用於胚胎體外生產的培養液以及牛胚胎體外生產的方法
2023-11-02 07:58:37
專利名稱：用於胚胎體外生產的培養液以及牛胚胎體外生產的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種用於胚胎體外生產的培養液以及牛早期 胚胎體外生產的方法。
背景技術：
動物胚胎移植是指將從一頭受孕母畜(供體)的生殖管道中取出的受精卵或發育 到一定時期的早期胚胎，移植到與供體母畜同步發情的母畜(受體)生殖管道的一定部位， 使其繼續生長、發育，長成子畜的技術。利用胚胎移植可以縮短動物繁殖周期，進一步挖掘 動物的繁殖潛力，為優良牲畜的大量繁殖，稀有動物的種族延續提供有效的解決辦法，在畜 牧業和製藥業等領域發揮重要的作用。由於從供體母畜收集受精卵易受動物生殖周期的影響，現在胚胎移植大都採用動 物早期胚胎進行移植，這就使動物早期胚胎的體外培養在胚胎移植中佔有重要地位。動物 早期胚胎體外培養是指將採集到的卵母細胞在體外經人工培養成熟後，通過體外受精、核 移植和孤雌激活等技術使卵母細胞受精或被激活，然後移至體外培養基中使其生長發育至 囊胚期的胚胎工程技術，該技術可以不受動物生殖周期的影響，大規模地進行動物早期胚 胎的體外生產。胚胎的體外培養已有40多年的發展歷史。目前，胚胎在體外培養條件下能夠存活 並發育，移植後能夠妊娠產仔，在胚胎工程和生產實踐中有了廣泛的應用。目前體外胚胎的 生產效率仍然很低，胚胎的質量與體內胚胎相比還存在很大的差距。牛胚胎體外主要存在 的問題為受胎率偏低、妊娠期延長、流產率增加、牛犢的生命力強弱不一、性比例偏斜、圍 產期和新生期犢牛的死亡率和畸形率增加等。其主要原因是體外培養體系還不能完全模擬 母畜體內環境，還不夠穩定。在體內，胚胎通過輸卵管遷移至子宮，胚胎暴露於動態環境。而 已經發展起來的絕大多數胚胎培養系統都是在一段時間相對平衡穩定的環境，胚胎仍然處 於一個相對靜止的環境，還無法完全模擬出與雌性生殖道相同的物理或環境條件，無法適 應早期胚胎分化發育的需求。因此，胚胎的體外培養體系還有待於進一步的優化、改進。目前常用的培養方法是體細胞共培養和序貫培養兩種。共培養是輔助細胞或體細 胞與胚胎在體外一起培養，更佳地模擬了胚胎在體內的發育環境，各種體細胞的混合培養 以及一些生長因子的添加都極大地推動了體外受精技術的進一步完善。該培養系統可以促 進胚胎的發育，高胚胎質量，使囊胚的形成率得到提高。然而共培養系統中有很多不確定因 子，並且體細胞可能充當病原的傳播載體，產生對胚胎的汙染。序貫培養是根據體外培養的胚胎在不同生長時間裡對不同物質需求和代謝的不 同，配製一系列不同成分的培養液，進行序列更換，從而延長胚胎在體外的培養時間，增加 體外篩選機會的方法，但該方法需要更換多種培養基，所用培養基需要篩選，操作麻煩，而 且容易汙染。各培養系統的培養液成分是整個培養過程中最為關鍵的部分，它決定了動物早期 胚胎生長發育率。目前TCM-199、CZB、KSOM等單純的基礎培養液不能完全模擬胚胎體內發育的環境，並且不能完全提供早期胚胎發育所必須的營養和非營養物質，由此極大降低了 胚胎發育成囊胚的效率。就牛早期胚胎體外生產而言，這些問題尤為突出，極大地制約著畜 牧業的發展。
發明內容
有鑑於此，本發明的一個目的是提供一種用於胚胎體外生產的培養液，所述培養液 可顯著促進體外胚胎向囊胚的發育，提高囊胚發育率從而進一步提高牛體外胚胎生產效率。為了實現上述發明目的，本發明採用如下技術方案本發明所述用於胚胎體外生產的培養液為包含5-lOmmol/L HepesU5-26. 2mmol/ L NaHCO3>30 50 μ g/L 的 BDNF 以及 3-5% OCS 的 TCM-199 基礎培養液。BDNF，腦源性神經營養因子(Brain derived neurotrophic factor)，主要存在於 大腦和外周組織，對神經細胞的分化和神經元存活具有重要作用。最近研究表明，這些因子 也表達在一些非神經系統中，如心血管、免疫、內分泌、生殖系統，並且參與調節這些系統的 功能。在本發明的具體實施方式
