抑制副粘病毒感染的抗病毒組合物的製作方法

2023-07-16 22:57:16 1

專利名稱：：抑制副粘病毒感染的抗病毒組合物的製作方法
技術領域：
：本發明大體上涉及微生物學、病毒學、傳染性疾病和免疫學領域。更具體來說，本發明涉及抑制或預防哺乳動物中的副粘液病毒科(副粘病毒)病毒感染的多肽、多肽片段和有機小分子。
背景技術：
：呼吸道合胞病毒(RSV)是非分節負鏈RNA病毒，而且是嬰幼兒、患有潛在疾病或免疫異常的患者和老年人中下呼吸道(LRT)疾病的主要起因(Domachowske和Rosenberg，1999；Hall，2001)。事實上，全球每年發生65,000,000例RSV感染，導致160,000人死亡(Robbins和Freeman，1988)。僅在美國，每年有100,000名因受RSV感染而患有嚴重肺炎和細支氣管炎的兒童被送進醫院治療(Glezen等人，1986；Katz，1985)。1992年估計美國感染上RSV的住院和不必住院的兒童的開支超過每年340000000美元(Wertz和Sullender，1992)。目前沒有預防人類疾病的得到許可的疫苗。因此，季節性流行病期間所出生的無免疫性嬰兒必須依賴於從母親得到的抗體來預防由RSV引發的嚴重LRT疾病。對於高風險嬰兒來說，由於母親的免疫狀況和得自母親的抗體的有限半衰期，因此這可能產生問題。目前已經批准兩個生物藥品IVIG和人類化單克隆抗體帕利珠(palivizumab)(Synagis)來預防高風險嬰兒的感染(Hall，2001；Krilov，2002)。儘管免疫預防的益處是明顯的，但是開支卻是巨大的。除了上述生物藥品之外，還存在一種得到許可的藥劑利巴韋林(ribavirin)來治療由RSV所引發的急性呼吸道疾病(Torrence和Powel，2002)。然而，利巴韋林是致畸劑，並且對醫院工作人員、父母和其他生育年齡的親屬造成安全風險；因此利巴韋林的益處是有爭議的(Hall，2001；Krilov，2002)。因此，在缺少得到許可的疫苗的情況下，目前極為需要具有改良效力和增加安全性的新穎醫藥和/或生物化合物來預防由例如RSV的副粘病毒所引發的LRT疾病。
發明內容本發明廣泛涉及抑制或預防哺乳動物中感染的抗病毒組合物。更具體來說，本發明涉及抑制或預防哺乳動物中的副粘液病毒科(副粘病毒)病毒感染的新穎抗病毒分子和其醫藥組合物。因此，在某些實施例中，本發明針對包含CCL5多肽的抗病毒組合物，其中CCL5多肽抑制哺乳動物受檢者中的副粘液病毒科(副粘病毒)病毒感染。在一個特定實施例中，副粘病毒是呼吸道合胞病毒(RSV)。在另一個實施例中，CCL5多肽通過阻斷RSV融合(F)蛋白與哺乳動物上皮細胞之間的互作來抑制RSV感染。在某些實施例中，CCL5多肽是合成CCL5多肽或重組表達的CCL5多肽。在某些其他實施例中，CCL5多肽在哺乳動物受檢者中是作為無生物活性的趨化因子。在一個特定實施例中，所述哺乳動物受檢者是人類。在其他實施例中，所述哺乳動物受檢者是經馴養的非人類哺乳動物，其選自由牛、馬、豬、狗、貓、山羊和綿羊組成的群組。在另一個實施例中，CCL5多肽包含SEQIDNO1的胺基酸序列。在某些實施例中，CCL5多肽是NH2-末端經修飾的CCL5多肽。在一個特定實施例中，NH2-末端經修飾的CCL5多肽選自由氨氧基戊烷-CCL5(AOP-CCL5)、Met-CCL5、Nα-壬醯基-CCL5(NNY-CCL5)、Δ1-2截短型CCL5和Δ1-8截短型CCL5組成的群組。在其他實施例中，本發明的抗病毒組合物進一步包含一個或一個以上的CCL5肽片段，其中所述片段包含SEQIDNO1的CCL5多肽的約10至20個相鄰胺基酸。在特定實施例中，所述一個或一個以上CCL5肽片段選自由SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO7、SEQIDNO8、SEQIDNO9、SEQIDNO10、SEQIDNO11、SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14、SEQIDNO15、SEQIDNO16、SEQIDNO17和SEQIDNO18組成的群組。在其他實施例中，CCL5肽片段包含SEQIDNO2的胺基酸序列。在某些實施例中，SEQIDNO2肽片段進一步被定義為SEQIDNO1的NH2-末端肽。在某些其他實施例中，CCL5多肽被進一步定義為人類CCL5多肽。在其他實施例中，本發明的抗病毒組合物進一步包含SEQIDNO1的CCL5多肽的NH2-末端的肽模擬物。在一個特定實施例中，CCL5多肽的NH2-末端的肽模擬物是包含SEQIDNO19、SEQIDNO20或SEQIDNO21胺基酸序列的逆轉CCL5多肽。在某些其他實施例中，本發明的抗病毒組合物進一步包含結合CCR3趨化因子受體的有機分子。在某些所述實施例中，所述有機分子是CCR3受體拮抗劑。在一個特定實施例中，所述有機分子包含一個或一個以上的以下化學結構在某些其他實施例中，本發明的抗病毒組合物是藉由鼻內投藥或非經腸投藥而投與哺乳動物受檢者。在其他實施例中，本發明的抗病毒組合物進一步包含為CCR1拮抗劑或CCR5拮抗劑的有機分子。在某些實施例中，為CCR1拮抗劑的有機分子包含一個或一個以上的以下化學結構在某些實施例中，為CCR5拮抗劑的有機分子包含一個或一個以上的以下化學結構在其他實施例中，本發明針對包含編碼CCL5多肽的多核苷酸序列的重組表達載體。在其他實施例中，本發明針對經包含編碼CCL5多肽的多核苷酸序列的載體轉染、轉化或侵染的宿主細胞。在另一個實施例中，本發明針對包含CCL5多肽的NH2-末端肽片段的抗病毒組合物，其中所述片段包含CCL5多肽的NH2-末端的約10至20個相鄰胺基酸，其中所述片段抑制哺乳動物受檢者中的副粘液病毒科(副粘病毒)病毒感染。在一個特定實施例中，副粘病毒是RSV。在另一個實施例中，CCL5多肽包含SEQIDNO1胺基酸序列。在其他實施例中，NH2-末端肽片段包含選自由以下序列組成的群組的胺基酸序列SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO7、SEQIDNO8、SEQIDNO9、SEQIDNO10、SEQIDNO11、SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14、SEQIDNO15、SEQIDNO16、SEQIDNO17和SEQIDNO18。在某些實施例中，NH2-末端多肽片段包含SEQIDNO2胺基酸序列。在某些實施例中，所述組合物在哺乳動物受檢者中是作為無生物活性的趨化因子。在其他實施例中，所述抗病毒組合物是藉由鼻內投藥或非經腸投藥而投與哺乳動物受檢者。在其他實施例中，NH2-末端的CCL5肽片段通過阻斷RSV融合(F)蛋白與哺乳動物上皮細胞之間的互作來抑制RSV感染。在某些其他實施例中，所述抗病毒組合物進一步包含一個或一個以上選自由氨氧基戊烷-CCL5(AOP-CCL5)、Met-CCL5、Nα-壬醯基-CCL5(NNY-CCL5)、Δ1-2截短型CCL5和Δ1-8截短型CCL5組成的群組的NH2-末端經修飾的CCL5多肽。在一個實施例中，抗病毒組合物進一步包含SEQIDNO1的CCL5多肽的NH2-末端的肽模擬物。在一個特定實施例中，CCL5多肽的NH2-末端多肽模擬物是包含SEQIDNO19、SEQIDNO20或SEQIDNO21胺基酸序列的逆轉CCL5多肽。在另一個實施例中，抗病毒組合物進一步包含為CCR1受體、CCR3受體或CCR5受體的拮抗劑的有機分子。在一個特定實施例中，CCR1受體、CCR3受體或CCR5受體的拮抗劑包含如由式I-XII所示的化學結構。在某些其他實施例中，本發明針對包含編碼NH2-末端CCL5肽片段的多核苷酸序列的重組表達載體。在某些其他實施例中，本發明針對經包含編碼NH2-末端CCL5肽片段的多核苷酸序列的載體轉染、轉化或侵染的宿主細胞。在某些其他實施例中，本發明針對通過基於計算機的分子模型化而設計的有機小分子模擬物，所述基於計算機的分子模型化使用SEQIDNO1的前15個CCL5NH2-末端胺基酸的原子X、Y、Z坐標，其中X、Y、Z坐標見於選自由1RTN、1RTO、1EQT和1B3A組成的群組的BrookhavenProteinDataBank文件。在另一個實施例中，本發明針對包含上述由基於計算機的分子模型化而設計的有機分子的抗病毒組合物。在某些其他實施例中，本發明針對CCL5多肽的NH2-末端的肽模擬物，其中所述多肽模擬物抑制哺乳動物受檢者中的副粘液病毒科(副粘病毒)病毒感染。在某些實施例中，所述模擬物是通過使用SEQIDNO1的前15個CCL5NH2-末端胺基酸的原子X、Y、Z坐標的基於計算機的分子模型化而設計，其中X、Y、Z坐標包含於選自由1RTN、1RTO、1EQT和1B3A組成的群組的BrookhavenProteinDataBank文件中。在一個特定實施例中，肽模擬物是回折模擬物。在某些實施例中，回折模擬物是β-轉角模擬物、單環β-轉角模擬物、雙環β-轉角模擬物、γ-轉角模擬物或單環γ-轉角模擬物。在某些其他實施例中，肽模擬物包含於抗病毒組合物中。在某些其他實施例中，本發明針對預防或抑制哺乳動物宿主中的副粘液病毒科(副粘病毒)病毒感染的方法，所述方法包含對所述宿主投與醫藥學有效量的本發明抗病毒組合物。根據以下詳細描述，根據其優選實施例並且根據權利要求書，本發明的其他特徵和優勢將變為顯而易見。圖1展示CCL5抑制上皮表面處的RSV感染。Hep-2單層在受RSVA2感染之前，經指定劑量的重組rCCL5(環形)或met-CCL5(正方形)預處理(感染前一小時)。三天後，計數菌斑，並表示為相對於僅經培養基中病毒培養而未暴露於趨化因子的對照孔(100％感染率)的感染百分比(±1標準偏差)。圖2展示HEp-2和A549細胞上CCR1、CCR3和CCR5的表達。用細胞刮取器將HEp-2和A549細胞單層從組織培養瓶中小心地移出。用與藻紅蛋白結合的抗人類CCR1或抗CCR3mAb，或者與FITC結合的抗CCR5(FL2-H，x軸，實線)來染色細胞。y軸展示相對細胞數目(計數)。圖3展示CCL5的重疊合成肽與Hep-2細胞單層的結合。用遞增濃度(0.0039-4.0μg/ml)的所示經生物素標記的肽培養(4℃)可存活Hep-2細胞單層。衝洗之後，將單層固定在甲醇中，並且通過OD450-550下的ELISA來觀察肽的結合。圖4A和4B展示CCL5多肽對CCL3多肽的水療法曲線。圖4A是CCL5(SEQIDNO1的胺基酸5至68)與CCL3(SEQIDNO22的胺基酸5至69)比對的水療法曲線。圖4B是CCL5(SEQIDNO1的胺基酸5至31)與CCL3(SEQIDNO22的胺基酸5至31)比對的水療法曲線。用Kyte和Doolittle(1982)的胺基酸水療法值產生y軸的水療法標尺，其具有9胺基酸移動平均窗口。標尺上負水療法值表示親水性環境，而標尺上正數表示疏水性環境。具體實施例方式本發明下文的描述是關於所屬
