鏈親和素/綠色螢光融合蛋白的製作方法

2023-04-24 18:22:21

專利名稱：鏈親和素/綠色螢光融合蛋白的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程和蛋白質工程領域，具體涉及來源於細菌的鏈親和素 (str印tavidin， SA)和水母的綠色螢光蛋白(green fluorescent protein, GFP)。
背景技術：
綠色螢光蛋白是1962年由下村修等人在一種維多利亞水母中發現的，由238個胺基酸殘 基組成，經490nm波長激發發出綠色螢光。該蛋白最大特點是能在活體生物體內或活細胞中 表達，並能動態觀察被標記目標的分布及代謝情況。因此，GFP己作為分子標籤廣泛應用於 分子及細胞生物學的研究。鏈親和素(SA)是由鏈黴菌產生的非糖基化同源四聚體蛋白，故一個鏈親和素蛋白可結合 四個生物素。它能與生物素緊密非共價結合(Kd-10—15M),結合力是抗原一抗體間作用力的一 千至一百萬倍。由於鏈親和素可與生物素發生快速且幾乎不可逆的強力結合，以及生物素較 容易參入各種生物分子(如蛋白質，核酸和脂多糖)中，即生物素化，故鏈親和素一生物素間 的強力作用早己用於生物醫學的許多領域。本發明將綠色螢光蛋白(GFP)與鏈親和素(SA)連接構建融合蛋白，在大腸桿菌中實現了高 效表達，並經分離、純化和復性後，能得到純度較高且有雙重活性的GFP/SA融合蛋白(即 鏈親和素對生物素(biotin)高效特異的超強結合活性和GFP發射綠色螢光的活性)。該融合蛋 白可高效錨定在靶細胞已生物素化的細胞表面，用於研究其在靶細胞表面的定量結合和代謝 規律。最近，我們為研製新型腫瘤細胞疫苗建立了細胞膜表面錨定修飾技術平臺利用生物 素化試劑將生物素化學交聯到目標腫瘤細胞表面的蛋白質氨基(即-NH。上，再將鏈親和素 與免疫刺激分子構建成的雙功能融合蛋白，通過鏈親和素與生物素高效特異的超強結合，將 免疫刺激分子錨定在目標腫瘤細胞表面，以增強腫瘤疫苗誘導主動免疫反應的能力。因此， GFP/SA雙功能融合蛋白可作為這類新型腫瘤疫苗研究體系的對照系統。我們所採用的pET原核表達載體是最有效的原核表達系統之一，它利用噬菌體T7啟動子 與T7 RNA聚合酶之間作用的高度特異性及高效性使得外源基因在細菌體中的表達效率提高， 表達蛋白以包涵體形式存在，約佔菌體蛋白的20%。 GFP/SA融合蛋白在N-或C-端含有6個 組氨酸的標籤，利用二價陽離子與組氨酸結合的性質，用一步螯合層析即可將表達的蛋白純 度提高至95%。復性後的GFP/SA融合蛋白穩定性較好，可以在-20。C保存半年。發明內容本發明要解決的技術問題是製備綠色螢光蛋白與鏈親和素的雙功能融合蛋白，作為新型 腫瘤細胞疫苗研究體系的對照系統。本發明解決上述技術問題的技術方案是一種融合蛋白，該蛋白由接頭肽連接一鏈親和素蛋白和一綠色螢光蛋白構成，其中所述 的接頭肽的胺基酸序列為Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser。本發明融合蛋白中的鏈親和素位於接頭肽的N端(SEQN0.2)或C端(SEQNO.l)。 本發明融合蛋白可通過將鏈親和素基因、綠色螢光蛋白基因以及連接二者的接頭多核苷 酸通過基因重組、轉化構建工程菌表達獲得，其中基因重組和轉化的方法均為本領域普通技 術人員所熟識的技術。為了便於融合蛋白的分離純化，本發明所述的融合蛋白的鏈親和素部分的末端還可以連 接有純化標籤，如本發明融合蛋白SEQ N0.3的鏈親和素的C端連有組氨酸標籤、本發明融 合蛋白SEQN0.4的鏈親和素的N端連有組氨酸標籤。本發明還提供一種編碼本發明融合蛋白的多核苷酸，該多核苷酸由成熟鏈親和素DNA、 成熟綠色螢光蛋白■通過TCG AGC GGG GGC AGC GGG GGC GGA GGC AGC GGC GGG GGC GGATCC連接而成；該多核苷酸中成熟鏈親和素DNA的末端還可以連接有CAT CAT CAC CAT CAC CAT。將所述的編碼本發明融合蛋白的多核苷酸通過基因重組構建到原核表達載體中，然後轉 化大腸桿菌可獲得高效表達本發明融合蛋白的工程菌；所述的原核表達載體可以是pET24a 或pET24d，宿主菌為大腸桿菌為BL21 (DE3)。本發明融合蛋白在上述工程菌中主要以包涵體的形式存在，從包涵體中分離純化蛋白並 復性處理後，即可獲得本發明融合蛋白。本發明融合蛋白採用富含甘氨酸和絲氨酸的連結肽連接綠色螢光蛋白和鏈親和素，此15 肽非常靈活，有助於融合蛋白中各單元蛋白質分子的獨立摺疊，從而保存各自的生物活性， 使融合蛋白具有鏈親和素和綠色螢光蛋白的雙重活性。鏈親和素和綠色螢光蛋白的雙功能融 合蛋白，通過鏈親和素與生物素的強力結合，可錨定在生物素化的腫瘤細胞表面，且能在y 射線滅活腫瘤細胞表面穩定存在，並仍保持綠色螢光蛋白的活性。


圖1. pET24d-GFP-L-SA-6His重組質粒的結構圖。 圖2. pET24a-6His-SA-L-GFP重組質粒的結構圖。圖3.重組表達質粒pET24d-GFP-L-SA-6His的酶切鑑定圖，.其中第1泳道是分子量標準，第2泳道為Ncol和EcoRI酶切，第3泳道為Ncol和Xhol酶切。 圖4.融合蛋白GFP-L-SA-6His的SDS-PAGE電泳圖，其中1是低分子量蛋白標準，2是未誘導表達菌株，3是用IPTG誘導表達後菌株，4是表達菌破碎後沉澱，5是純化後的峰值蛋白，6是復性後氧化型，7是復性後還原型。 圖5.螢光顯微鏡觀察GFP-L-SA-6His融合蛋白對B16細胞表面的錨定修飾圖，其中A是可見光下，B是螢光下。圖6.流式分析GFP-L-SA-6His融合蛋白對B16細胞的錨定修飾,，其中左峰為未修飾的細胞(陰性對照)，而右峰為錨定修飾的細胞。 圖7.GM-CSF-L-SA-6His融合蛋白錨定的腫瘤疫苗的預防接種組的生存數及生存期顯著高於GFP修飾的陰性對照組。 圖8.GM-CSF-L-SA-6His錨定的腫瘤疫苗治療組的生存數及生存期顯著高於GFP修飾的陰性對照組。下面將通過實施例進一步說明本發明以及本發明具有的技術效果。
