鐵螯合劑及其用途的製作方法

2023-11-11 13:24:22 2

專利名稱：鐵螯合劑及其用途的製作方法
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本發明涉及能螯合鐵並且在定位(adress)或治療鐵超載(iron-overload)方面有用的化合物。
為了理解Fe在細胞增殖中的作用和Fe螯合劑作為有效的抗腫瘤藥的可能用途，描述這種金屬離子如何在正常細胞和腫瘤細胞中被運輸和代謝很重要。這在D.R.Richardson的題為「Potentialof Iron Chelators as Effective Anti-proliferativeAgents(鐵螯合劑作為有效的抗增殖藥的潛力)」的綜述文章中得到了詳細的描述，這篇文章於1997年出版於Can J.Physiol.Pharmacol.75 1164-80，該文獻引入本文作參考。
本文還參考D.R.Richardson在Leukaemia andLymphoma，1998，31 47-60中報導的「Analogues ofPyridoxal Isonicotinoyl Hydrazone(PIH)as PotentialIron Chelators for the Treatment of Neoplastia(吡哆醛異煙醯腙(PIH)類似物作為有效的鐵螯合劑用於治療腫瘤)」，該文獻引入本文作參考，以下討論大部分取自該文獻。
Fe在血漿中的運輸通過結合兩個原子Fe(III)的糖蛋白運鐵蛋白(Tf)進行。運鐵蛋白通過結合到細胞膜上的特異性Tf受體(TfR)上而將其攜帶的Fe給予細胞。一旦結合到TfR上，Tf-TfR複合物就被內化在胞吞小泡中，通過血管內(intravescular)pH降至5.5而將Fe從該蛋白釋放。除了特異性受體介導的從Tf攝取Fe的過程之外，還報導了在大鼠肝細胞、人肝癌細胞和人黑素瘤細胞中符合非特異性吸附胞飲作用的另一過程。一旦Fe從Tf上釋放，它便尚未被表徵的特異性膜轉運蛋白結合。最近，已經識別了此後一蛋白的可能選擇物，即基因Nramp2的產物。該分子已被稱為二價陽離子轉運蛋白1(DCT1)，在從腸吸收Fe和Fe被運輸通過內體膜中均可能涉及之。一旦Fe被運輸通過該膜，其接著進入尚未良好表徵的稱為細胞內Fe庫的區室。對該庫的特性爭議很大，其可能由檸檬酸、胺基酸和核苷酸的低MTFe複合物組成，或者Fe可能結合於高MT大分子。試驗表明，該庫由含有Fe的分子組成，其中Fe處於Fe(II)和Fe(III)氧化態。在一些細胞，如發育中的紅細胞(erythroid)前體中，低MT重量Fe庫僅代表細胞中Fe總量的很少一部分，而在其它細胞類型，如Chang細胞中，其可能代表存在的Fe總量的相當部分。該庫中的鐵可以用於摻入含Fe蛋白，如細胞色素和Fe-S蛋白，當過量時，Fe可以摻入Fe貯存蛋白鐵蛋白中。
許多研究已詳細闡述了Fe在細胞增殖中所起的作用。例如，在沒有Fe時，核苷酸還原酶不能產生脫氧核苷酸，這對細胞周期有深刻影響，導致G1/S停滯，這可能導致編程性細胞死亡。癌細胞表達非常高水平的運鐵蛋白受體(TfR)，表明它們需要大量Fe。事實上，在體內，一些腫瘤細胞類型以與產生血紅蛋白的細胞如網織紅細胞相似的速率從Tf攝取Fe。所關心的是，在腫瘤細胞增殖期間，宿主可能抑制Fe，這在何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤中被發現，其中帶有Fe的Tf的飽和度顯著下降。後一現象被稱為亞鐵轉變(hypoferremic shift)，其被認為是阻礙腫瘤細胞生長的生理學反應。TfR在Fe吸收和細胞增殖中的重要性通過以下事實得到證明，即阻斷Tf結合到TfR上的單克隆抗體42/6也抑制腫瘤生長。
腫瘤細胞對Fe螯合作用敏感的證據來自體外細胞培養實驗，以及體內臨床試驗，其中用於治療鐵超載的螯合劑，去鐵敏(DFO)和其它Fe螯合劑有效地抑制增殖。證明DFO的顯著療效的最有意義的報導之一來自在患有成神經細胞瘤(NB)的患者中進行的研究。在後一試驗中，以8小時靜脈輸注給藥的DFO導致9個患者中的7個在腫瘤細胞的骨浸潤方面有大於50％的下降。而且，據報導在1個患者中腫瘤大小下降了48％。在最近的研究中，將DFO與細胞毒性藥(環磷醯胺、表鬼臼毒吡喃葡糖苷、硫化三磷和卡鉑)聯合用於治療III期和IV期NB患者。根據對57例患者的研究，24例有完全有效，5例非常好地部分有效，21例部分有效，3例略微有效，4例有疾病發展(progressive disease)。
現已確定目前臨床使用的藥物DFO非常昂貴，口服無效，且需要長時間皮下輸注(12-24小時/天，5-7天/周)以顯著影響Fe代謝(Olivieri等，1997，Blood 89 739-61；Richardson等，1998，Am.J.Hematol.，58 299-305)。對口服有效且經濟的Fe螯合劑的需求被deferiprone(也稱為L1或1，2-二甲基-3-羥基吡啶-4-酮)不能成功地螯合Fe-超載患者中的Fe(Olivieri等，1998，New Eng.J.Med.337 417-23)的事實得到強調。事實上，用後一藥物治療患者導致肝纖維樣變性和肝Fe水平的增加。
一組重要的在體外和體內都表現出高的Fe螯合功效的螯合劑是在上面的Richardson等，1998中提到的那些吡哆醛異煙醯腙(PIH)類配體。如在上面的Richardson等，1989和Vitolo等，1990，Inorg.Chim.Acta 733 39-50中所報導，這些螯合劑對Fe(III)具有很高的親合力和特異性，其親合力和特異性類似於DFO，並且遠優於乙二胺四乙酸(EDTA)。另外，如Richardson等，1989，J.Lab Clin.Med.131 306-15中所討論，這些配體通過簡單的一步席夫鹼縮合反應合成，它們經濟且口服有效。有趣的是，PIH能夠從線粒體螯合Fe，線粒體是可能在神經變性疾病遺傳性共濟失調中成為負載Fe的部位(Babcock等，1997，Science 276 1709-12；Foury等，1997，FEBS Lett.411373-7；Rotig等，1997，Nature Genetics 12 215-7)。
以前的研究已經表徵了PIH類似物的生物學和化學性質，其中一些PIH類似物表現出在摩爾基礎上比其母體化合物更高的活性。這些化合物衍生自三組芳醛，即吡哆醛、水楊醛和2-羥基-1-萘甲醛。通常，衍生自吡哆醛的螯合劑具有高螯合功效，但具有低抗增殖活性，而衍生自2-羥基-1-萘甲醛的螯合劑具有高Fe螯合功效和有效的抗增殖活性。因此，衍生自吡哆醛的芳醯腙被認為作為治療Fe超載疾病的藥物可能有用，而衍生自2-羥基-1-萘甲醛的螯合劑被認為對治療癌症有更好的效果。應注意，許多其它Fe螯合劑也顯示抗增殖活性，包括DFO。實際上，已報導了當DFO用於抗兒科腫瘤成神經細胞瘤時該藥物的一些最效的作用。在Cory等，1995，Adv.Enzyme Regul.，35 55-68和Liu等，1995，Prog.Med.Chem.，32 1-35中，公開了衍生自2-吡啶甲醛和氨基硫脲的密切相關的一組螯合劑(例如3-氨基吡啶-2-甲醛縮氨基硫脲)，其被發現為至今鑑定的最有效的核苷酸還原酶抑制劑之一。然而，發現這些螯合劑，儘管具有高抗增殖性質，但僅具有中等螯合功效和中等親脂性，這使這些螯合劑在治療Fe超載疾病方面並不很有效。
遺傳性共濟失調(FA)是嚴重的神經變性症狀。在97％的患者中，該疾病是由於FRDA基因的內含子1中GAA三聯體重複擴展，導致其表達顯著降低。由該基因編碼的蛋白被稱為frataxin，它在線粒體中被發現。在過去幾年中，已積累了證據提示frataxin在線粒體Fe代謝中起作用。使用酵母細胞的研究顯示，由線粒體Fe的累積導致的同源基因(YFH1)缺失引起線粒體DNA、含有[Fe-S]簇的酶和呼吸作用的損失。類似於人FRDA基因，YFH1編碼線粒體蛋白(Yfh1p)。當YFH1被再引入回酵母時，線粒體Fe輸出進入細胞溶膠，提示「線粒體Fe循環」。
與失效酵母模型一致，注意到出現在FA患者心臟中的線粒體DNA、複合物I、複合物II/III和順烏頭酸酶的減少，該觀察與線粒體損傷相符。另外，報導了在與線粒體位置相符的模型中，FA患者的心臟、肝和脾中Fe沉積增加。提出人的FA病理學是由線粒體Fe超載引起的這一項工作得到了證明Fe在心肌原纖維、缺損心肌和骨骼肌線粒體呼吸，和血紅素生物合成途徑中的幹擾中沉積的這一項工作的強有力的支持。
