一種用於弓形蟲感染的診斷抗原及其製備方法和應用的製作方法

2023-12-05 11:04:16 2

專利名稱：一種用於弓形蟲感染的診斷抗原及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物獸藥技術領域，是一種用於弓形蟲感染的診斷抗原及其製備方法和應用。該診斷抗原位於弓形蟲(Toxoplasma gondii)速殖子緻密顆粒上，由267個胺基酸組成的蛋白，該蛋白在弓形蟲入侵細胞的過程中和弓形蟲剛剛完成入侵時分泌到寄生泡邊緣。
背景技術：
剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)屬於原生動物門，頂復亞門，孢子蟲綱，球蟲亞綱，真球蟲目，艾美耳亞目，肉孢子蟲科，弓形蟲屬，於1908年被發現和命名。弓形蟲的生活史包括有性生殖階段(球蟲型生活史)和無性生殖階段。弓形蟲只有在終末宿主貓科動物腸上皮細胞中進行有性生殖，但是可以在任何一種溫血動物體內進行無性生殖，如哺乳動物和鳥類，甚至有報導表明在適宜的溫度下，某些爬行動物體內也有弓形蟲繁殖。因此弓形蟲是一種寄生範圍廣泛的人畜共患的機會致病性原蟲。該病不僅給畜牧業發展帶來很大影響，也嚴重威脅人類健康。在我國，於恩庶於20世紀50年代在貓、兔等動物體內發現了弓形蟲。上世紀7(T80年代，弓形蟲病曾經在豬群中爆發，引起豬群大批死亡，造成了嚴重危害。弓形蟲常常與其它病原混合感染，成為了一種重要的家畜致病因素。在人類中，全球大約有1/3的人感染有弓形蟲，我國居民的弓形蟲感染率為7.9%。正常的成年人感染弓形蟲後一般自愈，沒有症狀或者症狀很輕，但是弓形蟲感染對於孕婦、免疫力低下、免疫缺陷的人群危害嚴重。弓形蟲病可以導致孕婦的流產、胎兒畸形並危及免疫缺陷病人的生命。另有相關研究表明弓形蟲的隱性感染可能導致人的行為變化，與精神疾病有一定的相關性。

弓形蟲隱性感染雞是一類隱蔽性高、容易忽視的重要弓形蟲傳染源。散養雞從泥土地採食，極易接觸到由貓糞中的弓形蟲汙染的泥土，從而感染弓形蟲。雞感染弓形蟲後體內存在弓形蟲包囊，本身卻沒有顯著症狀，不易被發現帶蟲。人類攝入感染弓形蟲的雞肉時，如果烹調不充分或生熟食相互汙染，則容易被雞肉中的弓形蟲包囊感染。弓形蟲感染的檢測方法有很多。傳統的病原學診斷方法、DT染色實驗、凝集試驗，而弓形蟲ELISA抗體檢測法具有簡便易行、靈敏度高、易於標準化、自動化的特點，是一種良好的血清學檢測手段。目前國內市售的雞弓形蟲感染抗體診斷試劑盒存在抗體檢出時間短，弓形蟲感染後期無法檢出的問題。由於包被抗原的選擇是決定ELISA檢測效率的關鍵，這些問題的形成很可能是由包被抗原的選擇未經優化引起的。

發明內容
本發明的目的在於提供一種用於弓形蟲感染的診斷抗原。該抗原GRA8 (緻密顆粒蛋白)位於速殖子緻密顆粒上，由267個胺基酸組成，在弓形蟲入侵細胞的過程中和弓形蟲剛剛完成入侵時分泌到寄生泡邊緣。本發明的另一目的在於提供一種用於弓形蟲感染的診斷抗原的製備方法。
本發明的目的可以通過以下技術方案實現:胺基酸序列為SEQ ID N0:4的GRA8蛋白在製備弓形蟲感染的分子生物學診斷試劑盒或血清學診斷試劑盒中的應用。核苷酸序列為SEQ ID NO:1的GRA8基因在製備弓形蟲感染的分子生物學診斷試劑盒或血清學診斷試劑盒中的應用。核苷酸序列為SEQ ID NO:1的GRA8基因編碼的蛋白在製備弓形蟲感染的分子生物學診斷試劑盒或血清學診斷試劑盒中的應用。一種用於弓形蟲感染的診斷抗原的製備方法，包括以下步驟:(I)設計引物 P1、P2:
Pl: 5』一CCGGAATTCATGGCTTTACCATTGCGTGTT—3』，P2: 5』一CCCAAGCTTTTAATTCTGCGTCGTTACGGT—3』 ；(2)採用一步法提取弓形蟲的總RNA ；(3)cDNA的合成:以上述的總RNA為模板，用oligo dT18為引物進行反轉錄，合成cDNA第一鏈；(4) GRA8基因的RT-PCR擴增:以cDNA為模板，以PI和P2為引物進行RT-PCR擴增；(5)克隆GRA8基因:取上述獲得的RT-PCR擴增產物在1%瓊脂糖凝膠上電泳後，切下目的條帶回收純化，得到純化的PCR產物，取純化的PCR產物與pMD18-T載體連接，連接產物轉化感受態大腸桿菌DH5 a，挑取陽性克隆菌，提取質粒，確定為PMD18-T-GRA8 ；(6) GRA8基因的表達:分別用EcoRI和Hind III雙酶切克隆質粒載體PMD18-T-GRA8和pET28a，回收GRA8目的基因和pET28a大片段，按比例進行連接，連接產物轉化感受態大腸桿菌BL21，提取質粒，用Hind III和EcoRI雙酶切鑑定，確定為pET28a-GRA8 ；(7)表達產物的純化:使用ImM濃度的IPTG誘導在LB培養基中培養的GRA8表達菌，離心收集菌體，破碎分離，得到包涵體，向包涵體中加入ElutionBuffer並於4°C過夜溶解包涵體離心取上清並濾膜過濾後得蛋白樣品，將蛋白質樣品進行組氨酸親和層析純化得目的蛋白。上述的製備方法，其在於一步法提取弓形蟲總RNA的步驟為:取IO7純化好的弓形蟲速殖子置於DEPC處理過的玻璃勻漿器中，加入I mLTrizol試劑，研磨5 15min，勻漿後溶液置1.5 mLeppendorf管中，加入0.2 mL 24:1的氯仿/異戍醇混合物，用力搖動樣品10 20 S，置冰上3 8 min ;然後4°C 12000r/min，離心15 min ;將含有RNA的上層水相轉到另一 eppendorf管中並置冰上；向上清內加入0.5 mL冰冷異丙醇,輕輕混勻樣品並置冰上；5 15 min後4°C 12000 r/min,離心15 min,去掉異丙醇,加入I mL75%乙醇洗漆RNA沉澱,通過搖晃或吸打使RNA沉澱重新懸浮；4 °C 12000r/min離心8 min ;去掉乙醇,乾燥；加入20 u LDEPC水溶解沉澱得弓形蟲總RNA。上述的製備方法，其在於合成cDNA第一鏈的反應體系，以總體積20 y L計各組分為 總RNA 10 u L，oligo dT 2u L,混勻後70°C變性lOmin，迅速冰浴2min，再加入下列成分 5XRT Buffer 4 u L, dNTP (IOmM) 1.0 u L, M-MLV 反轉錄酶(5U/y L) 1.0 y L，RNasineInhibitor (40U/y L) 0.5 y L，無 RNase 水補至 20 y L ;反應條件為:42°C 反應lh，70°C溫浴15min，冰上冷卻後得cDNA。上述的製備方法，其在於以總體積為50ii L計，RT-PCR擴增GRA8基因的反應體系為:cDNA 模板 2.0ii L，10XPCR Buffer 5iiL，25mM 的 MgCl2 5yL，上遊引物 Pl (IOpM)2iiL，下遊引物P2 (IOpM) 2 u L, LA Taq酶(5U/y L)0.5 y L，補加滅菌超純水至50 y L ;反應條件為:於PCR儀上95°C預變性lmin，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸60s，30個循環，72°C延伸10 min。上述的製備方法，其在於克隆GRA8基因時，以總體積為10 ii L計，純化的PCR產物與PMD18-T載體連接的反應體系為:純化的PCR產物4.5iil，pMD18_T載體0.5yl，Ligation solution I 5.0 ii I,將上述反應體系中的各組分在薄壁eppendorf管中混合均勻後11°C連接過夜。