具體實施方式
實施實例和實驗所用的材料及設備如下表達菌株E. coli BL21 (DE3)、原核表達質粒pET24a購自Novagen公司；pEGFP質粒購 自Clontech公司；鏈黴菌、小鼠黑色素瘤細胞B16.F10均購自ATCC。 DNeasy組織試劑盒和 質粒DNA的製備試劑盒(Qiagen);寡核苷酸的合成(Sigma); Trizol， Superscript II逆轉 錄酶，dNTP、 IPTG購自Sigma公司；Platinum戶/> DNA聚合酶和T4 DNA連接酶購自 Invitrogen;各種限制性內切酶購自Promega公司；PCR引物訂購自IDT公司；PCR產物純化 試劑盒、凝膠回收試劑盒購自Qiagen公司；Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin購自Pierce公司； Ni-NTA螯合層析填料購自Qiagen公司。DNA片段的連接、轉化及轉化菌株篩選、限制性內切酶分析、SDS-聚丙烯醯胺凝膠點泳 等常規方法均參照文獻(Sambrook J> et aL Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Manual, 3rd edition, 2001)或廠家提供的產品說 明書；DNA序列分析在大連寶生物工程公司的DNA測序服務中心完成。例1. GFP-L-SA-6His融合蛋白的製備1、 以pEGFP質粒為模板，用Platinum DNA聚合酶進行PCR，製備GFP DNA。 引物為5， CATGCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG 3' (30nt)和5， GGAATTCCTTGTACAGCTCGTCCATGC 3， (27nt)反應條件變性94。C， 2min;循環(94°C， lmin — 56°C， lmin — 68°C, 1 min)， 30 輪；延伸68'C， 5分鐘。2、 用DNeasy組織試劑盒從親和素鏈黴菌中抽提出細菌的基因組DNA，然後用其作為模 板，通過Platinum p/V DNA聚合酶進行PCR製備成熟鏈親和素DNA 。引物5' GGAATTCTCAAGCGGGGGCAGCGGGGGCGGAGGCAGCGGCGGGGGCGGATCCGCCGACCCCTCC AAGGACTCGAAGGC 3, (78nt)和5， GTGGTGCTCGAGCTGCTGAACGGCGTCGAGCGGGTTGCC 3' (39nt)。反應條件變性94。C， 2min;循環(94°C， 15s — 60°C， 15s — 68°C， 30s)， 30輪； 延伸68。C， 5min。3、 構建pET24d-GFP-L-SA-6His重組質粒製備的GFP cDNA (不含終止密碼子，兩端分別含Ncol和EcoRI限制性內切酶位點)和 SA DNA (不含終止密碼子，兩端分別含EcoRI和Xhol限制性內切酶位點)，將上述GFP和 SA基因片段克隆於pET24d載體中，獲得pET24d-GFP-L-SA-6His重組表達質粒(結構圖如圖 l所示)。其中L為富含甘氨酸、絲氨酸的連接肽。重組表達質粒經DNA序列分析鑑定，驗證 其正確無誤。4、 構建pET24d-GFP-L-SA-6His/BL21 (DE3)工程菌pET24d-GFP-L-SA-6His重組表達質粒轉化細菌後用含氨苄青黴素的LB平板篩選。隨機 挑單菌落，經IPTG誘導後，用12%SDS-PAGE檢測GFP-L-SA_6His融合蛋白的表達情況。5、 GFP-L-SA-6His融合蛋白的表達挑取高表達的單菌落進行大量培養:將細菌接種於加有卡那黴素(30ug/ml)的LB液體培 養基中，經37°C， 250轉培養擴增至吸光度A卿為0. 4 0. 5時，加入終濃度為0. l咖ol/L 的IPTG， 37'C誘導表達4h，離心收穫菌體稱重，用12呢SDS-PAGE檢測融合蛋白的表達情況。 GFP-L-SA-6His融合蛋白在菌體中主要以包涵體的形式存在，其表達量達15-20%。6、 從包涵體中獲得GFP-L-SA-6His雙功能融合蛋白a.菌體按l : 10重懸於超聲緩衝液(100mmol/L磷酸鈉緩衝液、10mmol/LTris.Cl、pH8.0): 冰浴超聲20sX70次(間隔15s)， 4。C離心收集沉澱即包涵體。包涵體分別用A、 B、 C、 D、 E 液(A: 20mM Tris.HCl， 2mM EDTA ， 0. 5M NaCl， pH=8. 0; B: 20mM Tris.HCl, lOmM EDTA, 2mM 2ME, 0.1% Triton X-100， pH=8. 0; C: 20mM Tris.HCl, 2mM EDTA， 2M尿素，pH=8. 0; D: 20mM Tris.HCl, 2mM EDTA， 50%乙丙醇，pH=8.0; E: 20mM Tris.HCl, pH=8.0。)充分洗滌，每次10tnin。用溶解液(100mmol/L磷酸鈉緩衝液、10腦ol/LTris. Cl、 1,1/L EDTA、8mol/L尿素、0. lmol/L 2-巰基乙醇，pH8. 0)溶解，離心去沉澱。b. Ni-NTA柱層析純化將歩驟a得到的上清液用6M尿素(含2-ME)稀釋一倍上樣於Ni-NTA柱(2. 