一種高密度發酵生產人白細胞介素6的方法
2023-05-26 21:10:51
專利名稱：一種高密度發酵生產人白細胞介素6的方法
技術領域：
本發明涉及應用重組DNA技術生產基因工程蛋白藥物技術，具體來說涉及到一種 高密度發酵生產人白細胞介素6(rhlL-6)的方法。
背景技術：
人IL-6是一種分子量約為26kD的糖蛋白。人IL_6基因定位於第七號染色體上， 其mRNA大小為1. 3kb，內有4個內含子，其蛋白質前體由212個胺基酸殘基組成，其中27個 胺基酸是其前導肽，成熟IL-6蛋白由185個胺基酸殘基組成，未經糖基化修飾的蛋白分子 量約為20kDa。 IL-6於1980年被Weissenbach最先發現，命名為b2幹擾素，在隨後的研究 中IL-6不斷被其他人發現並先後命名為雜交瘤/漿細胞瘤生長因子、B細胞生長因子及肝 細胞剌激因子等，直到將這些細胞因子的基因克隆出來後，才將其命名為IL-6。 IL-6家族 包括IL-6、 IL-11、CNTF、LIF、0SM、CT-1、CLC、NPN等。 IL-6是多功能的細胞因子，多種細胞如巨噬細胞、T細胞、B細胞、成纖維細胞、內 皮細胞、腎小球繫膜細胞及若干腫瘤細胞等都可產生IL-6，其對生理和病理的發生發展都 起到重要的調節作用，可誘導免疫細胞的增殖、分化，在活化、增殖的B細胞分化為漿細胞 的過程中起關鍵作用，對機體的天然免疫和獲得性免疫都具有重要的調節作用，具有誘導 肝細胞急性期反應和促進造血幹細胞的分化成熟等作用，也廣泛作用於神經、內分泌和心 血管等系統，是參與機體各種調節的重要細胞因子。1997年，William等利用X射線晶體 衍射分析確定了人IL-6的三維結構，185個胺基酸殘基中的157胺基酸殘基在晶體中的結 構得以確定，IL-6與超家族中的其他成員有相似的結構，即由四個呈拓撲結構的螺旋束組 成，其中A螺旋和B螺旋呈同一走向，而C螺旋和D螺旋與前兩者趨向相反。另外，在四個 螺旋束之外有一個小螺旋-E螺旋，它可能在IL-6/IL-6R/gp130六聚體複合物的形成中參 與IL-6/IL-6R之間的相互作用。 最近研究發現IL-6與腫瘤的發生發展、預後及治療也密切相關。Naugler在 《Science》發表文章報導，肝細胞癌更易發生於男性。給予二乙基亞硝胺可以明顯增加雄 性小鼠IL-6的血清水平，中和IL-6後可以去除肝癌發生的性別差異。二乙基亞硝胺誘導 IL-6的產生是通過Kupffer細胞的信號分子Toll樣受體的適配蛋白MyD88的活化，阻斷 MyD88可以抑制二乙基亞硝胺誘導的肝癌發生。雌激素可以抑制DEN小鼠的Kupf f er細胞產 生IL-6，因此可以應用雌激素控制IL-6的高表達來預防男性肝癌的發生。Monique等報導 在體外腫瘤細胞培養中發現並不是所有的卵巢癌細胞都表達IL-6，但接種到裸鼠後發現所 有的卵巢癌細胞都表達高水平IL-6和IL-6R，且發現IL-6在體外可趨化血管內皮細胞，在 體內可促進新生血管的形成。Dalwadi等報導非小細胞肺癌可以產生環氧化酶(C0X-2)，應 用環氧化酶的siRNA處理的非小細胞肺癌細胞證明環氧化酶能夠誘導IL-6的表達。Wehbe 等在對膽管細胞癌的研究中，應用穩定表達IL-6的腫瘤細胞，發現IL-6可通過降低EGFR 生長調節因子啟動子的甲基化來實現其基因調控以促進膽管細胞癌的發展，且IL-6的高 表達降低了腫瘤細胞對甲基化抑制劑的敏感性。新的研究發現IL-6與腫瘤的發生關係密切，並可用於診斷治療和預後分析。對膽管癌患者，肝細胞癌患者及正常人血清IL-6水平 的研究，發現IL 6的濃度在膽管癌患者，肝細胞癌患者要顯著高於正常人的水平；在對鼻 咽癌的研究中發現，IL-6的水平可作為腫瘤診斷的標誌物，也是判斷預後的指標；腸癌病 人術後IL-6水平越低預後越好。基於對此的研究，人們開始尋求以降低IL-6及其受體的 表達或幹擾、阻斷IL-6信號傳導途徑作為抗腫瘤的一種方法。 IL-6與人的心血管病的發生同樣存在種種聯繫。