一種微型種子消毒轉接方法與流程

2023-11-05 11:09:57

本發明涉及種苗繁育技術領域，具體涉及一種微型種子消毒轉接方法。

背景技術：

目前，實生苗組培技術在新品種選育領域應用廣泛，尤其應用於發育不完全的種子。常用的種子無菌播種有點播、撒播，而相對較小的微型種子（直徑小於1mm）通常採用果莢消毒法，即在果莢開裂之前採收，對其進行消毒，消毒後剝去果莢進行無菌播種，該方法無法保證果莢內微型種子的成熟度及品質,這主要是由於微型種子如蝴蝶蘭、白芨等充分成熟時果夾會開裂，在開裂前不能保證其成熟度和品質。因此，研究一種微型種子直接消毒轉接的方法顯得尤為重要。

技術實現要素：

根據現有技術的不足，本發明的目的在於研究一種微型種子消毒轉接的方法，採用本發明可有效解決微型種子播種不均勻，密度較大，勤於分瓶的難題。

一種微型種子消毒轉接方法，它包括以下幾個步驟：

1）種子的收集：

將進行無菌轉接的微型種子，在果莢略微發黃、扭曲還未開裂時進行套袋，收集成熟飽滿的種子，置於4℃冰箱備用；

2）無菌材料的準備：

將1.5ml離心管，無菌水，0.1%-0.2%瓊脂，1000µL移液槍頭，121℃，20min進行高溫滅菌，冷卻備用;

3）種子的消毒處理：

將步驟1）獲得的種子取適量（不要多於離心管1/10的體積）裝於1.5mL離心管，加入1mL無菌水，震蕩10-30s，4000-6000r/s離心30s,將上清及漂浮的未成熟種子棄掉；向離心管中加入1mL70-75%酒精，震蕩10s,4000-6000r/s離心15s（為保證種子活性，酒精接觸時間不超30s），用移液槍小心去除上清；加入1mL無菌水，震蕩10-30s，4000-6000r/s離心30s，去上清，重複2-3次洗去酒精；向離心管中加入1mL0.1% HgCl2，強力震蕩滅菌3-5min， 4000-6000r/s離心30s，去上清；加入1mL無菌水，強力震蕩1min，4000-6000r/s離心30s，去上清，重複3-5次，去除HgCl2後備用；

本步驟中採用的轉速為4000-6000r/s ，轉速過低成熟種子不能離心沉積，轉速過高幹癟種子不能漂浮；

本步驟中採用的滅菌時間為3-5min，若滅菌時間過短消毒不徹底，滅菌時間過長種子受HgCl2毒害，活性降低。

）無菌種子的轉接：

向步驟3）獲得的盛無菌種子的離心管中加入1mL-1.5mL的0.1%-0.2%瓊脂，用移液槍吸打至種子均勻懸浮後吸取懸浮液，依據播種密度，將懸浮液滴於固體培養基表面，輕輕晃動培養基，直至懸浮液均勻分布於固體培養基表面。在超淨工作檯中晾至懸浮液凝固即可封口、標記。

本步驟中使用的0.1%-0.2%瓊脂能夠保證微型種子充分懸浮，濃度過低不能使種子懸浮，濃度過高易造成懸浮液凝固，不利於播種。

）無菌種子的培養：

將步驟4）獲得的無菌種子培養至長出兩片真葉後即可分瓶進行壯苗、生根培養，此為通過組培技術獲得的實生苗。

本發明所述的壯苗、生根培養均為現有技術。

本發明的有益效果： 本發明在果莢開裂後，進行微型種子的收集、消毒、轉接，培養獲得一種微型種子(直徑小於1mm)在實生苗組培過程中消毒播種方法。本發明的具體優點如下：第一，微型種子直接消毒法解決了果莢開裂後，微型種子消毒難的問題；第二，解決了微型種子播種不均勻，密度較大，勤於分瓶的難題。該方法能夠保證微型種子完全成熟後播種，提高萌發率；播種時保證微型種子均勻平鋪，疏密可控，受光均勻，在雜交選育及實生苗生產中具有很好的技術效果和推廣前景。

