人白細胞介素7在真核宿主中表達的方法

2023-11-01 01:54:57 1

專利名稱：人白細胞介素7在真核宿主中表達的方法
技術領域：
本發明涉及應用重組DNA技術產生基因工程蛋白藥物技術，具體來說涉及 到一種人白細胞介素7 (rhlL-7)在真核宿主中表達的方法。
背景技術：
人白細胞介素7 (human interleukin 7， rhlL-7)是細胞因子白介素蛋白家族中 一個重要的成員，該家族蛋白對調節淋巴細胞發育和存活有重要意義。它首次 被發現是在1988年，A.E. Namen等人在研究小鼠B細胞發育時分離出該細胞 因子，它具有刺激小鼠前B細增殖的功能。隨後一些科學研究發現，注射IL-7 的小鼠體內，T細胞和B細胞的數量都大大增加，並且在IL-7及其受體敲除的 小鼠中表現出淋巴系統發育不正常，因此IL-7在淋巴系統發育過程中其非常重 要的作用。
重組人白細胞介素7是一條羊鏈、含有152個胺基酸的多肽，分子量為 17.4kDa.其N端含有 一段信號肽。雖然白介素7的晶體結構仍然沒有解析出來， 但是根據它與其他蛋白家族成員序列同源性，用計算機模擬出的模型預測出它 與其他細胞因子相似的親水表面和高等電點。
白介素7的受體結構與其他白介素家族蛋白非常相似，但是白介素7在胸 腺和自然T細胞中的功能卻是非常特殊的。它通過一 系列的細胞信號轉導途徑， 例如JAK-STAT， PI3K，以及Src激酶信號通路，參與調節免疫代謝平衡和穩定。 最近，IL-7被證實在維持T細胞的能量代謝中起關鍵作用。它通過激活STAT5 和Akt激酶促進Glutl轉運，從而促進葡萄糖的攝取。由於白介素7的多種功能， 它具有很好的臨床應用價值。目前白介素7已經被用來治療多種疾病，包括免 疫缺陷性疾患和惡性腫瘤，以及在骨髓和器官移植和肺瘤免疫學中都有廣泛的 應用。
隨著對IL-7作用機制以及臨床應用的研究，IL-7的需求量大大增加。目前 市場上主要生產白介素的方法都是在原核宿主大腸軒菌裡表達蛋白，但是一方 面大腸桿菌表達體系非常容易形成不正確摺疊的蛋白容易形成包涵體，從而減 少蛋白的表達量和生物學的活性；另一方面，原核宿主表達可能存在毒性，因此每次表達產物都要經過毒性實驗檢測。

發明內容
本發明的目的是提供一種人白細胞介素7在真核宿主表達的方法，根據該方 法可獲得穩定、高效表達的人白細胞介素7，並保證得到的rhlL-7具有正確的空 間結構和生物學活性。
解決上迷目的的技術方案如下 人白細胞介素7在真核宿主中表達的方法， 真核宿主為畢赤酵母X-33，主要包 括以下步驟
(1) 複製人IL-7基因以人骨髓基質細胞提取總mRNA為模板，先用RT-PCR擴 增出總cDNA，再以該cDNA為模板，用IL-7特異引物擴增出完整rhlL-7基因片 段，所用IL-7特異引物中引入Xho I酶切位點和在末端Xbal酶切位點；回 收PCR產物連接到質粒pMD20-T載體，得質粒rhlL-7/pMD20-T，經過測序確 認為正確表達序列；
(2) 構建真核表達載體將表達栽體pPICZaB和質粒rhlL-7/pMD20-T經過Xhol 和XbaI雙酶後純化回收，並用T4 DNA連接酶於15—17。C連接15 — 17小時， 得重組載體pPICZaB-IL7;
(3) 轉化重組載體到真核酵母宿主中重組載體pPICZaB-IL7用Sacl單酶切線性 化後，用氯化鋰轉化方法轉化入畢赤酵母X-33宿主菌林中；經過抗性篩選得到 陽性克隆；
(4) 酵母宿主中表達rlL-7蛋白挑取含有陽性克隆的畢赤酵母X-33宿主菌林， 用BMGY培養基培養至光密度值〉2.0,離心收集細胞沉澱，用1LBMMY培養 基重懸細胞並加入0.5%甲醇誘導，溫度在26 — 28。C繼續培養4天，每24小時 補充甲醇使其中濃度保持0.5%,大量發酵表達IL-7蛋白，表達出的蛋白分泌在 蜂養基中。
優選地，所述IL-7特異引物為 5'GGCTCGAGATGTTCCATGTTTCTTTT 3' 3，AGTCTAGATCAGTGTTCTTTAGTGCC 5，。
