一種用於調節腸道菌群和增強免疫力的含雙歧桿菌的組合物的製作方法
2023-11-04 11:49:12
專利名稱：一種用於調節腸道菌群和增強免疫力的含雙歧桿菌的組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種雙歧桿菌製品，特別 是涉及一種用於調節腸道菌群和增強免疫 力的含雙歧桿菌的組合物，屬於雙歧桿菌製品製備技術領域。
背景技術：
腸道微生態系統是人體最大、最複雜的微生態系統，也是人體微生態系統中最 主要和最活躍的部分。腸道菌群是腸道防禦屏障的重要組成部分，平衡的腸道菌群對 人的健康十分重要。但是，由於機體衰老、環境汙染、飲食改變、濫用抗生素等原因， 往往使人體腸道微生態系統受到破壞，引起腸道菌群失調，嚴重影響身體的免疫系統機 能，造成免疫功能低下，導致菌群易位，誘發內源感染，造成機體病變，從而引發多種 疾病，如肝硬化、膽結石、動脈硬化、冠心病、心肌梗塞、腦動脈硬化、腦中風等。雙歧桿菌是1899年在法國巴斯德研究所由Tisser.H博士首次從健康的母乳哺育 嬰兒的糞便中發現並分離出來的，是人體腸道內重要的生理性細菌，與人的一生始終保 持著和諧的共生關係，是健康個體腸道中的優勢菌，其促進人體健康的有益作用遠遠超 過其它乳酸菌。基於雙歧桿菌的生物化學屏障、抑制致病菌和腐敗菌、提供營養、提高 免疫力功能及其臨床功效的肯定，國內外研究者相繼開發出多種雙歧桿菌食品和微生態 藥品用於保健功能和治療各種因素引起的腸道菌群失調和免疫功能低下，通過外源方式 增加人體腸道中雙歧桿菌數量，促進人體健康。雖然雙歧桿菌製品的開發層出不窮，但在眾多製品中存在的最為關鍵的問題是 產品在貯藏和消費過程中活菌含量下降。研究發現，雙歧桿菌在人體內的存活和增殖能 力對其益生作用有著重要影響，要獲得所期望的治療效果，雙歧桿菌必須達到足夠的數 量，以確保進入人體後有足夠的活菌發揮保健功能。然而，由於雙歧桿菌對營養條件要 求較高，對氧極為敏感，對低pH值的抵抗力差，導致進入市場的產品中雙歧桿菌的數量 急劇下降。另外，雙歧桿菌對人體產生有益效果，必須在通過胃環境後仍有大量的存活 菌到達腸道並定殖於腸黏膜上。但在胃酸和膽鹽環境中，雙歧桿菌菌數會很快下降，使 得最終在人體內沒有足夠的雙歧桿菌發揮作用。因此，如何提高產品中雙歧桿菌活菌數 量，確保其在人體腸道內定殖而發揮療效已成為我們亟待解決的問題。國內研究人員針對以上實際應用問題做了大量研究，主要體現在菌種基因改 造、高密度培養、微囊技術、保護劑研究等方面。專利CN 1056877C中公開了一種雙 歧桿菌微膠囊及其製造方法，CN 1063051C中公開了一種雙歧桿菌複合活菌製劑，CN 1149092C中公開了一種活性雙歧聯菌株耐酸腸溶微囊，三項專利均採用微膠囊技術，使 雙歧桿菌能夠抵抗外界環境的能力增強，可以抵擋胃酸及膽鹽的侵蝕，在液態或常溫狀 態下長時間儲存，仍可有效保護其活性，但是，一般經微膠囊包埋的雙歧桿菌到達腸道 後卻需要六小時以上才能溶解釋出，效果有限。專利CN 1116410C公開了一種高存活 性的活菌製劑及其製備方法，該專利將雙歧桿菌進行液體深層高密度培養，發酵液含活菌數5X108cfU/mL，菌體採用凍乾粉、微膠囊、充氮氣罐裝膠囊、充氮氣雙鋁包裝四重 保護措施，製成活菌製劑，使得菌體存活率顯著提高，製劑保存期常溫下可達兩年，但 是，該製劑工藝較繁瑣、費時，經高密度培養後活菌數仍較低，後期採用微膠囊技術同 樣存在有益效果發揮問題。專利CN 100519738C中公開了一種雙歧桿菌活菌製劑及其專 用保護劑，CN 100497594C中公開了一種高活性雙歧桿菌乾粉製劑的複合保護劑，兩項 專利採用特製保護劑，用其製成的凍乾粉劑，活菌含量均達LOXlO^cfu/g以上，同時解 決了雙歧桿菌製品常溫保存困難的問題，但是，雙歧桿菌有效定植腸道並發揮益生效果 的有效性問題並未解決。