一種弓形蟲感染的診斷抗原，該診斷抗原位於速殖子緻密顆粒上，包含267個胺基酸，其胺基酸序列如SEQ ID N0:4。該診斷抗原的篩選和鑑定的技術路線如下:(I)人工構建弓形蟲的動物模型。(2)腹腔注射弓形蟲速殖子。(3)長時間採集感染動物血清，與弓形蟲全蟲蛋白進行免疫印跡，篩選抗原蛋白條帶。(4)篩選出的抗原蛋白條帶進行雙向電泳，再將抗原蛋白點進行MALD1-T0F-T0F質譜鑑定，從而獲得單一抗原蛋白。(5)重組抗原蛋白，進行ELISA檢驗條件的建立和效果驗證。本發明利用Western blot法篩選家雞在弓形蟲感染過程中早期、中期、後期識別率均較高的抗原條帶並確定編 碼基因GRA8，旨在增加弓形蟲的檢出時間和檢出效果。本發明的有益效果:解決了目前市場上銷售的雞弓形蟲抗體檢測ELISA試劑盒存在抗體檢出時間短，對感染後期抗體無法檢出的缺點。應用該診斷抗原進行ELISA法診斷有著採樣簡單，對檢測設備要求低，檢測結果敏感性高、特異性高的特點，同時解決了一些使用速殖子天然抗原製作的ELISA試劑盒是存在的特異性差、假陽性率高的問題。


圖1為GRA8基因的T載體雙酶切鑑定其中，M:分子量標準 DL2000 ；1:pMD-18T_GRA8 質粒酶切前；2:pMD-18T_GRA8 質粒酶切後圖2為pET28a_GRA8雙酶切鑑定其中，M:分子量標準DL5000 ；1:pET28a_GRA8質粒酶切前；2:pET28a_GRA8質粒酶切後圖3 為 BL21-pET28a_GRA8 的誘導表達其中，M:分子量標準；1:BL21-pET28a空載體誘導前；2:BL21-pET28a空載體誘導後；3:BL21-pET28a-GRA8 誘導前；4，5，6，7:BL21-pET28a-GRA8 誘導後 1,2,4, 6h圖4為重組蛋白rGRA8的組氨酸親和層析純化結果
其中，M:分子量標準；I:純化後的rGRA8蛋白圖5為GRA8重組蛋白的抗原性Western blot結果其中，M:分子量標準；1:純化後的GRA8蛋白與陽性血清的Western blot ；2:純化後的GRA8蛋白與陰性血清的Western blot
具體實施例方式基礎材料:1.弓形蟲RH株:來源於國家獸醫微生物菌種保藏管理中心，保藏號為CVCC3217(L)。2.實驗動物:0日齡的小公雛購自南京某種雞場，自出殼至實驗結束時飼養在嚴格消毒，自由採食和飲水。
3.質粒與菌種:宿主菌 E.coli DH5 a、BL21,質粒 pET28a(+)、pMD18_T vector克隆載體，購自大連寶生物(TaKaRa)工程有限公司4.工具酶與試劑:Trizol試劑為Promega公司產品；DEPC為Amresco公司產品；Bioshop公司人淋巴細胞分離液；Bio-Rad公司1%低熔點瓊脂糖封閉液；博士德公司DAB顯色試劑盒；Millipore 公司 0.45 u m NC 膜;反轉錄酶 AMV、Oligo (dT) 18、rTaq 酶、dNTP、DNA分子量標準物DL2000、T4 DNA Ligase、限制性內切酶，水飽和酚、瓊脂糖膠回收試劑盒均為大連寶生物(TaKaRa)工程有限公司產品；其餘試劑為國產分析純。5.主要儀器設備:冷凍臺式離心機(Eppendorf centrifuge 5417R);紫外可見分光光度計(Bio-Rad) ;PCR儀(HYBAID公司)；空氣浴搖床(THZ，江蘇太倉市實驗設備廠)；紫外分析儀(WD-9304 C型，北京市六一儀器廠)；Bio-Rad PAGE系統、半乾轉系統；電熱封口機；脫色搖床；Bio-rad凝膠成像系統；微量移液器(GILS0N公司)。實施例1.