多步發酵法生產甘油的高產方法

2023-11-10 02:05:57 1

專利名稱：多步發酵法生產甘油的高產方法
技術領域：
本發明屬於生物化工技術領域，特別涉及多步發酵法生產甘油的高產方法。
背景技術：
甘油即丙三醇是一種重要的多羥基醇，其用途廣泛，應用於牙膏、菸草、化妝品、 塗料工業等行業，己知在1700多種產品的生產中直接或間接以甘油為原料，甘油的生 產方法有化學合成法、油脂皂化水解法和微生物發酵法，在前兩種方法生產的甘油無 法滿足市場需求時，人們將注意力集中在微生物發酵法生產甘油的研究上，其中研究 最多的是耐高滲酵母的發酵生產，提出了流加、連續生產及細胞固定化等技術，無錫 輕工學院與中科院化冶所等共同承擔的"發酵法生產甘油"專題攻關任務(諸葛健、
方慧英，微生物好氧發酵法生產甘油，精細與專用化學品，2001-20: 22-23)中，發酵 水平平均達到甘油含量106.9g/l，對糖轉化率達到50.39%;但發酵法生產甘油工藝 產業化的技術"瓶頸"在於甘油的提取(P.kishore, Concentration of Glycerol in Fermentation Baths by Reverse Osmosis, J.Microbio，Biotechnol, 1987,2(1): 22-27),原 因是在發酵後期，細胞對糖的消耗速率降低，儘管發酵液中殘糖濃度還處於一定水平， 但甘油卻開始被細胞消耗(Liu YQ, Liu DH, Su Q, Xie DM， Glycerol production by Ca"^/" Arww/ employing NaCl as an osmoregulator in batch and continuous fermentations., Biotechnol Lett 2002， 24: 1137-1140)。使得發酵被迫中止，這不僅影響 了最終甘油產量，而且在甘油蒸餾提取時，過高濃度的殘糖在高溫下易焦化結垢，使 甘油蒸餾十分困難，甚至無法進行；為此，人們相繼提出樹脂吸附法、載體蒸餾法(諸 葛建，中國專利，申請號89103615)、殘糖氧化法(蔡水洪，中國專利，申請號 94112202.6)、溶劑抽提(蔡水洪，中國專利，申請號94112180.1)等方法，這些方 法的出發點是一致的，既不是通過發酵工藝優化或菌種選擇來降低殘糖，而是待發教 停止後再設法將殘糖和甘油分開，雖有一定效果，但受技術和成本的限制，都不盡理 想。