IL-6通過與其特異性IL-6受 體結合，相互作用並激活信號轉導受體複合gpl30，對心血管系統發揮負性肌力和細胞毒 作用，通過其在白細胞介素家族"核心成員"的作用，對心血管系統發揮炎症反應的級聯效 應，從而參與冠狀動脈粥樣硬化、心肌缺血、心絞痛、缺血再灌注損傷、CHF等疾病的發生與 進展，因此對IL-6及其受體的研究為臨床診斷、治療以及對預後的評價提供了一個理論基 礎。 隨著對白介素6作用機制及臨床應用研究的不斷深入，白介素6作為抗原和藥物 篩選的重要標記，其需求量也大大增加。目前，市場上主要利用大腸桿菌進行表達，其表達 產物通常以包涵體形式存在，要通過變性復性得複雜操作才能得到活性形式的白介素6，從 而減少了活性蛋白的產率；另外，原核表達的白介素6通常以融合蛋白的形式存在，除去融 合的非白介素6片段需要經過複雜且高成本的酶切步驟才能得與天然白介素6-級結構完 全相同的蛋白；第三，原核宿主表達尤其是在大腸桿菌中表達，因為LPS的存在而產生毒素 性，因此往往需要對表達純化產物的毒性進行分析測定；最後，要得到高純度的蛋白往往需 要經過多步純化操作處理，純化的步驟越多，蛋白質的得率就會越低，且更可能導致目標產 物的失活。
發明內容
本發明的目的是提供一種高密度發酵生產人白細胞介素6的方法，根據該方法可 獲得穩定、高效分泌表達人白細胞介素_6的畢赤酵母轉化子並有效純化到該人白細胞介 素-6，可保證利用該方法得到的rhlL-6具有正確的空間結構和生物學活性。
解決上述目的的技術方案如下 —種高密度發酵生產人白細胞介素6的方法，包括以下步驟 (1)複製人IL-6基因以人骨髓基質細胞提取總mRNA為模板，先用RT-PCR擴增總
cDNA，再以該cDNA為模板，用IL-6特異引物擴增出完整人重組IL-6基因片段，所用IL-6
特異引物中引入Xho I酶切位點和在未端引入Not I酶切位點；回收PCR產物連接到質粒
pMD20-T載體，得質粒rhlL-6/pMD20-T，經過測序確定為正確表達序列； (2)構建真核表達載體將表達載體pPICZ a A和質粒rhlL-6/pMD20-T經過Xho
I及NotI雙酶切後純化回收，並利用T4DNA連接酶於16t:連接下12小時，得重組載體
pPICZ a A-IL-6; (3)轉化重組載體到真核酵母宿主中重組載體pPICZ a A_IL_6用Sacl單酶切線 性化後，用電擊轉化法轉入畢赤酵母X-33宿主菌中；經過Zeocin篩選得到陽性克隆，陽性 克隆利用聚合酶鏈式反應得到了驗證； (4)高水平分泌表達酵母轉化子的篩選陽性克隆轉接至含有高濃度Zeocin(優 選濃度為400-600 ii g/mL)的YPD平板，篩選到了高Zeocin抗性的轉化子，高抗性轉化子在BMGY培養基培養至光密度值> 2. 0，離心收集細胞沉澱，用B匪Y培養基重懸細胞並使 其甲醇濃度為1. 0 % ，於誘導後的0h， 24h， 48h， 72h， 96h， 120h時取樣，共誘導120小時，經 SDS-PAGE分析，得到了高水平分泌表達rhlL-6酵母轉化子，在搖瓶條件下的表達情況，該 轉化子表達的rhlL-6超過30mg/mL ; (5)高水平分泌表達酵母轉化子於YPG培養基培養至光密度值> 20，將上述YPG 培養物作為發酵罐的種子菌，按l : 10-20的比例(優選比例為1 : 20)將上述種子菌加 入到含4L基本鹽培養基的14L發酵罐中，30°C ，通壓縮空氣為其提供溶氧，設定發酵罐的溶 氧為30%，溶氧的調節與發酵罐的攪拌子串聯調控，發當基本鹽發生長培養基中的甘油耗 盡時，補加體積百分比為70X的甘油，直到菌體溼重達到350g/L時停止補加甘油，使酵母 菌飢餓30分鐘後，補加甲醇進行誘導表達，共誘導96h ;高水平分泌表達酵母轉化子在發酵 罐中高密度發酵並大量表達； (6)誘導後的酵母轉化子上清液於4t:離心，收集離心後的上清液，利用10%的 PEG8000對上清液中的rhlL-6於4。C過夜沉澱，15000g離心，收穫離心所得的沉澱；所得沉 澱重新溶解到含有20mM Tris-HCl的緩衝液中，經透析後，利用DEAE陰離子交換柱於ATKA -HPLC系統中純化，O-O. 3M NaCl的20mM Tris-Cl (pH 8. 5)緩衝液線性洗脫，收集0D28。 > 50mAU的樣品；收集的樣品利用超濾方法濃縮，濃縮樣品經S印hadex G-75分子篩分離，收 集IL-6目標蛋白，經該方法，最後得到純度達95%以上的重組人IL-6蛋白。
