紅假單胞菌菌株及其在抑制黃瓜霜黴病菌、促進黃瓜生長中的應用的製作方法

2023-12-03 13:09:11

紅假單胞菌菌株及其在抑制黃瓜霜黴病菌、促進黃瓜生長中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種兼性厭氧的紅假單胞菌菌株，其為保藏於中國典型培養物保藏中心、且保藏號為CCTCC?NO：M2012366的菌株。該紅假單胞菌菌株可抑制黃瓜霜黴病菌且促進黃瓜生長，應用時可將光合細菌菌液直接噴施施用或將菌液製備成發酵液後再進行噴施應用，其中光合細菌菌液和光合細菌發酵液的製備方法包括以下步驟：先將紅假單胞菌菌株活化；再將活化培養得到的單菌落接入至血清瓶進行種子培養；然後進行生產培養，獲得光合細菌菌液；將光合細菌菌液進行離心，收集上清液，再經細菌過濾器過濾後得到光合細菌發酵液。本發明具有生產成本低、拮抗效果好、高效、無毒、環保等優點。
【專利說明】紅假單胞菌菌株及其在抑制黃瓜霜黴病菌、促進黃瓜生長
中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種光合細菌及其應用，尤其涉及一種紅假單胞菌菌株及其在抑制黃瓜霜黴病菌以及促進黃瓜生長中的應用。
【背景技術】
[0002]黃瓜霜黴病是影響黃瓜種植的最重要的病害之一，在整個黃瓜生育期，如遇適宜發病條件，無論是露天還是保護地栽培，其浸染、傳播流行速度極快，均能對黃瓜的產量造成嚴重損失。目前，防治黃瓜霜黴病最主要和最有效的措施是採用殺菌劑，然而，由於化學藥劑選擇壓力，單一藥劑或單一類型殺菌劑地不合理使用，極易造成病原菌的抗藥性快速上升，進而導致殺菌劑用量上升，從而可能引起農產品中殺菌劑的超標，過量殺菌劑的投放，其一旦滲透進土壤或地下水層也將汙染生態環境。
[0003]隨著全社會環境保護意識的增強，農藥殘留帶來的農產品安全以及環境汙染問題愈來愈受到關注。然而，從目前農業生產現狀以及農業技術水平來看，殺菌劑仍將繼續使用且使用量還會繼續上升。殺菌劑作為控制作物病害的有效手段，是目前及今後相對較長時期內最主要的技術措施之一。因此，尋找殺菌劑的替代技術和方法，是目前最具有實際應用前景的研究方向。
[0004]生物防治特別是微生物防治研究，是國內外研究作物病害防治的熱點。微生物防治作物病害具有無毒、無汙染的特 點，而且微生物菌劑生產簡便、田間操作與殺菌劑一樣方便。光合細菌是地球上最早出現的具有原始光能合成體系的原核生物，分布廣泛，遍及江河、沼澤、湖泊和海洋等，具有固氮、制氫、固碳、脫硫等作用。光合細菌生命力強，容易培養，生長速度繁殖快，本身無毒，富含蛋白質、維他命、類胡蘿蔔素等。目前已經被廣泛的研究，發現光合細菌在種植、養殖、新能源開發利用以及醫藥方面具有十分廣闊的前景。目前在黃瓜霜黴病防治方面，已有一些較好的微生物資源被挖掘，然而，尚無光合細菌應用於黃瓜霜黴病的報導。

【發明內容】

[0005]本發明要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種生產成本低、拮抗效果好、高效、無毒、環保的紅假單胞菌菌株，還提供該菌株在抑制黃瓜霜黴病菌、促進黃瓜生長中的應用，使其能以環保、高效、低成本、方便快捷的操作實現抑制黃瓜病害的危害，促進黃瓜等蔬菜的生長。
[0006]為解決上述技術問題，本發明提出的技術方案為一種兼性厭氧的紅假單胞菌菌株，所述紅假單胞菌(Rhodopseudomonas sp.)菌株為保藏於中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC)、且保藏號為CCTCC NO:M2012366的菌株(以下簡稱紅假單胞菌CCTCCM2012366)。紅假單胞菌CCTCC M2012366的保藏單位為中國典型培養物保藏中心CCTCC，保藏單位的地址位於中國武漢大學，保藏日期為2012年9月20日，該紅假單胞菌CCTCCM2012366 被命名為紅假單胞菌 S_1 (Rhodopseudomonas sp.S-1)。
[0007]經過我們的檢測，本發明的紅假單胞菌CCTCC M2012366具有以下主要特徵:
[0008]G-，個體形態為杆狀，V-P反應陽性，甲基紅反應陽性，不能利用澱粉，H2S反應陽性，明膠液化陽性，吲哚反應陽性，檸檬酸鹽實驗陰性，脲酶實驗陰性，過氧化氫酶實驗陽性，3%NaCl中能生長，最適生長溫度為30°C~35°C，最適生長pH值為6.5~7.5，菌體的特徵吸收峰為375nm、805nm和865nm,測定的16S rDNA序列長度為1389bp,在Genbank中的登錄號為KC491187。
[0009]滿足上述特徵描述的紅假單胞菌CCTCC M2012366在下述應用中的效果更好。
[0010]作為一個總的技術構思，本發明還提供一種上述的紅假單胞菌CCTCC M2012366在抑制黃瓜霜黴病菌中的應用。
[0011]作為一個總的技術構思，本發明還提供一種上述的紅假單胞菌CCTCC M2012366在促進黃瓜生長中的應用。
[0012]上述的應用中，優選的，將所述紅假單胞菌CCTCC M2012366製備成光合細菌菌液直接噴施應用或將該紅假單胞菌菌株製備成光合細菌發酵液後再進行噴施應用。所述光合細菌菌液及光合細菌發酵液的製備方法包括以下步驟:
[0013](I)活化:將所述 紅假單胞菌CCTCC M2012366的保存種按雙層平板培養法進行培養，培養至紅色單菌落出現；
[0014](2)種子培養:將步驟(1)中培養得到的單菌落接入至血清瓶，用紅假單胞菌菌株種子培養基培養至對數生長期；
[0015](3)生產培養:將步驟(2)培養得到的培養液接入至生產瓶(例如5L的生產瓶，該瓶可以為透明玻璃瓶)中，用紅假單胞菌菌株生產培養基培養至對數生長期得到光合細菌菌液，所述培養液的接入量不少於紅假單胞菌菌株生產培養基總體積的1% ;
[0016](4)光合細菌發酵液製備:將步驟(3)培養得到的光合細菌菌液進行離心，收集離心後的上清液，再經細菌過濾器過濾後得到光合細菌發酵液。
[0017]上述的應用中，所述雙層平板培養法優選是採用雙層PSB固體培養基進行培養，所述雙層PSB固體培養基包含以下質量的成分=K2HPO40.2g、KH2PO40.8g、MgSO40.2g、CaSO4.2H200.lg、NaMoO4.2H200.0033g、FeSO4.7H200.005g、酵母提取粉 L 5g 和瓊脂粉(agar) 13g/18g (雙層平板培養基上層培養基瓊脂粉18g/L、下層培養基瓊脂粉13g/L)、蒸餾水 1L，pH7.0 ~7.2。
[0018]上述的應用中，所述紅假單胞菌菌株種子培養基、紅假單胞菌菌株生產培養基均優選用PSB液體培養基，所述PSB液體培養基包含以下質量的成分=K2HPO40.2g、KH2PO40.8g、MgSO40.2g、CaSO4.2H200.lg、NaMoO4.2H200.0033g、FeSO4.7H200.005g 和酵母提取粉(yeast extract) 1.5g、蒸懼水IL ;所述PSB液體培養基的pH值為7.0~7.2。
[0019]上述的應用中，所述活化、種子培養和生產培養過程中，培養溫度均控制在30°C~
350C，培養pH值為7.0~7.2，光照條件均控制為2000Lx~3000Lx。
[0020]上述的應用中，所述步驟(3)中，培養液的接入量優選為紅假單胞菌菌株生產培養基總體積的1%~3%。
[0021]上述的應用中，所述步驟(4)中，離心時的轉速優選控制在4000rpm~6000rpm,離心時間優選控制在5min~8min。[0022]通過對上述製備方法進行優化，包括對培養基、培養條件及培養工藝參數的優化，能使本發明的紅假單胞菌CCTCC M2012366生長更加迅速，從而縮短生產時間(全流程時間一般僅需24天左右)；工藝成本及產品價格更為低廉，便於農業生產應用中進行推廣；應用方法更為簡便，易於操作，培養結束後，菌體數量可以達到2.0X IO9個/mL以上，培養完成後出瓶可以直接分裝成液體菌劑。