中，發現BDNF在不同發育階段的卵母細胞和胚胎以及 不同方法生產的早期胚胎中均有表達，BDNF對早期胚胎發育有促進作用。用含BDNF的培養 液培養早期胚胎，當BDNF濃度介於30 50 μ g/L時，顯著提高牛體外胚胎向囊胚的發育。 本領域技術人員可根據常識將其應用於其它哺乳動物如馬、羊等的胚胎體外生產。同樣的， 所述培養液也可以提高顯著促進發育，提高早期胚胎的囊胚發育率。作為優選，所述用於胚胎體外生產的培養液中BDNF濃度為40μ g/L。本發明的另一個目的是提供一種牛胚胎體外生產的方法，包括在含5-lOmmol/L H印es、15-26. 2mmol/L NaHCO3>30 50 μ g/L 的 BDNF 以及 3-5% OCS 的 TCM-199 培養液培 養早期胚胎，定期更換培養液，獲得囊胚期胚胎的步驟。作為優選，所述培養液為含有5mmol/L H印es、26. 2mmol/LNaHCO3、40 μ g/L 的 BDNF 以及3% OCS的TCM-199培養液。所述早期胚胎為通過體外受精、孤雌激活或核移植生產的早期胚胎。體外受精，英文簡稱為IVF，是指哺乳動物的精子和卵子在體外人工控制的環境中 完成受精過程的技術。孤雌激活是指是M II期卵母細胞不經過精子刺激，而通過化學或物理等人工刺激 模擬受精過程，恢復並完成第二次減數分裂，發生卵裂並形成早期胚胎。核移植是指將供體細胞核移入去核的卵母細胞中，使後者不經精子穿透等有性過 程即可被激活、分裂並發育成早期胚胎。作為優選，所述方法中每隔48h更換為新鮮的本發明所述培養液。本發明將BNDF應用到胚胎體外培養領域，獲得了更為理想、發育率更高的胚胎體 外培養液。利用本發明所述培養液體外培養牛胚胎，可顯著提高早期胚胎的囊胚發育率，完 善了現有的培養系統，大大提高了體外胚胎生產的質量和效率。
具體實施例方式本發明公開了一種胚胎體外生產的培養液以及利用該培養液進行牛胚胎體外生產的方法，本領域技術人員可以借鑑本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的 是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本 發明。本發明所述培養液及方法已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫 離本發明內容、精神和範圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實 現和應用本發明技術。依照本發明，所述用於胚胎體外生產的培養液為含有5mmol/Iifepes、26. 2mmol/L NaHCO3>40 μ g/L 的 BDNF 以及 3% OCS 的 TCM-199 培養液。在BDNF對早期胚胎發育影響的實驗中，以體外受精和孤雌激活方式生產的兩種 早期胚胎，在本發明所述牛早期胚胎體外生產的培養液中培養，在BDNF濃度為30 50 μ g/ L時，與未加有BDNF的培養液以及加其它濃度的BDNF的培養液相比，囊胚率顯著提高。優選地，所述培養液中BDNF濃度為40 μ g/L時，可使以體外受精方式生產的早期 胚胎的囊胚率提高至51. 22%，以孤雌激活方式生產的早期胚胎的囊胚率提高至58. 41%。本發明另一方面還提供了一種牛早期胚胎體外生產的方法，包括在含5-lOmmol/L H印es、15-26. 2mmol/L NaHCO3>30 50 μ g/L 的 BDNF 以及 3-5% OCS 的 TCM-199 培養液培 養早期胚胎，每隔48h更換培養液，獲得囊胚期胚胎的步驟。