發明內容
本發明的目的在於提供一種高活性雙歧桿菌及其製備方法，解決目前雙歧桿菌 製品中存在的產品在貯藏和消費過程中活菌含量下降及雙歧桿菌有效定植腸道並發揮益 生效果的有效性問題。本發明的另一目的在於提供一種含雙歧桿菌的組合物及其在調節腸道菌群和增 強免疫力方面的應用。本發明給出的技術解決方案是這種用於調節腸道菌群和增強免疫力的含雙歧 桿菌的組合物，其特點是所述組合物由經高密度培養和雙層包埋的雙歧桿菌、低聚糖、 維生素、金屬元素和輔料混合配製而成。 為更好的完成本發明的目的，所述含雙歧桿菌的組合物的組分，按重量百分比 計，雙歧桿菌為0.01 10%，低聚糖為10 50%，維生素為0.01 10%，金屬元素為 0.01 10%，其餘為輔料。為更好的完成本發明的目的，所述雙歧桿菌至少為嬰兒雙岐桿菌AS 1.2202、短 雙歧桿菌AS 1.2213、長雙歧桿菌CICC 6186、兩歧雙歧桿菌CICC 6071、青春雙歧桿菌 CICC 6070 中的一種。上述雙歧桿菌中的嬰兒雙岐桿菌AS 1.2202、短雙歧桿菌AS 1.2213均由中國普 通微生物菌種保藏管理中心保藏，長雙歧桿菌CICC 6186、兩歧雙歧桿菌CICC6071、青 春雙歧桿菌CICC 6070均由中國微生物菌種保藏管理委員會工業微生物菌種保藏管理中 心保藏，屬於現有的雙歧桿菌菌種。為更好的完成本發明的目的，所述低聚糖至少為低聚果糖、低聚半乳糖、大豆 低聚糖、低聚木糖、低聚乳果糖、低聚異麥芽糖等中的一種。為更好的完成本發明的目的，所述維生素至少為維生素A、維生素氏、B2, B6, B12,維生素C、維生素D、維生素E等中的一種。為更好的完成本發明的目的，所述金屬元素至少為鋅、鐵、鈣、鎂等中的一 種。為更好的完成本發明的目的，所述輔料至少為麥芽糊精、乳糖、澱粉等中的一 種。用於本發明的雙歧桿菌的製備方法如下1、高密度培養(1)菌種活化無菌條件下，挑取安瓿管中菌體接種於液體培養基和瓊脂平板上，在36 38°C條件下厭氧培養24 48小時，連續活化2 3代，即得活化菌種。其中，用於本發明的雙歧桿菌培養基的配製方法如下胰蛋白腖5.0g、酵母提 取物lO.Og、大豆蛋白腖5.0g、葡萄糖lO.Og、L 半胱氨酸鹽酸鹽0.5g、吐溫801.0mL、 鹽溶液40mL、加水定容至lOOOmL，調節pH6.8 7.0，121°C滅菌20min。其中鹽溶液 的成分為氯化鈣0.2g、磷酸二氫鉀l.Og、硫酸鎂0.48g、碳酸氫鈉lO.Og、磷酸氫二鉀 l.Og、氯化鈉2.0g、加水定容至lOOOmL。 (2)種子培養將活化菌種按5% 10%的接種量接入液體培養基中，在36 38°C條件下厭氧培養20 28小時，作為種子培養物。(3)發酵培養將種子培養物按5% 10%的接種量接入液體培養基中，在 36 38 °C條件下進行發酵罐高密度培養。(4)發酵終止培養基pH和葡萄糖含量均不再降低時終止發酵，獲得雙歧桿菌 高密度發酵液。2、雙層包埋(1)離心濃縮將雙歧桿菌高密度發酵液在4°C、6000 8000r/min的條件下離 心10 20min，無菌水洗滌2 3次，取下層沉澱即為活性菌泥。