具體實施方式

一種微型種子消毒轉接方法，其中本實施例中的微型種子為蝴蝶蘭種子，它包括以下幾個步驟：

（1）選取蝴蝶蘭雜交140天的果莢，進行套袋處理，10天後收集到成熟飽滿、自然開裂的蝴蝶蘭種子，置於4℃冰箱備用；

（2）將1.5ml離心管，無菌水，0.1%瓊脂，1000µL移液槍頭裝袋封口後，進行高溫滅菌，冷卻備用。

（3）將步驟1）獲得的種子取適量（不多於1/10體積）裝於1.5mL離心管，加入1mL無菌水，震蕩10s，4000r/s，離心30s，去掉廢液及漂浮的種子；向離心管中加入1mL70%酒精，上下震蕩10s, 4000r/s，離心15s，用移液槍小心去除廢液；加入1mL無菌水，震蕩10s，4000r/s，離心30s，去廢液，重複2次；向離心管中加入1mL0.1% HgCl2，強力震蕩3min,4000r/s離心30s，去廢液；加入1mL無菌水，強力震蕩1min，4000r/s離心30s，去廢液，重複3次後備用；

（4）向步驟3）獲得的盛無菌種子的離心管中加入1.5mL的0.1%瓊脂，用移液槍吸打至種子均勻懸浮後吸取懸浮液，均勻分布於培養基表面，15min後，晾乾、封口、標記。

（5）將步驟4）獲得的無菌種子培養2個月後，長出兩片真葉進行分瓶轉接，2個月後進行壯苗、生根培養，3個月後得蝴蝶蘭雜交的實生苗。

本實施例中，種子的萌發率高達84.38%，中間只進行一次分瓶。而同期用傳統方法轉接的種子，萌發率為78.31%左右，中間因為播種不均勻，進行了3次分瓶。

實施例2

一種微型種子消毒轉接方法，其中本實施例中的微型種子為霍山石斛種子，它包括以下幾個步驟：

（1）選取霍山石斛自交170天的果莢，進行套袋處理，10天後收集到成熟飽滿、自然開裂的石斛種子，置於4℃冰箱備用；

（2）將1.5ml離心管，無菌水，0.15%瓊脂，1000µL移液槍頭裝袋封口後，進行高溫滅菌，冷卻備用。

（3）將步驟1）獲得的種子取適量（不多於1/10體積）裝於1.5mL離心管，加入1mL無菌水，震蕩20s，5000r/s，離心30s，去掉廢液及漂浮的種子；向離心管中加入1mL0.1% HgCl2，強力震蕩4min,5000r/s離心30s，去廢液；加入1mL無菌水，強力震蕩1min，5000r/s離心30s，去廢液，重複4次後備用；

（4）向步驟3）獲得的盛石斛種子的離心管中加入1.5mL的0.15%瓊脂，用移液槍吸打至種子均勻懸浮後吸取懸浮液，均勻分布於培養基表面，晾乾、封口、標記。

（5）將步驟4）獲得的無菌種子培養50天後，長出兩片真葉進行分瓶轉接，2個月後進行壯苗、生根培養，3個月後得霍山石斛實生苗。

本實施例中，石斛種子消毒轉接40天後，萌發率為86.21%，中間進行一次分瓶。而同期用傳統方法轉接的種子，萌發率不高於85%，中間因為播種不均勻，造成光照不足，進行了2次分瓶轉接。

實施例3

一種微型種子消毒轉接方法，其中本實施例中的微型種子為白芨種子，它包括以下幾個步驟：

（1）選取白芨自交160天的果莢，進行套袋處理，5天後收集到成熟飽滿、自然開裂的白芨種子，置於4℃冰箱備用；

（2）將1.5ml離心管，無菌水，0.2%瓊脂，1000µL移液槍頭裝袋封口後，進行高溫滅菌，冷卻備用。

（3）將步驟1）獲得的種子取適量（不多於1/10體積）裝於1.5mL離心管，加入1mL無菌水，震蕩30s，6000r/s，離心30s，去掉廢液及漂浮的種子；向離心管中加入1mL75%酒精，上下震蕩10s, 6000r/s，離心15s，用移液槍小心去除廢液；向離心管中加入1mL0.1% HgCl2，強力震蕩5min,6000r/s離心30s，去廢液；加入1mL無菌水，強力震蕩1min，6000r/s離心30s，去廢液，重複5次後備用；

（4）向步驟3）獲得的盛無菌種子的離心管中加入1.5mL的0.2%瓊脂，用移液槍吸打至種子均勻懸浮後吸取懸浮液，均勻分布於培養基表面，晾乾、封口、標記。

（5）將步驟4）獲得的白芨種子培養45天後，長出兩片真葉進行分瓶轉接一次，40天後進行壯苗、生根培養，3個月後得白芨實生苗。

本實施例中，白芨種子消毒轉接40天後，萌發率高於90%，中間進行1次分瓶，而同期用傳統方法轉接的種子，萌發率不高於80%，中間因為播種較密不均勻，造成受光不勻，部分徒長，進行了3次分瓶。