由於FA病理學與線粒體Fe超載有關，所以基於這些結果的新治療方法可為FA患者提供希望。一種策略是使用能滲透線粒體的特異性Fe螯合劑。由National Institute of Health(國家健康協會)贊助的試驗已經在研究臨床使用的Fe螯合劑去鐵敏(DFO)治療FA患者的用途。然而，DFO不能有效地移動(mobilize)細胞Fe，以前的研究已經證明它在移動網織紅細胞中負載Fe的線粒體的Fe方面無效。
與DFO相反，另一個被稱為吡哆醛異煙醯腙(PIH)的螯合劑在移動網織紅細胞中線粒體Fe超載的實驗模型的Fe方面顯示出高活性。多種體外、體內和臨床試驗研究已證明PIH及其類似物在治療Fe超載疾病方面具有潛力。
雖然已進行許多工作來開發Fe螯合劑以用於藥物應用，但仍需要新的安全有效的螯合劑。本發明的發明者現在開發了適用於治療Fe超載疾病的新的Fe螯合劑。本發明的發明者已經合成了被稱為 2-吡啶甲醛異煙醯腙(2-pyridylcarboxaldehydeisonicotinoyl hydrazone，PCIH)類似物的一組新的配體。幾種PCIH類似物在移動神經上皮瘤細胞系(SK-N-MC)的Fe方面比DFO或PIH具有更高的活性，並且表現出低的抗增殖活性。
優選地，R1是疏水性的芳基或雜環基。更優選地，R1是任選地在環上任一空位連接有烷基、滷素、硝基、胺和羥基的苯基、吡啶、呋喃或噻吩環。更優選地，R1是苯甲醯基、滷代苯甲醯基、間溴苯甲醯基、異煙醯基，或噻吩基。
本發明的發明者已發現當R1本質是親水性的時，該類似物水的溶性更好，但是螯合劑在移動Fe方面顯示較差的功效。由於已製備了多種具有不同的R1基的類似物，所以本發明包括一系列具有不同R1基的類似物。
更優選地，該類似物選自2-吡啶甲醛間溴苯甲醯腙(PCBBH)、2-吡啶甲醛2-噻吩羧基腙(PCTH)。
2-吡啶甲醛間溴苯甲醯腙(PCBBH)的Br取代基可以被其它任何滷素基團取代。
在第二方面，本發明提供適於用作體內鐵螯合劑的藥物組合物，該組合物包含治療有效量的具有分子式1的2-吡啶甲醛異煙醯腙(PCIH)類似物，它們的異構體或它們的鹽，以及藥學適用的載體或稀釋劑， 其中R1是芳基或雜環，且R2是H或OH；。
優選地，R1是疏水性的芳基或雜環基。更優選地，R1是任選地在環上任一空位連接有烷基、滷素、硝基、胺和羥基的苯基、吡啶、呋喃或噻吩環。在一種優選的形式中，R1是苯甲醯基、滷代苯甲醯基、間溴苯甲醯基、異煙醯基，或噻吩基。
優選地，該類似物選自化合物2-吡啶甲醛異煙醯腙(PCIH)、2-吡啶甲醛2-噻吩羧基腙(PCTH)、2-吡啶甲醛苯甲醯腙(PCBH)、2-吡啶甲醛間溴苯甲醯腙(PCBBH)。
2-吡啶甲醛間溴苯甲醯腙(PCBBH)的Br取代基可以被其它任何滷素基團取代。
在一個實施方案中，載體是可口服給予的載體。優選地，該藥物組合物是配方為腸溶包衣的顆粒劑或膠囊劑的劑量形式。
優選地，該藥物組合物進一步含有適當的緩衝劑以將患者或個體胃部pH調節至使酸水解最小化的水平。對於本文的活性化合物，包括游離鹼和鹽酸鹽而言，該pH應為約6-8(更優選為約7)。更優選地，緩衝劑為磷酸-檸檬酸緩衝劑。
術語「給予治療有效量」意指包括將類似物給予或施用於生物體的方法，該方法使該類似物表現其預期的治療功能。類似物的治療有效量將根據許多因素變化，如個體的疾病類型、年齡、性別、體重，以及類似物在個體的細胞中螯合鐵的能力。可以調節劑量以提供最優治療效果。例如，可以每日給予幾個分開的劑量或者可以根據治療情況緊急需要而按比例減少劑量。
該類似物可以以常規方式給予，如注射(皮下注射、靜脈注射等)、口服給予、吸入、經皮施用，或直腸給予。取決於給藥途徑，類似物可以用物質包衣以防止該類似物受酶、酸和其它可能使該類似物螯合劑滅活的天然條件的破壞。
類似物也可以非胃腸或腹膜內給予。可以在甘油、液態聚乙二醇和它們的混合物以及在油中製備分散體。在常規貯存和使用條件下，這些製劑可以含有防腐劑以防止微生物生長。
適於注射用的藥物組合物包括無菌水溶液(水溶性藥物)或用於無菌注射溶液或分散體臨時製劑的分散體和無菌粉末。在這些情況下，該組合物必須無菌並且必須具有一定的流動性以使其容易注射。它在生產和貯存條件下必須穩定並且必須在沒有微生物如細菌和真菌汙染作用的條件下保存。載體可為溶劑或含有例如水、醇、多元醇(例如、甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)的分散體介質，它們的適當的混合物，以及植物油。可以通過，例如，使用包衣如卵磷脂，通過在分散情況下維持所需的顆粒大小和通過使用表面活性劑維持適當的流動性。可以通過各種抗菌劑和抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯類、氯代丁醇、酚、抗壞血酸、乙基汞硫代水楊酸鈉等實現防止微生物作用。在許多情況下，優選在組合物中包含等滲劑，例如糖、多元醇如甘露糖醇、山梨糖醇、氯化鈉。可注射的組合物的延長的吸收可以通過在組合物中包含延遲吸收的試劑實現，例如單硬脂酸鋁和明膠。
可以通過將所需劑量的類似物摻入到含有上面列舉的一種或幾種成分的適當溶劑中，根據需要，接著過濾滅菌而製備無菌注射溶液。通常，通過將類似物摻入到含有基本分散介質和所需的選自上面列舉的其它成分的無菌載體中而製備分散體。
該類似物可以口服給予，例如和惰性稀釋劑或可同化的可食用載體一起給予。可以將該類似物和其它成分包入硬或軟殼明膠膠囊中，壓成片劑，或直接摻入個體的飲食中。為了口服治療給藥，可以將該類似物摻入賦形劑並以可吞咽(ingestible)片劑、口含(buccal)片、錠劑、膠囊劑、酏劑、懸浮劑、糖漿劑、糯米紙囊劑(wafer)等的形式使用。這種組合物和製劑應至少含有1％(重量)的活性化合物。組合物和製劑的百分比當然可以變化並可以方便地在單位重量的約5％至約80％單位之間。在這種治療用組合物中該類似物的量是獲得適當劑量的量。
片劑、錠劑、丸劑、膠囊劑等還可以含有下列物質粘合劑如gragacanth樹膠、阿拉伯樹膠、玉米澱粉或明膠；賦形劑如磷酸二鈣；崩解劑如玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、藻酸等；潤滑劑如硬脂酸鎂；以及甜味劑如蔗糖、乳糖或糖精或矯味劑如薄荷、冬青油，或櫻桃香精。當劑量單位形式是膠囊時，除了以上類型的物質之外，其還可以含有液體載體。各種其它物質可以作為包衣存在或者修飾劑量單位的物理形式。例如，片劑、丸劑，或膠囊可以用紫膠、糖或以上兩者包衣。糖漿劑或酏劑可以含有類似物、作為甜味劑的蔗糖、作為防腐劑的對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯、染料和矯味劑如櫻桃香精或橙香精(orange flavor)。當然，在製備任何劑量單位形式中所使用的任何物質均應為藥物純並且在所採用的量下基本上無毒。另外，可以將該類似物摻入緩釋製劑和配方中。
術語「藥學可接受的載體」意為包括溶劑、分散介質、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和延遲吸收劑等。這種介質和試劑用於藥物活性物質在本領域是公知的。除非常規介質或試劑與該類似物不相容，它們在治療組合物和治療方法中的用途均可以考慮。輔助活性物質也可以摻入本發明的組合物中。為了方便給藥和有利於劑量的均一性，將劑量單位形式配方成非胃腸給予的組合物尤為有利。本文中所用的劑量單位形式指適於作為單位劑量給予的物理上分立的單位；各單位含有經計算以產生所需療效的預定量的類似物和所需的藥物載體。本發明的新的劑量單位形式的規格由以下(a)和(b)規定並取決與(a)和(b)，(a)該類似物的獨特性質和要實現的特定療效，(b)本領域中固有的配製這種用於治療個體中與鐵相關的疾病或鐵超載疾病的類似物的限制。為了方便並有效地給藥，將有效量的主要類似物和適當的藥學可接受的載體混合在可接受的劑量單位中。在組合物含有輔助活性成分的情況下，參考所述成分的通常給藥劑量和給藥方式確定其劑量。
優選地，該藥物組合物以30-500mg/kg患者體重的劑量給予。更優選地，劑量為50-100mg/kg體重。
在第三方面，本發明提供鐵螯合治療方法，所述方法包括將本發明第二方面的藥物組合物給予患者。
在第四方面，本發明提供治療個體的鐵超載疾病的方法，所述方法包括將本發明第二方面的藥物組合物給予患者。
在一個實施方案中，鐵超載疾病是β-地中海貧血。在另一個實施方案中，該疾病是遺傳性共濟失調。