弓形蟲感染診斷抗原的篩選和鑑定1.1弓形蟲的擴增和純化取弓形蟲RH株約5 X IO6腹腔注射健康清潔級ICR小鼠，飼養3天後斷頸處死，使用滅菌生理鹽水衝洗小鼠腹腔，收集含有弓形蟲速殖子的淋巴細胞，並使用淋巴細胞分離液純化速殖子，去除淋巴細胞，進行純化。1.2雞弓形蟲人工感染模型的建立和血清採集購I日齡雛雞，飼養2周齡時按照每隻雛雞IO7的劑量腹腔注射弓形蟲JS株，在攻蟲後不同時間採集並分離血清。1.3速殖子全蟲蛋白的提取和Western blot將純化後的速殖子生理鹽水懸液血球計數板計數後離心，按照2X108/ml的最終比例加入等量的水和2 X SDS-PAGE上樣緩衝液，95°C加熱5min裂解速殖子，使用2ml無菌注射器和小號針頭反覆抽吸5-10次，95°C再次保溫10min，4°C 12000r/min離心lOmin，進行SDS-PAGE電泳。SDS-PAGE結束後，立即卸膠，將蛋白膠在轉印緩衝液中平衡10_15min，再將膠上的蛋白轉印到NC膜上，封閉液中，4-8°C封閉過夜。然後與不同的血清在雜交袋中室溫振蕩孵育L 5h，封閉液封閉，用0.05%TBST洗滌IOminX 4次，將膜用goat anti chickenIgY封閉液室溫中反應lh，TBST洗滌IOminX4次後，使用博士德DAB顯色試劑盒避光顯色5-10min，使用去離子水終止顯色。根據顯色結果選取陽性較強、且跨度時間長的抗原蛋白進行分析。1.4抗原蛋白的回收和質譜鑑定按1.3中的方法獲得弓形蟲全蟲蛋白SDS-PAGE電泳膠，參照1.3的結果切下對應抗原蛋白分子量區域的聚丙烯醯胺凝膠，截成較短的小條，放入透析袋，加入含有PMSF的TGS電泳緩衝液2ml，封緊袋口充分浸泡。然後電洗脫70min。電洗脫後，濃縮蛋白洗脫液至Iml左右。移至EP管，用丙酮沉澱處理後進行IEF聚焦電泳。電泳後，同1.3中的方法Western blot分析，根據需要挖取的需要的蛋白點，用移液器吸取超純水吹打，移入EP管中，送專業的質譜鑑定機構進行MALD1-T0F-T0F檢測，並通過蛋白資料庫檢索比對，結果為弓形蟲的GRA8蛋白，其胺基酸序列為SEQ ID N0:4。實施例2.用於弓形蟲感染的診斷抗原GRA8的製備2.1合成引物根據實施例1中獲知的弓形蟲GRA8蛋白，在Genbank中檢獲核苷酸序列，利用軟體primer premier5.0設計GRA8引物P1、P2,並送往上海英俊生物技術有限公司合成引物。序列如下:Pl: 5』 —CCGGAATTCATGGCTTTACCATTGCGTGTT— 3』 (SEQ ID NO:2)，P2: 5』 —CCCAAGCTTTTAATTCTGCGTCGTTACGGT— 3』 (SEQ ID NO:3)。其中下劃線部分分別為引入的酶切位點Hind III和EcoRI，；方框部分為起始密碼子。2.2弓形蟲總RNA的提取
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採用一步法提取弓形蟲總RNA，具體操作步驟如下:取IO7純化好的弓形蟲速殖子置於DEPC處理過的玻璃勻漿器中，加入I mLTrizol試劑，研磨10 min，勻漿後溶液置1.5mLeppendorf管中，加入0.2 mL24:1的氯仿/異戍醇混合物，用力搖動樣品15 s,置冰上5min ;然後4°C 12000r/min,離心15 min ;小心將含有RNA的水相(上層)轉到另一 eppendorf管中並置冰上；向上清內加入0.5 mL冰冷異丙醇，輕輕混勻樣品並置冰上；10 min後40C 12000 r/min，離心15 min，小心去掉異丙醇，加入I mL75%乙醇洗滌RNA沉澱，通過搖晃或吸打使RNA沉澱重新懸浮；4 V 12000r/min離心8 min;去掉乙醇，室溫(25±5°C)乾燥；加入20 y LDEPC水(無RNA酶DEPC處理的超純水)水溶解沉澱。