考例3、參考例6實施。
[0139][表 I]
[0140]糖成分
[0141]
【權利要求】
1.糖液的製造方法，包括以下的工序(I)?(3)， 工序(I):在纖維素前處理物中添加來源於絲狀菌的纖維素酶，得到水解物的工序， 工序(2):在上述水解物中添加混合廢糖蜜，得到混合糖液的工序， 工序(3):將上述混合糖液進行固液分離，使所得的溶液成分通過超濾膜而進行過濾，作為非透過液回收來源於絲狀菌的纖維素酶，作為透過液得到糖液的工序。
2.根據權利要求1所述的糖液的製造方法，工序(I)的來源於絲狀菌的纖維素酶是來源於木黴屬的纖維素酶。
3.根據權利要求1或2所述的糖液的製造方法，工序(I)的纖維素前處理物是選自水熱處理、稀硫酸處理和鹼處理中的I種以上的處理物。
4.根據權利要求1?3的任一項所述的糖液的製造方法，在工序(2)中，在水解物中添加混合廢糖蜜，將混合糖液的糖濃度調製在40?200g/L的範圍。
5.根據權利要求1?4的任一項所述的糖液的製造方法，在工序(2)中，包括將混合糖液在40?60°C的溫度範圍保溫的工序。
6.根據權利要求1?5的任一項所述的糖液的製造方法，包括:使工序(3)的糖液通過納濾膜和/或反滲透膜而進行過濾，作為透過液除去發酵抑制物質，作為非透過液得到糖濃縮液的工序。
7.化學品的製造方法，將具有以權利要求1?6的任一項所述的糖液的製造方法所得的糖液作為發酵原料而生 產化學品的能力的微生物進行發酵培養。
【文檔編號】C13K1/02GK103429750SQ201280011279
【公開日】2013年12月4日 申請日期:2012年3月2日 優先權日:2011年3月3日
【發明者】慄原宏徵, 山本優樹, 山田勝成 申請人:東麗株式會社