優選地，所述rhlL-6特異引物為 5， -GC CTC GAG AAA AGA GCC CCA GTA CCC CCA GGA G_3，加入了 Xho I酶切位 點 5' -GCG GCC GCT ACA TTT GCC GAA GAG-3'在未端引入Not I酶切位點。
優選地，步驟(5)所述當基本鹽培養基中的甘油耗盡時，補加體積百分比為70% 的甘油的方法是0-8小時補加8mL/小時、9-16小時補加16mL/小時、17小時之後按24mL/ 小時補加，直到菌體溼重達到350g/L時停止補加甘油；進行誘導表達時的甲醇補加方法 是:5mL/h補加12小時，10mL/h補加24h， 15mL/h補加60小時，共誘導96h，以使高密度發 酵生產人白細胞介素6的方法效果更好(高水平分泌表達)。 用本發明所述的高密度發酵生產人白細胞介素6的方法具有顯著的優勢一方 面，它能夠防止宿主菌對表達產物的降解、減輕宿主細胞代謝的負荷以及表達產物對宿主 的毒性作用；二是能夠促進分泌蛋白按適當的方式摺疊、恢復其天然構象和活性；三是畢 赤酵母在表達重組蛋白的同時進行適度的糖基化修飾，且不會引起超抗原反應，提高使用 安全性，也有利於糖基化蛋白的生物活性；四是利用酵母載體上的分泌信號a-因子信號 肽引導目的蛋白的基因分泌表達，目的蛋白會大量分必到培養液中，能夠形成準確的空間 結構，從而保持了 IL-6的天然活性；五是利用發酵罐對其高密度培養並發酵實現了 IL-6 在發酵罐條件下的高水平分泌表達；六是摸索出一條有效純化具有生物活性的人重組白介 素6的方法；七是測定了畢赤酵母表達IL-6的生物活性，測定結果表明畢赤酵母表達的 rhIL-6比某國際知名大公司用大腸桿菌表達的rhIL-6具有更高的生物活性。
本發明改變傳統的用原核大腸桿菌表達IL-6，探索出用真核宿主畢赤酵母在發酵 罐中高密度發酵並高效表達IL-6的方法，既保證了 IL-6的生物學活性，又有效地獲得了大 量穩定蛋白。
圖l，真核表達載體pPICZ a A-IL-6構建示意圖； 圖2，畢赤酵母表達載體pPICZ a A_IL_6電泳分析示意圖； 圖3，搖瓶條件下，畢赤酵母表達的rhIL-6各時段SDS-PAGE電流分析示意圖； 圖4，高密度條件下，畢赤酵母表達rhIL-6各時段SDS-PAGE電流分析示意圖； 圖5，高密度條件下，畢赤酵母表達rhlL-6各時段總蛋白變化曲線圖； 圖6， PEG沉澱後陰離子交換層析方法純化目的蛋白的洗脫曲線圖； 圖7，分子篩純化目的蛋白的洗脫曲線圖和SDS-PAGE結果示意圖； 圖8，各步純化所得樣品的SDS-PAG分析純度； 圖9， IL-6分子量大小的MASS分析； 圖10， IL-6的穩定性驗證； 圖11， rhIL-6生物學活性的結果示意圖。
具體實施例方式
本發明選用畢赤酵母X-33菌株，整合性表達質粒pPICZaA載體均購自美國
Invritrogen公司。 所用培養基配方如下 1)酵母生長培養基(BMGY): 完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白腖，定容到700mL。 12rC蒸氣高壓滅菌 15-20min，冷卻到室溫，加入lOOmL 1M磷酸鉀溶液，lOOml YNB，2mL 500*B， lOOmL 10*GY ; [OO37] 2)酵母誘導培養基(B匪Y) 完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白腖，定容到700mL。 12rC蒸氣高壓滅菌 15-20min，冷卻到室溫，加入lOOmL 1M磷酸鉀溶液，lOOmL YNB， 2mL500*B， 100mL10*M ;