在第五方面，本發明提供本發明的第一或第二方面的2-吡啶甲醛異煙醯腙(PCIH)類似物在生產用於治療鐵超載疾病的藥物中的用途。
考慮到在體內和體外均具有高Fe螯合效率的PIH類配體的高潛力，本發明的發明者合成了許多芳醯腙以鑑定Fe比去鐵敏(DFO)更有效並且比PIH類螯合劑溶解性更好的螯合劑。這些化合物屬於被稱為2-吡啶甲醛異煙醯腙(PCIH)類似物的一系列新的三齒螯合劑。已經研究了這些螯合劑的Fe螯合功效和抗增殖活性，包括它們對基因(WAF1和GADD45)表達的影響，已知所述基因在介導G1/S細胞周期停滯方面重要。在所合成的螯合劑中，三種類似物，即2-吡啶甲醛苯甲醯腙(PCBH)、2-吡啶甲醛間溴苯甲醯腙(PCBBH)和2-吡啶甲醛2-噻吩羧基腙(PCTH)顯示高於PIH的Fe螯合活性。這些配體在移動細胞59Fe和阻止從59Fe-運鐵蛋白攝取59Fe方面非常有效，並導致鐵調節蛋白(IRP)的RNA結合活性顯著增加。與細胞毒性Fe螯合劑2-羥基-1-萘甲醛異煙醯腙(311)相比，這些配體對細胞生長和3H-胸腺嘧啶脫氧核苷、3H-亮氨酸或3H-尿嘧啶核苷摻入的影響小得多。另外，與顯著增加WAF1和GADD45 mRNA表達的311相比，PCBH和PCTH沒有任何影響，而PCBBH增加GADD45 mRNA的表達。總而言之，本結果證明了這些配體中的幾種作為用於治療Fe超載疾病的藥物的潛力。
在這些特定的化合物中，已發現PCTH、PCBH和PCBBH具有用作治療Fe超載的藥物的潛力。
如果需要，該組合物還應含有適當的緩衝劑以將患者或個體胃部pH調節至使酸水解最小化的水平。對於本文的活性化合物，包括游離鹼和鹽酸鹽而言，該pH應為約6-8(更優選為約7)。
眾所周知，這種緩衝劑包括一種或多種成分，列於UAPharmacopoeia XXII中的那些，具體地舉例，如磷酸的銨鹽、鉀鹽和/或鈉鹽，連同檸檬酸。使用藥學可接受的抗酸劑，如氫氧化鋁和/或氫氧化鎂或碳酸鈣或甘氨酸USP/NF，足以中和200-600ml胃液中正常存在的0.1M HCl(20至60meq鹼)。磷酸-檸檬酸緩衝劑的pH6.8的具體實例是9.1ml 0.1M檸檬酸與40.9ml0.2M磷酸氫二鈉溶液混合。
測定本發明的螯合劑的生物效率可以根據Brittenham，1990年4月2日，Seminar in haematology 27 112-116或US5834492中所描述的方法進行，這兩篇文獻均引入本文做參考。
用US 5834492中描述的配方可以將本發明的活性化合物製成腸溶包衣顆粒劑配方。例如，將藥物與充足的乙醇混合，使之成為微溼稠的糊狀物，將其進一步與providone混合，並以層狀包衣機械施加於規定篩目大小的球形載體上。如果需要，載體本身通常是藥理學惰性的，但是也可以使用活性載體。球形基質可以是耐酸的生物相容的聚合物。其實例是聚碳酸酯、聚乙烯、聚四氟乙烯、微晶纖維素或其它塑料。也可以使用其它生物相容的聚合物。
將腸溶聚合物和增塑劑在乙醇中混合形成溶液，將該溶液小心噴到載體上形成膜，該膜覆蓋在活性藥物上並使之免於在不利於最佳吸收的環境pH中過早溶解。產品隨後機械乾燥同時保持腸溶包衣的均一性。
在整個說明書中，除非上下文另外需要，詞語「包括」或者其變體「包含」被理解為意指包括所述元素、整數或步驟，或元素組、整數組或步驟組，但不排除任何其它元素、整數或步驟，或元素組、整數組或步驟組。
本文中已有技術的任何描述並非認可該文獻是在澳大利亞內相關技術的共有一般知識的一部分。
為了使本發明能更清楚地被理解，參考以下實施例和附圖對優選形式進行描述。
圖2.DFO、311、PIH或PCIH類似物對(A)從預標記的SK-N-MC細胞釋放59Fe，和(B)SK-N-MC細胞從59Fe-運鐵蛋白(59Fe-Tf)攝取59Fe的影響。(A)用59Fe-Tf(0.75μM)將SK-N-MC神經上皮瘤細胞在37℃標記3小時，洗滌，並接著在只存在培養基(對照)或存在含有DFO(100μM)或其它螯合劑(50μM)的培養基中在37℃再培養3小時。(B)將SK-N-MC細胞在含有59Fe-Tf(0.75μM)和DFO(100μM)或其它螯合劑(50μM)的培養基中培養3小時，洗滌，並接著在4℃與鏈黴蛋白酶(1mg/ml)一起培養30分鐘。結果表示為所進行的兩次試驗中的典型試驗的3次平行測定的平均值±SD。
圖3.螯合劑濃度對(A)從預標記的SK-N-MC細胞釋放鐵，和(B)SK-N-MC細胞從59Fe-運鐵蛋白(59Fe-Tf)攝取59Fe的影響。(A)用59Fe-Tf(0.75μM)將SK-N-MC神經上皮瘤細胞在37℃標記3小時，洗滌，並接著在螯合劑(0.5-50μM)的存在下在37℃再培養3小時。(B)將SK-N-MC細胞在含有59Fe-Tf(0.75μM)和螯合劑(0.5-50μM)的培養基中培養3小時，洗滌，並接著在4℃與鏈黴蛋白酶(1mq/ml)一起培養30分鐘。結果表達為所進行的兩次試驗中的典型試驗的3次平行測定的平均值。
圖4.螯合劑濃度對SK-N-MC神經上皮瘤細胞增殖的影響。將細胞在37℃在存在和不存在螯合劑(0-50μM)的情況下培養90小時。該培養後，通過MTT分析測定細胞密度。數據點代表所進行的兩次試驗中的典型試驗的4次平行測定的平均值。
圖5.螯合劑對SK-N-MC神經上皮瘤細胞中鐵調節蛋白(IRP)RNA結合活性的影響。將細胞僅和培養基(對照)，或者和檸檬酸鐵銨(FAC100μg/ml)、DFO(100μM)或其它螯合劑(25μM)一起培養20小時。所示結果是所進行的兩次試驗中的典型試驗。
圖6.螯合劑對SK-N-MC神經上皮瘤細胞中GADD45、WAF1和β-肌動蛋白的mRNA水平的影響。在將細胞僅和培養基(對照)，或者和含有檸檬酸鐵銨(FAC100μg/ml)、DFO(100μM)或其它螯合劑(25μM)的培養基一起培養20小時後，從細胞中萃取出所有的RNA。接著將分離的RNA在1.2％瓊脂糖-甲醛凝膠上電泳，轉移到雜交膜上，並在高度嚴格的條件下用探針探測。所示結果是所進行的三次試驗的典型試驗。
圖7.和Fe螯合劑一起再培養的時間對負載59Fe的網織紅細胞的Fe移動的影響。在血紅素合成抑制劑，琥珀醯丙酮(1mM)的存在下用59Fe-運鐵蛋白(3.75μM)標記細胞，所述抑制劑在37℃和細胞一起培養1小時。接著將59Fe標記的網織紅細胞和螯合劑(200μM)一起在37℃培養15-240分鐘。結果是所進行的三次試驗的典型試驗的平均值±SD(3次測定)。
圖8.和Fe螯合劑一起再培養的時間對網織紅細胞中醇溶性59Fe百分比的影響。如圖7所述處理細胞，用冰冷的水溶解59Fe標記的網織紅細胞來測定醇溶性59Fe的百分比。用冰冷的95％乙醇沉澱蛋白，並通過離心分離可溶和不可溶部分(詳見方法)。結果是所進行的三次試驗的典型試驗的平均值±SD(3次測定)。
圖9.螯合劑濃度對負載59Fe的網織紅細胞的59Fe移動的影響。將細胞在血紅素合成抑制劑，琥珀醯丙酮(1mM)的存在下用59Fe-運鐵蛋白(3.75μM)標記，所述抑制劑和細胞一起在37℃培養1小時。接著將59Fe標記的網織紅細胞和螯合劑(10-200μM)一起在37℃培養15-240分鐘。結果是所進行的三次試驗的典型試驗的平均值±SD(3次測定)。
具體實施例方式