技術領域：
需要用於投與易受副粘病毒感染，尤其是呼吸道合胞病毒(RSV)感染的哺乳動物宿主(例如人類)的有效抗病毒分子。因此，在某些實施例中，本發明針對新穎抗病毒分子和其醫藥組合物。如下文所定義，本發明的「抗病毒分子」是「多肽」、「趨化因子多肽」、趨化因子「多肽片段」(下文「肽片段」)、「有機小分子」(或「小分子模擬物」)或「肽模擬物(peptidemimetic)」(或「擬肽(peptidomimetic)」)，其中所述抗病毒分子抑制或預防哺乳動物細胞的副粘病毒感染。趨化因子是在指引細胞朝向受傷或感染部位運動中起重要作用的小分子量細胞因子(Baggiolini，2001)。舉例來說，人們認為趨化因子CCL5(也稱為「RANTES」；其是對調控活化、正常T細胞表達和分泌的英文首字母縮寫)在對由RSV複製所引起的組織傷害區域的白細胞募集方面起主要作用(Appay和Rowland-Jones，2001；Moser和Loetscher，2001)。基於保守半胱氨酸基序的數目和間距將趨化因子分為亞家族，將其命名為C、CC、CXC和CX3C。先前已經確定，經RSV感染誘導氣道上皮細胞中的基因表達和趨化因子分泌(Harrison，1999；Noah等人，2002；Zhang，2001)。此外，CC家族的某些趨化因子多肽已經展示擁有有效對抗人類免疫缺失病毒1型(HIV-1)的抗病毒特性(Lusso，2002；Lehner，2002；Proudfoot等人，2003)。舉例來說，HIV-1通過結合CCR5作為主要共受體而進入T細胞和巨嗜細胞。趨化因子多肽CCL5(RANTES)、CCL3(MIP-1α)和CCL4(MIP-1β)是阻斷CCR5作為HIV-1共受體並進而預防HIV-1感染的抑制性配體。本發明首次展示重組CCL5(rCCL5)多肽、N-末端經修飾CCL5多肽和N-末端CCL5肽片段(a)抑制人類上皮細胞受RSV感染(實例2)，(b)阻斷上皮細胞與RSV的融合(F)蛋白的互作(實例3)，且(c)抑制活體內RSV感染(實例4)。與所公開的HIV-1感染的趨化因子抑制的報導相反(例如趨化因子CCL3、CCL4和CCL5)(Lusso，2002；Lehner，2002；Proudfoot等人，2003)，本發明的數據證明僅發生CCL5的RSV感染的趨化因子抑制，而其他例如CCL3(MIP-1α)或CCL4(MIP-1β)的CC抑制劑並不發生(參看實例2)，這表明RSV可能利用不同於CCR5的受體(即，與HIV-1相反)。通過已知與CCL5結合的受體(CCR1、CCR3和CCR5)的流式細胞術來檢查人類上皮細胞。結果證實，CCR3(而非CCR1或CCR5)是在HEp-2和A549上皮細胞的表面上表達(參看，實例3和圖1)，這表明CCL5阻斷上皮細胞表面上RSV與CCR3之間的互作。測試其他已知與CCR3結合的重組CC趨化因子(Baggiolini，2001)，以確定其是否也降低RSV感染性。用遞增量的重組CCL11(嗜酸性粒細胞趨化因子(eotaxin))、CCL8(MCP-2)或CCL15(MIP-1δ)來預先處理HEp-2細胞單層並不減弱RSV感染性(表10和表12)。此外，在針對CCR1、CCR3和/或CCR5的多或單克隆抗趨化因子受體抗體的存在下預培養HEp-2細胞單層並不降低RSV感染性(數據未顯示)。先前已經證實，活體外，使用缺少SH(小疏水性)蛋白和/或G(粘附)蛋白的突變RSV菌株，僅F(融合)蛋白足以介導RSV粘附(Karron等人，1997)。因此，通過檢查rCCL5抑制缺失G蛋白和/或SH蛋白的RSV菌株的感染的能力來進一步研究CCL5抑制。用缺失SH蛋白(RSVΔSH)或G蛋白C-末端的外部域截去胺基酸118(RSVΔ118)的經遺傳修飾的RSV菌株來進行一系列研究。所述研究表明，相對於僅經培養基中病毒培養的對照細胞，經10μg/mlrCCL5或Met-CCL5預處理降低RSVΔ118和RSVΔSH病毒的感染率。用rCCL5(10μg/ml)預先處理也降低突變cp32/D1(缺少SH和G蛋白)和RSV的親代B1菌株的感染(實例3，表15)。因此，rCCL5抑制缺失G和/或SH蛋白的RSV菌株的感染。為了確定CCL5抑制RSV感染的區域，合成代表SEQIDNO1的所有68個胺基酸的一系列9個CCL5肽片段(15聚體，由7個胺基酸重疊)(實例4和表2)，並且在用於感染的活體內小鼠模型中測試。當與RSV感染同時投與或在RSV感染之前投與時，代表CCL5NH2-末端前15個胺基酸殘基的肽1(SEQIDNO2)是活體內的主要抑制肽(實例4，表16和表17)。總而言之，本發明的數據表明新穎的CCL5抑制機制，其中CCL5阻斷髮生在RSV包膜中的F蛋白與上皮細胞表面之間的互作。此外，已經鑑定出抑制RSV感染的代表CCL5的NH2-末端部分的CCL5肽片段。因此，在某些實施例中，本發明的抗病毒分子是CCL5多肽、NH2-末端經修飾的CCL5多肽、NH2-末端CCL5肽片段、經修飾NH2-末端CCL5肽片段、設計以模擬CCL5多肽的NH2-末端部分的肽模擬物或設計以模擬CCL5多肽的NH2-末端部分的小分子，其中所述抗病毒分子抑制或預防哺乳動物細胞，尤其是上皮細胞的副粘病毒感染。如下文所定義，「副粘病毒」涵蓋副粘液病毒科的病毒，其包括(但不限於)RSV、副流感病毒(PIV)1-4型、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人類偏肺病毒(humanMetapneumovirus)、尼派(Nipah)病毒、亨德拉(Hendra)病毒、牛瘟病毒和犬瘟病毒。A.抗病毒分子如上文所述，本發明的抗病毒分子是抑制或預防哺乳動物細胞的副粘病毒感染的多肽、肽片段、有機小分子或肽模擬物。更具體來說，抗病毒分子是阻斷、抑制或預防副粘病毒F蛋白與上皮細胞表面受體之間互作，進而阻止副粘病毒進入細胞的多肽、肽片段、有機小分子或肽模擬物。本發明的抗病毒多肽(和其片段)和抗病毒肽模擬物/小分子模擬物分別在下文部分A.1和A.2闡述。1.CCL5多肽和其片段在某些實施例中，本發明的抗病毒分子是CCL5多肽，經化學修飾的CCL5多肽或經遺傳修飾的CCL5多肽。在一個特定實施例中，CCL5多肽在其NH2-末端經修飾。在其他實施例中，本發明的抗病毒分子是NH2-末端CCL5肽片段、經化學修飾的NH2-末端CCL5肽片段或經遺傳修飾的NH2-末端CCL5肽片段，其中所述肽片段包含抑制哺乳動物細胞的副粘病毒感染的CCL5多肽的NH2-末端部分。如下文所定義，全長CCL5多肽具有約7.8kDa的分子量，並且包含SEQIDNO1胺基酸序列。在某些實施例中，SEQIDNO1的全長CCL5多肽是合成多肽或重組表達CCL5多肽。本發明的全長CCL5多肽包含與SEQIDNO1胺基酸序列具有至少95％一致性的胺基酸序列，其中所述多肽抑制或預防哺乳動物細胞的副粘病毒感染。因此，CCL5多肽涵蓋包含以下物質的多肽(a)SEQIDNO1所示的胺基酸序列，(b)SEQIDNO1多肽的天然發生等位變體，(c)從除人類之外的生物體分離的多肽(例如，CCL5多肽的直系同源物)和(d)SEQIDNO1的NH2-末端經修飾的CCL5多肽。根據本發明CCL5多肽的等位變體涵蓋以下情況的多肽(1)從人類細胞分離，和(2)含有與SEQIDNO1人類CCL5多肽的實質同源性。CCL5多肽的等位變體是維持抑制或預防哺乳動物細胞的副粘病毒感染的CCL5多肽的天然發生胺基酸序列變體。因此，將CCL5多肽的等位變體定義為「功能性變體」。功能性變體僅含有SEQIDNO1的一個或一個以上胺基酸的保守性置換，或者多肽非關鍵區內非關鍵殘基的置換、缺失或插入。舉例來說，觀察到NH2-末端CCL5肽片段(SEQIDNO2)抑制哺乳動物上皮細胞的副粘病毒感染(實例4)。此外，HIV-1感染的CCL5抑制的結構和功能研究進一步揭示胺基酸殘基Phe12、Tyr14和Ile15對於抗HIV-1活性是至關重要的(Nardese等人，2001)。因此，在某些優選實施例中，全長CCL5多肽的等位變體包含實質上與SEQIDNO1的人類多肽同源的多肽，其中所述多肽不包含胺基酸Phe12、Tyr14和Ile15的置換或缺失。本發明進一步提供CCL5多肽的非人類直系同源物。CCL5多肽的直系同源物是從非人類哺乳動物類有機物分離的多肽，並且擁有CCL5多肽的抗病毒特性。可輕易地鑑別出CCL5多肽的直系同源物包含與SEQIDNO1實質上同源的胺基酸序列。