所述早期胚胎的生產方式包括體外受精、孤雌激活或核移植。卵母細胞正常受精時，精子與卵子質膜直接融合或通過表面上的受體蛋白引起卵 內Ca2+濃度的瞬時升高，由此引起包括皮質顆粒(CG)釋放、細胞質內pH的改變、母源mRNA 的補充等一系列激活反應，最終導致原核的形成、DNA合成的起始和卵裂。核移植、卵母細胞體外受精和孤雌激活是胚胎工程研究領域獲得胚胎的重要途 徑。卵母細胞孤雌激活是一種人工激活卵的方式，通過電脈衝、Ionomycin、乙醇、鈣離子載 體、放線菌酮和1，4，5_三磷酸肌醇(IP3)等都可以引起卵母細胞的激活，使MII期卵母細 胞不經過受精過程完成早期胚胎發育，獲得孤雌胚胎。孤雌激活與體外受精都是以MII期卵母細胞為起點，都能獲得早期胚胎，但孤雌 激活與體外受精存在本質的區別；前者是人工活化卵母細胞，後者是活化卵母細胞；孤雌 激活胚是通過抑制第二極體排放，使其與原來的卵母細胞核融合構成二倍體的胚胎，而體 外受精胚胎是由雌雄配子融合所獲得的胚胎，孤雌激活和體外受精是兩項相對獨立的技術 但又有密切的聯繫。核移植是指將供體細胞核移入去核的卵母細胞中，使後者不經精子穿透等有性過 程即可被激活、分裂並發育成早期胚胎。下面結合實施例，進一步闡述本發明。實施例1 早期胚胎BDNF mRNA表達水平的檢測用螢光定量PCR技術檢測BDNF在不同發育階段卵母細胞和胚胎以及不同方法生 產早期胚胎(體外受精胚胎、孤雌激活、核移植胚胎)中的表達水平，結果見表1和表2。表1不同發育階段牛卵母細胞和體外受精胚胎BDNF mRNA表達水平 注不同大寫字母表示差異極顯著(P < 0. 01)表2 牛不同類型胚胎中BDNF mRNA表達水平 注不同大寫字母表示差異極顯著(P < 0. 01)以上結果表明，BDNF在不同發育階段的卵母細胞和胚胎以及不同方法生產的早期 胚胎中均有表達，BDNF對早期胚胎發育有促進作用。實施例2 用免疫螢光技術檢測BDNF蛋白在胚胎中的表達用免疫螢光技術檢測BDNF蛋白在胚胎中的表達，顯示BDNF蛋白信號主要集中在 囊胚的外胚層。實施例3 卵母細胞的收集及體外成熟將屠宰場收集的牛卵巢，置於含有K+、Ca2+和Mg2+的35 37°C生理鹽水保溫瓶 內，4h內送到實驗室，用37°C的生理鹽水洗淨。然後用帶有12號針頭的IOmL注射器抽取 直徑為2 6mm卵泡中的卵母細胞。在實體顯微鏡下挑選出細胞質均勻、並有完整或部 分緻密卵丘細胞的卵母細胞，用洗卵液清洗兩遍後，放入含1.5mL成熟培養液的玻璃平皿 (30X IOmm)中，在38. 5°C、5% CO2和飽和溼度的培養箱中培養22 24h，獲得成熟的卵母 細胞。實施例4 體外受精生產早期胚胎將凍精在37 0C水浴中解凍後，取0. 25mL精液小心置於含有1. 5mL改良的 Tyrode' s受精液的圓底試管底部，15min懸浮後，活精子上遊，然後將上層液吸出，離心洗 滌及濃縮一次去上清，留約30 μ L備用。在培養皿中做30μ1的受精微滴，覆蓋以石蠟油， 放入38. 5°C,5% CO2和最大飽和溼度的培養箱中至少平衡lh。用細管機械去除包繞在實 施例1製備的成熟卵母細胞周圍的卵丘細胞，用新鮮洗卵液洗滌卵母細胞2 3次。將洗 滌後的卵母細胞放入微滴中，每滴加15 25個卵母細胞，再加2 5 μ L的精子懸液，使得 精子濃度為1. OX IO6 1.5 X IO6個/mL。將含精卵的培養皿放回38. 5°C，5 % CO2培養箱 中培養24h，獲得早期胚胎。實施例5 孤雌激活生產早期胚胎取實施例3製備的體外成熟培養20 22h後的卵母細胞，用吸管反覆吹打去掉卵 母細胞周圍的卵丘細胞。將卵母細胞在含5 μ mol/L離子黴素的培養液內處理5min，之後用 培養液洗3次，再移入含2mmol/L 6- 二甲氨基嘌呤培養液內培養3h，得到早期胚胎。實施例6 本發明所述培養液對體外受精生產的早期胚胎發育影響以 TCM-199+5mmol/L Hepes+26. 