試驗鐵螯合劑的合成及其用於在培養物中篩選的製劑通過2-吡啶甲醛和相應的酸醯肼間的席夫鹼縮合合成本發明的PCIH類似物。通過元素分析、紅外光譜、1H-NMR光譜和X-射線晶體學的組合表徵螯合劑。根據以前在Richardson等，1995中描述的方法合成並表徵PIH和PIH類似物2-羥基-1-萘甲醛異煙醯腙(311)。去鐵敏(去鐵敏甲磺酸鹽；DFO)購自CibaGeigyPharmaceutical Co.，Summit，NJ。在試驗前將所有的芳醯腙螯合劑溶於二甲亞碸(DMSO)中形成10mM貯備液，接著在10％胎牛血清(FCS；Commonwealth Serum Laboratories，墨爾本，澳大利亞)中稀釋使DMSO的終濃度等於或小於0.5％(v/v)。稀釋後，劇烈混合溶液以確保全部溶解。本發明的發明者以前的研究已經證明該濃度的DMSO對細胞增殖、預標記細胞的59Fe釋放或細胞從Tf轉移59Fe的能力均沒有影響(Richardson等，1995)。游離鹼的合成所有螯合劑都是通過將10mmol酸醯肼和2-吡啶甲醛(或者為獲得FIH而用2-糠醛和異煙酸醯肼)在50％乙醇水溶液(40ml)中回流30分鐘而製備的。冷卻後，通過過濾收集產品，用乙醚洗滌並在真空保幹器中乾燥。收率通常為70-80％。鹽酸鹽的合成將各游離鹼樣品(0.25g)溶解在乙醇(15ml)中。攪拌下加入濃鹽酸(1ml)，接著加入乙醚(40ml)以獲得鹽酸鹽沉澱。過濾化合物並在真空保幹器中乾燥。細胞培養物人SK-N-MC神經上皮瘤細胞和SK-Mel-28惡性黑素瘤細胞系來自美國典型培養物保藏中心(ATCC)，羅克韋爾，馬裡蘭州，美國。SK-N-MC細胞系最初被分類為成神經細胞瘤，但是最近被重新分類為神經上皮瘤，一種緊密相關的神經外胚層惡性腫瘤。BE-2成神經細胞瘤細胞是昆士蘭州的Queensland Institute ofMedical Research的Greg Anderson博士贈送的。SK-N-MC和SK-Mel-28細胞系在Eagle′s修飾的最小必須培養基(minimum essential medium，MEM；Gibco BRL，雪梨，澳大利亞)中生長，所述培養基含有10％FCS、1％(v/v)非必需胺基酸(Gibco)、2mM L-穀氨酸(Sigma Chemical Co.，聖路易斯，密蘇裡州，美國)、10μg/ml鏈黴素(Gibco)、100U/ml青黴素(Gibco)和0.28μg/ml 兩性黴素B(SquibbPharmaceuticals，蒙特婁，加拿大)。這種生長培養基以後被稱為完全培養基。BE-2細胞系在Rosewall Park MemorialInstitute(RPMI)培養基中生長，該培養基有以上MEM的所有添加物。細胞在37℃，5％CO2/95％空氣的潮溼氣氛中在培養箱(FormaScientific，俄亥俄州，美國)中生長，並且如以前所描述(Richardson等，1990.Biochim.Biophys.Acta 1053 1-12)進行傳代培養。用相穩定顯微鏡(phase-constant microscopy)和錐蟲藍染色監測細胞生長和活力。螯合劑對細胞增殖的影響用MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓)分析通過基本上與以前描述的方法(Richardson等，1995)相同的方法檢測螯合劑對SK-N-MC神經上皮瘤細胞增殖的影響。通過將細胞以15000細胞/孔接種在96孔微量滴定板上檢測細胞增殖，每孔有0.1ml含有人二鐵Tf(1.25μM)的完全培養基。該接種密度導致在整個分析過程中細胞的指數生長。使細胞生長過夜，接著加入在0.1ml含有二鐵運鐵蛋白(1.25μM)的完全培養基中的螯合劑。螯合劑的終濃度為0.39-50μM。對照樣品含有完全培養基和二鐵Tf(1.25μM)。細胞與螯合劑一起在37℃在含有95％空氣和5％CO2的潮溼氣氛中培養90小時。在此培養後，向各孔中加入0.01ml MTT，將板在37℃培養2小時。通過加入0.1ml在0.01M HCl中的10％SDS-50％異丁醇溶解細胞，接著在掃描多孔分光光度計(Titertek Multiscan；Beckman InstrumentsInc.，加利福尼亞)上在570nm處對該板讀數。如以前所證明的，對於SK-N-MC細胞，MTT顏色形成與可成活細胞數目成正比(Richardson等，1995)。MTT分析的結果以對照值的百分比表示。59Fe運鐵蛋白的製備用以前描述的標準過程(Richardson等，1990)製備脫鐵運鐵蛋白(Sigma Chemical CO.，聖路易斯，美國)並用59Fe(在0.1M HCl中的氯化鐵，Dupont NEN，明尼蘇達州，美國)標記以產生59Fe2-運鐵蛋白(59Fe-Tf)。通過紫外可見分光光度法用280nm(蛋白)處的吸光度與在456nm(鐵結合處)處的吸光度比較而監測Tf的Fe飽和度。在所有試驗中，使用充分飽和的二鐵Tf。螯合劑對3H-胸腺嘧啶脫氧核苷、3H-亮氨酸和3H-尿嘧啶核苷摻入的影響用三氯乙酸(TCA)沉澱後，評估細胞的3H-胸腺嘧啶脫氧核苷(20Ci/mmol；Dupont NEN，明尼蘇達州，美國)、3H-尿嘧啶核苷(42.7Ci/mmol/Dupont NEN，明尼蘇達州，美國)和3H-亮氨酸(52Ci/mmol；Dupont NEN)標記。在和螯合劑一起培養20小時後，接著加入3H-亮氨酸、3H-尿嘧啶核苷或3H-胸腺嘧啶脫氧核苷(1μCi/ml)，在37℃培養2小時。接著，將含有細胞培養物的培養皿放在冰上並用冰冷的Hanks′平衡鹽溶液(BSS)洗滌四次，用無Ca/Mg的鹽水中的1mM EDTA將細胞從板上脫附下來。接著通過離心將細胞形成粒狀沉澱，除去上清液，在-70℃冷卻粒狀沉澱。在冰上解凍細胞後，加入1ml冰冷的20％TCA，攪動溶液並在冰上放置1小時，其間周期性混合。接著將該溶液在15000rpm，4℃下離心15分鐘，除去上清液。接著用1ml冰冷的10％TCA將粒狀沉澱洗滌兩次。將粒狀沉澱溶於0.5ml 1M NaOH中，並轉移到含3ml閃爍體的閃爍管中。在β-閃爍計數器(LKBWallace，芬蘭)上測定放射性活度。鐵攝取和鐵流出試驗用以前報導的標準過程(Richardson等，1994，J.Lab Clin.Med.124 660-71)研究螯合劑對從59Fe-Tf攝取59Fe和從預標記的細胞釋放59Fe的影響。通過和一般蛋白酶黴鏈蛋白酶(1mg/ml)一起在4℃培養30分鐘以除去膜結合的59Fe和Tf來測定被細胞內化的59Fe的量(Richardson等，1990；Baker等，1998，Biochim.Biophys.Acta，1380 21-30)。在以前的研究中報導的對照試驗已發現該技術對細胞的59Fe內化評估有效(Richardson等，1990；Baker等，1998)。鐵調節蛋白凝膠阻滯分析用已建立的技術(Leibold等，1988.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85 2171-5；Mullner等，1989，Cell 58 373-82)將凝膠阻滯分析用於測定IRP和IRE間的相互作用。簡單地說，在僅與培養基一起(對照)或與含有檸檬酸鐵銨(100μg/mlAldrich Ltd.，雪梨，澳大利亞)或螯合劑的培養基一起培養後，將2-5×106個細胞用冰冷的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌並且在4℃在40μl冰冷的Munro萃取緩衝溶液(10mM HEPES，pH7.6，3mM MgCl2，40mM KCl，5％甘油，1MM二硫蘇糖醇和0.5％NonidetP-40)中溶解細胞。細胞溶解後，接著將樣品在10000rpm，4℃離心3分鐘以除去細胞核並將上清液在-70℃貯存。將冷凍的細胞質萃取物在冰上解凍並且在15000rpm，4℃離心10分鐘。用BioRad蛋白質分析(BioRad Ltd.，美國)測定可溶的上清液的蛋白質濃度。在不含Nonidet P-40的Munro緩衝液中將細胞質萃取物樣品稀釋到蛋白質濃度為100μg/ml，並且通過將1μg等分試樣和0.1ng(約1×105cpm)32P-標記的pGL66 RNA轉錄物一起培養來分析其IRP(Leibold等，1988)。用SP6 RNA聚合酶在α-32P UTP(Dupont，NEN)的存在下，從線性質粒模板體外轉錄核探針(riboprobe)。用Promega Riboprobe In VitroTranscription Kit(Promega核探針體外轉錄試劑盒，Promega，Maison，WI，美國)進行後一反應。接著在6％尿素/PAGE凝膠上純化探針。為了形成RNA-蛋白複合物，將含有1μg蛋白的細胞質萃取物在室溫下和32P-標記的核探針一起培養10分鐘。通過在室溫下和1U RNAse T1一起培養10分鐘而將未保護的探針降解。接著加入終濃度為5mg/ml的肝素(Sigma)，並且和萃取物一起在室溫下再培養10分鐘以排除非特異性結合。如Konarska等，1986，Cell，46 845-55所述，在4℃，6％非變性聚丙烯醯胺凝膠上分析RNA-蛋白複合物。乾燥凝膠，用塑料膜覆蓋並在-70℃曝光於有增感屏的Kodak XAR膠片上。諾慎印跡分析通過用得自Advanced Biotechnologies Ltd(Surrey，英國)的Total RNA IsolationReagent(完全RNA分離試劑)分離所有的RNA而進行諾慎印跡分析。將RNA(15μg)在RNA負載緩衝液中在90℃加熱變性2分鐘，並且接著裝載至1.2％瓊脂糖-甲醛凝膠上。電泳後，用毛細管點樣法將RNA在10×SSC中轉移到尼龍膜(GeneScreen，New England Nuclear，波士頓，美國)上。接著用UV-交聯劑(UV Stratalinker 1800，StrageneLtd.，美國)將RNA交聯到膜上。