(2)添加保護劑按1 4 1 10(V保護劑/V發酵液)的比例在活性菌泥中加入菌 體冷凍乾燥保護劑，無菌條件下150 250r/min攪拌15 30min至均勻，製備菌懸液。其中，用於本發明的冷凍乾燥保護劑的配製方法如下脫脂奶粉8 12g、蔗糖 8 12g、穀氨酸鈉0.5 1.5g、山梨醇0.5 1.5g，加水定容至lOOmL，加熱攪拌使其溶 解，然後115°C滅菌15min。(3)1層包埋按1 1 1 5 (Vljg包埋液/V保護劑)的比例將I層包埋液加入菌懸 液中，無菌條件下150 250r/min攪拌15 30min至均勻。其中，用於本發明的I層包埋液為蛋白質溶液，包括酪蛋白、乳白蛋白、卵白蛋 白、卵黃磷蛋白、肌蛋白、大豆分離蛋白、中草藥白蛋白等中的一種或幾種。(4)11層包埋按1 1 1 5 (V11層包埋液/V保護劑)的比例將II層包埋液加入上 述混合液中，無菌條件下150 250r/min攪拌15 30min至均勻。其中，用於本發明的II層包埋液為為膠質溶液，包括卡拉膠、黃原膠、瓜爾 膠、果膠、木薯澱粉、瓊脂、海藻酸鈉、刺槐豆膠、魔芋膠等中的一種或幾種。3、冷凍乾燥將經雙層包埋的雙歧桿菌置於_70°C冰箱中預凍2 6h後，在冷阱溫 度-45 -55°C，真空度0.1 10帕下真空冷凍乾燥，即得雙歧桿菌菌粉。用於本發明的組合物可以製成膠囊劑、衝劑、顆粒劑、片劑等形式，應用於食 品、保健品、藥品領域，具有調節腸道菌群和增強免疫力的功能。與現有技術相比，本發明的有益效果是(1)高密度培養使菌體密度較傳統培養方式有顯著提高，從而達到減少培養體 積，還可以縮短生產周期，最終提高特定產物的比生產速率，減少設備投資從而降低生 產成本，提高在市場上的競爭力。(2)雙層包埋的外層膠體在酸性環境中不溶解，保護菌體安全通過胃部，不受胃 酸及膽鹽的破壞。到達腸道後外層膠體溶解，暴露出內層蛋白質，協助菌體黏附在腸壁絨毛上而在腸道內定 殖，同時提供營養，促進菌體增殖。(3)真空冷凍乾燥技術在低溫、低壓下進行，基本隔絕空氣，有效抑制產品發生 理化性質改變，可以較好地保存活性物質，並賦予產品良好的穩定性，便於長期貯存。(4)低聚糖不易被人體胃腸道消化吸收，作為雙歧桿菌的增殖因子，能有效地促 進其生長繁殖，抑制腐敗菌生長。
具體實施方案下面實施例是對本發明的進一步說明，而不是限制本發明的保護範圍。實施例1 雙歧桿菌菌粉的製備1、高密度培養(1)菌種活化無菌條件下，挑取安瓿管中菌體接種於液體培養基和瓊脂平板 上，在37°C條件下厭氧培養48小時，連續活化3代，即得活化菌種。其中，用於本發明的雙歧桿菌培養基的配製方法如下胰蛋白腖5.0g、酵母提 取物lO.Og、大豆蛋白腖5.0g、葡萄糖lO.Og、L 半胱氨酸鹽酸鹽0.5g、吐溫801.0mL、 鹽溶液40mL、加水定容至lOOOmL，調節pH6.8 7.0，121°C滅菌20min。其中鹽溶液 的成分為氯化鈣0.2g、磷酸二氫鉀l.Og、硫酸鎂0.48g、碳酸氫鈉lO.Og、磷酸氫二鉀 l.Og、氯化鈉2.0g、加水定容至1000mL。(2)種子培養將活化菌種按5%的接種量接入液體培養基中，在37°C條件下厭 氧培養24小時，作為種子培養物。(3)發酵培養將種子培養物按5%的接種量接入液體培養基中，在37°C條件下 進行發酵罐高密度培養。發酵過程主要參數控制為pH控制接種後NaOH調節培養基初始pH至7.0，發酵期間流加NaOH維持 pH>5.0 ；葡萄糖控制發酵期間監測培養基中葡萄糖濃度，流加葡萄糖維持葡萄糖含量 >4g/L0(4)發酵終止培養基pH和葡萄糖含量均不再降低時終止發酵，獲得雙歧桿菌 高密度發酵液。