例如BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool；Altschul等人，1990)、AACompIdent和AACompSim(Wilkens等人，1998)的程序是在SwissInstituteofBioinformatics(SIB)的ExPASy(ExpertProteinAnalysisSystem)蛋白組學伺服器上公開可用的，並且尤其可用於鑑別公開資料庫中的同源多肽，這些公開資料庫例如GenBank、ProteinDataBank(PDB)、SwissProt、ProteinInformationResource(PIR)和ProteinResearchFoundation(PRF)。如先前所闡述，趨化因子(也稱為趨化細胞因子)是在指引或募集細胞(例如單核細胞)朝向受傷或感染部位運動中起重要作用的小分子量(例如，約8-10kDa)多肽。在某些實施例中，CCL5多肽(或其片段)是經化學修飾的CCL5多肽或經遺傳修飾的CCL5多肽，使得經修飾的CCL5多肽在哺乳動物受檢者中是作為無生物活性的趨化因子促效劑。舉例來說，CCL5修飾削弱、降低或鈍化CCL5多肽作為趨化因子促效劑的生物活性，其中經修飾的CCL5多肽保留其抑制副粘病毒感染的能力。如文中所定義，「趨化因子促效劑」或「趨化因子或趨化因子促效劑的生物活性」是指趨化因子多肽(例如CCL5)誘導或刺激趨化性、鈣流動、炎症和類似過程的能力。通過例如鈣流動測定、趨化性測定、N-乙醯基-β-D-氨基葡糖苷酶測定和類似測定的方法檢測或測量本發明趨化因子多肽的促效劑活性(Proudfoot等人，1996；Simmons等人，1997；Gong和Clark-Lewis，1995；Fincham，1988)(例如，參看實例6)。在某些實施例中，CCL5多肽在其NH2-末端經遺傳和/或化學修飾，其中NH2-末端修飾使CCL5失去作為趨化因子促效劑的活性。所屬
技術領域：
已經描述一些CCL5NH2-末端修飾使CCL5趨化因子失去活性。舉例來說，當保留CCL5(RANTES)的起始甲硫氨酸(Met)時，所得Met-CCL5(Met-RANTES)多肽(1)失去作為趨化因子促效劑的活性(例如，Met-CCL5不刺激或誘導Ca2+流動或趨化性)，(2)對抗CCR5受體處由CCL5和CCL3(MIP-1α)所誘導的「趨化因子」作用(Proudfoot等人，1996)和(3)抑制主要人類巨嗜細胞培養物的HIV-1感染(Simmons等人，997)。如下文所定義，「Met-CCL5」或「Met-RANTES」多肽包含SEQIDNO1胺基酸序列，並且進一步包含SEQIDNO1位置1處絲氨酸殘基的甲硫氨酸胺基酸NH2-末端。也已經描述使CCL5趨化因子失去活性的截短型NH2-末端CCL5多肽。舉例來說，Arenzana-Seisdedos等人(1996)合成了一種其中前8個胺基酸被去除(命名為RANTES(9-68))的截短型CCL5多肽(下文稱為「CCL5(Δ1-8)」)和一種其中前2個胺基酸被去除(命名為RANTES(3-68))的截短型CCL5多肽(下文稱為「CCL5(Δ1-2)」)，其中截短型多肽缺乏趨化性和白細胞活化特性並且抑制HIV-1感染。如下文所定義，「CCL5(Δ1-8)」多肽包含SEQIDNOI的胺基酸殘基9至68。如下文所定義，「CCL5(Δ1-2)」多肽包含SEQIDNO1的胺基酸殘基3至68。也已經描述使CCL5趨化因子失去活性的CCL5多肽的化學修飾。所述修飾包括向CCL5的NH2-末端絲氨酸殘基添加氨氧基戊烷基團(稱為「AOP-RANTES」或「AOP-CCL5」)(Simmons等人，1997)，和向CCL5的NH2-末端絲氨酸殘基添加Nα-壬醯基基團(稱為「Nα-壬醯基-RANTES」、「NNY-RANTES」和「NNY-CCL5」)(Mosier等人，1999)。如下文所定義，AOP-CCL5多肽包含SEQIDNO1胺基酸序列，並且進一步包含共價連接於SEQIDNO1第一個絲氨酸殘基的氨氧基戊烷基團。如下文所定義，NNY-CCL5多肽包含SEQIDNO1胺基酸序列，並且進一步包含共價連接於SEQIDNO1第一個絲氨酸殘基的Nα-壬醯基。或者，Ser1殘基經另一個胺基酸(例如Gly1)置換，其中位置1處的經置換胺基酸包含經共價連接的AOP或NNY。因此，在某些實施例中，在本發明CCL5多肽的一級序列中進行修飾和改變以使CCL5失去作為趨化因子促效劑的活性，其中經修飾的CCL5保留其抗副粘病毒特性。舉例來說，通過在一級、二級和三級結構水平上的複雜互作來確定多肽的功能和/或生物活性，並且因此可以在多肽序列(或其潛在的DNA編碼序列)中進行某些胺基酸序列置換，且獲得具有相似特性(例如抗病毒特性)的多肽。在進行這些改變時，應考慮胺基酸的水療法指數(例如，參看圖10A和10B)。所屬
技術領域：
通常應了解賦予多肽交互性生物功能的水療法胺基酸指數的重要性(例如，Kyte和Doolittle，1982；Eisenberg等人，1984；Hopp和Woods，1981)。已知某些胺基酸被具有相似水療法指數或分值的其他胺基酸所置換，並且仍然得到具有相似生物活性的多肽。舉例來說，胺基酸殘基的相對水療法特徵影響所得多肽的二級和三級結構，這又界定多肽與，例如，酶、底物、受體、抗體、抗原和類似分子的其他分子的互作。如上文所略述，胺基酸置換通常是基於胺基酸側鏈置換基的相對相似性，例如疏水性、親水性、電荷、大小等等。考慮在內的許多前述特徵的示範性置換是所屬領域技術人員所熟知的，並列於表1中。表1胺基酸置換原初示範性殘基殘基置換在某些實施例中，CCL5多肽在其NH2-末端經修飾，其中NH2-末端修飾使CCL5失去作為趨化因子促效劑的活性。因此，在某些所述實施例中，使用位點特異性突變發生在CCL5多肽的NH2-末端對其修飾(例如，CCL5Δ1-8，Arenzana-Seisdedos等人，1996)。或者，通過所屬
技術領域：
已知的化學和合成修飾在CCL5多肽(或其片段)的NH2-末端對其修飾(例如，AOP-CCL5，Simmons等人，1997；NNY-CCL5，Mosier等人，1999)。位點特異性突變發生也可用於通過優先DNA的特異突變發生來製備第二代CCL5多肽(例如，趨化活性降低的抗病毒多肽(或其片段)和/或抗病毒特性增加的CCL5多肽(或其片段))。位點特異突性變發生允許通過使用編碼所需突變的DNA序列的特異性寡核苷酸序列以及足夠數目的相鄰核苷酸來產生突變體，而提供足夠大小和序列複雜性的引物序列，以在經橫斷的缺失連接處的兩側均形成穩定雙鏈(duplex)。通常約17至25個核苷酸長度的引物為優選，其中在經改變的序列的連接處的兩側均有約5至10個殘基。位點特異性突變發生技術是所屬
技術領域：
所熟知的，並且通常採用可以單鏈和雙鏈形式存在的噬菌體載體(例如，參看美國專利第5,556,747號；美國專利第5,789,166號和美國專利第6,391,548號；各專利案全文均以引用的方式併入本文)。在特定實施例中，本發明針對CCL5多肽片段。如本文所使用術語「多肽片段」、「肽片段」和「蛋白片段」可交替使用。如下文所定義，CCL5肽片段是具有與全長和成熟CCL5胺基酸序列的部分(但非全部)完全相同的胺基酸序列的CCL5多肽。因此，多肽片段包含，例如，SEQIDNO1的CCL5多肽的至少7個或7個以上(例如，8、10、12、14、16、18、20或更多)的相鄰胺基酸。通過重組表達方法、合成肽化學或通過全長CCL5多肽的化學剪切或酶剪切生產或產生CCL5肽片段。片段是「獨立的(freestanding)」，並且包含於更大的多肽中，所述片段形成所述更大多肽的一部分或區域，最優選是單一的連續區域。在一個實施例中，CCL5肽片段包含SEQIDNO1的全長CCL5多肽的約10至20個相鄰胺基酸(例如，10聚體、11聚體、12聚體、13聚體、14聚體、15聚體等)。如實例4所描述，產生一系列9個重疊CCL5肽片段(15聚體)(參看下表2)，並且通過活體外和活體內RSV感染測定來進行測試。在這些測定中觀察到代表CCL5前15個NH2-末端胺基酸(即SEQIDNO1的胺基酸1-15)的1號肽(SEQIDNO2)是9個經測試的重疊CCL5肽中最具抑制性的。所屬
技術領域：
中也已知NH2-末端CCL5肽片段抑制淋巴細胞的HIV-1感染。舉例來說，Nardese等人(2001)設計出一系列包含形成CCL5上的疏水性片的NH2-環與β1-鏈殘基的合成12聚體肽(例如，見下文A.2部分和表5A)，跨越NH2-環與β1-鏈芳烴簇的19聚體和跨越Cysll-Cys43的環狀24聚體。所述肽在下文所指示的胺基酸位置處經乙醯化(Ac)和氨基化(NH2)。在急性感染測定中，跨越NH2-環與β1-鏈芳烴簇的19聚體(Ac-Cys11-Tyr29-NH2；SEQIDNO16)的抗HIV-1效力顯著高於NH2-環衍生的十二聚體Ac-Cys11-Ala22-NH2(SEQIDNO13)的抗HIV-1效力(平均ID50＝8.9+/-3.8μM對51.5+/-6.3μM；P＜0.0001)。缺少β1-鏈芳烴簇的兩個較短肽(Cysll-Lys25與Cys11-Glu26)的有效性較低(分別為平均ID50＝48.1+/-6.8μM與44.7+/-3.3μM)，這證明所述芳烴簇對HIV-1抗病毒活性的重要性。跨越第二與第三半胱氨酸之間整個區域的環狀24聚體(環-Cysll-Cys34；SEQIDNO17)比原初的十二聚體(SEQIDNO13)抑制HIV-1更有效(ID50＝29.8+/-1.6μM)，但比19聚體(SEQIDNO16)的低。未觀察到用來源於CXCR4配體SDF-1的共線性對照環肽的作用。這些發現證明CCL5的β1-鏈內的芳烴簇對於抗HIV-1活性是關鍵的，證明此區域連同NH2-環包含在CCR5受體界面內。對抑制RSV感染(表2；1號肽)和HIV感染(表3)的CCL5肽片段進行比對，並展示於下表4中。表4中(粗體文字)也顯示包含SEQIDNO18胺基酸序列的一致CCL5肽片段(17號肽)。