用對人WAF1、GADD-45和β-肌動蛋白特異性的探針雜交膜。WAF1探針由來自pSXV(ATTC；Cat.No.79928)的1kb片段組成。GADD45探針由來自克隆到pHu145B2(由NIH，馬裡蘭的National Cancer Institute的Albert Fornace博士提供)中的人GADD45 cDNA的760bp片段組成。β-肌動蛋白探針由克隆到pBluescript SK-(ATCC；at.No37997)中的人β-肌動蛋白cDNA的1.4kb片段組成。
如Mahmoudi和Lin，1989，Biotechniques 7，331-2所述，用Hybaid Shake和Stack hybridization oven(HybaidLtd.，米德爾克斯郡，英國)將探針雜交到膜上並進行它們的後續洗滌。接著在-70℃將膜曝光於有增感屏Kodak XAR膠片上。如膜製造商所述，通過在含有10mM Tris-HCl(pH7.0)、1mMEDTA(pH8.0)和1％SDS的溶液中煮沸15-30分鐘而將探針剝離。用Laser Densitometer(雷射密度計)採集密度數據，並通過Kodak Biomax軟體(Kodak Ltd，美國)分析該數據。網織紅細胞用標準過程(Richardson，D.R.，Ponka，P.和Vyoral，D.(1996)Blood，87，3477-3488)，用經McGill UniversityAnimal Care Committee批准的方案通過心穿刺反覆靜脈切開放血術在紐西蘭白兔中誘導網織紅細胞。在用新亞甲基藍染色的基礎上鑑別網織紅細胞，用增強的Neubauer計數室測定細胞數。運鐵蛋白的標記用已建立的方法(Richardson，D.R.和Baker，E.(1992)J.Biol.Chem.267，13972-13979)製備並用59Fe(在0.1MHCl中的氯化鐵，Dupont NEN，明尼蘇達州，美國)標記脫鐵運鐵蛋白(Sigma Chemical Co)以產生59Fe2-運鐵蛋白(59Fe-Tf)。來自負載59Fe的網織紅細胞的59Fe的移動已證明59Fe標記的兔網織紅細胞是研究Fe螯合劑穿透細胞膜並螯合細胞內Fe庫的能力的有用模型。如上所述，從長期出血的兔中獲得網織紅細胞，並且將它們與1mM琥珀醯丙酮(SA；Sigma)一起培養以抑制血紅素合成。在SA的存在下進行15分鐘預培養後，加入59Fe-Tf(3.75μM)並和細胞一起在振蕩下於37℃培養1小時。此培養後，用冰冷的PBS將網織紅細胞洗滌三次以除去非特異性結合的59Fe-Tf。將經洗滌的59Fe-標記的網織紅細胞(30-35μL)在緩衝鹽溶液(終體積為250μL)中和去鐵螯合劑(apochelator)一起培養。SA在所有的培養液中和螯合劑一起存在以阻止用非血紅素59Fe合成血紅素。培養後，測定經洗滌的網織紅細胞和培養基中的59Fe，然後計算從網織紅細胞移動的59Fe的百分比。
在一些試驗中，用200μL冰冷的蒸餾水溶解經洗滌的59Fe-標記的網織紅細胞，用1ml冰冷的95％乙醇沉澱蛋白質。接著在IEC Micromax微型離心機(IEC，加拿大)上離心混合物(13000rpm/30min/4℃)以獲得含有結合於低MT螯合劑的59Fe的醇溶性部分，以及含有蛋白結合的59Fe的醇沉澱部分。以前的研究已經證明該方法導致鐵蛋白和運鐵蛋白中的59Fe的沉澱，而結合於螯合劑的59Fe仍保持可溶狀態。在醇溶部分中59Fe的增加證明螯合劑可以穿透細胞膜並形成以有限效率釋放的細胞內Fe複合物。結果2-吡啶甲醛異煙醯腙(PCIH)類似物的製備PCIH-H2OC12H12N4O2的元素分析計算值C，59.0；H，5.0；N，22.9。試驗值C，59.2；H，4.9；N，22.9％。1H NMR(MeOH-d4)δ(對TMS的ppm)7.44(m，1H)；7.90(m，3H)；8.26(d，1H)；8.41(s，1H)；8.57(d，1H)8.74(dd，2H)。
PCBH-H2OC13H12N3O2的元素分析計算值C，64.2；H，5.4；N，17.3。試驗值C，64.1；H，5.4；N，17.3％。1H NMR(MeOH-d4)δ(對TMS的ppm)7.41(m，1H)；7.51(m，3H)；7.92(d，1H)；7.95(m，2H)；8.28(d，1H)；8.39(s，1H)；8.55(d，1H)。
PCBBH-H2OC13H12BrN3O2的元素分析計算值C，48.5；H，3.8；N，13.0。式驗值C，47.8；H，3.6；N，12.7％。1H NMR(MeOH-d4)δ(對TMS的ppm)7.44(m，2H)；7.76(d，1H)；7.91(m，2H)；8.12(s，1H)；8.27(d，1H)；8.39(s，1H)；8.55(d，1H)。
PCTHC11H9N3OS的元素分析計算值C，57.1；H，3.9；N，18.2。試驗值C，57.2；H，4.0；N，17.3％。1H NMR(MeOH-d4)δ(對TMS的ppm)7.20(m，1H)；7.43(m，1H)；7.85(m，3H)；8.26(d，1H)；8.37(s，1H)；8.56(d，1H)。
PCHH-H2OC13H11.5N3O2.25的元素分析計算值C，63.8；H，4.3；N，17.2。試驗值C，63.6；H，4.8；N，16.4％。1H NMR(MeOH-d4)δ(對TMS的ppm)6.88(dd，2H)；7.43(m，1H)；7.86(m，3H)；8.29(d，1H)；8.36(s，1H)；8.55(d，1H)。
PCAH-H2OC13H14N4O2的元素分析計算值C，60.5；H，5.5；N，21.7。試驗值C，60.3；H，5.5；N，21.4％。1H NMR(MeOH-d4)δ(對TMS的ppm)6.69(dd，2H)；7.39(m，1H)；7.74(dd，2H)；7.85(td，1H)；8.26(d，1H)；8.33(s，1H)；8.52(d，1H)。
FIHC11H9N3O2的元素分析計算值C，61.4；H，4.2；N，19.5。試驗值C，61.6；H，4.2；N，19.4％。1H NMR(MeOH-d4)δ(對TMS的ppm)6.59(dd，1H)；7.00(d，1H)；7.69(d，1H)；7.86(dd，2H)；8.26(s，1H)；8.73(dd，2H)。
PCIH-2HCl-2.5H2OC12H17Cl2N4O3.5的元素分析計算值C，41.9；H，5.0；N，16.3。試驗值C，41.6；H，4.5；N，16.0％。1H NMR(D2O)δ(對TMS的ppm)8.17(t，1H)，8.40(d，1H)，8.59(d，2H)，8.70(s，1H)，8.75(t，1H)，8.94(d，1H)，9.12(d，2H)。
PCBH-HCl-1.5H2OC13H15ClN3O2.5的元素分析計算值C，54.1；H，5.2；N，14.6。試驗值C，53.9；H，4.8；N，14.1％。1H NMR(D2O)δ(對TMS的ppm)7.39-7.53(m，3H)，7.80(d，2H)，7.97(t，1H)，8.12(d，1H)，8.32(s，1H)，8.55(t，1H)，8.69(d，1H)。
PCBBH-HClC13H11ClN3O的元素分析計算值C，45.8；H，3.3；N，12.3。試驗值C，45.2；H，4.1；N，13.3％。1H NMR(D2O)δ(對TMS的ppm)7.25(m，2H)，7.50(d，1H)，7.7-8.0(m，4H)，8.5(s，1H)，8.70(d，1H)。
PCTH-HCl-H2OC11H12ClN32S的元素分析計算值C，46.2；H，4.2；N，14.7。試驗值C，45.6；H，4.1；N，14.3％。1H NMR(D2O)δ(對TMS的ppm)7.2(m，2H)，7.7-8.0(m，3H)，8.4-8.6(m，2H)，8.50(d，1H)。
PCHH-HClC13H15ClN3O4的元素分析計算值C，49.8；H，5.1；N，13.4。試驗值C，50.2；H，4.9；N，13.1％。1H NMR(D2O)δ(對TMS的ppm)6.60(d，2H)，7.60(d，2H)，7.91(t，1H)，8.01(s，1H)，8.48(t，1H)，8.59(d，1H)。
