一種通過抑制自噬促進心肌再生的藥物的製作方法

2023-12-03 11:59:26 1

本發明屬於醫藥領域，涉及藥物的新用途，特別涉及抑制自噬的藥物在促進心肌再生方面的新應用。

背景技術：

心臟作為人體最重要的器官之一，它的主要功能是為血液流動提供壓力，將血液運輸到身體的各處。心臟的體積伴隨發育過程不斷增大，其中心肌細胞的增殖和肥大是心臟發育兩大主要途徑。出生以後心肌細胞逐漸喪失增殖能力。心衰是全球範圍內廣泛存在的嚴重的，致死率極高的心血管疾病。成年人發生心肌梗塞或心衰後，心肌細胞數目的損失幾乎是不可逆的，這與哺乳動物心肌細胞的增殖能力有限密切相關，因此，疾病或缺血等因素造成的心肌損傷難以修復。因此，心肌細胞增殖一直是領域內研究的焦點。

中心體由兩對互相垂直的桶狀結構中心粒和周圍電子緻密物構成。它作為一種重要的細胞器參與到細胞增殖的過程中，在特定的細胞周期裡細胞含有兩個中心體更利於細胞的分裂。而在關於心肌細胞增殖能力的研究中，觀察到例如DNA合成降低、多核體及多倍體細胞比例增加、有絲分裂水平降低和胞質分裂過程受阻等現象與中心體有關。所以，對於在心肌細胞增殖再生的研究中，中心體可能是一個重要的研究對象。

細胞自噬作為一種清除降解途徑在細胞受到飢餓或者其他壓力時發揮作用，通過降解大分子、細胞器或者功能紊亂的蛋白質維持細胞的內部平衡。近期研究發現小鼠的胚胎成纖維細胞自噬可以參與調節中心體數目。但是在心肌細胞中，該過程是否存在還處於未知的狀態。

技術實現要素：

本發明的目的在於探索心肌細胞中自噬作用對心肌細胞增殖再生的影響，發現具有抑制自噬作用的藥物的新用途。

本發明的研究發現，在發育過程中心肌細胞中心體的數目減少，而中心體數目的減少與自噬相關。通過藥物抑制心肌細胞中心體自噬，能夠緩解在發育過程由於心肌細胞中心體數目減少導致的細胞無法再生的現象，並提高心肌細胞EdU的攝取率。

在實驗的基礎上，本發明提出抑制自噬的藥物可促進心肌細胞的再生，從而有望應用於心衰或其他導致心肌細胞死亡的疾病治療。

一個完整的自噬過程需要多個步驟的參與，包括自噬體的形成、自噬體與溶酶體的融合及自噬溶酶體內容物的降解三個過程。抑制自噬的藥物及其衍生物可能干擾其中的一個或多個過程，從而抑制自噬的發生。例如：

3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)可以通過抑制自噬過程中的III型磷脂醯肌醇激酶(Phosphoinositide 3-Kinase)信號通路，從而阻遏自噬體的產生。除此之外，渥曼青黴素(Wortmannin)、LY294002均可以阻斷III型磷脂醯肌醇激酶信號通路，從而抑制自噬的發生。

氯喹(Chloroquine，CQ)可通過提高溶酶體pH值影響自噬體與溶酶體的融合過程，使得自噬過程被阻斷。除此之外，羥氯喹、巴伐洛黴素A1(Bafilomycin A)、長春鹼及諾考達唑(nocodazole)也可以抑制自噬體與溶酶體的融合，從而影響自噬的發生。

自噬體與溶酶體融合後最終通過溶酶體中的水解酶降解內容物，E46d和Pepstatin A對溶酶體的降解進行抑制，使得被降解的囊泡內容物大量蓄積與溶酶體中，從而達到抑制自噬的作用。

本發明通過實驗推測，抑制自噬的藥物及其衍生物可能參與到心肌細胞的再生過程，從而提供了一種通過抑制自噬促進心肌細胞再生的新思路。

以抑制自噬的藥物及其衍生物作為活性成分，可用於製備促進心肌細胞再生的藥物製劑。將抑制自噬的化合物或分子和藥學上可接受的輔劑製成各種形式的藥物製劑，用於心衰或其他導致心肌細胞死亡的疾病治療。

所述「藥學上可接受的輔劑」包括藥學上可接受的載體、賦形劑、稀釋劑等，它們與活性成分(抑制自噬的化合物或分子)相容。運用藥學上可接受的輔劑製備藥物製劑對本領域普通技術人員來說是公知的。所述藥物製劑可以是固體製劑或液體製劑。本發明的製劑可以為單位劑量形式，如片劑、膠囊(包括持續釋放或延遲釋釋放形式)、栓劑、丸劑、粉劑、膏劑、混懸劑、顆粒劑、酊劑、糖漿劑、乳液劑、懸浮液、針劑等各種劑型以及各種緩釋劑型，從而適合各種給藥形式，例如口服、非腸道注射、黏膜、肌肉、靜脈內、皮下、眼內、皮內或經過皮膚等的給藥形式。

