天冬氨酸激酶iii突變體及其宿主細胞和應用的製作方法
2023-11-30 15:45:11 1
天冬氨酸激酶iii突變體及其宿主細胞和應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供一種天冬氨酸激酶，所述天冬氨酸激酶的胺基酸序列在對應於SEQ?ID?NO:2所示胺基酸序列的第340位的胺基酸殘基為非天冬氨酸。本發明的天冬氨酸激酶能高效解除L-賴氨酸的反饋抑制，並且能有效用於生產L-賴氨酸。本發明還提供包含編碼所述天冬氨酸激酶的基因的宿主細胞以及利用所述宿主細胞或天冬氨酸激酶產生L-賴氨酸的方法。本發明的天冬氨酸激酶或包含本發明天冬氨酸激酶的宿主細胞還用於產生L-蘇氨酸、L-甲硫氨酸、L-異亮氨酸或L-纈氨酸。本發明還提供利用所述天冬氨酸激酶或宿主細胞產生L-天冬氨醯-4-基磷酸的方法。
【專利說明】天冬氨酸激酶111突變體及其宿主細胞和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】。具體地說，本發明涉及天冬氨酸激酶III (簡稱AKIII，又稱LysC)的突變體及其應用。
【背景技術】
[0002]L-賴氨酸是人類和動物營養中最重要的必需胺基酸，在食品工業、養殖業和飼料工業中有著十分重要的地位。近年來，其市場需求穩步增加，世界市場銷售量已經突破百萬噸規模。目前，賴氨酸主要採用微生物發酵法來生產。
[0003]在許多微生物中L-賴氨酸的合成途徑是以天冬氨酸為前體的，包括兩步和甲硫氨酸和蘇氨酸等胺基酸共用的步驟。在大腸桿菌中，L-賴氨酸生物合成途徑經過九步的酶催化過程(如下式所示)。其中，天冬氨酸激酶催化賴氨酸生物合成的第一步反應，是賴氨酸生產的限速步驟，它的活力決定著代謝流流向L-賴氨酸合成途徑的比例。在大腸桿菌中有三個天冬氨酸激酶，分別命名為天冬氨酸激酶I (AK I，由thrA基因編碼)、天冬氨酸激酶IKAK II，由metL基因編碼)、天冬氨酸激酶III (AK III，由IysC基因編碼，其編碼基因的核苷酸序列如SEQ IDN0:1所示，其胺基酸序列如SEQ ID NO: 2所示)。AK I和AK II是雙功能酶，都還具有高絲氨酸脫氫酶活性。AK I在酶活性水平受到蘇氨酸和賴氨酸的反饋抑制，AK III在酶活性水平受終產物賴氨酸的反饋抑制(Bearer CF, Neet KE ；Stadtman, E.R., Cohen, G.N., LeBras, G., Robichon-Szulmajster, H.(1961)."Feed-back Inhibitionand Repression of Aspartokinase Activity in Escherichia coli and Saccharomycescerevisiae.〃J.Biol.Chem.)。AK II在酶活水平不受天冬氨酸家族胺基酸的反饋抑制但是受到轉錄水平嚴謹調控(X D`ong, PJ Quinn, X Wang.(2011).「Metabolic engineeringof Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum for the production ofL-threonine.，』Biotechnology advances)D
[0004]
【權利要求】
1.一種天冬氨酸激酶，其特徵在於，所述天冬氨酸激酶的胺基酸序列在對應於SEQ IDN0:2所示胺基酸序列的第340位的胺基酸殘基為非天冬氨酸。
2.編碼權利要求1所述天冬氨酸激酶的基因。
3.包含權利要求2所述編碼基因的載體。
4.一種宿主細胞，其特徵在於，所述宿主細胞含有權利要求2所述編碼基因。
5.權利要求4所述宿主細胞在生產L-胺基酸中的應用。
6.一種製備L-胺基酸的方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟: a.培養權利要求4所述的宿主細胞，使之產生L-胺基酸；和 b.從培養液中分離L-胺基酸。
7.權利要求1所述天冬氨酸激酶在生產L-胺基酸中的應用。
8.如權利要求5-7所述的應用或方法，其特徵在於，所述的L-胺基酸為L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-甲硫氨酸、L-異亮氨酸或L-纈氨酸。
9.一種製備L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-甲硫氨酸、L-異亮氨酸或L-纈氨酸方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟: a.利用權利要求1所述的天冬氨酸激酶(EC2.7.2.4)，催化從L-天冬氨酸生成L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-甲硫氨酸、L-異亮氨酸或L-纈氨酸過程中的以下反應，進而獲得L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-甲硫氨酸、L-異亮氨酸或L-纈氨酸，
10.製備權利要求1所述天冬氨酸激酶的方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟: a.改造SEQID N0:2所示胺基酸序列的編碼序列，使得編碼的胺基酸序列中對應於SEQID N0:2所示胺基酸序列的第340位的胺基酸殘基突變為非天冬氨酸； b.將a得到的編碼序列直接轉染合適的宿主細胞或經載體引入合適的宿主細胞； c.培養b得到的宿主細胞； d.從步驟c得到的培養體系中分離所述宿主細胞產生的天冬氨酸激酶；和 e.測定所述天冬氨酸激酶解除賴氨酸反饋抑制的能力。
11.改造野生型天冬氨酸激酶使之解除賴氨酸反饋抑制的方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟: a.將野生型天冬氨酸激酶的胺基酸序列與SEQID N0:2所示胺基酸序列作比對；和 b.改造所述野生型天冬氨酸激酶的編碼序列，使得編碼的胺基酸序列中對應於SEQIDN0:2所示胺基酸序列的第340位的胺基酸殘基突變為非天冬氨酸； c.將b得到的編碼序列直接轉染合適的宿主細胞或經載體引入合適的宿主細胞； d.培養c得到的宿主細胞； e.從步驟d得到的培養體系中分離所述宿主細胞產生的天冬氨酸激酶；和 f.測定所述天冬氨酸激酶解除賴氨酸反饋抑制的能力。
【文檔編號】C12N15/54GK103773745SQ201210398902
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年10月18日 優先權日:2012年10月18日
【發明者】嶽國君, 孫際賓, 鄭平, 劉嬌, 李慶剛, 夏令和, 周永生, 羅虎, 周勇, 滿雲, 盧宗梅, 馬延和 申請人:中糧生物化學（安徽）股份有限公司, 天津工業生物技術研究所