PCAH-HClC13H16Cl2N4O3的元素分析計算值C，44.7；H，5.2；N，16.0。試驗值C，44.7；H，5.2；N，15.9％。1H NMR(D2O)δ(對TMS的ppm)7.28(d，2H)，7.90(d，2H)，8.20(t，1H)，8.40(s，1H)，8.60(t，1H)，8.80(d，1H)。
FIH-2HCl-H2OC11H13Cl2N3O3的元素分析計算值C，49.0；H，4.5；N，15.6。試驗值C，49.2；H，4.5；N，15.6％。1H NMR(D2O)δ(對TMS的ppm)6.64(m，1H)，7.01(d，1H)，7.71(s，1H)，8.26(s，1H)，8.42(d，2H)，8.99(d，2H)。
游離鹼形式的螯合劑微溶於水，但極易溶於甲醇，在乙醇中的溶解度稍差。一旦它們的鹼性基團質子化，所有螯合劑的水溶性均顯著提高。PCBBH-HCl和PCTH-HCl鹽酸鹽表現出該系列化合物中最低的水溶性，而溶解性最好的螯合劑是PCIH-2HCl和PCAH-2HCl(均是二質子酸)。
鹽酸鹽在水中的1H NMR譜圖與相應的游離鹼的譜圖(在甲醇中)非常相似。最重要的是，在所有情況中都觀察到了亞胺單峰共振，這表明亞胺官能團在形成鹽酸鹽時保持完整。而且，在一周內，質子化的螯合劑在水溶液中沒有表現出顯著的亞胺水解，這由NMR譜圖顯示。
質子化程度取決於所存在的鹼性基團數目。異煙醯基、對氨基苯基和2-吡啶基都經歷質子化。亞胺N-原子(潛在的鹼性位點)並沒有質子化，除非鄰近的雜環本身為非鹼性的(即FIH中的呋喃基)。亞胺N-原子與質子化的吡啶鎓基之間的內氫鍵似乎可解釋這些配體中亞胺對質子化作用的耐受。螯合劑對預標記的細胞釋放鐵和運鐵蛋白攝取鐵的影響對PCIH類似物增加SK-N-MC細胞釋放59Fe的能力與「標準螯合劑」(DFO、PIH和311)進行比較，後者的活性以前已在這種細胞系中得到證明。在用59Fe-Tf(0.75μM)標記3小時後，在存在或不存在DFO(100μM)或濃度為50μM的其它配體的情況下再培養3小時，而後測定SK-N-MC細胞的59Fe流出(圖2A)。應注意，在所有試驗中，均在100μM考查DFO，這是因為其在SK-N-MC細胞中Fe螯合效率低的緣故。螯合劑311、PIH、PCTH、PCBH和PCBBH顯示相似的活性，導致40-42％的細胞59Fe釋放。通過PCIH移動的59Fe與通過DFO移動的59Fe相似，後者釋放19％的細胞59Fe。相反，與對照培養基的觀察結果相比，FIH、PCAH和PCHH並不可觀地增加59Fe移動(圖2A)。
為了測定螯合劑抑制從59Fe-Tf(0.75μM)攝取59Fe的能力，將SK-N-MC細胞與59Fe和DFO(100μM)或其它螯合劑(50μM)一起在37℃培養3小時(圖2B)。在阻止從59Fe-Tf攝取59Fe方面，配體311、PIH、PCTH、PCBH和PCBBH比DFO顯示高得多的功效(圖2B)，分別將其降低到對照值的13-30％，而DFO將其降低到對照值的91％(圖2B)。對於其它螯合劑，PCIH比DFO略微更有效，而FIH、PCAH和PCHH對從59Fe-Tf攝取59Fe沒有影響。考慮這些數據，在59Fe攝取和59Fe流出研究中，PCIH類似物中的三種，即PCTH、PCBH和PCBBH，表現出高於DFO而與PIH和311相似的活性(圖2A和2B)。
為了進一步研究在以上的篩選研究中鑑定的最有效的PCIH類似物的功效，在一系列配體濃度下，對PIH、PCIH、PCTH、PCBH和PCBBH在移動SK-N-MC細胞的59Fe方面的功效進行比較(0.5-50μM；圖3A)。在用59Fe-TF(0.75μM)標記3小時並接著在存在或不存在有效螯合劑(0.5-50μM；圖3A)的情況下再培養3小時後，測定SK-N-MC細胞59Fe的移動。由所有螯合劑介導的59Fe釋放作為螯合劑濃度的函數是雙相的，當配體濃度為25μM時，59Fe釋放開始達到穩定狀態。顯然，在達10μM的螯合劑濃度下，在移動59Fe方面最有效的螯合劑是PCTH和PCBBH(圖3A)。然而，隨著配體濃度增加到25和50μM，PCTH和PCBBH的活性與PIH和PCBH相似。PCIH在所有濃度下是效率最低的螯合劑(圖3A)。
進一步的研究測定了在3小時的培養期間，螯合劑濃度(0.5-50μM)對從59Fe-Tf(0.75μM)攝取59Fe的影響(圖3B)。與以上流出研究中發現的結果相似，在配體濃度達10μM時，在阻止從59Fe-Tf攝取59Fe方面，PCTH和PCBBH是最有效的螯合劑，而在25-50μM的濃度下，PIH、PCBH、PCTH和PCBBH的活性相似(圖3B)。同樣，在測試的所有濃度下，PCIH是效率最低的螯合劑。為了確定在不同的細胞類型之間，配體的Fe螯合效率是否存在差異，對在BE-2成神經細胞瘤細胞、SK-N-MC神經上皮瘤細胞和SK-Mel-28惡性黑素瘤細胞中，三種最有效的PCIH類似物(PCTH、PCBH和PCBBH)的活性與DFO和311的活性進行比較(表1和2)。考察螯合劑移動用59Fe-Tf(0.75μM)預標記3小時並接著再培養3小時的細胞中的59Fe的能力，在移動BE-2細胞的59Fe方面，DFO(100μM)具有與311和3種PCIH類似物(50μM)相似的活性(表1)。相反，在移動SK-N-MC或SK-Mel-28細胞的59Fe方面，DFO的效率遠低於311或PCIH類似物(表1)。表1.DFO、311、PCTH、PCBH或PCBHH對從BE-2成神經細胞瘤細胞、SK-N-MC神經上皮瘤細胞和SK-Mel-28惡性黑素瘤細胞中釋放59Fe的影響。用59Fe-運鐵蛋白(0.75μM)將細胞在37℃標記3小時，洗滌，並接著和螯合劑一起在37℃下再培養3小時。在50μM篩選螯合劑311、PCTH、PCBH和PCBBH，而在100μM考察DFO。結果是典型試驗的三次測定的平均值±SD。

表2.DFO、311、PCTH、PCBH或PCBBH對BE-2成神經細胞瘤細胞、SK-N-MC神經上皮瘤細胞和SK-Mel-28惡性黑素瘤細胞從59Fe-運鐵蛋白攝取內化59Fe的影響。將細胞和螯合劑及59Fe-運鐵蛋白(0.75μM)一起在37℃培養3小時，洗滌，在4℃和鏈黴蛋白酶(1mg/ml)一起培養30分鐘，以將內化的59Fe和膜結合的59Fe分離。除了在100μM的濃度下篩選DFO之外，在50μM的濃度下篩選其它所有螯合劑。結果是典型試驗的平均值(三次測定)±SD。

還在同樣的細胞系中考察了螯合劑阻止從培養3小時後的59Fe-運鐵蛋白(0.75μM)攝取59Fe的影響(表2)。在抑制從59Fe-Tf攝取59Fe方面，最有效的螯合劑是311，它在所有3個細胞系中將59Fe攝取類似地降低到對照值的8-10％。三種PCIH類似物顯示低於311的活性，但是它們遠比DFO有效(表2)。有趣地注意到，DFO在抑制SK-N-MC神經上皮瘤細胞和SK-Mel-28惡性黑素瘤細胞攝取59Fe方面幾乎沒有作用(分別是對照值的100和98％)，而在BE-2細胞系中，它將從59Fe-Tf攝取的內化59Fe降低到對照值的42％(表2)。相反，3種PCIH類似物的活性在3個細胞系中有些相似，它們將從59Fe-Tf攝取的59Fe降低到對照值的15-38％。對此唯一的例外是PCBBH，其降低SK-Mel-28細胞攝取59Fe的效率方面比降低SK-N-MC或BE-2細胞中的低得多(表2)。PCIH類似物對細胞增殖的影響以上研究已經清楚地證明，PCBH、PCBBH和PCTH具有與PIH或311相似的且高於DFO的Fe螯合功效。因此，決定測定與活性在以前已被表徵的DFO、PIH及311相比，PCIH類似物的抗增殖作用。從圖4可見，顯然所有的PCIH類似物對增殖的影響均遠小於螯合劑311，在以前的研究中已證明螯合劑311在抑制多種腫瘤細胞系生長的方面有效。如以前所證明的，DFO抑制SK-N-MC細胞生長的能力遠低於311的(IC50DFO＝47μM；IC50311＝2μM)。在PCIH類似物中，PCBBH和PCBH具有與DFO相似的抗增殖活性(IC50PCBBH＝42μM；IC50PCBH＝50μM)。其餘PCIH類似物在抑制生長方面幾乎沒有作用。有趣地注意到，儘管在SK-N-MC細胞中PIH、PCTH、PCBH和PCBBH具有與311相似的Fe螯合活性(圖2、表1和2)，但它們抑制增殖的能力卻低得多。