6X5 cm)，柱用平衡液(100mraol/L磷酸鈉緩衝液，6mol/L尿素，10mmol/L咪 唑pH8.0)先平衡，然後依次用含30、 50、 lOOmmol/L咪唑的平衡液洗脫，收集洗脫峰，12% SDS-PAGE檢測融合蛋白純化情況，收集GFP-L-SA-6His融合蛋白(分子量為44. 3KD)。。c. 透析復性將純化的GFP-L-SA-6His融合蛋白濃度調至0D2s。二0,2，在大於20倍體積 的透析液(50mmol/L磷酸鈉緩衝液，1.0mol/L尿素，lmmol/L還原型穀胱苷肽，0. 2mmol/L 氧化型穀胱苷肽，pH 8.0)中4'C透析復性12小時；然後在PBS中繼續透析6小時；離心除 去不溶物，收集上清除菌保存。d. 2-Iminobiotin親和柱層析用平衡液(50mmol/L NaHC03， 500mmol/L NaCl， pHll)洗脫5個柱體積後(柱體積0. 5X2cm)，將收集的已復性的GFP-L-SA-6His融合蛋白溶液上親和層析柱，並用平衡液洗脫至樣品A，恢復至基線；然後，用50mmol/LNaAc, pH4.0洗脫，分管收集各洗脫峰，並用10x平衡液(500mmol/L NaHC03， 5mol/L NaCl， pH 11)將收集的融合蛋白質液調至pH8.0，並過濾除菌分裝，儲存於一2(TC。所得GFP-L-SA-6His融合蛋白用SDS-PAGE分析鑑定，結果如圖4所示。7、 GFP-L-SA-6His雙功能融合蛋白表面錨定修飾腫瘤細胞的測定傳代培養的B16細胞，胰酶消化，用PBS洗3次，調節細胞濃度1X106，加入Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin使終濃度為0、 lmg/ml,室溫下作用30分鐘;用1XPBS洗漆細胞3次後，每106個B16.F10細胞加入200ng IL2-L-SA-6His或6His-SA-L-IL2融合蛋白，冰上作用30分鐘；1 XPBS洗滌細胞1次後，用 y-射線滅活(20000rad)。然後，分別用螢光顯微鏡觀察和B-D FACScan流式細胞儀檢測。結 果如圖5、 6所示。例2. 6His-SA-L-GFP融合蛋白的製備1、 製備成熟SA DNA:方法與例1同。引物5， GGAATTCCATATGCATCATCACCATCACCATGAGGCCGGCATCACCGGCACCTGG 3' (55nt)CGGGTTGCC 3，(82nt)。2、 製備成熟GFP cDNA:方法與例1同。引物5' GGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG 3'(31nt)和5' CGCCATGGCTTGTACAGCTC GTCCATGC 3， (28nt)3、 構建pET24a-6His-SA-L-GFP重組質粒製備的SA DNA (兩端分別含Ndel和EcoRI限制性內切酶位點)和GFP cDNA (不含終 止碼，兩端分別含EcoRI和HindIII限制性內切酶位點)，將上述SA和GFP基因片段克隆於 pET-24a載體中，獲得pET24a-6His-SA-L-GFP重組表達質粒(結構圖如圖2所示)。其中L 為富含甘氨酸、絲氨酸的連接肽。重組表達質粒經DNA序列分析鑑定，驗證其正確無誤。4、 構建pET24a-6His-SA-L-GFP/BL21 (DE3)工程菌方法與例1同。5、 6His-SA-L-GFP融合蛋白的表達6His_SA-L-GFP融合蛋白在菌體中主要以包涵體的形式 存在，其表達量達20 30%。6、 從包涵體中獲得6His-SA-L-GFP雙功能融合蛋白方法同例1 。7、 6His-SA-L-GFP雙功能融合蛋白表面錨定修飾腫瘤細胞的測定方法同例1。例3.本發明融合蛋白對腫瘤細胞的表面錨定修飾效果及其穩定性檢測經流式細胞儀，對錨定在生物素化的B16. F10表面上的GFP-L-SA-6His或6His-SA-L-GFP 雙功能融合蛋白進行檢測，結果見圖6，幾乎100%的腫瘤細胞被錨定修飾；對錨定在Y-射線 滅活的腫瘤細胞表面的GFP/SA雙功能融合蛋白的穩定性進行分析表明，在一周內這些錨定在 細胞表面的的融合蛋白數量無顯著下降。例4.作為表面錨定修飾的腫瘤細胞疫苗的對照體系。1. 作為表面錨定修飾的腫瘤細胞疫苗預防腫瘤效果的陰性對照分別將106個GFP-L-SA-6His錨定修飾的的B6. F10腫瘤細胞疫苗和GM-CSF-L-SA-6His 錨定修飾的腫瘤細胞疫苗(均經20000rad"r射線滅活)接種於C57BL/6小鼠左肋腹部的皮內， 14天後加強一次；7天後，將105未經任何處理的B6. F10腫瘤細胞接種於小鼠右肋腹部的皮 下，然後觀察腫瘤的生長情況和小鼠在40天內的成活情況。GM-CSF錨定修飾的腫瘤疫苗預 防接種組的生存數及生存期顯著高於GFP錨定修飾的陰性對照組，如圖7所示。2. 作為表面錨定修飾的腫瘤細胞疫苗治療腫瘤效果的陰性對照將10S個未經任何處理的B6.F10腫瘤細胞接種於小鼠右肋腹部的皮下；4, 11和18天後， 分別將106個GFP-L-SA-6His修飾的B6. F10腫瘤細胞疫苗和GM-CSF-L-SA-6His錨定修飾的 B6.F10腫瘤細胞疫苗(均經20000rady-射線滅活)接種於C57BL/6小鼠左肋腹部的皮內，然 後觀察腫瘤的生長情況和小鼠在40天內的成活情況。GM-CSF錨定修飾的腫瘤疫苗治療組的 生存數及生存期顯著高於GFP錨定修飾的陰性對照組，如圖8所示。SEQUENCE LISTING溫州醫學院鏈親和素/綠色螢光蛋白融合蛋白〈160〉 4<210〉 1 412〈212〉 PRT 人工序列〈220〉 CHAIN (1)..(238)綠色螢光蛋白(GFP) 〈220〉<221〉 DOMAIN<222〉 (239)..(253)甘氨酸和絲氨酸的連結肽(L)，此15肽非常靈活，有助於融合蛋白中各單元蛋白質分子的獨立摺疊，從而保存各自的生物活性，最終提高融合蛋白的雙 重活性。