表2重疊CCL5合成肽十五聚體(15聚體)的胺基酸序列表3抗HIVCCL5十二聚體(12聚體)、CCL5十九聚體(19聚體)和環24聚體的胺基酸序列表4抗RSV與抗HIV-1CCL5片段的胺基酸序列比對和一致胺基酸序列因此，在某些實施例中，CCL5肽片段包含SEQIDNO2胺基酸序列，其代表全長CCL5多肽的NH2-末端15個殘基。在其他實施例中，SEQIDNO2的CCL5肽在其一個或一個以上的NH2-末端胺基酸殘基處經修飾。在其他實施例中，CCL5肽片段包含SEQIDNO18胺基酸序列或其NH2-末端經修飾的片段。在某些其他實施例中，SEQIDNO2、SEQIDNO11、SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14、SEQIDNO15、SEQIDNO16、SEQIDNO17或SEQIDNO18的CCL5肽片段的一級和二級序列用於設計下文A.2部分中所闡述的肽模擬物或有機小分子模擬物。在本發明某些實施例中預期通過化學剪切或酶剪切將CCL5多肽剪切成片段。這通過用蛋白水解酶(即蛋白酶)處理經純化的CCL5多肽實現，蛋白水解酶包括(但不限於)絲氨酸蛋白酶(例如，胰凝乳蛋白酶、胰島素、胞漿素、彈性蛋白酶、凝血酶、substilin)、金屬蛋白酶(例如，羧肽酶A、羧肽酶B、亮氨酸氨基肽酶、嗜熱菌蛋白酶、膠原酶)、硫醇蛋白酶(例如，木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、鏈球菌(Streptococcal)蛋白酶、梭菌蛋白酶)和/或酸性蛋白酶(例如，胃蛋白酶、胃亞蛋白酶、胰蛋白酶原)。用化學手段也產生多肽片段，例如用溴化氰(CNBr)、2-硝基-5-硫氰基苯甲酸、異苯甲酸、BNPA-糞臭素、羥胺或稀酸溶液處理多肽。在其他實施例中，本發明的CCL5多肽片段通過所屬領域已知的肽合成技術重組表達和製備(Barany等人，1997；Simmons等人，1997；Proudfoot等人，1996；Proudfoot等人，1999；美國專利第5,258,454號)，並且在實例1中描述。2.肽模擬物和有機小分子模擬物關於藥物設計的普通方法包括檢查與特定疾病相關的蛋白-蛋白互作，然後設計可以模擬或結合於一個互作蛋白的小分子。生物活性通常來源於由二級結構單元所產生的蛋白表面的僅一小局部區，二級結構單元例如α-螺旋、β-片層、β-轉角、γ-轉角、β-鏈、環結構和類似結構單元。因此，通常設計有機小分子模擬物和肽模擬物，以通過模擬蛋白摺疊表面(即三級結構)的這些局部結構單元(即二級結構)來發揮其生物活性。「肽模擬物」或「擬肽」是指各種類型和類別的分子，只要所得分子模擬或類似所需多肽二級(或局部三級)結構單元。舉例來說，肽模擬物是通過使用醯胺鍵等排體和/或天然肽骨架的修飾(包括鏈延長或雜原子併入)來模擬肽二級結構的寡聚體；其實例包括氮雜肽、寡氨基甲酸鹽、寡脲、β-肽、γ-肽、寡(亞苯基乙炔撐)、乙烯類似(vinylogous)磺醯肽、聚-N-取代甘氨酸(類肽)和類似物(例如，參看Gellman，1998；Kirshenbaum等人，1999；Barron和Zuckermann，1999)。所屬領域技術人員熟知設計和合成肽模擬物的方法。在某些實施例中，預期肽模擬物用於克服蛋白酶敏感性、穩定二級結構和/或相對於天然發生的CCL5肽類似物改進生物利用率。在某些實施例中，本發明的肽模擬物是回折模擬物，例如β-轉角模擬物、單環β-轉角模擬物、雙環β-轉角模擬物、γ-轉角模擬物或單環γ-轉角模擬物。通常認為β-鏈二級結構是隨機構型，但最近認為其是許多生物分子受體所識別的蛋白結構的基本與離散單元。舉例來說，已經令人信服地證明，所有蛋白水解酶以經延長的β-鏈結構與其抑制劑/底物結合，其中肽骨架或等同非肽分子呈線性構型排列(Tyndall和Fairlie，1999；Fairlie等人，2000；Bode和Huber，1992)。β-轉角是多肽結構中多肽鏈反向的部位。這些轉角為極性，且主要位於蛋白分子的表面上(即溶劑所暴露)，並且因此充當受體結合、抗體識別和肽模擬物設計的理想部位。因此，在某些實施例中，抑制或預防哺乳動物受檢者內的副粘病毒感染的分子是肽模擬物或有機小分子模擬物(下文「小分子」或「小分子模擬物」)。本發明的肽模擬物或小分子模擬物被設計成模擬或類似於下文所述CCL5多肽或其經修飾的CCL5多肽(例如Met-CCL5；AOP-CCL5)的某些二級或三級結構單元。通過二維和三維NMR已經分解出CCL5的三維溶液結構(Skelton等人，1995)。所獲NMR數據用於產生20成員總體的能量最低的CCL5結構，其以1RTN登記名存放在BrookhavenProteinDataBank中。也存放了用20個CCL5結構通過2000步計算機模擬(insilico)能量最低化計算出的平均CCL5結構(PDB登記名1RTO)。最近，已經化學合成了AOP-CCL5，且分解出了它的高解析度(1.6A)晶體結構，並且以PDB登記名1B3A存放(Wilken等人，1999)，其後不久分解出Met-CCL5的高解析度(1.6A)晶體結構，其以DB登記名lEQT存放(Hoover等人，2000)。CCL5的多肽摺疊與其他CC和CXC多肽的摺疊相似，形成三鏈、反平行的β-片層，其側翼為COOH-末端α-螺旋。下表5A和表5B中分別列出由NMR(PDB1RTO；Skelton等人，1995)和X射線結晶學(PDB1B3A；Wilken等人，1999)所確定的CCL5和AOP-CCL5的二級結構單元。表5ACCL5二級結構表5BAOP-CCL5二級結構CCL5二聚體的NMR溶液結構(Skelton等人，1995)展示部分雜亂的NH2-末端區，接著是指向標記二-半胱氨酸基序的短鏈(β0)，以310轉角結束的延長區(NH2-環)、由環所連接的三條反平行β-鏈(β1-β3)和COOH-末端α-螺旋。趨化因子二聚體的生理相關性仍然存在爭論，但是最近的研究指出CCL5的生物學功能依賴於二聚結構(Nardese等人，2001)。根據兩位點趨化因子模型，趨化因子的兩個截然不同的區域參與與趨化因子受體的互作對受體活化而言關鍵性的NH2-末端，和負責主要對接事件(dockingevent)的另一域，有人提出其包括NH2-環區域(Clark-Lewis，1994；Schraufstatter，1995；Lowman等人，1996；Pakianathan等人，1997；Crump等人，1997Hemmerich等人，1999；Laurence等人，2000)。因為趨化因子所介導的HIV-1阻斷和HIV-1共受體功能均不需要趨化因子受體的信號傳遞活性，因此相信NH2-環在HIV-1感染的生理學中起樞紐作用(Nardese等人，2001)。CCL5的功能作圖(描述於上文A.1部分)符合NMR溶液結構(Nardese等人，2001)。CCL5二聚體的表面靜電勢的分析表明，對於HIV-1抗病毒活性關鍵的NH2-環殘基(Phe12、Tyr14和Ile15)顯示於分子表面上，在那裡它們有助於大(1802)疏水性溶劑暴露片的形成。此結構特徵與作為受體對接位點的潛在作用一致。舉例來說，Phe12在相關CC趨化因子MCP-1中結構上與Tyr13等同，所述Tyr13與CCR2結合有關，並且與其他NH2-環殘基一起促使形成疏水性表面槽。類似地，MIP-1β中的等同殘基Phe13對於CCR5結合與趨化因子二聚化起關鍵作用。然而，CCL5上的疏水性片也涵蓋位於展示HIV-1抗病毒活性的β1-鏈肽的中心的芳香烴殘基簇(Tyr27-Tyr29)(例如，參看上文部分A.1)。因此，Nardese等人的結構分析揭示NH2-環與β1-鏈殘基均有助於假定的CCR5受體界面的形成。令人感興趣的是，CCL5的β1-鏈殘基並非是抑制哺乳動物上皮細胞的RSV感染所需的，這暗示了RSV感染的CCL5抑制的替代機制(或替代結構單元)的可能性(即相對於HIV-1感染)。具有倒轉胺基酸手性的肽模擬物(即天然發生L-胺基酸立體異構體的D-胺基酸立體異構體)本能地抵抗蛋白酶所介導的消化，並且因此代表用於治療應用的合適候選者。Nardese等人(2001)合成具有反向肽鍵以阻止原初側鏈局部化學的NH2-環/β1-鏈19聚體的倒轉模擬物。逆轉肽(Ac-D-Tyr29-D-Cys11-NH2；SEQIDNO19)有效抑制HIV-1包膜所介導的細胞融合，其效力(平均ID50＝13.3+/-2.7μM)與其L-胺基酸對應物(SEQIDNO16)可比，並且其對抗趨化現象。相反，用具有相似胺基酸組成和疏水性值的對照逆轉肽未發現產生作用。這些生物學活性證實逆轉引起肽側邊側鏈的原初空間定向的保存的預測。因此，在某些實施例中，本發明針對從SEQIDNO1約胺基酸殘基1至約胺基酸殘基30的CCL5多肽的肽模擬物，其中肽模擬物抑制哺乳動物受檢者的副粘病毒感染。在一個特定實施例中，肽模擬物基於如SEQIDNO2所示的SEQIDNO1的NH2-末端CCL5肽片段的胺基酸殘基1至15，並且展示抑制RSV感染(實例4)。在另一個實施例中，肽模擬物基於SEQIDNO1的胺基酸殘基1至22。在另一個實施例中，肽模擬物基於SEQIDNO1的胺基酸殘基1至29。在另一個實施例中，肽模擬物是包含以如下反向順序的SEQIDNO1胺基酸殘基11至29的逆轉肽Ac-YFYEKIHARPLPRAIYAFC-NH2(SEQIDNO19)，下文表示為「Ac-D-Tyr29-D-Cys11-NH2」。在另一個實施例中，肽模擬物是包含以如下反向順序的SEQIDNO1胺基酸殘基1至34的逆轉肽Ac-CKGSTYFYEKIHARPLRPAIYAFCCPTTDSSYPS-NH2(SEQIDNO20)，下文表示為「Ac-D-Cys34-D-Ser1-NH2」。在另一個實施例中，肽模擬物是包含以如下反向順序的SEQIDNO1胺基酸殘基1至15的逆轉肽Ac-IYAFCCPTTDSSYPS-NH2(SEQIDNO21)，下文表示為「Ac-D-Iso15-D-Ser1-NH2」。