紫外分光光度計測定RNA的含量及純度。2.3 cDNA 的合成以上述的總RNA為模板，用oligo dT18為引物進行反轉錄，合成cDNA第一鏈，反應體系為20 ii L:總RNA IOu L, oligo dT 2 y L，混勻後70°C變性lOmin，迅速冰浴2min，再加入下列成分 5XRT Buffer 4 u L, dNTP (IOmM) 1.0u L, M-MLV 反轉錄酶(5U/iiL)1.0u L, RNasineInhibitor (40U/y L) 0.5 y L，無 RNase 水補至 20yL。充分混勻，42°C反應lh。70°C溫浴15min，冰上冷卻後獲得cDNA。2.4 GRA8 的基因 RT-PCR 擴增以cDNA為模板，採用以下反應體系進行RT-PCR:cDNA模板2.0 ii L，10XPCRBuffer 5 u LjMgCl2 (25mM)5 y L，上遊引物 Pl (IOpM) 21^，下遊引物卩2 (10pM)2u L, LATaq酶(5U/ u L)0.5 u L,補加滅菌超純水至50 u L，充分混勻，於PCR儀上95°C預變性lmin，94°C變性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 608，30個循環，721:延伸 10 min。
2.5 GRA8基因的克隆(見圖1)取上述獲得的RT-PCR產物25 iil，I %瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下切下目的條帶處瓊脂糖凝膠，用大連寶生物公司的膠回收試劑盒回收純化目的片段，方法參照說明書。取純化的PCR產物與pMD18-T載體連接，反應體系如下:
權利要求
1.胺基酸序列為SEQID N0:4的GRA8蛋白在製備弓形蟲感染的分子生物學診斷試劑盒或血清學診斷試劑盒中的應用。
2.核苷酸序列為SEQID NO:1的GRA8基因在製備弓形蟲感染的分子生物學診斷試劑盒或血清學診斷試劑盒中的應用。
3.核苷酸序列為SEQID NO:1的GRA8基因編碼的蛋白在製備弓形蟲感染的分子生物學診斷試劑盒或血清學診斷試劑盒中的應用。
4.一種用於弓形蟲感染的診斷抗原的製備方法，其特徵在於包括以下步驟: (1)設計引物PUP2:Pl: 5』一CCGGAATTCATGGCTTTACCATTGCGTGTT—3』，P2: 5』一CCCAAGCTTTTAATTCTGCGTCGTTACGGT—3』 ； (2)採用一步法 提取弓形蟲的總RNA； (3)cDNA的合成:以上述的總RNA為模板，用oligodT18為引物進行反轉錄，合成cDNA第一鏈； (4)GRA8基因的RT-PCR擴增:以cDNA為模板，以Pl和P2為引物進行RT-PCR擴增； (5)克隆GRA8基因:取上述獲得的RT-PCR擴增產物在1%瓊脂糖凝膠上電泳後，切下目的條帶回收純化，得到純化的PCR產物，取純化的PCR產物與pMD18-T載體連接，連接產物轉化感受態大腸桿菌DH5 a，挑取陽性克隆菌，提取質粒，確定為PMD18-T-GRA8 ； (6)GRA8基因的表達:分別用EcoRI和Hind III雙酶切克隆質粒載體pMD18_T_GRA8和pET28a，回收GRA8目的基因和pET28a大片段，按比例進行連接，連接產物轉化感受態大腸桿菌BL21，提取質粒，用Hind III和EcoRI雙酶切鑑定，確定為pET28a-GRA8 ; (7)表達產物的純化:使用ImM濃度的IPTG誘導在LB培養基中培養的GRA8表達菌，離心收集菌體，破碎分離，得到包涵體，向包涵體中加入ElutionBuffer並於4°C過夜溶解包涵體離心取上清並濾膜過濾後得蛋白樣品，將蛋白質樣品進行組氨酸親和層析純化得目的蛋白。