〈220> CHAIN (254)..(412)潘驪S勢^3^沐藩^苦洲(SA) 1set Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr G一y Val <al Pro lie Leu Val5 10 5Glu Leu Asp Gly Asp va一 Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu20 25 30oly Glu G一y Asp Ala Thr Tyr G一y Lys Leu Thr Leu Lys Phe lie Cys35 40 45Thr Thr Gly llys廠eu Pro Val Iuro Trp Iuro Thr lieu Val Thr Thr Iuhe50 5^ S3Ser Tyr G一y Val G一n Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys G一n65 70 75 80His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu G_y Tyr <al Gin Glu Arg85 90 95Thr lie Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu <al100 105 110廠ys Phe Glu Gly Asp Thr Leu va一 Asn Arg lie G一u Leu Lys Gly lie115 120 125Asp Phe Lys Glu Asp G一y Asn lie Leu Gly His Lys Leu G一u Tyr Asn130 135 140Tyr Asn Ser His Asn va一 Tyr lie Met Ala Asp Lys G一n Lys Asn Gly145 150 15^ 160lle Lys <al Asn Phe Lys lie Arg His Asn lie Lys Asp Gly Ser va一165 170 175Gin Leu Ala Asp His Tyr Gin G一n Asn Thr Pro lie Gly Asp G一y Iuro180 185 190va一廠eu L.eu Pro Asp Asp- His Tyr廠eu Ser Thr G一n Ser Ala廠eu ser195 200 205Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val210 215 220Thr Ala Ala Gly lie Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ser Ser 225 230 235 240Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Pro Ser 245 250 255Lys Asp Ser Lys Ala Gin Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly lie Thr Gly 260 265 270Thr Trp Tyr Asn Gin Leu Gly Ser Thr Phe lie Val Thr Ala Gly Ala275 280 285Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu290 295 300Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp 305 310 315 320Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr 325 330 335Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gin Tyr Val Gly Gly340 345 350Ala Glu Ala Arg lie Asn Thr Gin Trp Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr355 360 365Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp Thr Phe Thr370 375 380Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser lie Asp Ala Ala Lys Lys Ala Gly 385 390 395 400Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gin Gin405 410 415 2 403 PRT 人工序列<220〉 CHAIN (1)..(147)鏈親和素(SA);與成熟的全長相比，在N-端缺失了 13個胺基酸。 <221〉 DOMAIN (148)..(165) 連接肽(L),並且其3'端含有BamHI和EcoRI的酶切位點。 <221〉 CHAIN<222〉 (166)..(403)綠色螢光蛋白(GFP)。 