在另一個實施例中，肽模擬物或小分子模擬物包含NH2-環胺基酸Phe12、Tyr14和Ile15的二級和三級結構單元。如下文所述，這些結構單元可通過計算機模擬分子模型化和選自由1EQT(Met-CCL5)、1B3A(AOP-CCL5)和1RTO(CCL5)組成的群組的BrookhavenProteinDataBank分子坐標登記文件的直觀化而輕易地確定。在其他實施例中，CCL5(PDB1RTN；PDB1RTO)、Met-CCL5(PDB1EQT)和/或AOP-CCL5(PDB1B3A)的分子坐標用於產生(通過計算機模擬分子模型化)SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO18或其NH2-末端片段的第二代肽模擬物。如前文所述，CCL5的多肽摺疊與其他CC和CXC趨化因子(例如CCL3、CCL4)的多肽摺疊相似。然而，本發明證明CCL5，而不是CCL3(MIP-1α)或CCL4(MIP-1β)抑制上皮細胞的RSV感染，這暗示RSV(與HIV-1相反)可能利用不同於CCR5的受體。為了進一步闡述CCL5所介導的RSV感染的抑制的序列和/或結構要求，通過胺基酸序列比對(表6)、水療法曲線(圖4A和圖4B)和分子模型化/直觀化(圖11)來比較CCL5和CCL3多肽。如實例5所述，CCL5與CCL3(MIP-1α)序列的比較表明CCL5與CCL3共享32個一致胺基酸(即48％一致性)，並且具有約78％胺基酸序列相似性(表6)。表6CCL5與CCL3的BLAST比對全長CCL5與全長CCL3的水療法曲線(Kyte和Doolittle，1982)的比較(圖4A和圖4B)表明，CCL5與CCL3間的最大水療序列分歧發生在這些多肽的NH2-末端內(例如，參看實例5)。計算機模擬(SWISS-MODEL和Swiss-PdbViewer(Guex和Peitsch，1997))模型化CCL5(PBD1RTO)與CCL3(PBD1B53)的能量最低結構，並且三級結構(或摺疊)疊加，NH2-末端胺基酸1至7(數據未顯示)和COOH-末端胺基酸64至68除外。與CCL5/CCL3水療法曲線相似(圖4A)，CCL5與CCL3之間的最大結構序列分歧發生在NH2-末端胺基酸殘基內。不希望由任何特定理論約束，預期HIV-1感染的CCL5抑制與RSV抑制之間的差異可能部分上是由CCL5NH2-末端的前15個胺基酸調控。因此，在某些實施例中，本發明的肽模擬物或小分子模擬物模擬包含SEQIDNO2胺基酸序列的CCL5NH2-末端肽片段。在一個特定實施例中，如表7所闡述，肽模擬物基於CCL5、AOP-CCL5或Met-CCL5的前15個胺基酸的二面角。表7CCL5、MET-CCL5和AOP-CCL5的前15個NH2-末端胺基酸的二面角在本發明的其他實施例中，抗病毒分子是抑制或預防哺乳動物細胞的副粘病毒感染的非肽小分子模擬物(與肽模擬物相反)。與肽模擬物的設計類似，本發明的非肽小分子被設計成模擬SEQIDNO1的CCL5多肽的關鍵結構單元或胺基酸殘基。在一個特定實施例中，小分子基於SEQIDNO2所示的SEQIDNO1的NH2-末端CCL5肽片段的胺基酸殘基1至15。在另一個實施例中，小分子基於SEQIDNO13所示的SEQIDNO1的胺基酸殘基11至22。在另一個實施例中，小分子基於SEQIDNO16所示的SEQIDNO1的胺基酸殘基11至29。在另一個實施例中，小分子基於SEQIDNO18的逆轉肽模擬物Ac-D-Tyr29-D-Cys11-NH2。在一個優選實施例中，本發明的小分子模擬由NH2-環的胺基酸殘基Phe12、Ala13、Tyr14和He15所形成的CCL5疏水性片。在某些實施例中，小分子模擬物包含如功能性和摺疊CCL5多肽中所發現的胺基酸Phe12、Tyr14和Ile15的三維分子排列，其中根據CCL5(PDB1RTO)分子坐標、AOP-CCL5(PDB1B3A)或Met-CCL5(PDB1EQT)分子坐標的二面角，Phe12、Tyr14和Ile15空間受束縛。在其他實施例中，如Nardese等人所描述(2001)，本發明的小分子模擬由NH2-環的胺基酸殘基Phe12、Ala13、Tyr14和Ile15以及β-片層的殘基Tyr27、Phe28和Tyr29所形成的CCL5疏水性片。在某些其他實施例中，CCL5(PDB1RTN；PDB1TRO)、Met-CCL5(PDB1EQT)和/或AOP-CCL5(PDB1B3A)的分子坐標用於產生(通過計算機模擬分子模型化和計算)模擬CCL5疏水性片的小分子。如上所述，本發明的某些數據表明CCR3是用於RSV進入哺乳動物上皮細胞的共受體。因此，在另一個實施例中，本發明針對與CCR3受體的小分子拮抗劑、CCR3受體的肽拮抗劑、CCR3受體模擬物或其組合結合投藥的本發明抗病毒分子。在某些實施例中，CCR3拮抗劑是包含一個或一個以上的以下化學結構的分子在其他實施例中，本發明的抗病毒分子與CCR1受體的小分子拮抗劑結合投藥。在某些實施例中，CCR1拮抗劑是包含一個或一個以上的以下化學結構的分子在其他實施例中，本發明的抗病毒分子與CCR5受體的小分子拮抗劑結合投藥。在某些實施例中，CCR5拮抗劑是包含一個或一個以上的以下化學結構的分子B.編碼趨化因子的多核苷酸、重組表達載體和宿主細胞在某些實施例中，趨化因子多肽(例如CCL5、CCL3)、截短型趨化因子多肽(例如CCL5A1-8)、趨化因子片段(例如SEQIDNO2的CCL5)等重組表達。在一個優選實施例中，編碼趨化因子多肽的多核苷酸包含於質粒載體中，並且在原核宿主細胞中表達。編碼本發明全長CCL5多肽的多核苷酸序列如SEQIDNO23所述。當將趨化因子多核苷酸用於趨化因子多肽、其片段或其截短物的重組產生時，所述多核苷酸包括所述多肽的編碼序列或讀碼框中多肽的編碼序列和其他編碼序列，例如編碼前導或分泌序列、前體蛋白(pre-protein)序列、蛋白原(pro-protein)序列、前蛋白原(prepro-protein)序列或其他融合肽部分的序列。舉例來說，有助於經融合多肽純化的標記序列可以與編碼序列連接(參看Gentz等人，1989，其全文以引用的方式併入本文)。因此，本發明預期製備出允許表達產物的His標籤純化的融合多肽的多核苷酸。多核苷酸也可以含有非編碼5』和3』序列，例如轉錄、非轉錄序列，拼接和聚腺苷酸化信號。如本文中所使用，術語「載體」是指能夠轉運其所連接的另一核酸的核酸分子。本發明的載體包括所屬
技術領域：
已知的載體，例如質粒載體、病毒載體和類似載體。原核生物中蛋白的表達最通常是在大腸桿菌(E.coli)中用含有針對融合蛋白或非融合蛋白表達的組成型或可誘導啟動子的載體進行。融合載體向其中所編碼的蛋白、向重組蛋白的氨基或羧基末端加入若干胺基酸。所述融合載體通常用於三種目的1)增加重組蛋白的表達；2)增加重組蛋白的溶解性；和3)通過充當親合純化中的配體來輔助重組蛋白的純化。在融合表達載體中，通常在融合部分與重組蛋白的連接位點處引入蛋白水解裂解位點，以能夠在融合蛋白純化之後將重組蛋白從融合部分分離出來。所述酶和其相關識別序列包括因子Xa、凝血酶和腸激酶。典型的融合表達載體包括分別將穀胱甘肽S轉移酶(GST)、麥芽糖E結合蛋白或蛋白A融合於目標重組蛋白的pGEX(PharmaciaBiotechInc；Smith和Johnson，1988)、pMAL(NewEnglandBiolabs，Beverly；MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)。合適的可誘導的非融合大腸桿菌表達載體的實例包括pTrc(Amann等人，1988)和pETIld(Studier等人，1990)。在某些實施例中，將重組表達載體引入至「宿主細胞」內，其中表達趨化因子多肽。本文可交替使用「經遺傳工程改造的宿主細胞」和「重組宿主細胞」。宿主細胞可以是任何原核或真核細胞。舉例來說，趨化因子多肽在細菌細胞(例如大腸桿菌、卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis))、昆蟲細胞(例如Sf9或Sf21細胞)、酵母(例如釀酒酵母(S.cerevisiae))或哺乳動物細胞(例如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、NIH3T3、PER.C6、NSO或COS細胞)中表達。其他合適宿主細胞為所屬領域技術人員所知。通過常用轉化、侵染或轉染技術將載體DNA引入至原核或真核細胞內。如本文所使用，術語「轉化」、「侵染」和「轉染」意指多種用於將外源核酸(例如DNA)引入至宿主細胞內的所屬領域所公認的技術，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉澱、DEAE-右旋糖所介導的轉染、脂質體轉染(lipofection)、侵染或電穿孔。轉化、侵染或轉染宿主細胞的合適方法可參看Sambrook等人(″MolecularCloningALaboratoryManual″第2版，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，1989)和其他實驗室手冊。本發明宿主細胞，例如培養物中原核或真核宿主細胞，也可以用於生產(即表達)大量的所需趨化因子多肽。因此，本發明進一步提供用本發明的宿主細胞生產趨化因子多肽的方法。在一個實施例中，所述方法包含在合適培養基中培養本發明的宿主細胞(向其中引入編碼多肽的重組表達載體)直至趨化因子多肽產生。在另一個實施例中，所述方法進一步包含將趨化因子多肽從培養基或宿主細胞中分離出來。本發明的表達載體可用作製備大量自身編碼趨化因子多肽的DNA的手段，並且可用作製備編碼多肽的手段。預期當本發明的趨化因子多肽通過重組手段製備時，可採用原核或真核表達載體作為穿梭系統。C.抗病毒醫藥組合物在某些優選實施例中，本發明提供包含本發明抗病毒分子和醫藥學可接受的載劑的醫藥組合物。將抗病毒分子併入適於投用與例如人類的哺乳動物受檢者的醫藥組合物中。所述組合物通常包含「活性」成分(即抗病毒分子)和「醫藥學可接受的載劑」。如下文所使用，術語「醫藥學可接受的載劑」意欲包括與醫藥投藥相容的任何和所有溶劑、分散介質、塗層、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑和類似物質。所屬