用本發明所迷的表達方法分泌表達的人活性IL-7具有良好的優勢 一方面，它能夠防止宿主菌對表達產物的降解、減輕宿主細胞代謝的負荷以及表達
產物對宿主的毒性作用二是能夠促進分泌蛋白按適當的方式摺疊、恢復其天 然構想和活性；三是畢赤酵母在表達重組蛋白的同時進行適度的糖基化修飾上， 且不會引起超抗原反應，提高使用安全性，也有利於糖基化蛋白的生物活性。 利用酵母載體上的分泌性的a-因子以及IL-7自身的信號肽引導目的基因分泌表 達。用目的蛋白將會大量分泌到培養液中，能夠形成準確的空間結構，從而保 持了IL-7的天然活性；由於不受宿主菌體細胞內蛋白的影響，減少了純化工藝， 提高了回收率；同時酵母細胞結構簡單、生長迅速、易於培養和發酵、生產成 本低、目的蛋白產量高。
本發明改變傳統的用原核宿主大腸桿菌表達IL-7，探索出用真核宿主畢赤 酵母來表達IL-7的方法，既保證了 IL-7生物學活性，又獲得大量穩定的蛋白。


圖1是真核表達載體rhlL-7/pPICZaB構建示意圖2是畢赤酵母表達出的rhlL-7各個時段SDS-PAGE電泳分析示意圖3是畢赤酵母表達出的rhlL-7各個時段Western檢測結果示意圖4是用陽離子親和層析方法(SP-Sepharose)純化目的蛋白結果圖示意圖5是小鼠前B細胞增殖方法rhlL-7生物學活性檢測結果圖示意圖。
具體實施例方式
本發明選用的X-33畢赤酵母林，整合性表達質粒pPICZaB.載體均購自美國 Invritrogen公司。 1.克隆rhlL-7全基因
設計一對引物，以人骨髓基質細胞mRNA逆轉錄所得cDNA為模板進行PCR 擴增，條件為94。C 5min, 94°C 45s, 58°C 45s, 72°C 1 min， 30個循環:72°C 10 min。 所獲得的擴增片斷連接到高效克隆載體pMD20-T(購自於廣州TaKaRa公司)，用 PCR、酶切和核酸序列測定鑑定，測定序列與Genebank公布的IL-7序列一致。 引物序列為
5 ，GGCTCGAGATGTTCCATGTTTCTTTT 加入了 Xho I酶切位點 3，AGTCTAGATCAGTGTTCTTTAGTGCC 加入了 Xba I酶切位點2.構建畢赤酵母分泌型表達栽體rhIL-7/pPICZaB
1) 用Xho I和Xba I雙酶切重組質粒rhlL-7/Pmd20-T，獲得目的片斷rhlL-7,反 應體系如下，所用內切酶和緩衝液均購自大連TaKaRa公司，
質粒rhlL-7/Pmd20-T 15 |il
10 *H buffer 5|xl XhoI 5U XbaI 5U 無菌水 Upto50nl
2) 用Xho I和Xba I雙酶切表達栽體pPICZaB，獲得載體片斷，反應體系如下， 所用內切酶和緩衝液均購自大連TaKaRa公司，
pPICZaB載體 15 pi
10先H buffer 5 pi
XhoI 5U
Xba I 5U 無菌水 Upto50jxl
3) 由1)和2)步所後得目的片斷和載體片斷，DNA凝膠回收試劑盒回收，該 試劑盒購自於大連TaKaRa公司，具體操作按試劑盒說明書進行。構建示意圖見 圖U
4) 回收得到的目的片斷和載體用T4DNA連接酶(購自美國Invitrogen公司) 進行連接反應，目的基因準確的插入到含有a-因子的分泌型載體讀碼框內.反應 體系如下
目的片段 3(il
載體片斷 lul
10 * ligase buffer
T4 ligase 0.5^1
無菌水 4.5ul
總體積
5)轉化重組質粒到畢赤酵母X-33中用Sac I單酶切重組載體rhIL-7/pPICZaB 進行線性化，按照Invitrogen公司操作手冊用氯化鋰轉化的方法將重組栽體轉化到宿主菌X-33中。轉化後用含有100 pg/ml Zeocin抗生素的YPD ( yeast extract peptone dextrose)平板進行篩選陽性克隆。
3.重組表達載體rhIL-7/pPICZaB在宿主菌畢赤酵母X-33中的表達