這些結果與以前的研究一致，以前的研究證明Fe螯合功效並不總是與配體抑制增殖的能力相關。螯合劑對3H-胸腺嘧啶脫氧核苷、3H-亮氨酸或3H-尿嘧啶核苷摻入的影響為了進一步獲得有關這些配體可能的作用機理的信息，研究了螯合劑對3H-胸腺嘧啶脫氧核苷、3H-亮氨酸或3H-尿嘧啶核苷摻入SK-N-MC細胞的影響(表3)。在這些試驗中，由於DFO和311的抗增殖活性在以前已經用SK-N-MC細胞表徵過，因此將PCIH類似物的作用與DFO和311進行比較。具有最強Fe螯合功效的PCIH類似物，即PCBBH、PCTH和PCBH，分別將3H-胸腺嘧啶脫氧核苷摻入降低到對照值的33％、64％和72％，這遠低於所觀察到的311的抑制作用(對照值的0.1％)，並且與所發現的PIH的抑制作用(對照值的52％)相似。有趣的是，幾乎不顯示Fe螯合功效的三種螯合劑，即FIH、PCAH和PCHH(圖2)引起3H-胸腺嘧啶脫氧核苷摻入顯著下降至對照值的11-17％(表3)。表3.螯合劑對3H-胸腺嘧啶脫氧核苷、3H-亮氨酸或3H-尿嘧啶核苷摻入SK-N-MC神經上皮瘤細胞的影響。將細胞和DFO(100μM)或其它螯合劑(50μM)一起在37℃培養20小時。此後，加入3H-胸腺嘧啶脫氧核苷、3H-亮氨酸或3H-尿嘧啶核苷(1μCi/ml)，並且將細胞在37℃另外培養2小時(詳見方法)。結果是所進行的2-4次試驗的典型試驗的平均值±SD(4-5次測定)。

考察螯合劑在抑制3H-亮氨酸和3H-尿嘧啶核苷摻入方面的影響(表3)，同樣，最有效的螯合劑是311，它分別將它們的摻入降低到對照值的2％和5％。相反，在抑制3H-亮氨酸和3H-尿嘧啶核苷摻入方面，PCBH、PCBBH和PCTH的活性遠低於311的，它們將摻入降低到對照值的16-47％(表3)。在抑制3H-亮氨酸和3H-尿嘧啶核苷摻入方面，DFO的效率也低於311的，它將摻入分別降低到對照值的9％和34％。引起3H-胸腺嘧啶脫氧核苷摻入顯著下降的3種PCIH類似物(FIH、PCAH和PCHH)並不以相同程度抑制3H-亮氨酸和3H-尿嘧啶核苷摻入，它們將其降低到對照值的40-80％(表3)。螯合劑對鐵調節蛋白(IRP)的RNA結合活性的影響使用DFO的細胞內Fe消耗的重要作用是鐵調節蛋白(IRP)的RNA結合活性的激活(Hentze等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93 8175-82)。儘管已經很好地表徵了DFO對這種蛋白的RNA結合活性的影響，但是有關其它Fe螯合劑如PCIH類似物的作用卻知之甚少。本發明的發明者考察了在SK-N-MC細胞中，與311、PIH和PCIH類似物(25μM)一起培養20小時對IRP-RNA結合活性的影響。在所有的試驗中，將DFO(100μM)用作陽性對照以消耗細胞的Fe並提高IRP-RNA結合活性。相反，將檸檬酸鐵銨(FAC100μg/ml)用以給細胞提供Fe並降低IRP-RNA結合。觀察圖5，顯然僅存在唯一的主IRP-IRE帶，這歸因於以下事實，即人IRP1-IRE和IRP2-IRE複合物在非變性聚丙烯醯胺凝膠中共同遷移(Chitambar等，1995，Cancer Res.55 4361-66)。如所預期的，對照相比，與DFO一起培養20小時後，IRP-RNA結合活性增加，而與Fe供體FAC一起培養20小時後，IRP-RNA結合活性明顯下降(圖5)。與對照相比，用311、PCTH、PCBH和PCBBH處理細胞後，IRP-RNA結合活性顯著增加(圖5)，這最有可能反映出它們的高Fe螯合功效(圖2和3)。令人驚奇的是，對照相比，PIH和PCIH對IRP-RNA結合活性幾乎沒有影響，而FIH、PCAH和PCHH使IRP-RNA結合降低(圖5)。與螯合劑一起培養後，將β-巰基乙醇加入細胞溶解物中顯示，IRP-RNA結合活性總量沒有變化(數據未給出)。PCIH類似物對細胞周期中涉及的基因表達的影響用高濃度DFO(150μM)或濃度低得多(2.5-5μM)的311處理細胞導致p53-反應基因WAF1(野生型激活基因1)和GADD45(生長停滯和DNA損傷基因)的表達增加(Darnell等，1994，Blood 94781-792)。WAF-1是有效的細胞周期蛋白依賴性激酶的通用抑制劑，它能誘導G1/S停滯以及可能的G2/M停滯。在DNA損傷時誘導GADD45，其能使細胞周期停滯，並且DNA核苷酸切除修復中也涉及其。儘管已知DFO、311和其它Fe螯合劑可能引起細胞停滯，但對可能在抑制細胞周期中起作用的基因表達的變化卻了解很少。在本項研究中，與311(25μM)一起培養和在更低程度上與DFO(100μM)一起培養，引起SK-N-MC細胞中WAF1和GADD45 mRNA水平增加(圖6)。在PCIH類似物中，只有PCBBH顯著增加GADD45 mRNA水平而不增加WAF1 mRNA水平。後一作用相應於PCBBH相對於其它PCIH類似物的更高抗增殖活性。PCIH類似物對網織紅細胞中線粒體鐵移動的影響在該研究中，用唯一的得到很好表徵的線粒體Fe超載模型研究PCIH類似物的Fe螯合功效，該模型是負載線粒體非血紅素59Fe的網織紅細胞。在所有研究中，將PIH用作參照化合物，因為該螯合劑在以前的研究中已被表徵為能有效消耗非血紅素線粒體Fe庫。
在最初的研究中，評估了再培養時間對從負載Fe的網織紅細胞釋放59Fe的影響(圖7)。在這些試驗中，用59Fe-Tf將細胞在37℃標記1小時，洗滌，並接著在存在或不存在螯合劑(200μM)的情況下再培養240分鐘。在所考察的八種化合物中，作為培養時間的函數，PCIH在增加細胞59Fe釋放方面最為有效(圖7)。事實上，在15-120分鐘的培養時間內，PCIH比PIH更有效，但是在240分鐘的再培養後，二者活性相似。在僅15分鐘和負載59Fe的網織紅細胞一起培養後，PCIH的高活性明顯，在該時間點，該化合物已將細胞59Fe的21±1％(3次測定)移動(圖7)。15分鐘後，由PCIH釋放的59Fe的量多於經240分鐘培養後由PCBBH、PCAH、PCHH和FIH移動的量，後四個化合物移動的量分別是17％、15％、6％和4％。與螯合劑一起培養後，考察醇溶性細胞內59Fe，結果顯示它僅在FIH的存在下增加(圖8)，表明在細胞內其59Fe複合物的可能累積。
在進一步的研究中，評估了螯合劑濃度對負載59Fe的網織紅細胞的59Fe移動的影響。在這些試驗中，用59Fe-Tf將細胞在37℃標記1小時，洗滌，並接著在存在或不存在螯合劑的情況下在37℃再培養1小時(圖9)。同樣，PCIH是活性最高的化合物。在濃度為200μM時，PCIH釋放細胞59Fe的31±1％(3次測定)，而PIH移動了18±1％(3次測定)。化合物PCTH具有與PIH相似的Fe螯合功效，而其餘配體實質上效率更低。如前所述，DFO即使在濃度高達5mM時，對移動59Fe也幾乎沒有影響，其活性與對照培養基的相似。如所報導，使用SK-N-MC神經上皮瘤細胞系，FIH和PCHH在移動細胞內59Fe方面均顯示極低活性(圖9)。如圖8所示，僅在用FIH時觀察到醇溶性細胞內59Fe的增加，並且其隨濃度增加至200μM而增加。結論本發明的發明者已經合成並篩選了多種基於2-吡啶甲醛異煙醯腙(PCIH)的芳醯腙配體。這些螯合劑中的三種，即PCBH、PCBBH和PCTH，顯示出高於DFO且與PIH和311相似的Fe螯合活性。另外，這些螯合劑的抗增殖活性遠低於類似物311的，311是已經證明擁有高細胞毒性活性的芳醯腙配體。這些性質表明，這三種PCIH類似物更適用於治療Fe負載疾病，而不是作為對抗癌症的抗增殖藥。
試圖通過將2-吡啶甲醛和多種以前用於合成PIH類似物的酸醯肼縮合而合成具有高抗增殖活性的配體。考察了2-吡啶甲醛部分，因為當它和氨基硫脲縮合形成相應的縮氨基硫脲時，該配體具有有效的抗增殖活性。事實上，α-N-雜環甲醛縮氨基硫脲的後一基團已經被描述為迄今鑑定的最有效的核苷酸還原酶抑制劑。本發明的結果證明，PCIH類似物幾乎不顯示抗增殖活性，比311的活性小得多。這些數據可以表明，與2-吡啶甲醛部分相反，2-吡啶甲醛縮氨基硫脲的氨基硫脲成分可能對抗增殖活性是重要的。
本項研究中所考察的所有PCIH類似物，除了FIH，均具有相同的潛在Fe配位部位，即羰基氧、醛亞胺氮和2-吡啶基氮(