技術領域：
熟知所述介質和試劑用於醫藥活性物質的使用方法。只要任何常用介質或試劑與活性化合物相容，那麼所述介質就可用於本發明的組合物中。組合物中也可以併入補充性活性化合物。本發明的醫藥組合物被調配成適合其預期投藥途徑。投藥途徑的實例包括非經腸(例如靜脈內、真皮內、皮下、肌肉內、腹膜內)、黏膜(例如口服、直腸、鼻內、面頰、陰道、呼吸道)和透皮(局部)。用於非經腸、真皮內或皮下應用的溶液或懸浮液可以包括以下組份無菌稀釋劑，例如注射用水、鹽水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗細菌劑，例如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲脂；抗氧化劑，例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，例如乙二胺四乙酸；緩衝劑，例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；和用於調節張性的試劑，例如氯化鈉或右旋糖。可用酸或鹼調節pH值，例如鹽酸或氫氧化鈉。非經腸製劑可密封於安瓿、一次性注射器或者由玻璃或塑料製成的多劑量瓶內。適於可注射使用的醫藥組合物包括無菌含水溶液(其中水可溶)或分散液，和用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末。對於靜脈內投藥來說，合適載劑包括生理鹽水、細菌抑制水、CremophorELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。在所有情形下，組合物必須為無菌，並且應為一定程度的流體以易於注射。組合物在生產和儲存條件下應該穩定，並且應針對免受微生物(例如細菌和真菌)汙染行為而保存。載劑是含有(例如)水、乙醇、多元醇(甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)和其合適混合物的溶劑或分散介質。舉例來說，通過使用例如卵磷脂的塗層，通過維持分散液情形下的所需粒子大小和通過使用表面活性劑來維持適當的流動性。通過各種抗細菌劑和抗真菌劑來防止微生物行為，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸和類似試劑。在許多情形下，組合物中優選包括等滲劑，例如，糖、多元醇，例如甘露醇、山梨醇、氯化鈉。通過在組合物中包括延遲吸收的試劑，例如單硬脂酸鋁和明膠，來產生可注射組合物的延長吸收。通過在具有一種上述所列的成分或上述成分的組合的適當溶劑中併入所需量的活性化合物來製備無菌可注射溶液，隨後如果需要則進行過濾滅菌。通常通過將活性化合物併入至含有鹼性分散介質和上文所列的所需其他成分的無菌媒劑中來製備分散液。在用於製備無菌可注射溶液的無菌粉末的情形下，優選製備方法是真空乾燥和冷凍乾燥，從而由先前無菌過濾溶液產生活性成分和任何其他所需成分的粉末。口服組合物通常包括惰性稀釋劑或可食用載劑。其可以密封於明膠膠囊內或壓製成片劑。為了達到口服治療投藥的目的，在活性化合物中併入賦形劑，並且以片劑、錠劑或膠囊的形式使用。也可以用流體載劑製備口服組合物以用作漱口水，其中流體載劑中的化合物口服並漱口，並且吐出或咽下。醫藥學相容粘合劑和/或佐劑物質也可以作為組合物的部分包括在內。片劑、藥丸、膠囊、錠劑和類似劑型可以含有任何以下的成分或相似性質的化合物粘合劑，例如微晶纖維素、黃芪膠或明膠；賦形劑，例如澱粉或乳糖；崩解劑，例如褐藻酸、羥基乙酸澱粉鈉(Primogel)或玉米澱粉；潤滑劑，例如硬脂酸鎂或Sterotes；助流劑，例如膠狀二氧化矽；甜味劑，例如蔗糖或糖精；或者調味劑，例如薄荷油、水楊酸甲酯或橘子香料。對於吸入投藥來說，以來自加壓容器或含有例如氣體(例如二氧化碳)的合適推進劑的配出器或噴霧器的氣溶膠噴霧形式傳遞化合物。也可以通過黏膜或透皮手段來全身性投藥。對於黏膜或透皮投藥來說，調配物中使用對於待滲透屏障適當的滲透劑。所述滲透劑通常是所屬
技術領域：
已知的，並且對於黏膜投藥來說包括(例如)去汙劑、膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物。通過使用鼻噴霧器或栓劑來完成黏膜投藥。對於透皮投藥來說，將活性化合物調配成所屬
技術領域：
通常已知的藥膏、軟膏、膠或乳膏。對於直腸傳遞來說，也以栓劑(例如用常用栓劑基，例如可可油和其他甘油酯)或延遲灌腸劑的形式製備化合物。在一個實施例中，用可以保護化合物以免從身體快速消除的載劑製備活性化合物，例如受控釋放調配物，其包括植入體和微膠囊傳遞系統。可以使用生物可降解的、生物可相容的聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯共聚物(ethylenevinylacetate)、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原質、聚原酸酯和聚乳酸。製備所述調配物的方法對於所屬領域技術人員將是顯而易見的。所述物質也可商業購自AlzaCorporation和NovaPharmaceuticals，Inc。脂質體懸浮液(包括靶向具有抗病毒抗原的單克隆抗體的受染細胞的脂質體)也用作醫藥學可接受的載劑。根據所屬
技術領域：
已知方法製備所述物質，例如如美國專利第4,522,811號所描述的方法，其以引用的方式併入本文。將口服或非經腸組合物調配成易於投藥且劑量均一的劑量單位形式是尤其有利的。下文所用的劑量單位形式是指適合作為待治療的受檢者的一元劑量的物理離散單位；各單位含有經計算與所需醫藥載劑結合產生所需治療作用的預定量的活性化合物。本發明劑量單位形式的具體情況受支配於或直接依賴於活性化合物的獨特特徵和待達到的特定治療作用以及複合所述活性化合物以治療個體的
技術領域：
的固有限制。應了解，醫藥學可接受的媒劑是指進入醫藥組合物中不引起副作用，且(例如)可能有助於活性化合物投藥，增加醫藥組合物體內壽命和/或效力，增加醫藥組合物在溶液中的溶解性或增強醫藥組合物的保存的化合物或化合物組合。這些醫藥學可接受的媒劑是眾所周知的，並且可以由所屬領域技術人員根據所選活性化合物的性質和投藥模式來調整。本發明的組合物通常以含有標準的、熟知的無毒生理可接受的載劑、佐劑和媒劑(如果需要)的劑量單位調配物非經腸投藥。下文所用術語非經腸包括靜脈內、皮下、真皮內、肌肉內、動脈內注射或輸液技術。根據已知技術，使用合適分散劑或溼潤劑和懸浮劑來調配可注射製劑，例如無菌可注射水性或油性懸浮液。無菌可注射製劑也可以是無毒非經腸可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或懸浮液，例如1，3-丁二醇溶液。在這些可接受的媒劑和溶劑中，可以使用水、林格(Ringer)溶液和等滲氯化鈉溶液。此外，習慣上將無菌、固定油用作溶劑或懸浮介質。為此，可以使用任何溫和固定油，包括合成單甘油酯或二甘油酯。此外，脂肪酸，例如油酸，可以用於製備可注射製劑。優選載劑包括用磷酸鹽、乳酸鹽、三羥甲基氨基甲烷(Tris)和類似物緩衝的中性鹽水溶液。當投用病毒載體時，載體經充分純化以使其基本上無不良汙染物，例如缺陷幹擾腺病毒顆粒或內毒素和其他熱原質，因此其不在接受載體構建體的個體中引起任何不適當的反應。純化載體的優選手段包括使用浮力密度梯度，例如氯化銫梯度離心。載劑可以是脂質體。用脂質體作為傳遞媒劑的手段在所屬
技術領域：
中是熟知的。本文所引用的所有專利和公開案均以引用的方式併入本文。D.實例除另有詳細描述外，均使用所屬領域技術人員熟知和常規的標準技術來進行以下實例。以下實例僅為說明性的目的，而不應理解為以任何方式限制本發明的保護範圍。實例1材料與方法趨化因子與試劑。除另有說明外，所有重組(r)人類趨化因子和抗人類趨化因子受體抗體均購自RDSystemsInc.(Minneapolis，MN)。重組人類CCL5和基質細胞衍生因子(SDF)-1α(CXCL12)分別自BiosourceInternational(Camarillo，CA)和Wyeth(Andover，MA)獲得。所述研究中使用抗CC趨化因子受體(CCR)的單克隆抗體和多克隆抗體。單克隆抗體(mAb)針對人類CCR3(目錄號MAB155)或CCR5(目錄號MAB182)。針對來自CCR1(目錄號sc-7934)、CCR3(目錄號sc-7897)、CCR4(目錄號sc-6126)或CCR5(目錄號sc-8283)的肽序列而培育的經親合純化的多克隆抗體是購自SantaCruzBiotechnology(SantaCruz，CA)。抗人類CX3CR1多克隆抗體(目錄號TP502AF)是購自TorreyPinesBiolabs(Houston，TX)。CCL5的一系列9個重疊合成肽(表1)(Schall等人，1988)是購自Sigma-Genosys(TheWoodlands，TX)，或用標準肽化學方法合成。根據廠商說明(Pierce；Rockford，IL)用EZ-LINKTMNHS(N-羥基琥珀醯亞胺生物素)化學標記所述肽。