2、雙層包埋(1)離心濃縮將雙歧桿菌高密度發酵液在4°C、eOOOr/min的條件下離心 15min,無菌水洗滌2次，取下層沉澱即為活性菌泥。(2)添加保護劑按V保護劑/V發酵液=1 8的比例在活性菌泥中加入菌體冷凍幹 燥保護劑，無菌條件下200r/min攪拌15min至均勻，製備菌懸液。其中，用於本發明的冷凍乾燥保護劑的配製方法如下脫脂奶粉10g、蔗糖 log、穀氨酸鈉l.Og、山梨醇l.Og，加水定容至lOOmL，加熱攪拌使其溶解，然後115°C 滅菌15min。(3) I層包埋按％層包_/乂保護劑=1 2的比例將I層包埋液加入菌懸液中，無 菌條件下200r/min攪拌15min至均勻。其中，用於本發明的I層包埋液為5%的大豆分離蛋白溶液。(4)11層包埋按V11層包埋液V保護劑=1 2的比例將II層包埋液加入上述混合液中，無菌條件下200r/min攪拌15min至均勻。其中，用於本發明的II層包埋液為0.04%的κ-卡拉膠和0.06%的魔芋膠的膠體
混合溶液。3、冷凍乾燥將經雙層包埋的雙歧桿菌置於_70°C冰箱中預凍4h後，在冷阱溫度_50°C，真空
度0.1 10帕下真空冷凍乾燥，即得雙歧桿菌菌粉，活菌數可達1.0X lO^cfu/g以上。實施例2 組合物配方
權利要求
1.一種用於調節腸道菌群和增強免疫力的含雙歧桿菌的組合物，其特徵在於所述組 合物由經高密度培養和雙層包埋的雙歧桿菌、低聚糖、維生素、金屬元素和輔料混合配 制而成。
2.根據權利要求1所述的用於調節腸道菌群和增強免疫力的含雙歧桿菌的組合物，其 特徵在於所述含雙歧桿菌的組合物的組分，按重量百分比計雙歧桿菌為0.01 10%， 低聚糖為10 50%，維生素為0.01 10%，金屬元素為0.01 10%，其餘為輔料。
3.根據權利要求1所述的用於調節腸道菌群和增強免疫力的含雙歧桿菌的組合物，其 特徵在於所述雙歧桿菌至少為嬰兒雙岐桿菌AS 1.2202、短雙歧桿菌AS 1.2213、長雙歧 桿菌CICC 6186、兩歧雙歧桿菌CICC 6071、青春雙歧桿菌CICC 6070中的一種。
4.根據權利要求1所述的用於調節腸道菌群和增強免疫力的含雙歧桿菌的組合物，其 特徵在於所述低聚糖至少為低聚果糖、低聚半乳糖、大豆低聚糖、低聚木糖、低聚乳果 糖、低聚異麥芽糖等中的一種。
5.根據權利要求1所述的用於調節腸道菌群和增強免疫力的含雙歧桿菌的組合物，其 特徵在於所述維生素至少為維生素A、維生素氏、B2, B6, B12,維生素C、維生素D、 維生素E中的一種。
6.根據權利要求1所述的用於調節腸道菌群和增強免疫力的含雙歧桿菌的組合物，其 特徵在於所述金屬元素至少為鋅、鐵、鈣、鎂中的一種。
7.根據權利要求1所述的用於調節腸道菌群和增強免疫力的含雙歧桿菌的組合物，其 特徵在於所述輔料至少為麥芽糊精、乳糖、澱粉中的一種。
8.根據權利要求1所述的用於調節腸道菌群和增強免疫力的含雙歧桿菌的組合物，其 特徵在於所述經高密度培養和雙層包埋的雙歧桿菌的製備方法為A、高密度培養(1)菌種活化無菌條件下，挑取安瓿管中菌體接種於液體培養基和瓊脂平板上， 在36 38°C條件下厭氧培養24 48小時，連續活化2 3代，即得活化菌種；(2)種子培養將活化菌種按5% 10%的接種量接入液體培養基中，在36 38°C 條件下厭氧培養20 28小時，作為種子培養物；(3)發酵培養將種子培養物按5% 10%的接種量接入液體培養基中，在36 38 °C條件下進行發酵罐高密度培養；(4)發酵終止培養基pH和葡萄糖含量均不再降低時終止發酵，獲得雙歧桿菌高密 度發酵液；B、雙層包埋(1)離心濃縮將雙歧桿菌高密度發酵液在4°C、6000 8000r/min的條件下離心 10 20min，無菌水洗滌2 3次，取下層沉澱即為活性菌泥；(2)添加保護劑按1 4 1 10(V保護劑/V發酵液)的比例在活性菌泥中加入菌體 冷凍乾燥保護劑，無菌條件下150 250r/min攪拌15 30min至均勻，製備菌懸液；(3)1層包埋按1 1 1 5 (Vljg包埋液/V保護劑)的比例將I層包埋液加入菌懸液 中，無菌條件下150 250r/min攪拌15 30min至均勻；⑷II層包埋按1 1 1 5 (V11層包埋液/V保護劑)的比例將II層包埋液加入上述混 合液中，無菌條件下150 250r/min攪拌15 30min至均勻；C、冷凍乾燥將經雙層包埋的雙歧桿菌置於-70 0C冰箱中預凍2 6h後，在冷阱溫 度-45 -55°C，真空度0.1 10帕下真空冷凍乾燥，即得雙歧桿菌菌粉。
9.根據權利要求8所述的用於調節腸道菌群和增強免疫力的含雙歧桿菌的組合物，其 特徵在於雙歧桿菌培養基的配製方法如下胰蛋白腖5.0g、酵母提取物lO.Og、大豆蛋白腖5.0g、葡萄糖lO.Og、L-半胱氨酸鹽 酸鹽0.5g、吐溫801.0mL、鹽溶液40mL、加水定容至lOOOmL，調節pH6.8_7.0，121°C滅 菌20min。其中鹽溶液的成分為氯化鈣0.2g、磷酸二氫鉀l.Og、硫酸鎂0.48g、碳酸氫 鈉lO.Og、磷酸氫二鉀l.Og、氯化鈉2.0g、加水定容至IOOOmL0
10.根據權利要求8所述的用於調節腸道菌群和增強免疫力的含雙歧桿菌的組合物， 其特徵在於冷凍乾燥保護劑的配製方法如下脫脂奶粉8 12g、蔗糖8 12g、穀氨酸鈉0.5 1.5g、山梨醇0.5 1.5g，加水定 容至IOOmL,加熱攪拌使其溶解，然後115°C滅菌15min。
11.根據權利要求8所述的用於調節腸道菌群和增強免疫力的含雙歧桿菌的組合物， 其特徵在於I層包埋液為蛋白質溶液，至少為酪蛋白、乳白蛋白、卵白蛋白、卵黃磷蛋 白、肌蛋白、大豆分離蛋白、中草藥白蛋白中的一種。
12.根據權利要求8所述的用於調節腸道菌群和增強免疫力的含雙歧桿菌的組合物， 其特徵在於II層包埋液為膠質溶液，至少為κ-卡拉膠、黃原膠、瓜爾膠、果膠、木薯澱 粉、瓊脂、海藻酸鈉、刺槐豆膠、魔芋膠等中的一種。
13.根據權利要求1所述的用於調節腸道菌群和增強免疫力的含雙歧桿菌的組合物， 其特徵在於該組合物的劑型為膠囊劑或衝劑或顆粒劑或片劑。
14.權利要求1所述的用於調節腸道菌群和增強免疫力的含雙歧桿菌的組合物的用 途，其特徵在於作為調節腸道菌群和增強免疫力的食品或保健品或藥品應用。
全文摘要
一種用於調節腸道菌群和增強免疫力的含雙歧桿菌的組合物，其特點是所述組合物由經高密度培養和雙層包埋的雙歧桿菌、低聚糖、維生素、金屬元素和輔料混合配製而成，其中該組合物的組分為雙歧桿菌為0.01～10％，低聚糖為10～50％，維生素為0.01～10％，金屬元素為0.01～10％，其餘為輔料。本發明給出的含雙歧桿菌的組合物具有調節腸道菌群和增強免疫力的功能，可以製成膠囊劑、衝劑、顆粒劑、片劑等形式，應用於食品、保健品和藥品領域。
文檔編號A61P37/04GK102018216SQ200910175658
公開日2011年4月20日 申請日期2009年9月19日 優先權日2009年9月19日
發明者曾星 申請人:菲伯納生物醫藥有限責任公司