3) YPD培養基 完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白腖，10g葡萄糖，定容到1000mL， 12rC蒸氣高壓 滅菌15-20min。
4)YPG培養基 完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白腖，20g甘油，定容到1000mL， 121°C蒸氣高壓滅
菌15_20min。 5)基本鹽培養基40g/L glycerol, 18g/L K2S04， 14. 9g/L MgS04 7H20，4. 13g/L K0H，27ml/L H3P04， 0. 9g/L CaS04， 12rC蒸氣高壓滅菌15-20min。
6)PTM1微量鹽溶液 6g/L CuS04 5H20，0. 09g/L KI，3g/L MnS04 H20， 0. 02g/L H3B03，24g/L MoNa204 2跳0. 5g/L CoC12，20/L ZnC12，65g/L FeS04 跳0. 2g/L biotin， 5. OmL/L H2S04，0. 22微米細菌過濾器過濾後於fC保存。 —種高密度生產人白細胞介素6(rhIL-6)的方法，主要包括以下步驟
1、克隆rhlL-6全基因
設計一對引物，以人骨髓基質細胞取總mRNA為模板，先用RT-PCR擴增總cDNA，再以該cDNA為模板，用IL-6特異引物擴增出完整人重組IL-6基因片段，PCR條件為95。C預變性，4min，一個熱循環；94。C熱變性30s，55。C褪火30s，72。C延伸45s，28個熱循環；72。C復性10min。所獲得的擴增片斷連接到pMD20-T載體(購自於廣州TAKARA公司)，用PCR，酶切和核酸測序鑑定，測定序列與Genebank公布的IL-6序列一致。
PCR擴增引物為 上遊引物5， -GC CTC GAG AAA AGA GCC CCA GTA CCC CCA GGA G3， (SEQ NO. 1)加入了 Xho I酶切位點 下遊引物:5，-GCG GCC GCT ACA TTT GCC GAA GAG-3' (SEQ NO. 2)在未端引入NotI酶切位點。 2、構建畢赤酵母分泌型表達載體pPICZ a A-IL-6 1)用Xho I和Not I雙酶切重組質粒rhIL-6/pMD20-T，獲得目的片斷rhIL_6，反
應體系如下(所用內切酶及緩衝液均購自大連TAKARA公司)質粒rhIL-6/pMD20-T 15yL 10XH緩衝液 5iiL Xho I 5U Not I 5U 無菌水 至50 ii L 2)用Xho I和Not I雙酶切pPICZ a A，獲得載體片斷，反應體系如下(所用內切
酶及緩衝液均購自大連TAKARA公司) 質粒pPICZaA 15iiL 10XH緩衝液 5iiL Xho I 5U Not I 5U 無菌水 至50 ii L 3)由1)及2)步後所得目的片斷和載體片斷，DNA凝膠收回試劑盒回收，該試劑盒
購自大連TAKARA公司，具體操作按試劑盒說明書進行。構建示意圖見圖1。 4)回收得到的目的片斷和載體用T4DNA連接酶(購自大連TAKARA公司)進行連
接反應，目的基因準確插入到含有分泌信號a-因子的分泌型載體讀碼框內，反應體系如
下 質粒pPICZ a A片段 1 ii L 目的片段落 3 ii L 10X緩衝液 liiL
T4連接酶 0. 5iiL 無菌水 至10 ii L 得重組載體pPICZa A-IL-6。