5.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於一步法提取弓形蟲總RNA的步驟為:取IO7純化好的弓形蟲速殖子置於DEPC處理過的玻璃勻漿器中，加入I mLTrizol試劑，研磨5 15min,勻眾後溶液置1.5 mLeppendorf管中，加入0.2 mL 24:1的氯仿/異戍醇混合物，用力搖動樣品10 20 S，置冰上3 8 min ;然後4°C 12000r/min，離心15 min;將含有RNA的上層水相轉到另一 eppendorf管中並置冰上；向上清內加入0.5 mL冰冷異丙醇,輕輕混勻樣品並置冰上；5 15 min後4。。12000 r/min,離心15 min,去掉異丙醇,加入I mL75%乙醇洗漆RNA沉澱,通過搖晃或吸打使RNA沉澱重新懸浮；4 V 12000r/min離心8 min ;去掉乙醇，乾燥；加入20 u LDEPC水溶解沉澱得弓形蟲總RNA。
6.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於合成cDNA第一鏈的反應體系，以總體積20 ii L計各組分為 總RNA 10 u L，oligo dT 2 u L,混勻後70°C變性lOmin，迅速冰浴2min，再加入下列成分 5XRT Buffer 4 u L, dNTP (IOmM) 1.0u L, M-MLV 反轉錄酶(5U/U L) 1.0 u L, RNasineInhibitor (40U/y L)0.5 y L，無 RNase 水補至 20 y L ;反應條件為:42°C反應lh，70°C溫浴15min，冰上冷卻後得cDNA。
7.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於以總體積為50ii L計，RT-PCR擴增GRA8 基因的反應體系為:cDNA 模板2.0 y L，IOXPCR Buffer 5iiL，25mM 的 MgCl2 5u L,±遊引物 Pl (IOpM) 2iiL，下遊引物 P2 (10pM)2u L, LA Taq 酶(5U/y L) 0.5 y L，補加滅菌超純水至50 ii L ;反應條件為:於PCR儀上95°C預變性lmin，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸60s，30個循環，72°C延伸10 min。
8.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於克隆GRA8基因時，以總體積為IOyL計，純化的PCR產物與pMD18-T載體連接的反應體系為:純化的PCR產物4.5 yl，pMD18_T載體0.5 ii I, Ligation solution I 5.0 ii I,將上述反應體系中的各組分在薄壁eppendorf管中混合均勻後i re連接過夜。
全文摘要
本發明公開了一種用於弓形蟲感染的診斷抗原及其製備方法和應用，屬於生物獸藥技術領域。利用Western blot、雙向電泳、MALDI-TOF-TOF串聯質譜鑑定相結合的方法篩選到一種適宜於弓形蟲感染診斷的抗原GRA8。本抗原可用於弓形蟲感染的各種分子生物學診斷和血清學診斷的應用。
文檔編號G01N33/531GK103235119SQ20131012495
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月11日 優先權日2013年4月11日
發明者李祥瑞, 徐立新, 嚴若峰, 宋小凱, 李銳 申請人:南京農業大學