[0023]與現有技術相比，本發明的優點在於:本發明提供了一種生產成本低、高效、無毒、環保的紅假單胞菌CCTCC M2012366，該菌株可通過簡單、快捷、低成本的操作方法製備得到光合細菌菌液和光合細菌發酵液，該菌株菌液和發酵液可促進黃瓜生長，發酵液可高效抑制黃瓜霜黴病菌，應用時不僅操作簡單、方便、工藝成本低，而且具有明顯的防治黃瓜霜黴病效果和促生長效果，為今後黃瓜等蔬菜的種植創造了更加優異的生長環境。
[0024]一種紅假單胞菌菌株(Rhodopseudomonas sp S-1),其保藏單位為中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC)，地址為中國武漢大學，保藏號為CCTCC NO:M2012366，保藏日期為2012年9月24日。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為本發明應用實施例1中各處理組對黃瓜幼苗的累積生物量的影響。
[0026]圖2為本發明應用實施例1中各處理組對黃瓜幼苗根活力的影響。
[0027]圖3為本發明應用實施例1中各處理組對黃瓜幼苗生長素(IAA)含量的影響。
[0028]圖4為本發明應用實施例1中各處理組對黃瓜幼苗過氧化物酶活性的影響。
[0029]圖5為本發明應用實施例1中各處理組對黃瓜幼苗過氧化氫酶活性的影響。
`[0030]圖6為本發明應用實施例2中各組光合細菌發酵液菌劑對黃瓜霜黴病菌的抑制率曲線。
【具體實施方式】
[0031]以下結合說明書附圖和具體優選的實施例對本發明作進一步描述，但並不因此而限制本發明的保護範圍。
[0032]實施例:
[0033]一種本發明的兼性厭氧的紅假單胞菌菌株，其保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NO:M2012366的菌株。該紅假單胞菌CCTCC M2012366被命名為紅假單胞菌 S_1 (Rhodopseudomonas sp.S-1)。
[0034]經過我們的檢測，本實施例的紅假單胞菌CCTCC M2012366具有以下主要特徵:
[0035]G-，個體形態為杆狀，V-P反應陽性，甲基紅反應陽性，不能利用澱粉，H2S反應陽性，明膠液化陽性，吲哚反應陽性，檸檬酸鹽實驗陰性，脲酶實驗陰性，過氧化氫酶實驗陽性，3%NaCl中能生長，最適生長溫度為30°C~35°C，最適生長pH值為6.5~7.5，菌體的特徵吸收峰為375nm、805nm和865nm,測定的16S rDNA序列長度為1389bp,在Genbank中的登錄號為KC491187。
[0036]上述本實施例的紅假單胞菌M2012366主要通過以下方法篩選得到:將採自湖南省植物保護研究所水塘的水樣5.0mL加入到120mL PSB液體培養基中，培養5d~7d後得到深紅色混合菌液，用接種環挑取適量的菌液劃線於PSB雙層平板培養基中，30°C ±2°C，約3000Lx，光照培養5d~7d後，獲得大量深紅色的單菌落；用滅菌牙籤挑取外形規整、光滑且較大的單菌落至PSB液體培養基中富集培養5d~7d獲得深紅色菌液，劃線、挑取單胞富集獲得菌液、重複3次；梯度稀釋法稀釋平板培養法測定最終富集獲得的菌液中菌株的生物量，後續試驗中菌液濃度調整至約2X 109cfu/mL。
[0037]本實施例的紅假單胞菌CCTCC M2012366可用於抑制黃瓜霜黴病菌，還可用於促進黃瓜生長。應用時，先將紅假單胞菌CCTCC M2012366製備成光合細菌發酵液，再進行噴施應用，該光合細菌發酵液的製備方法包括以下步驟:[0038](I)活化:將本實施例的紅假單胞菌CCTCC M2012366的超低溫保存種按雙層平板培養法進行培養，培養溫度控制在30°C~35°C，培養pH值為7.0~7.2，光照條件控制為2000Lx~3000Lx，培養至紅色單菌落出現；該雙層平板培養法是採用雙層PSB固體培養基進行培養，雙層PSB固體培養基包含以下成分=K2HPO40.2g、KH2PO40.8g、MgSO40.2g、CaSO4.2Η200.lg、NaMo04.2Η200.0033g、FeS04.7Η200.005g、酵母提取粉 1.5g和瓊脂 13g/18g(雙層平板培養基上層培養基瓊脂粉18g/L、下層培養基瓊脂粉13g/L)、蒸餾水lL，pH7.0~