2Met Glu Ala Gly lie Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gin Leu Gly Ser Thr 5 10 15Phe lie Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu20 25 30Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr35 40 45Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr50 55 60Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp 65 70 75 80Ser Gly Gin Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg lie Asn Thr Gin Trp 85 90 95Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu100 105 110Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser lie115 120 125Asp Ala Ala Lys廠ys Ala Gly Val Asn Asn oly Asn Pro Leu Asp Ala130 135 140va一 G一n oln Ser Ser G一y〇ly Ser〇ly Gly o一y o一y Ser〇ly Gly Gly145 150 155 160G一y Ser Ala Glu Phe Met Ser Lys Gly G一u G一u Leu Phe Thr Gly Val165 170 175<al Pro lie Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys刀he180 185 190Ser Val Ser〇ly Glu o一y OIL-〇ly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu叫hr195 200 205廠eu Lys Phe lie Cys Thr Thr〇ly Lys Leu Pro Val Pro Trp pr.o Thr210 215 220廠eu va一 Thr Thr Iuhe Ser Tyr Gly Val Gin Cys _uhe Ser Arg Tyr Iuro22^ 230 235 2臺Asp His Met Lys Gin His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly245 250 255Tyr va一 Gin Glu Arg Thr lie Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr廠ys260 265 270Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg lie275 280 285Glu Leu Lys Gly lie Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn lie Leu Gly His290 295 300廠ys Leu. Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn va一 Tyr lie Met Ala Asp305 310 315 320廠ys Gin Lys Asn G一y lie Lys Val Asn Phe Lys lie Arg His Asn lie325 330 335廠ys Asp Gly Ser va一 G一n Leu Ala Asp His Tyr G一n Gh Asn Thr _us340 345 350lie Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr
355 360 365
Gin Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val
370 375 380
Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly lie Thr His Gly Met Asp Glu 385 390 395 400
Leu Tyr Lys
405
3 <211〉 420 <212〉 PRT <213〉 人工序列

<221〉 CHAIN (1)..(238)
綠色螢光蛋白(GFP)
DOMAIN (239),.(253)
富含甘氨酸和絲氨酸的連結肽(L),此15肽非常靈活，有助於融合蛋白中各 單元蛋白質分子的獨立摺疊，從而保存各自的生物活性，最終提高融合蛋白 的雙重活性。

CHAIN (254)..(412)<223〉鏈黴菌成熟的全長鏈親和素(SA)。 <220〉
<221〉 PEPTIDE
(415)..(420)
組氨酸標籤 <400〉 3
Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro lie Leu Val 5 10 15
Glu Leu AsP Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu
20 25 30
Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe lie Cys
35 40 45
Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe
50 55 60
Ser Tyr Gly Val Gin Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gin 65 70 75 80