綜上，本發明發現通過抑制自噬可以促進心肌細胞再生，從而抑制心肌細胞自噬的藥物可能成為心力衰竭、心肌梗塞及其他導致心肌細胞死亡的疾病的治療成分。

附圖說明

圖1.大鼠心肌細胞中心體數目在發育早期的變化情況，其中，0Ctr表示心肌細胞細胞中不含有中心體；1Ct表示心肌細胞中含有一個中心體；2Ctr表示心肌細胞中含有兩個中心體；mCtr表示心肌細胞中含有大於2個中心體。

圖2.實施例2中測得的大鼠發育過程中中心體與自噬體共定位比例變化情況統計圖，*P<0.05。

圖3.實施例3中通過CQ或3-MA抑制自噬後，心肌細胞中心體數目的變化情況，*P<0.05，**P<0.01。

圖4.實施例4中抑制自噬後心肌細胞EdU攝取率變化情況，*P<0.05。

具體實施方式

下面通過實施例對本發明做進一步說明，但不以任何方式限制本發明的範圍。

實施例1.心肌細胞在發育過程中中心體數目減少

利用γ-tubulin(γ微管蛋白)作為中心體的標記物(γ-tubulin作為中心體的主要成分，通過NEDD1/GCP-WD錨定在中心粒周圍物質中)，觀察在發育過程中大鼠心肌細胞中心體的變化情況。

利用0.1％胰蛋白酶及0.08％膠原酶II分離不同日齡大鼠的心室肌細胞。培養36小時後，預冷甲醇-20℃固定打孔7分鐘，之後血清封閉30分鐘後，利用γ微管蛋白及心肌細胞標記物抗體標記中心體及心肌細胞，通過雷射共聚焦顯微鏡成像後，統計發育過程中中心體數目。

結果如圖1所示，大鼠從出生後1天(P1)到9天(P9)的過程中，心肌細胞中含有兩個中心體的比例從56％降至24％，而細胞中不含中心體的細胞比例從4％上升至32％。

實施例2.發育過程中中心體與自噬體的共定位比例增加

微管相關蛋白輕鏈3(Microtubule-associated protein 1light chain 3,LC3)參與了自噬體的形成，定位在自噬體膜上，並被證明了是哺乳動物細胞中常見的自噬體標記蛋白之一。同樣利用0.1％胰蛋白酶及0.08％膠原酶II分離不同日齡大鼠的心室肌細胞。培養36小時，預冷甲醇-20℃固定打孔7分鐘，之後血清封閉30分鐘後，利用γ微管蛋白、自噬體及心肌細胞標記物抗體做免疫細胞化學，通過雷射共聚焦顯微鏡成像後，統計發育過程中中心體與自噬體共定位的比例。

在大鼠發育過程中我們發現心肌細胞中心體與自噬體(LC3標記)的共定位比例逐漸增多，由P1時的26％升高至P7時的52％(圖2)，說明在發育的過程中，中心體數目減少和自噬有關。

實施例3.抑制細胞自噬緩解心肌細胞中心體數目減少

為了進一步驗證自噬是否參與到中心體數目的減少這一過程，我們利用藥物(CQ和3-MA)對大鼠進行腹腔注射，以達到抑制自噬的目的，從而觀察中心體數目在細胞自噬受到抑制後的變化情況。氯喹(Chloroquine，CQ)，可通過提高溶酶體PH值影響自噬體與溶酶體的融合過程，使得自噬過程被阻斷。3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)能夠抑制自噬過程中的III型磷脂醯肌醇激酶(Phosphoinositide 3-Kinase)信號通路，從而阻遏自噬體的產生。

向不同日齡的大鼠乳鼠腹腔注射生理鹽水(作為對照)、氯喹(60mg/kg)和3-甲基腺嘌呤(30mg/kg)，注射12小時後分離心室肌細胞，利用γ微管蛋白、自噬體及心肌細胞標記物抗體做免疫細胞化學，通過雷射共聚焦顯微鏡成像後，統計不同實驗組大鼠心肌細胞在發育過程中中心體與自噬體共定位的比例變化情況。結果表明，在抑制自噬後，與對照組相比心肌細胞中含有兩個中心體的比例明顯升高(圖3)。

實施例4.抑制細胞自噬後提高了心肌細胞EdU的攝取率

5-乙炔基-2』脫氧尿嘧啶核苷(EdU)是一種胸腺嘧啶核苷類似物，在細胞增殖時能夠插入正在複製的DNA分子中，可以有效地標記處於S期的細胞。利用EdU這一特點，向不同日齡的大鼠乳鼠腹腔注射生理鹽水(作為對照)、氯喹和3-甲基腺嘌呤，12小時後分離心肌細胞，並向培養基中添加EdU，培養兩天後利用cy5染料標記EdU及利用心肌細胞標記物抗體做免疫細胞化學，通過雷射共聚焦顯微鏡成像後，統計不同實驗組大鼠心肌細胞在發育過程中EdU攝取率的變化情況。我們發現，在抑制細胞自噬的過程中，相較於對照組，注射氯喹和3-甲基腺嘌呤的心肌細胞EdU的攝取率明顯提高(圖4)，暗示抑制細胞自噬可能促進了心肌細胞的增殖。

上述實驗結果表明，在乳鼠發育過程中，自噬參與到調節心肌細胞中心體數目的過程中。抑制自噬可以有效緩解這一過程，並且對增加發育過程中心肌細胞增殖能力提供了一定的借鑑。為臨床治療心肌梗塞提供思路。