3、轉化重組質粒至畢赤酵母X-33中 將5-10 ii g經Xho I和Not I雙酶切pPICZ a A驗證的質粒(電泳結果如圖2所示)線性化後(SacI)溶解在5-10iiL MilliQ水中，與80iiLX-33菌感受態混均，轉至0. 2cm冰預冷的電轉化杯中；按照Invitrogen公司操作手冊電轉化法將重組載體轉化到宿主畢赤酵母菌X-33中。轉化後用含有100ii g/mL Zeocin抗生素的YPD(Yeast extract p印tonedextrose)平板進行篩選，利用PCR對轉化子進行了驗證。
4、高水平分泌表達酵母轉化子的篩選 經PCR驗證的畢赤酵母轉化子(陽性克隆)劃線接種至含有500 g/mL Zeocin抗生素的YPD平板，篩選高抗性的轉化子，高抗性轉化子以BMGY培養基培養至光密度值>12.0，離心收集細胞，用B匪Y培養基重懸細胞並使其甲醇濃度為1.0%，誘導120小時後，經SDS-PAGE分析，得到了高水平分泌表達rhlL-6酵母轉化子，搖瓶條件下，該轉化子表達的rhlL-6超過30mg/L且分泌的雜蛋白含量較低；搖瓶條件下，誘導96小時左右，rhlL-6的表達量達到最高值，再延長誘導的時間會導致表達量的下降；
5、重組表達載體pPICZ a A-IL-6在畢赤酵母X-33中的少量表達
挑取高水平分泌表達的酵母轉化子單菌落，接種至裝有50mL YPD液體培養基的250mL三角瓶中，28-30。C，250-300rpm，培養至菌體0D6。。 = 12-15，取上述菌液，接種500mLBMGY培養基的2， OOOmL搖瓶中，每瓶接種5mL，於28_30°C ， 250rpm培養至0D6。。 = 12-15 ;室溫下1， 500g離心5min，收集菌體，用1/5到1/10原培養體積的B匪Y重懸菌體；每24h向培養基中添加100%甲醇至終濃度為1. 0% ;每24小時取樣，SDS-PAGE檢測分析，SDS-PAGE電泳結果如圖3所示，在21kD處有目的蛋白表達。
6、rhlL-6在發酵罐中的大量表達 高水平分泌表達酵母轉化子於YPG培養基培養至光密度值> 20，將上述YPG培養物作為發酵罐的種子菌，按l : 20的比例將上述種子菌加入到含4L基本鹽培養基的14L發酵罐中，3(TC，通壓縮空氣為其提供溶氧，設定發酵罐的溶氧為30%，溶氧的調節與發酵罐的攪拌子串聯調控，發當基本鹽發生長培養基中的甘油耗盡時，補加體積百分比為70%的甘油(700mL甘油，288mL水，12mL PTM1微量元素溶液)，補加甘油的方法是0_8小時補加8mL/小時、9-16小時補加16mL/小時、17小時之後按24mL/小時補加，當菌體溼重達350g/L時停止甘油的補加；飢餓酵母菌30分鐘後，補加甲醇進行誘導表達，共誘導96h，誘導階段的甲醇補加方法是5mL/h補加12小時，10mL/h補加24h， 15mL/h補加60小時，；補加甲醇後每12小時取樣一次，SDS-PAGE檢測分析和測定總蛋白含量。SDS-PAGE電泳結果如圖4所示，在21kD處有目的蛋白表達，發酵上清的總蛋白隨誘導時間變化的曲線如圖5所示。
7、rhlL-6的純化 高水平分泌表達酵母轉化子在發酵罐中高密度發酵並大量表達，誘導上清液於4t:離心，收集離心後的上清液，利用10%的PEG8000對上清液中的該rhlL-6於fC過夜沉澱，15000g離心，收穫離心所得的沉澱；所得沉澱重新溶解到含有20mM Tris-HCl (pH8. 5)的緩衝液中，經透析後，所得溶液上樣至DEAE陰離子交換層析柱於ATKA-HPLC系統中純化，用含有0. 1NaCl的20mM Tris-HCl (pH8. 5)漂洗DEAE離子交換層析柱，最後，利用0. 15-0. 3MNaCl的20mM Tris-HCl (pH8. 5)對DEAE離子交換層析柱進行洗脫(洗脫曲線如圖6所示)，收集0D28。 > 50mAU的樣品，洗脫所得到的含IL-6的溶液經超濾濃縮後，利用S印hadex G-75柱子進行分子篩純化(洗脫曲線如圖7所示)，純化樣品經SDS-PAGE分析表明，該方法可以得到高純度的rhlL-6(圖8所示)，以MASS分析表明，該蛋白分子量大小為20908. 85Da，與預測分子量大小一致(圖9所示)。