7.2 ；
[0039](2)種子培養:將步驟(1)中培養得到的單菌落接入至血清瓶，用紅假單胞菌菌株種子培養基培養至對數生長期；紅假單胞菌菌株種子培養基選用PSB液體培養基，PSB液體培養基包含以下質量的成分=K2HPO40.2g、KH2PO40.8g、MgSO40.2g、CaSO4.2Η200.lg、NaMoO4.2Η200.0033g、FeSO4.7Η200.005g 和酵母提取粉 1.5g、蒸餾水 IL ;所述 PSB 液體培養基的PH值為7.0~7.2 ;培養溫度控制在30°C~35°C，培養pH值為7.0~7.2，光照條件控制為2000Lx~3000Lx ；
[0040](3)生產培養:將步驟(2)培養得到的培養液接入至生產瓶(例如5L的生產瓶，該瓶可以為透明玻璃瓶)中，用紅假單胞菌菌株生產培養基培養至對數生長期，培養液的接入量為紅假單胞菌菌株生產培養基總體積的1% ;紅假單胞菌菌株生產培養基選用PSB液體培養基，PSB液體培養基包含以下質量的成分=K2HPO40.2g、KH2PO40.8g、MgSO40.2g、CaSO4.2H200.lg、NaMoO4.2H200.0033g、FeSO4.7H200.005g 和酵母提取粉 1.5g、蒸餾 IL ;培養溫度控制在30°C~35°C，培養pH值為7.0~7.2，光照條件控制為2000Lx~3000Lx ；
[0041](4)光合細菌發酵液製備:將步驟(3)培養得到的光合細菌菌液進行離心，離心時的轉速控制在6000rpm,離心時間優選控制在5min,收集離心後的上清液,再經細菌過濾器過濾後得到光合細菌發酵液。
[0042]應用實施例1:光合細菌在促進黃瓜苗期生長發育中的應用。
[0043]選用直徑為9cm的滅菌培養皿中加墊6張滅菌濾紙，加入無菌水，無菌水的量以浸透濾紙且能浸沒1/2顆黃瓜種子為宜。將黃瓜種子平鋪於溼潤的紗布上4°C冷藏過夜，打破種子休眠後平鋪於上述培養皿中；置於光照培養箱，25°C, 16h光照，8h黑暗培養，直至種子萌發。種子發芽至幼苗並長至4cm左右時，移栽入水培盒中。水培盒中添入Hoagland 水培營養液，營養液的配方為:Ca(NO3)2945mg/L，KN0360 7mg/L, NH4NO3115mg/L,NH3H2PO3136mg/L, MgS0449 3mg/L,鐵鹽溶液 2.5mL (七水硫酸亞鐵 2.78g，EDTA-2Na3.73g，蒸餾水 500mL，pH5.5)，微量元素 5mL(K10.83mg/L，Η3Β036.2mg/L，MnS0422.3mg/L, ZnS048.6mg/L, NaMoO30.25mg/L, CuSO40.025mg/L, CuCl20.025mg/L), pH:6.0。
[0044]將實施例中製備的光合細菌發酵液加入水培營養液中作為處理C，光合細菌菌液加入水培營養液中作為d處理，另設不加光合細菌發酵液處理的空白水培營養液作為處理a,設PSB液體培養基加入到水培營養液中作為處理b對照，處理濃度為12.5mL/L (具體指的是12.5ml發酵液配IL的營養液，a, b兩個處理是對應C、d處理中發酵液或菌液加入的量添加)。在0d、3d、6d、9d、12d、15d分別測定a、b、c、d四個處理組中黃瓜幼苗的生物量(參見圖1)、根活(參見圖2)、生長素(IAA)(參見圖3)、過氧化物酶活力(參見圖4)、過氧化氫酶活力(參見圖5)等指標，各指標測定重複三次，測定結果分別如圖1~圖5所示。
[0045]由圖1可見，本實施例中的光合細菌發酵液及光合細菌菌液在施用於黃瓜幼苗時，能夠顯著提高黃瓜幼苗的累積生物量。由圖2可見，本實施例中的光合細菌發酵液及光合細菌菌液在施用於黃瓜幼苗時，能夠顯著提升黃瓜幼苗的根活力。由圖3可見，本實施例中的光合細菌發酵液及光合細菌菌液在施用於黃瓜幼苗時，能夠明顯提高黃瓜幼苗中生長素(IAA)的含量。由圖4可見，本實施例中的光合細菌發酵液及光合細菌菌液在施用於黃瓜幼苗時，能夠提高黃瓜幼苗過氧化物酶活性。由圖5可見，本實施例中的光合細菌發酵液及光合細菌菌液在施用於黃瓜幼苗時，能夠提高黃瓜幼苗過氧化氫酶活性。