挑取含有陽性克隆的宿主菌用25ml BMGY培養基培養至光密度值> 2.0， 2500g離心15分鐘收集細胞沉澱，用lLBMMY培養基重懸細胞並加入0.5Q/o甲 醇誘導，溫度在28。C繼續培養4天，每24小時補充甲醇使其中濃度保持0.5%。 每隔12小時取樣檢測，SDS-PAGE電泳結果見圖2,在17kD處有目的蛋白表 達。Western檢測結果見圖3 。培養基配方如下
1. BMGY
蛋白腖 2%
酵母提取物 1%
酵母含氮鹼基 1.34%
生物素 4xl(T5%
葡萄糖 2% 磷酸鉀溶液PH6.0 lOOMm
甘油 1%
2. BMMY
蛋白腖 2%
酵母提取物 1%
酵母含氮鹼基 1.34%
生物素 4xl0'5%
葡萄糖 2% 磷酸鉀溶液PH6.0 lOOMm
甲醇 0.5 %
4. 純化rhlL-7蛋白第4步發酵液5000g離心15分鐘，收集上清，上清用20mM PBS濃縮後過陽離子親和層析柱(SP-Sepharose),用0.2MNaCl和1M PBS洗 脫目的蛋白。純化結果圖見圖4。
5. 純化所得rhlL-7蛋白生物活性檢測96孔細胞培養板中每孔加入2xl05個2E8 細胞(小鼠前B細胞品系，購自於美國ATCC公司)，不同濃度的rhlL-7蛋白
(lpg/ml到100ng/ml)分別加入8個孔，每個濃度3個平行孔。細胞在IMDM培養基(購於美國GIbco公司)48小時培養後每個孔加入10|ilMTT，繼續培養 4小時，之後細胞離心去上清並加入DMSO，震蕩10分鐘，在多孔板酶標儀上 測定570nrn光吸收值，根據數據作圖。IL-7蛋白功能活性檢測結果見圖5 ， 10pg/ml 蛋白就具備了使前B細胞增殖的能力，與天然rML-7生物活性相似，因而具備 很高生物活性。
權利要求
1、人白細胞介素7在真核宿主中表達的方法，其特徵在於真核宿主為畢赤酵母X-33，主要包括以下步驟(1)複製人IL-7基因以人骨髓基質細胞提取總mRNA為模板，先用RT-PCR擴增出總cDNA，再以該cDNA為模板，用IL-7特異引物擴增出完整rhIL-7基因片段，所用IL-7特異引物中引入XhoI酶切位點和在末端XbaI酶切位點；回收PCR產物連接到質粒pMD20-T載體，得質粒rhIL-7/pMD20-T，經過測序確認為正確表達序列；(2)構建真核表達載體將表達載體pPICZαB和質粒rhIL-7/pMD20-T經過XhoI和XbaI雙酶後純化回收，並用T4DNA連接酶於15-17℃連接15-17小時，得重組載體pPICZαB-IL7；(3)轉化重組載體到真核酵母宿主中重組載體pPICZαB-IL7用SacI單酶切線性化後，用氯化鋰轉化方法轉化入畢赤酵母X-33宿主菌株中；經過抗性篩選得到陽性克隆；(4)酵母宿主中表達rIL-7蛋白挑取含有陽性克隆的畢赤酵母X-33宿主菌株，用BMGY培養基培養至光密度值＞2.0，離心收集細胞沉澱，用1L BMMY培養基重懸細胞並加入0.5％甲醇誘導，溫度在26-28℃繼續培養4天，每24小時補充甲醇使其中濃度保持0.5％，大量發酵表達IL-7蛋白，表達出的蛋白分泌在培養基中。
2、 根據權利l所述的方法，其特徵在於所迷IL-7特異引物為 5'GGCTCGAGATGTTCCATGTTTCTTTT 3， 3，AGTCTAGATCAGTGTTCTTTAGTGCC 5，。
全文摘要
本發明公開了一種人白細胞介素7在真核宿主中表達的方法，真核宿主為畢赤酵母X-33，主要包括以下步驟(1)複製人IL-7基因；(2)構建真核表達載體；(3)轉化重組載體到真核酵母宿主中；(4)酵母宿主中表達rIL-7蛋白。本發明改變傳統的用原核宿主大腸桿菌表達IL-7，探索出用真核宿主畢赤酵母來表達IL-7的方法，既保證了IL-7生物學活性，又獲得大量穩定的蛋白。
文檔編號C12N15/81GK101302517SQ20081002627
公開日2008年11月12日 申請日期2008年2月3日 優先權日2008年2月3日
發明者吳東海, 李侍武, 勇 羅, 許愛民, 金守光 申請人:中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院;中國科學技術大學