8、 rhIL-6的穩定性分析 純化得到的rhIL-6於PBS中，置4"C存放3周；同時，將同一次分子篩純化的樣品於PBS，按1 : 4的比例加入5承SDS-PAGE上樣緩衝液，將樣品凍存於中-8(TC存放3周；3周後，4。C存放的純化的rhlL-6樣品按1 : 4的比例加入5*SDS_PAGE上樣緩衝液，與-80。C存放3周的樣品經熱變性後SDS-PAGE分析，檢測4°C PBS緩衝液中純化的rhIL_6的穩定性(SDS-PAGE結果如圖10所示)。
9、 rhIL-6蛋白的活性分析 純化所得rhIL-6蛋白活性的檢測取成年BALB/c小鼠一隻，脫頸處死，於75%消毒酒精中浸泡數分種；部開小鼠腹腔，取其脾臟；在200目不鏽剛網篩上將脾臟剪碎，用注射器頭輕輕摩擦，用1640培養基將淋巴細胞衝洗下來，收集含淋巴細胞的1640溶液，300g離心3min，得下層細胞；1640培養基重懸細胞，並利用紅細胞裂解液裂解紅細胞；同上離心，收集下層細胞，1640培養基重懸細胞；含細胞的1640培養基加到含有35% Percoll分離液的離心管中；400g，15min離心，收集下層淋巴細胞，並利用1640培養基洗滌和離心兩次；所得淋巴細胞用含10%胎牛血清的1640培養基稀釋細胞至5X10s細胞/mL ;將上述細胞加入至96孔培養板中，每孔加100ii L微升；將IL-6加入各孔中，使終濃度分別為200ng/mL、 100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、 10ng/mL、5ng/mL、 lng/mL、0. 2ng/mL禾口 0. lng/mL，同時，按上述濃度加入購買得到的大腸桿菌表達系統表達的人重組IL-6作為對照，每個濃度分別設三個重複孔；將細胞於37t:含5XC02的細胞培養箱中，培養60h，每孔加入10iiL 5mg/mLMTT溶液，於培養箱中再培養4h ;96孔培養板，800g，離心10min，小心吸取上清，向各孔中加入100ii L二甲亞碸，於37t:溫育15min ;酶標儀上測定570nm和630nm的吸光值，用570nm所得吸光值減去630nm所得的吸光值。所測結果表明，酵母表達的IL-6具有生物學活性，且酵母表達IL-6的活性較大腸桿菌表達的IL-6要好(結果如圖11所示)。
權利要求
一種高密度發酵生產人白細胞介素6的方法，其特徵在於真核宿主為畢赤酵母菌X-33，主要包括以下步驟(1)複製人IL-6基因以人骨髓基質細胞提取總mRNA為模板，先用RT-PCR擴增總cDNA，再以該cDNA為模板，用IL-6特異引物擴增出完整人重組IL-6基因片段，所用IL-6特異引物中引入Xho I酶切位點和在未端引入NotI酶切位點；回收PCR產物連接到質粒pMD20-T載體，得質粒rhIL-6/pMD20-T，經過測序確定為正確表達序列；(2)構建真核表達載體將表達載體pPICZαA和質粒rhIL-6/pMD20-T經過Xho I及NotI雙酶切並純化回收，並利用T4DNA連接酶連接，得重組載體pPICZαA-IL-6；(3)轉化重組載體到真核酵母宿主中重組載體pPICZαA-IL-6用SacI單酶切線性化後，用電擊轉化法轉入畢赤酵母X-33宿主菌中；經過Zeocin篩選得到陽性克隆；(4)高水平分泌表達酵母轉化子的篩選陽性克隆轉接至含有400-600μg/mL