[0046]應用實施例2:光合細菌發酵液在抑制黃瓜霜黴病中的應用。
[0047]取實施例製備的光合細菌發酵液，等比稀釋成以下梯度的菌劑:稀釋5倍、稀釋10倍、稀釋20倍、稀釋40倍、稀釋80倍。採用聯合國糧食與農業組織FA0( 1982年)推薦的葉盤漂浮法，用移液器將稀釋後的光合細菌發酵液菌劑移至直徑6cm的培養皿中，每皿10mL，空白對照加去離子水；將黃瓜葉盤背面朝上漂浮在培養皿上，用移液器將黃瓜霜黴病的孢子囊懸浮液接種至葉盤中心，IOyL/葉盤，重複試驗3次。然後將各處理組置於20°C溫度下按每天16小時光照和8小時黑暗條件下進行培養，培養IOd~14d，調查各葉盤的發病情況。
[0048]以DPS軟體(vl2.01)計算稀釋倍數對數值與相對防效概率值之間的線性回歸方程及IC5tl等，結果如表1和圖6所示。
[0049]表1:不同稀釋倍數光合細菌發酵液對理黃瓜霜黴病病的抑制率
【權利要求】
1.一種兼性厭氧的紅假單胞菌菌株，其特徵在於:所述紅假單胞菌(Rhodopseudomonas sp.)菌株為保藏於中國典型培養物保藏中心、且保藏號為CCTCC NO:M2012366的菌株。
2.一種如權利要求1所述的紅假單胞菌菌株在抑制黃瓜霜黴病菌中的應用。
3.—種如權利要求1所述的紅假單胞菌菌株在促進黃瓜生長中的應用。
4.根據權利要求2或3所述的應用，其特徵在於，將所述紅假單胞菌菌株製成光合細菌菌液直接噴施應用或將該紅假單胞菌菌株製備成光合細菌發酵液後再進行噴施應用，所述光合細菌菌液及光合細菌發酵液的製備方法包括以下步驟: (1)活化:將所述紅假單胞菌菌株的保存種按雙層平板培養法進行培養，培養至紅色單菌落出現； (2)種子培養:將步驟(1)中培養得到的單菌落接入至血清瓶，用紅假單胞菌菌株種子培養基培養至對數生長期； (3)生產培養:將步驟(2)培養得到的培養液接入至生產瓶中，用紅假單胞菌菌株生產培養基培養至對數生長期得到光合細菌菌液，所述培養液的接入量不少於紅假單胞菌菌株生產培養基總體積的1% ； (4)光合細菌發酵液製備:將步驟(3)培養得到的光合細菌菌液進行離心，收集離心後的上清液，再經細菌過濾器過濾後得到光合細菌發酵液。
5.根據權利要求4所述的應用，其特徵在於:所述雙層平板培養法是採用雙層PSB固體培養基進行培養，所述雙層PSB固體培養基包含以下質量的成分=K2HPO40.2g、KH2PO40.8g、MgSO40.2g、CaSO4.2H200.lg、NaMoO4.2H200.0033g、FeSO4.7H200.005g、酵母提取粉1.5g、瓊脂粉13g/18g、蒸餾水1L，pH7.0~7.2。
6.根據權利要求4所述的應用，其特徵在於:所述紅假單胞菌菌株種子培養基、紅假單胞菌菌株生產培養基均選用PSB液體培養基，所述PSB液體培養基包含以下質量的成分=K2HPO40.2g、KH2PO40.8g、MgSO40.2g、CaSO4.2Η200.lg、NaMoO4.2Η200.0033g、FeSO4.7Η200.005g、酵母提取粉1.5g、蒸餾水IL ;所述PSB液體培養基的pH值為7.0~7.2。
7.根據權利要求4所述應用，其特徵在於:所述活化、種子培養和生產培養過程中，培養溫度均控制在30°C~35°C，光照條件均控制為2000Lx~3000Lx。
8.根據權利要求4所述應用，其特徵在於:所述步驟(3)中，培養液的接入量為紅假單胞菌菌株生產培養基總體積的1%~3%。
9.根據權利要求4所述應用，其特徵在於:所述步驟(4)中，離心時的轉速控制在4000rpm~6000rpm,離心時間控制在5min~8min。
【文檔編號】C12R1/01GK103602622SQ201310660114
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年12月9日 優先權日:2013年12月9日
【發明者】劉勇, 張德詠, 彭靜, 張松柏, 高陽, 張卓, 程菊娥, 譚新球, 成飛雪, 朱春暉, 楊春曉 申請人:湖南省植物保護研究所