圖1)。然而有趣的是，這些配體的生物學活性可能受到置於Fe結合位點遠端的取代基的性質顯著影響。例如，PCHH和PCAH都表現出很低的Fe螯合活性，而PCTH、PCBBH和PCBH則表現出很高的功效(圖2A、2B)。由於親脂性是配體的膜穿透性和Fe螯合功效的重要標準，因此可能是PCHH和PCAH增加的親水性(由於分別存在羥基和氨基)可以阻止這些螯合劑進入細胞內Fe庫。儘管PCAH、PCHH和FIH幾乎沒有移動59Fe和抑制從59Fe-Tf攝取59Fe的活性，有趣的是，這些螯合劑在抑制3H-胸腺嘧啶脫氧核苷摻入方面比其它PCIH類似物更有效(表3)。考慮到這一點，有可能FIH、PCAH和PCHH在抑制核苷酸還原酶方面相對更有效，核苷酸還原酶是在DNA合成中將核苷酸轉化成脫氧核苷酸中涉及的關鍵的含Fe酶。
本發明的PCIH類似物與PIH類似物相比的一個優點是，它們在水溶液中更高的溶解性。儘管親脂性是膜穿透性的重要性質，但在螯合劑的實際和臨床使用方面，螯合劑在水中的溶解性也是重要的因素。因此，對於可以用作有用的治療藥的螯合劑，必須達到在水溶液中的溶解性和穿透生物膜的能力間的適當平衡。對於幾種PCIH類似物，這似乎已經實現。
DFO在增加IRP的RNA結合活性方面的作用已經得到很好的表徵。然而，對於其它Fe螯合劑的作用卻了解很少。311、PCTH、PCBH和PCBBH都能以與DFO相似的方式增加IRP-RNA結合活性的事實(圖5)可能表示這些配體作用於相同或相似的細胞內Fe庫。與預期相反，PIH和PCIH在提高IRP-RNA結合活性方面沒有作用，儘管這些螯合劑在移動細胞59Fe和阻止從59Fe-Tf攝取59Fe方面高度有效(圖2和3)。然而，更高濃度的PIH的確提高IRP-RNA結合活性，表明可能涉及濃度效應。還有趣地注意到，FIH、PCAH和PCHH抑制IRP-RNA結合活性的水平與和FAC一起培養後的抑制水平相似(圖5)。考慮這些結果，可以推測，PCAH、PCHH和FIH可能干擾細胞內Fe的分布，這樣增加了IRP感知的Fe庫。
儘管對於Fe螯合劑在G1/S抑制細胞周期的能力了解很多，但是對於可能在該過程中起作用的基因表達的變化卻知之甚少。在以前用成神經細胞瘤細胞系和K562細胞進行的研究中，本發明的發明者證明了，和DFO(150μM)或311(2.5-5μM)一起培養導致WAF1和GADD45表達的顯著增加，這兩種分子在誘導G1/S細胞周期停滯方面起作用。在本項研究中，已經確證，用DFO和311得到的這些結果顯示，在PCIH類似物中，只有PCBBH增加GADD45 RNA的表達(圖6)。螯合劑增加在抑制細胞周期中涉及的分子的表達的能力並不是用於治療Fe超載的的化合物適當特性。
考慮到這一點，以及PCBBH在抑制增殖方面是最有效的配體的事實，PCTH和PCBH似乎是治療Fe-負載疾病的優選的候選螯合劑。
在本項研究中，所有PCIH類似物均顯示遠低於311的抗增殖活性(見圖4)，儘管這些化合物中有些具有高Fe螯合功效，例如PCBBH、PCBH和PCTH(圖2和3)。本發明的發明者已經證明，當製備311的Fe複合物時，其阻止它的抗增殖活性和增加GADD45和WAF1 mRNA表達的能力。這些結果與它的高Fe螯合功效一起，表明311可以通過消耗細胞內Fe庫而抑制生長。
幾項研究已經表明，遺傳性共濟失調可能是由Fe在線粒體內累積引起的。如果該疾病由線粒體Fe超載引起，可能的治療方案可以包括Fe螯合治療。DFO有效地消耗胞質Fe庫，但是不知道它能否螯合線粒體Fe。相反，以前的研究已經表明，芳醯腙螯合劑，如PIH，可以從線粒體中除去Fe。
顯然，本發明的PCIH類似物可以包括游離鹼和它們的鹽酸鹽形式的這些化合物，本文以下討論鹼和鹽的合成。
目前還沒有治療FA的方法，FA是一種嚴重的致殘神經症狀。線粒體Fe累積在其發病機理中起重要作用這一令人激動的發現表明，可能的治療介入可能是Fe螯合治療。該研究鑑定了PCIH類螯合劑中的一些是用以移動網織紅細胞線粒體非血紅素Fe的高度有效的配體。採用網織紅細胞模型，因為它是細胞中線粒體Fe超載的唯一很好表徵的系統。PCIH和PCTH移動線粒體Fe庫的能力克服了DFO不能有效從該室消耗Fe的缺點。這些研究對證明PCIH類配體在SK-N-MC神經上皮瘤細胞系中的高螯合功效和低毒性的工作進行了補充。事實上，這些化合物中的一些在增加細胞Fe移動和阻止從Tf攝取Fe方面遠比DFO有效。
基於對多種PIH類化合物的研究而具體設計PCIH類螯合劑。根據這些研究，選擇高Fe螯合功效和低毒性所必須的結構特徵以優化這些配體作為治療Fe超載疾病的藥物的用途。事實上，設計方案非常成功，因為通過它獲得了比母體化合物PIH更高活性的螯合劑。
設計衍生自PIH的新螯合劑的方案是建立在這種化合物的有利性質基礎上的。它們是(a)口服有效；(b)接近最優的親水-親脂平衡；(c)對Fe的高特異性和選擇性；(d)在生理pH下主要是中性的；(e)合成經濟並且簡單；(f)高的體內體外螯合功效。
PCIH配體中的一些具有移動線粒體Fe的能力的原因可能是它們遠高於DFO的親脂性。事實上，要穿透線粒體並螯合Fe，需要穿越三層脂質膜，即原生質膜和內外線粒體膜。因此，快速穿透膜並靶向線粒體Fe的親脂性螯合劑將遠比親水性化合物如DFO有效。這可能是類似物的重要性質，因為FA中的Fe負載不如在未治療的β-地中海貧血症中發現的那樣顯著。因此為了阻止全部機體Fe消耗，可能僅很短的治療時間是可能或必須的。在這些條件下，特異性靶向線粒體Fe庫可能是重要性質。
本領域技術人員將會理解，在不背離廣泛描述的本發明的實質和範圍的前提下，可以對在特定實施方案中顯示的本發明進行各種改變和/或修飾。因此這些實施方案在所有方面，僅被視為說明性的而非限制性的。
權利要求
1.適於用作體內鐵螯合劑的2-吡啶甲醛異煙醯腙(PCIH)類似物，它們的異構體或它們的鹽，該PCIH類似物具有分子式1 其中R1為除未取代的吡啶之外的芳基或雜環基，且R2是H或OH。
2.根據權利要求1的PCIH類似物，其中芳基或雜環基是疏水性的。
3.根據權利要求1的PCIH類似物，其中R1是苯基、吡啶、呋喃或噻吩環，它們任選地具有連接於環上任何空位的烷基、滷素、硝基、胺或羥基。
4.根據權利要求1的PCIH類似物，其選自2-吡啶甲醛間溴苯甲醯腙(PCBBH)、2-吡啶甲醛對氨基苯甲醯腙(PCAH)、2-吡啶甲醛對羥基苯甲醯腙(PCHH)，它們的鹽和它們的異構體。
5.適於用作鐵螯合劑的藥物組合物，其包含治療有效量的至少一種具有分子式1的2-吡啶甲醛異煙醯腙(PCIH)類似物，它們的異構體或它們的鹽，以及藥學適用的載體或稀釋劑 其中R1為芳基或雜環基，且R2是H或OH。
6.根據權利要求5的藥物組合物，其中芳基或雜環基是疏水性的。
7.根據權利要求5的藥物組合物，其中R1是苯基、吡啶、呋喃或噻吩環，它們任選地具有連接於環上任何空位的烷基、滷素、硝基、胺或羥基。
8.根據權利要求5的藥物組合物，其中2-吡啶甲醛異煙醯腙(PCIH)類似物選自2-吡啶甲醛異煙醯腙(PCIH)、2-吡啶甲醛2-噻吩羧基腙(PCTH)、2-吡啶甲醛苯甲醯腙(PCBH)、2-吡啶甲醛間溴苯甲醯腙(PCBBH)，它們的鹽和它們的異構體。
10.根據權利要求5至8中的任一權利要求的藥物組合物，其被配方以皮下或靜脈內注射、口服給予、吸入、經皮施用或直腸給予。
11.鐵螯合治療方法，其包括給予患者權利要求5至10中的任一權利要求的藥物組合物。
12.治療個體中鐵超載疾病的方法，該方法包括給予個體權利要求5至10中的任一權利要求的藥物組合物。
13.根據權利要求11或12的方法，其中藥物組合物的給藥劑量方案是30-500mg/kg患者體重。
14.根據權利要求13的方法，其中劑量方案是50-100mg/kg體重。
15.根據權利要求11至14中的任一權利要求的方法，其中患者患有β-地中海貧血或遺傳性共濟失調。
16.具有分子式1的2-吡啶甲醛異煙醯腙(PCIH)類似物，它們的異構體或它們的鹽在生產用於治療鐵超載疾病的藥物中的用途
全文摘要
本發明提供適於用作體內鐵螯合劑的2－吡啶甲醛異煙醯腙(2－pyridylcar boxaldehyde isonicotinoyl hydrazone,PCIH)類似物,它們的異構體或它們的鹽,含有該類似物的藥物組合物,以及該類似物在治療鐵超載(iron－overload)疾病中的用途,該PCIH類似物通式如(1)所示,其中R
文檔編號A61K31/4436GK1378449SQ00812399
公開日2002年11月6日 申請日期2000年9月4日 優先權日1999年9月2日
發明者德斯·理查森, 保羅·文森特·伯恩哈特, 埃麗卡·米歇爾·貝克爾 申請人:昆士蘭大學, 心臟研究所有限公司