一種快速測定飼料添加劑中6種大豆異黃酮的方法與流程

2023-12-02 14:07:26 1

本發明涉及分析化學
技術領域：
，更具體地講，是關於一種快速測定飼料添加劑中6種大豆異黃酮的方法。
背景技術：
：目前，大豆異黃酮作為一種新型高效綠飼料添加劑開始廣泛應用於畜禽業，有劑量小，見效快，無毒性等優點。作為一種植物雌激素，它與哺乳動物雌激素結構相似，具有類雌激素作用。在畜禽飼料中添加適量的大豆異黃酮，能夠增強動物機體免疫力、提高動物繁殖能力和泌乳能力、提高家禽的產蛋性能以及促進生長等生理作用，降低飼料成本。然而，異黃酮類化合物在畜禽飼料中的添加劑量，使用時期及方法會影響畜禽的生理功能甚至引起副作用。由於飼料的主要原料——大豆和豆粕本身含有異黃酮類物質，飼料中異黃酮的含量會直接影響到其添加劑量。因此在使用異黃酮飼料添加劑時應參考飼料的配方和選料，並根據其所起的生物學功能以及動物的種類、性別和生長期的不同酌情添加，以減少其潛在的副作用。為了使大豆異黃酮更好地發揮生物學功能，需要建立檢測飼料中大豆異黃酮主要成分含量的快速分析方法。hplc法具有快速、分離效果好、重複性好、準確度高、以及儀器自動化程度高等優點，已被廣泛應用於大豆異黃酮主要成分含量的的分析檢測。飼料中大豆異黃酮含量檢測的研究進展緩慢，相關報導較少。提供一種方法快速檢測飼料中大豆異黃酮不同組分含量的有效方法，以便更好地為畜禽生產提供指導作用，是目前亟待解決的問題。技術實現要素：發明目的：針對現有技術的不足，申請人經過多次實踐改進，設計了一種快速測定飼料添加劑中6種大豆異黃酮的方法，利用hplc法進行測定，具有快速準確，重複性好的優點，大大節約了測定飼料添加劑產品中6種大豆異黃酮含量的時間。技術方案：為了實現上述發明目的，本發明所採用的技術方案為：一種快速測定飼料添加劑中6種大豆異黃酮的方法，所述6種大豆異黃酮分別為大豆苷(daidzin)、黃豆黃苷(glycitin)、染料木苷(genistin)、大豆苷元(daidzein)、黃豆黃素(glycitein)和染料木素(genistein)。按照下述步驟進行：a、選擇6種大豆異黃酮的標準品如下：黃豆黃素、黃豆黃苷、大豆苷元、大豆苷、染料木素及染料木苷的標準品，本發明中所使用的6種大豆異黃酮的標準品購自上海同田生物技術有限公司。b、標準品配製：分別稱取大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素6種標準品各5mg，4mg，5mg，5mg，4mg，5mg，精確到0.01mg，6種標準品中分別加80％乙醇溶解定容至50ml，100ml，50ml，50ml，100ml和50ml，分別配製成濃度為100mg/l，40mg/l，100mg/l,100mg/l，40mg/l和100mg/l作為標準品母液。c、從步驟b中得到的6種標準品母液中分別稱取大豆苷母液1ml、黃豆黃苷母液2ml、染料木苷母液1ml、大豆苷元母液1ml、黃豆黃素母液2ml和染料木素母液1ml配製成混標，濃度分別為12.5mg/l，10mg/l，12.5mg/l，12.5mg/l，10mg/l和12.5mg/l，作為標準品溶液，供上機用。樣品前處理：精密稱定大豆異黃酮供試品0.1g，精確到0.0001g，加入80％乙醇約80ml，超聲波加熱助溶30min，冷卻後再用80％乙醇定容在100ml容量瓶中，取部分混勻後的溶液，以4000r/min離心5min，取上清液，用0.45μm微孔濾膜過濾即為待測樣品，等待進樣，同一樣品測兩次平行。色譜條件：色譜柱：athena—c18(4.6*150mm,5μm)，流動相a為0.1％乙酸水溶液，流動相b為0.1％乙酸乙腈溶液，流動相採用梯度洗脫程序：0min：90％a+10％b；12.5min：70％a+30％b；17.5min：60％a+40％b；18.5min：100％b；21min：100％b；22.5min：90％a+10％b；26.5min：90％a+10％b；30min：90％a+10％b；流速1ml/min，柱溫40℃，紫外檢測波長254nm；進樣量10μl，運行時間30min。通過外標法進行計算，即可得出樣品溶液中大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的含量。本發明應用於動物飼料添加劑產品中6種大豆異黃酮的檢測。