His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gin Glu Arg 85 90 95
Thr lie Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val
100 105 110
Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg lie Glu Leu Lys Gly lie
115 120 125
Asp Phe Ly's Glu Asp Gly Asn lie Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn
130 135 140
Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr lie Met Ala AsP Lys Gin Lys Asn Gly 145 150 155 160
lie Lys Val Asn Phe Lys lie Arg His Asn lie Lys Asp Gly Ser Val 165 170 175Gin Leu Ala Asp His Tyr Gin Gin Asn Thr Pro lie Gly Asp Gly Pro
180 185 190
Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gin Ser Ala Leu Ser
195 200 205
Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val
210 215 220
Thr Ala Ala Gly lie Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ser Ser 225 230 235 240
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Pro Ser 245 250 255
Lys Asp Ser Lys Ala Gin Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly lie Thr Gly
260 265 270
Thr Trp Tyr Asn Gin Leu Gly Ser Thr Phe lie Val Thr Ala Gly Ala
275 280 285
Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu
290 295 300
Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp 305 310 315 320
Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr 325 330 335
Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gin Tyr Val Gly Gly
340 345 350
Ala Glu Ala Arg lie Asn Thr Gin Trp Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr
355 360 365
Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp Thr Phe Thr
370 375 380
Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser lie Asp Ala Ala Lys Lys Ala Gly 385 390 395 400
Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gin Gin Leu Glu His His 405 410 415
His His His His420
<210〉 4
409
<212〉 PRT
人工序列

PEPTIDE
(2)..(7)
<223〉組氨酸標籤
CHAIN
(8)..(153)
<223〉 鏈親和素(SA);與成熟的全長相比，在Nh端缺失了 13個胺基酸。 <220〉
<221〉 DOMAIN
(154)..(171)
<223〉 連接肽(L),並且其3'端含有BamHI和EcoRI的酶切位點。
CHAIN
(172)..(409)
綠色螢光蛋白(GFP)
4Met His His His His His His Glu Ala Gly lie Thr Gly Thr Trp Tyr 5 10 15
Asn Gin Leu Gly Ser Thr Phe lie Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala
20 25 30
Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr
35 40 45
Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly
50 55 60
Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala 65 70 75 80
His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gin Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala 85 90 95