Zeocin的YPD平板，篩選到了高Zeocin抗性的轉化子，高抗性轉化子以BMGY培養基培養至光密度值＞12.0，離心收集細胞，用BMMY培養基重懸細胞並使其甲醇濃度為1.0％，誘導120小時後，經SDS-PAGE分析，得到了高水平分泌表達rhIL-6酵母轉化子，搖瓶條件下，該轉化子表達的rhIL-6超過30mg/L且分泌的雜蛋白含量較低；(5)高水平分泌表達酵母轉化子於YPG培養基培養至光密度值＞20，將上述YPG培養物作為發酵罐的種子菌，按種子菌與基本鹽培養基的體積比為1∶10-20的比例將上述種子菌加入到含基本鹽培養基的14L發酵罐中，30±1℃，通壓縮無菌空氣為其提供溶氧，設定發酵罐的溶氧為30％，當基本鹽培養基中的甘油耗盡時，補加體積百分比為70％的甘油，當菌體溼重達到350g/L時停止補加甘油，使酵母菌飢餓30分鐘後，補加甲醇進行誘導表達，共誘導96h；高水平分泌表達酵母轉化子在發酵罐中高密度發酵並大量表達；(6)誘導後的酵母轉化子上清液，利用10％PEG-8000沉澱，沉澱蛋白溶於緩衝液中，經透析後，利用DEAE陰離子交換柱於ATKA-HPLC系統中純化，0-0.3M NaCl的20mM Tris-Cl緩衝液線性洗脫，收集的樣品利用超濾方法濃縮，濃縮樣品經Sephadex G-75分子篩分離，收集IL-6目標蛋白，最後得到純度達95％以上的重組人IL-6蛋白。
2. 根據權利要求1所述的高密度發酵生產人白細胞介素6的方法，其特徵是所述 IL-6特異引物為5' -GC CTC GAG AAAAGA GCC CCA GTA CCC CCA GGA G3， 5' -GCG GCC GCT ACA TTT GCC GAA GAG_3，。
3. 根據權利要求1所述的高密度發酵生產人白細胞介素6的方法，其特徵是步驟(4) 中所述Zeocin的濃度為500 ii g/mL。
4. 根據權利要求1所述的高密度發酵生產人白細胞介素6的方法，其特徵是步驟(5) 所述種子菌與基本鹽培養基的體積比為1 : 20。
5. 根據權利要求1所述的高密度發酵生產人白細胞介素6的方法，其特徵是步驟(5) 所述當基本鹽培養基中的甘油耗盡時，補加體積百分比為70%的甘油的方法是0-8小時 補加8mL/小時、9-16小時補加16mL/小時、17小時之後按24mL/小時補加，直到菌體溼重達 到350g/L時停止補加甘油；所述進行誘導表達時的甲醇補加方法是5mL/h補加12小時， 10mL/h補加24h， 15mL/h補加60小時，共誘導96h。
6. 根據權利要求l-5任一項所述的高密度發酵生產人白細胞介素6的方法，其特徵是所述步驟(6)為誘導上清液於4t:離心，收集離心後的上清液，利用10X的PEG8000對上 清液中的rhlL-6於4t:過夜沉澱，15000g離心，收穫離心所得的沉澱；所得沉澱重新溶解到 含有20mM Tris-HCl的緩衝液中，經透析後，利用DEAE陰離子交換柱於ATKA-HPLC系統中 純化，O-O. 3M NaCl的20mM Tris-Cl緩衝液線性洗脫，收集OD， > 50mAU的樣品；收集的樣 品利用超濾方法濃縮，濃縮樣品經S印hadex G-75分子篩分離，收集IL-6目標蛋白，最後得 到純度達95%以上的重組人IL-6蛋白。
全文摘要
本發明公開了一種高密度發酵生產人白細胞介素6的方法，真核宿主為畢赤酵母X-33，主要包括以下步驟(1)複製人IL-6基因；(2)構建真核表達載體；(3)轉化重組載體到真核酵母宿主中；(4)通過篩選，得到高水平分泌表達的酵母轉化子；(5)利用14L發酵罐，實現了人IL-6蛋白在發酵罐中高密度生長培養並實現高效分泌表達，培養物上清經PEG沉澱、DEAE陰離子交換和G-75分子篩分離，三步法，得到了純度達95％以上的重組人IL-6蛋白。本發明改變了傳統的用原核宿主大腸桿菌表達IL-6，探索出用真核宿主畢赤酵母在發酵罐中高密度培養來大量表達IL-6的方法，獲得了高純度的重組人IL-6蛋白，本方法既保證了IL-6的生物學活性，又獲得了大量穩定的蛋白。
文檔編號C07K1/18GK101736009SQ20091019411
公開日2010年6月16日 申請日期2009年11月24日 優先權日2009年11月24日
發明者吳東海, 徐愛民, 李侍武, 李洪波, 汪玉, 金守光 申請人:中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院