發明內容
本發明的目的在於提供一種多步發酵法生產甘油的高產方法，通過通氣量和轉速 的調節將發酵分為四個階段，從而使發酵後期殘糖顯著降低，而甘油不返耗，同時能 夠得到較高的發酵甘油濃度和總糖轉化率，拉大了甘油和殘糖含量的比例，使甘油的 後提取更加容易。所述發酵工藝過程為
將酵母接入含IO-50g/l葡萄糖的種子培養基中，30'C 37'C培養20 24h,再將 種子液按體積5 10%的接種量加入含葡萄糖濃度為250~380g/l的初始發酵培養基，
30 40'C條件下進行有氧發酵，發酵過程中監測發酵液的pH值、菌濃、葡萄糖和甘油 濃度，發酵12—24小時為第一階段，每間隔5 — 7小時調高一次通空氣量，根據發酵 罐的容量及罐型，最終通氣量調到0. 6 3. 5vvm，攪拌轉速70 600rpm,繼續發酵進 入第二階段，保持通氣量和轉速不變並監測葡萄糖、甘油濃度，當葡萄糖濃度低於30~ 50g/l時，進入第三階段的發酵，即每間隔4 6小時調低一次通氣量，最終通氣量調 到Ovvm，攪拌轉速10 50rpra，則進入第四階段的厭氧發酵，整個發酵過程中，當葡 萄糖濃度低於2g/l時即可中止發酵， 一般發酵周期為72-96小時，發酵生產結束後， 採用板框、膜過濾、離心等手段將發酵液固液分離，清液通過濃縮、蒸餾、離子交換 和脫色等步驟將甘油分離、提純，製備成產品。
本發明所述的酵母為假絲酵母，屬產甘油的菌株。通氣量和轉速的調節方式為單
獨或同時調節發酵通氣量和轉速。所述發酵方式包括批次流加發酵和連續發酵。
本發明的優點在於，多步發酵法的新工藝使發酵後期殘糖顯著降低，而甘油不返 耗，同時能夠得到較高的發酵甘油濃度和總糖轉化率，拉大了甘油和殘糖含量的比例， 使甘油的後提取更加容易。
具體實施例方式
本發明提出了通過通氣量和轉速的調節採用多步發酵法生產甘油的高產工藝，下
面再以具體實施例對本發明予以進一步說明
實例l
(1) 菌種克魯斯假絲酵母(C朋^/fl ^rww/)
(2) 發酵方式2L機械攪拌發酵罐，通空氣批次發酵
(3) 發酵過程2L發酵罐，裝液量1.5L，發酵溫度控制在37'C,採用自然pH值。 發酵培養基初始含葡萄糖濃度為343.7g/L，通入空氣，通氣量1.5vvm,發酵罐攪 拌轉速400rpm，發酵過程中監測發酵液的pH值、菌濃、葡萄糖和甘油濃度，第一階 段於發酵6、 12、 18、 24hr分別調高通氣量為2.0、 2.5、 3.0、 3.5vvm，轉速450、 500、 550、 600rpm;第二階段維持通氣量3.5vvm，轉速600rpm，並繼續監測葡萄 糖、甘油濃度，發酵54hr時葡萄糖濃度為45.3g/1，則進入第三階段的發酵，於發酵 54、 58、 62hr分別調低通氣量為3.0、 2.5、 2.0vvm，轉速550、 500、 450rpm;此 時葡萄糖濃度分別為45.3、 17.7、 6.5g/l,甘油濃度為168、 181.1、 182.7g/l， 66hr 時葡萄糖濃度為O，甘油濃度為183.8g/l，尚未進入第四階段即可停止發酵，此時 對糖轉化率為53.48%。
同樣條件下，不採用多步發酵工藝進行發酵，則發酵到66hr葡萄糖濃度分別 為52.8g/l，甘油濃度為150.3g/l，84hr時葡萄糖和甘油濃度分別為21.5g/l、142.3g/1, 耗糖的同時甘油被反耗，發酵不得不停止，相比之下，採用多步發酵工藝甘油濃度由142.3g/L上升到182.7g/L，葡萄糖濃度濃度由21.5 g/L下降到0g/L,轉化率 由44.17%上升到53.48%，效果顯著。
實例2
(1) 菌種克魯斯假絲酵母(Om^Wfl ;bme0
(2) 發酵方式5噸機械攪拌發酵罐，通空氣批次發酵
(3) 發酵過程5噸發酵罐，裝液量4噸，發酵溫度控制在37'C，採用自然pH值。 發酵培養基初始含葡萄糖濃度為308.5g/L,通空氣量0.2vvm,發酵罐攪拌電機不 可調，固定轉速126rpm，發酵過程中監測發酵液的pH值、菌濃、葡萄糖和甘油濃度, 第一階段於發酵6、 12、 18、 24hr分別調高通氣量為0.3、 0.4、 0.5、 0.6vvm,轉 速126rpm不變；第二階段維持通氣量0.6vvm，轉速126rpm，繼續監測葡萄糖、 甘油濃度，發酵72hr時葡萄糖濃度為48.4g/1，則進入第三階段的發酵，於發酵72、 76、 80、 84hr分別調低通氣量為0.5、 0.4、 0.3、 Ovvm，在84hr時停止攪拌；用 蠕動泵進行罐外液體循環，此時葡萄糖濃度分別為48.4、 37.2、 20.4、 7.1g/l，甘 油濃度為136.2、 139.6、 147.6、 152.2g/l，然後進入第四階段的厭氧發酵，88hr時 葡萄糖濃度為0，甘油濃度為152.8g/l，停止發酵，轉化率為49.53%。發酵生產結 束後，採用板框過濾將發酵液固液分離，清液通過濃宿、蒸餾、離交和脫色等步驟將 甘油分離、提純，後提取總收率達到88.93%，產品甘油濃度為99.2%，並達到國家質 量標準。
權利要求
1.一種多步發酵法生產甘油的高產工藝，通過通氣量和轉速的調節將發酵分為四個階段分段發酵，具體工藝過程為將酵母接入含10-50g/l葡萄糖的種子培養基中，30℃～37℃培養20～24小時，再將種子液按體積5～10％的接種量加入含葡萄糖濃度為250～380g/l的初始發酵培養基，30～40℃條件下進行有氧發酵，發酵過程中監測發酵液的pH值、菌濃、葡萄糖和甘油濃度，發酵12-24小時為第一階段，每間隔5-7小時調高一次通空氣量，根據罐子的容量及罐型，最終通氣量調到0.6～3.5vvm，攪拌轉速70～600rpm，繼續發酵進入第二階段，保持通氣量和轉速不變並監測葡萄糖、甘油濃度，當葡萄糖濃度低於30～50g/l時，進入第三階段的發酵，每間隔4～6小時調低一次通氣量，最終通氣量調到0vvm，攪拌轉速10～50rpm，則進入第四階段的厭氧發酵，無論進入那個階段，當葡萄糖濃度低於2g/l時中止發酵，發酵周期為72-96小時，發酵生產結束後，採用板框、膜過濾、離心手段將發酵液固液分離，清液通過濃宿、蒸餾、離子交換和脫色等步驟將甘油分離、提純，製備成產品。
2. 根據權利要求1所述，其特徵在於所述的酵母為假絲酵母屬產 甘油的菌株。
3. 根據權利要求1所述，其特徵在於所述通氣量和轉速的調節方 式為單獨或同時調節發酵通氣量和轉速。
4. 根據權利要求1所述，其特徵在於所述發酵方式包括批次流 加發酵或連續發酵。
全文摘要
一種多步發酵法生產甘油的高產方法，屬於生物化工技術領域。通過通氣量和轉速的調節將發酵分為四個階段分段發酵，工藝步驟為將耐高滲酵母種子液按體積5～10％的接種量加入含葡萄糖濃度為250～380g/l的初始發酵培養基中，30～40℃條件下進行有氧發酵；每間隔6hr調高一次通空氣量，最終通氣量調到0.6～3.5vvm，攪拌轉速70～600rpm，當葡萄糖濃度低於30～50g/l時，進入第三階段的發酵，每間隔4～6hr調低一次通氣量，最終通氣量調到0vvm，攪拌轉速10～50rpm，則進入第四階段的厭氧發酵，當葡萄糖濃度低於2g/l時中止發酵。發酵結束後，將發酵液固液分離，將甘油分離、提純，製備成產品。優點在於，使發酵後期殘糖顯著降低，而甘油不返耗。
文檔編號C12P7/02GK101343643SQ200810222028
公開日2009年1月14日 申請日期2008年9月5日 優先權日2008年9月5日
發明者劉宏娟, 劉德華, 燕 孫, 張建安 申請人:清華大學