Arg lie Asn Thr Gin Trp Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn
100 105 110
Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys
115 120 125
Pro Ser Ala Ala Ser lie Asp Ala Ala Lys Lys Ala Gly Val Asn Asn
130 135 140
Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gin Gin Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly 145 150 155 '160
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Phe Met Ser Lys Gly Glu 165 170 175
Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro lie Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp
"180 185 190
Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala
195 200 205
Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe ll.e Cys Thr Thr Gly Lys Leu
210 215 220
Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe Ser Tyr Gly Val Gin225 230 235 240
〇ys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gin His Asp Phe Phe廠ys
245 250 255
Ser Ala Met Pro Glu G一y Tyr Val〇h Glu Arg Thr lie Phe Phe Lys
260 265 270
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280
Thr廠eu Val Asn Arg lie Glu廠eu廠ys Gly lie Asp F-he廠ys Glu Asp
290 295 300
Gly Asn lie Leu〇ly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn
305 310 315 320
Val Tyr lie Met Ala Asp Lys Gin Lys Asn Gly lie Lys Val Asn Phe
325 330 335
廣ys lie Arg His Asn lie llys Asp Gly Ser Val Gin廠eu Ala Asp His
340 350
Tyr Gin Gin Asn Thr Pro lie Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp
355 360 365
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370 375 380
Lys Arg Asp His Met va一 Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly lie
381 385 390 395
Thr His G一y Met Asp Glu Leu Tyr Lys
400 40權利要求
1. 一種融合蛋白，該蛋白由接頭肽連接一鏈親和素和一綠色螢光蛋白構成，其中所述的接頭肽的胺基酸序列為Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser。
2. 根據權利要求l所述的一種融合蛋白，其特徵在於所述的鏈親和素位於接頭肽的N端。
3. 根據權利要求2所述的一種融合蛋白，其胺基酸序列為SEQ.N0 2。
4. 根據權利要求1所述的一種融合蛋白，其特徵在於所述的鏈親和素位於接頭肽的C端。
5. 根據權利要求1所述的融合蛋白，其特徵在於所述的的鏈親和素部分的末端連接有純化 標籤。
6. —種基因，該基因編碼權利要求l、 2、 3或4融合蛋白。
7. —種表達載體，該表達載體含有權利要求5所述的基因。
8. —種工程菌，該工程菌轉化了權利要求6所述的表達載體。
9. 權利要求l、 2、 3或4所述的融合蛋白在製備腫瘤疫苗中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種融合蛋白，該蛋白由接頭肽連接一鏈親和素和一綠色螢光蛋白構成，其中所述的接頭肽的胺基酸序列為Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly GlySer。本發明融合蛋白同時具有鏈親和素和綠色螢光蛋白的活性，可通過鏈親和素與生物素的強力結合將綠色螢光蛋白錨定在生物素化的腫瘤細胞表面，且能在γ-射線滅活的腫瘤細胞表面穩定存在，並仍保持綠色螢光蛋白的活性。本發明融合蛋白可用於研究其在靶細胞表面的定量結合和代謝規律，並作為表面修飾的腫瘤細胞疫苗預防和治療腫瘤效果的陰性對照。
文檔編號A61K39/00GK101531720SQ20091000346
公開日2009年9月16日 申請日期2009年1月1日 優先權日2009年1月1日
發明者琳 張, 林來新妹, 華 蘇, 高基民 申請人:溫州醫學院