對於活體外和活體內實驗，分別將凍幹肽溶解於補充有5％(V/V)FBS(Hyclone；Logan，UT)、2mML-穀氨醯胺和2％青黴素(penicillin)/鏈黴素(streptomycin)(GibcoBRL)的Dulbecco最小基本培養基(Dulbecco’sMinimumEssentialMedia)(DMEM，GibcoBRL；GrandIsland，NY)中；或者重構於PBS中，並且在指定濃度下使用。所述肽純度均大於90％。抗融合抑制劑RFI-641(Raznikov等人，2001)在PBS中稀釋，並且以25微克/劑量活體內投放。病毒備料。如上所述(Hancock等人，1996)，在完全培養基(補充有2mML-穀氨醯胺、2％青黴素/鏈黴素和10％(V/V)FBS的DMEM，37℃、5％CO2)中培養的HEp-2細胞(ATCCCCL23)中繁殖野生型RSV菌株A2與B1(Wright等人，1973)和缺失SH與G基因(核苷酸4064-5462)的突變體RSV菌株cpts248/404(Ackerlind等人，1988)、rA2cpts248/404ASH(Crowe等人，1994)和cp32/D1(Karron等人，1997))。使用上文所述用於cp52的方法從B1菌株分離cp32/D1突變體(Crowe等人，1996；Karron等人，1997)。在所述研究中也使用在G蛋白的胺基酸117處用遺傳工程方法截短的重組RSV(rA2cpΔG118)。所有病毒備料均通過4℃下15分鐘低速(200g)離心淨化從細胞溶菌產物中製備。病毒感染性活體外抑制。使HEp-2細胞單層在含有完全培養基的96孔組織培養板(Falcon，BectonDicksonandCo.；FranklinLakes，NJ)中生長。在一式三份含有指定量重組趨化因子或抗趨化因子受體抗體的孔中，在4℃或37℃下預處理所述單層1小時。在移去趨化因子或抗體之後，在相同溫度下用所示野生型或突變型RSV菌株侵染單層1小時，並且隨後覆蓋上2％葡聚糖(Sephadex)(AmershamBiosciences；Piscataway，NJ)。也在細胞受侵染之後1小時，或者在將單層同時暴露於病毒與指定劑量的趨化因子或CCL5肽的1∶1混合物之後評估抗病毒活性。單獨或組合測試5至100μg/ml培養基劑量範圍內的抗趨化因子受體抗體的抑制特性。病毒感染性活體內抑制。在以RSV的A2菌株(約2×106pfu)的1∶1混合物攻毒之前1小時或之後1小時或與其同時對雌性BALB/c小鼠(8-10周齡，CharlesRiverLaboratories；Wilmington，ME)投與肽(125微克至500微克/劑量)。所有投藥均為鼻內(0.05ml)，並且在注射麻醉下進行(60mg克他命(ketamine)/千克和2.5mg賽拉嗪(xylazine)/千克(TheButlerCo.；DublinOH))。四天之後移去肺，勻質化，並通過低速離心淨化，驟冷，並儲存於-70℃下直至用HEp-2細胞單層進行菌斑測定(Hancock等人，1996)。所有動物均在美國實驗動物管理認證協會(AmericanAssociationforAccreditationofLaboratoryAnimalCare)許可的設施中圈養。菌斑測定。用抗F蛋白(L4)mAb如上文所述(Hancock等人，1996)顯現病毒菌斑(Paradiso等人，1991；Walsh和Hruska，1983)。其後，用blotto封閉劑(PBS，5％奶粉)衝洗細胞，並且用辣根過氧化物酶共扼山羊抗小鼠IgG((KirkegaardandPerryLaboratories，Inc.；Gaithersburg，MD)培養。用含有在PBS中的0.1％H2O2的0.05％4-氯-1-萘酚檢測結合抗體。菌斑計數之後，相對於僅暴露於培養基中病毒而無趨化因子或抗趨化因子受體抗體的單層，計算平均感染百分比(一式三份孔的±標準偏差)。CCL5肽與HEp-2細胞的相互作用。使用ELISA評估合成肽與HEp-2細胞單層的相對結合。簡單來說，以每孔0.2ml完全培養基中3×104HEp-2細胞接種96孔板(Falcon)。過夜培養(37℃，5％CO2)之後，在冰上冷卻單層大約15分鐘。向二份重複孔中加入從0.49μg至500μg/mlDMEM(補充有1％FBS、2％青黴素/鏈黴素和2mML-穀氨醯胺)的上升劑量的經生物素標記的肽，並且在4℃下培養1小時。隨後用80％甲醇(JTBaker；Phillipsburg，NJ)固定(室溫下20分鐘)單層。用PBS洗滌之後，用0.3％(V/V)H2O2(Sigma；St.LouisMO)培養單層(室溫下30分鐘)，再次洗滌並且用經生物素標記的抗人類CCL5mAb(RDsystems)探查(4℃下30分鐘)。其後，用抗生蛋白鏈菌素-HRP(Zymed；SanFrancisco，CA)培養單層(室溫下1小時)。用TMB一步底物溶液(TMBOne-StepSubstrateSolution)(DAKO；Carpinteria，CA)顯影孔。用MolecularDevicesVersamax酶標儀(microplatereader)(Sunnyvale，CA)測定(450nm，參照為550nm)光密度。流式細胞術。為了確定CCR的表達，用細胞刮取器將A549和HEp-2細胞從6孔板(Falcon)小心地移出，並且用抗CCR1(目錄號FAB182F)、CCR3(目錄號FAB145P)或CCR5(目錄號FAB155P)的經生物素標記的mAb培養，接著用抗生蛋白鏈菌素-藻紅蛋白培養。用標準流式細胞計數技術分析細胞(FACSort，BeetonDickinson；MountainView，CA)。所有試劑均購自RDsystems。檢測CCL5。根據廠商(RDSystems)說明用ELISA檢測RSV感染24小時後HEp-2和A549上皮細胞的培養物上清液中所分泌的CCL5。用MolecularDevicesVersamax酶標儀測定(450nm，參照為550nm)光密度。為了確定感染之後CCL5mRNA複製體數目和RSV基因組數目，開發出定量聚合酶鏈反應(qPCR)測定法。用RNeasy小量試劑盒(MiniKit)(Qiagen；Valencia，CA)和QiaShredders(Qiagen)從細胞單層分離出總細胞RNA。在加入RiboGreenRNA定量試劑(QuantitationReagent)(MolecularProbes；Eugene，OR.)之後，在CytoFluor4000螢光讀板儀(AppliedBiosystems)上測量RNA濃度。根據廠商說明用TaqMan反轉錄酶試劑盒(AppliedBiosystems)反轉錄1微克的總細胞RNA。用與RSVA2的L基因的一個區域互補的DNA引物-探針組來測定所得eDNA中RSV基因組的存在與否。此外，根據廠商說明，用含有引物-探針組的人類RANTESTaqManPre-Developed測定試劑(PDAR)(AppliedBiosystems；FosterCity，California)來檢測CCL5eDNA。在ABIPrism7700序列檢測器(Perkin-Elmer；Pittsburgh，PA)上進行PCR、螢光檢測和數據分析。統計分析。使用JMP統計軟體(SASInstituteInc.；Cary，NC)，通過Tukey-KramerHSD多重比較或學生t-測驗來確定對數轉化後的顯著差異(p＜0.05)。數據表示為±1標準偏差。在單獨研究中所有數據均證明相似的結果。實例2CCL5抑制上皮細胞受RSV感染在本實例中，活體外證明，人類氣道上皮細胞響應於RSV感染而產生CCL5多肽。表8和表9展示分別檢測RSV感染對mRNA複製體數目的數量增加和對A549與HEp-2細胞單層分泌CCL5的影響的實驗的代表性結果。在A549單層中，CCL5mRNA複製體數在感染之後2天(7倍)和3天(20倍)增加。所述數據進一步表明，隨著RSV複製的進行，CCL5轉錄本的數目相對於RSV基因組複製體數顯著增加(表8)。CCL5mRNA比RSV基因組複製體數的比率在培養第一天與第三天之間增加16倍。早在感染之後24小時即在培養物上清液中檢測到CCL5蛋白(表9)。因此，響應於RSV感染，所分泌的單層增加CCL5多肽的量。表8人類肺上皮細胞系受RSV感染後誘導CCL5a的表達a.A549細胞經RSVA2(RSV)感染(MOI＝0.09)或僅在培養基中培養(對照)，並且在其後1至3天通過定量實時RCR對總細胞RNA測定CCL5mRNA複製體數和負鏈RSV基因組複製體數。b.表示每納克總RNA的CCL5mRNA複製體數。c.表示CCL5mRNA複製體數比RSV基因組複製體數的比率。表9人類上皮細胞系受RSV感染後增加培養基中所分泌的CCL5的量aa.A549和HEp-2細胞經RSVA2(RSV)感染(MOI＝0.09)或僅在培養基中培養(對照)。其後1-3天收集培養物上清液，並且通過ELISA分析所分泌的CCL5。b.數目表示每毫升培養基的CCL5皮克數。c.ND表示未測。進一步調查CCL5抑制上皮細胞受RSV感染的潛能。表10和表11描述單獨實驗，其中HEp-2細胞單層預先暴露(1小時)於遞升量的人類rCCL5減少感染。在最大測試劑量(10μgrCCL5/ml)下，相對於僅在培養基中培養的對照單層，感染率降低至大約30％(表10)和20％(表11)。抑制作用等同於726nm的中值抑制濃度(IC50)。抑制性取決於劑量，如1μg和5μg的抑制性低於10μgrCCL5/ml培養基的抑制性。HEp-2細胞預先暴露於(1小時)相似濃度的重組MIP-1α/CCL3、MIP-1β/CCL4、MCP-2/CCL8或嗜酸性粒細胞趨化因子/CCL11(表10和表11)或重組MIP-1δ/CCL15或SDF-1α/CXCL12(表12)不減弱感染性。數據進一步表明，感染性的抑制需要在將病毒加入單層之前(表12)或在將病毒加入單層的同時(表13)，將細胞單層經rCCL5(10μg/ml)處理。