有益效果：本發明與現有技術相比，其有益效果是：1、本發明的採用hplc法，能夠同時測定飼料添加劑產品中包括黃豆黃素、黃豆黃苷、大豆苷元、大豆苷、染料木素、染料木苷在內的6種大豆異黃酮的含量，一次操作分析可以得到多成分數據，節約了分析時間。2、本發明提供的方法測定快速、分離效果好、重複性好、準確度高，適合於工業化生產的大批量樣品檢測。附圖說明圖1為本發明中黃豆黃素、黃豆黃苷、大豆苷元、大豆苷、染料木素、染料木苷的標準品色譜圖。具體實施方式下面通過實施例及效果分析，對本技術方案進行詳細說明，但是本發明的保護範圍不局限於所述實施例。一種快速測定飼料添加劑中6種大豆異黃酮的方法，所述6種大豆異黃酮分別為黃豆黃素、黃豆黃苷、大豆苷元、大豆苷、染料木素及染料木苷。實施例1：(1)選用購自上海同田生物技術有限公司的標準品：黃豆黃素、黃豆黃苷、大豆苷元、大豆苷、染料木素、染料木苷6種標準品。(2)標準品配製：分別稱取大豆苷(daidzin)、黃豆黃苷(glycitin)、染料木苷(genistin)、大豆苷元(daidzein)、黃豆黃素(glycitein)和染料木素(genistein)6種標準品各5mg，4mg，5mg，5mg，4mg，5mg精確到0.01mg，分別加80％乙醇溶解定容至50ml，100ml，50ml，50ml，100ml和50ml。分別配製成濃度為100mg/l，40mg/l，100mg/l,100mg/l，40mg/l和100mg/l作為標準品母液。分別取大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素1ml，2ml，1ml，1ml，2ml，1ml配製成混標，濃度分別為12.5mg/l，10mg/l，12.5mg/l，12.5mg/l，10mg/l和12.5mg/l，作為標準品溶液，供上機用。(3)樣品前處理：精密稱定大豆異黃酮供試品0.1g，精確到0.0001g，加入80％乙醇約80ml，超聲波加熱助溶30min，冷卻後再用80％乙醇定容在100ml容量瓶中。取部分混勻後的溶液，4000r/min離心5min，取上清液，用0.45μm微孔濾膜過濾即為待測樣品，等待進樣。同一樣品測兩次平行。(4)色譜條件：色譜柱：athena—c18(4.6*150mm,5μm)，流動相a為0.1％乙酸水溶液，流動相b為0.1％乙酸乙腈溶液，流動相採用梯度洗脫程序：0min：90％a+10％b；12.5min：70％a+30％b；17.5min：60％a+40％b；18.5min：100％b；21min：100％b；22.5min：90％a+10％b；26.5min：90％a+10％b；30min：90％a+10％b；流速1ml/min，柱溫40℃，紫外檢測波長254nm；進樣量10μl，運行時間30min。如圖1所示，圖1為黃豆黃素、黃豆黃苷、大豆苷元、大豆苷、染料木素、染料木苷的標準品色譜圖。(5)通過外標法進行計算，即可得出飼料添加劑產品中大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的含量，各個組分所佔百分比如表1所示。表1飼料添加劑產品中大豆異黃酮的含量(％)實施例2：測定6種大豆異黃酮的精密度精密度試驗：精密量取配製的標準品溶液試樣，按照實施例1(4)中的色譜條件連續進樣6次，記錄色譜圖峰面積。測得6種大豆異黃酮的精密度如表2所示。種類大豆苷黃豆黃苷染料木苷大豆苷元黃豆黃素染料木素rsd(％)0.160.250.240.300.060.21表26種大豆異黃酮的精密度實施例3：6種大豆異黃酮的線性回歸方程、相關係數、線性範圍線性範圍的考察：精密量取配製的標準品溶液試樣，對標準品濃度進行不同程度的稀釋，記錄色譜圖。以系列濃度標準品溶液中峰面積(y)為縱坐標，濃度x(μg/ml)為橫坐標，進行線性回歸，得到結果如表3所示。表36種大豆異黃酮的線性回歸方程、相關係數、線性範圍實施例4：6種大豆異黃酮含量測定的加標回收率加標回收試驗：取同一批樣品三份，分別配製成供試品溶液。將供試品溶液與標準品溶液分別按照1:1，1:2和2:1的比例進行混合，測得平均回收率在99％～102％，rsd<2.0％，各項平均回收率及rsd數值如表4所示。表46種大豆異黃酮含量測定的加標回收率以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出：對於本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。當前第1頁12