2mmol/L NaHC0s+3% OCS 為胚胎基礎液，向其中添加不同濃度的BDNF，在38. 5°C,5% CO2條件下對實施例4體外受精生產的早期胚胎進行培 養，培養液每隔48h更換一次，培養48h後檢查分裂率，7d後記錄發育的囊胚率，結果見表 3。(卵裂數百分比=卵裂數/卵母細胞數％ ；囊胚數數百分比=囊胚數/卵裂數％ ；孵化 數百分比=孵化數/卵裂數％)表3不同濃度BDNF對牛體外受精胚胎的影響 註上標表示與不加BDNF組相比，差異顯著a =P < 0. 05，b =P 30 50 μ g/L 的 BDNF 以及3-5% OCS的TCM-199培養液能顯著提高體外受精胚胎的囊胚率，優選地培養液中 BDNF 濃度為 40 μ g/L。實施例7 本發明所述培養液對孤雌激活生產的早期胚胎發育影響參照實施例6中方法，對實施例5孤雌激活生產的早期胚胎進行培養，結果見表4。表4不同濃度BDNF對牛孤雌激活胚胎的影響
7. 註上標表示與不加BDNF組相比，差異顯著a =P < 0. 05由表 4 得知，含 5-10mmol/L H印es、15-26. 2mmol/L NaHCO3、30 50 μ g/L 的 BDNF 以及3-5% OCS的TCM-199培養液能顯著提高孤雌激活胚胎的囊胚率，優選地培養液中 BDNF 濃度為 40 μ g/L。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人 員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應 視為本發明的保護範圍。
權利要求
一種用於胚胎體外生產的培養液，其特徵在於，所述培養液為含5-10mmol/L Hepes、15-26.2mmol/L NaHCO3、30～50μg/L的BDNF以及3-5％OCS的TCM-199培養液。
2.根據權利要求1所述培養液，其特徵在於，所述培養液為含有5mm0l/LHepes、 26. 2mmol/L NaHCO3>40 μ g/L 的 BDNF 以及 3% OCS 的 TCM-199 培養液。
3.根據權利要求1或2所述培養液，其特徵在於，所述胚胎為牛早期胚胎。
4.一種牛胚胎體外生產的方法，其特徵在於，包括在含5-lOmmol/Iifepes、 15-26. 2mmol/L NaHCO3>30 50 μ g/L 的 BDNF 以及 3-5% OCS 的 TCM-199 培養液中培養牛 早期胚胎，定期更換培養液，獲得囊胚期胚胎的步驟。
5.根據權利要求4所述方法，其特徵在於，所述培養液為含有5mm0l/LHepes、 26. 2mmol/L NaHCO3>40 μ g/L 的 BDNF 以及 3% OCS 的 TCM-199 培養液。
6.根據權利要求4或5所述方法，其特徵在於，所述早期胚胎為通過體外受精生產的早 期胚胎。
7.根據權利要求4或5所述方法，其特徵在於，所述早期胚胎為通過孤雌激活生產的早 期胚胎。
8.根據權利要求4或5所述方法，其特徵在於，所述早期胚胎為通過核移植生產的早期 胚胎。全文摘要
本發明涉及生物技術領域，公開了一種用於胚胎體外生產的培養液，所述培養液為含5-10mmol/L Hepes、15-26.2mmol/L NaHCO3、30～50μg/L的BDNF以及3-5％OCS的TCM-199培養液，其中優選地所述培養液中BDNF濃度為40μg/L。本發明所述培養液能顯著提高牛體外胚胎發育成囊胚的比率。本發明還提供了利用所述培養液進行牛胚胎體外生產的方法。
文檔編號C12N5/073GK101886059SQ201010224589
公開日2010年11月17日 申請日期2010年7月6日 優先權日2010年7月6日
發明者周虛, 易康樂, 李純錦 申請人:周虛