當在病毒吸收1小時之後(表12)或在熱變性之後(表13)投放時，rCCL5不減少活體外感染性。A549單層經rCCL5預先處理也抑制RSV感染(數據未顯示)。表10CCL5抑制人類上皮細胞受RSV感染aa.HEp-2細胞單層暴露於1、5或10μg/ml的CCL5(RANTES)、CCL3(MlP-1α)、CCL8(MCP-2)或CCL11(嗜酸性粒細胞趨化因子)1小時。其後，用培養基衝洗單層3次，並且用RSV的A2菌株感染1小時。培養3天後，計數菌斑以確定病毒感染程度。將數據表示為相對於僅經培養基中病毒培養而未暴露於趨化因子的對照孔(100％感染率)的感染百分比(±1標準偏差)。表11CCL5抑制人類上皮細胞受RSV感染aa.HEp-2細胞單層暴露於1、5或10μg/ml的CCL5(RANTES)、CCL3(MlP-1α)或CCL4(MIP-1β)1小時。其後，用培養基衝洗單層3次，並且用RSV的A2菌株感染1小時。培養3天後，計數菌斑以確定病毒感染程度。將數據表示為相對於僅經培養基中病毒培養而未暴露於趨化因子的對照孔(100％感染率)的感染百分比(±1標準偏差)。表12RSV感染的抑制依賴於CCL5的預先投放aa.在感染(PRE)前1小時或在移除RSVA2(POST)後小時，HEp-2細胞單層經10μg/mlCCL5、CCL3、CCL15(MIP-1δ)或CXCL12(SDF-1)處理。三天後，計數菌斑，並表示為相對於僅經培養基中病毒培養而未暴露於趨化因子的對照孔(100％感染率)的感染百分比(±1標準偏差)。表13感染的抑制依賴於CCL5的預先投藥或與RSV同時投藥，並且對熱變性敏感aa.CCL5(10μg/ml)或/和等體積PBS在感染前(PRE)1小時投放，或者同時(SIM)與RSV混合投放至HEp-2細胞單層。其他組包括由熱(HEAT)變性的CCL5。其後3天計數菌斑。實例3CCL5阻斷上皮細胞與RSV融合(F)蛋白間的互作為了確定直接通過阻斷病毒與細胞表面配體的互作，或者其次在配體-受體互作之後向外部傳遞信號途徑中是否發生感染的抑制，用保留N-末端甲硫氨酸(met)-CCL5的rCCL5進行實驗(Proudfoot等人，1996)。Met-CCL5保留起始甲硫氨酸，並且在受體結合後無生物活性(Simmons等人，2000)。在最大測試劑量(20μgmet-CCL5/ml)下，感染率大約為對照細胞的25％(圖1)。met-CCL5的抑制特性也依賴於劑量。1.25μgmet-CCL5/ml的預先處理導致大約80％的感染率，而0.313或0.156μgmet-CCL5/ml劑量無抑制性。當在4℃下相繼進行感染和rCCL5投放以阻止CCR聚集時，也測試對複製的抑制，這對於向外部傳遞信號是重要的(Blanpainetal.，2002)。4℃下經20μgrCCL5/ml預處理(1小時)後，感染率大約為對照組的14％，並且與當於37℃下相繼經rCCL5處理並感染時所觀察到的感染率相似(16％)(表14)。因此，數據表明，rCCL5能夠在可能限制細胞內信號傳遞級聯的條件下(4℃)抑制複製。表14人類上皮細胞系在4℃或37℃下經CCL5預先處理後抑制RSV感染aa.HEp-2細胞單層在4℃或37℃下經指定劑量的重組CCL5預處理1小時。RSVA2感染三天後，計數菌斑，並表示為相對於僅經培養基中病毒培養而未暴露於趨化因子的對照孔(100％感染率)的感染百分比。最近報導，活化支氣管上皮細胞表達CCR3(Stellato等人，2001)。因為CCL5也是CCR1和CCR5的配體(Pakianathah等人，1997)，因此通過流式細胞術來檢查上皮細胞以確定已知結合CCL5的受體。圖2所示的結果證實，在HEp-2和A549上皮細胞表面上表達CCR3。未檢測到CCR1和CCR5。因此，數據表明，CCL5阻斷RSV與上皮細胞表面上CCR3之間的互作。測試其他已知與CCR3結合的重組趨化因子(Baggiolini，2001)以確定其是否降低感染率。用遞升量的重組嗜酸性粒細胞趨化因子/CCL11、MCP-2/CCL8或MIP-1δ/CCL15來預先處理HEp-2細胞單層並不減弱RSV的感染性(表10和表12)。因為CXCR4也功能性地表達在活化支氣管上皮細胞上(Eddleston等人，2002)，因此也測試重組SDF-1α/CXCL12，但不減弱感染(表12)。在多克隆或單克隆抗趨化因子受體抗體存在下，HEp-2細胞單層的預培養或侵染不降低RSV感染性(數據未顯示)。通過檢查rCCL5抑制缺失位於病毒包膜中3個糖蛋白(F、G和SH蛋白)中一或兩個的RSV菌株的感染的能力來進一步研究抑制機制。用缺失SH蛋白(rA2cpts248/404ΔSH)或G蛋白C-末端的外部域在胺基酸118處截短(rA2cpGΔ118)的經遺傳修飾的菌株來進行一系列研究。表15證明，相對於僅以培養基中病毒培養的對照細胞，經10μg/mlrCCL5或met-CCL5預處理降低rA2cpGΔ118和rA2cpts248/404ΔSH病毒的感染性。用rCCL5(10μg/ml)預先處理也降低由突變型cp32/D1(缺少SH和G蛋白)和RSV的親代B1菌株的感染(表8)。因此，rCCL5抑制缺失G和/或SH蛋白的病毒的感染。總體來說，數據表明，rCCL5阻斷髮生在包膜內F蛋白與上皮細胞表面之間的互作。表15CCL5抑制缺失SH和/或G包膜糖蛋白的突變型RSV菌株感染HEP-2細胞aa.HEp-2細胞單層經10μg/ml重組CCL5或met-CCL5處理1小時。移除CCL5之後，單層經指定RSV菌株感染。實驗1和實驗2表示2個獨立研究的結果。3(A2)或5天(rA2cpΔ118、248/404、248/404ΔSH、B1和cp32/D1)培養之後觀察菌斑。將數據表示為相對於僅經培養基中病毒培養而未暴露於趨化因子的對照孔(100％感染率)的感染百分比。b.ND表示未完成。實例4由CCL5的合成N-末端肽活體內抑制RSV感染CCL5可以通過阻斷包膜內F蛋白與上皮細胞表面上趨化因子受體(例如CCR3)或負電荷葡糖胺聚糖(GAG)之間的互作來抑制感染。F蛋白具有由正電荷胺基酸組成的肝磷脂結合(HBD)基序，所述基序對於氣道上皮細胞的感染是重要的(Feldman等人，2000)。顯示CCL5的C末端α-螺旋區對於抑制HIV-1感染有所作用(Burns等人，1998)。與同源受體或GAG互作的胺基酸殘基分別位於CCL5的N-末端(Pakianathan等人，1997)和C-末端(Proudfoot等人，2001)區。為了檢測這些可能性，合成了一系列代表CCL5所有68個胺基酸的肽(15聚體，由7個胺基酸重疊)(表2)。作為起始篩選，將肽以生物素標記並且評估與人類上皮細胞的結合。圖3描述代表性實驗，其中遞增濃度的經生物素標記肽在4℃下用活HEp-2細胞培養。所得到的數據指示，rCCL5和代表CCL5N-末端15個殘基的肽1(SEQIDNO2)容易與上皮細胞單層結合。含有RSVG蛋白(Feldman等人，1999)的一致HBD的合成肽(肽19)也與單層結合。代表CCL5的HBD的肽7-9不容易與單層結合。因此，數據表明發生了感染抑制，這是因為CCL5的N-末端區(肽1；SEQIDNO2)阻斷包膜內F蛋白與上皮細胞表面之間的互作。為了進一步驗證所述假設，在BALB/c小鼠模型中評估CCL5的相同肽對RSVA2菌株感染的抑制。表16和表17中所描述的結果是5個實驗的代表。結果證實，當同時與病毒投與(表16和表17)或在感染之前1小時給藥(表17)時，肽1(500微克/劑量，10mg/ml)活體內有抑制性。感染4天後未經處理的BALB/c小鼠的肺含有每克組織大約5log10PFU。相比較來說，經共投與肽1的小鼠肺部的RSV滴定度為1,000(表16和表17)至100倍(表16)以下。當肽1在感染之前1小時投放時，病毒負載量減少超過50倍，並且顯著地少於未經處理小鼠中所觀察的病毒負載量(表17)。在5個實驗中與投與300μg或更多的肽1相關的病毒負載量的平均減少量為2.4log10。肽1的抑制特性依賴於劑量。共投與300-500μg肽1顯著地降低病毒負載量。250μg或125μg劑量下未觀察到此現象(表16)。與rCCL5活體外研究相似(表12)，當感染之後1小時投與時，肽1不抑制感染(表17)。數據揭示，代表CCL5的C-末端HBD(肽7-9)的肽(500微克/劑量，10mg/ml)抑制性較低。表16中所示的數據證實，共投與肽8或9與RSV降低感染性(大約10倍)。所有實驗中與500微克/劑量的肽7-9相關的病毒負載量的平均減少量分別為1.1、1.0和1.4log10。所有實驗中與500微克/劑量的肽2、4和6相關的病毒負載量的平均減少量分別為0.9、1.2和0.5log10(數據未顯示)。代表胺基酸184-198的肽19、RSVG蛋白的HBD和醫藥化合物RFI-641(Razinkov等人，2001)抑制RSV感染。因此，在CCL5肽中，肽1活體外結合活上皮細胞，並且活體內最具抑制性。所有肽活體外的抑制僅在391至525μM的IC50值時發生(數據未顯示)。表16CCL5的合成肽活體內抗病毒活性aa.對BALB/c小鼠同時投與等體積混合的RSVA2(約1×106PFU)和指定量(微克/劑量)的合成肽。其後4天，確定肺中幾何平均傳染性病毒滴定度(±1標準偏差)。測定的檢測極限大約為1.5log10。每組有5隻小鼠。b.向對照小鼠投與與指定量的肽#19(代表RSVG蛋白的肝磷脂結合域)、RFI-641和PBS混合的RSV。表17當在RSV感染之前而非之後給藥時，CCL5的肽1活體內有抑制性a.對BALB/c小鼠在感染之前1小時(Pre)或之後1小時(Post)投與500μg指定CCL5肽1，或者以等體積混合併與RSVA2同時投與。向對照小鼠投與相當劑量(約1×106PFU)的與肽#7或PBS等體積混合的RSV。4天後，測定幾何平均傳染性病毒滴定度(±1標準偏差)。測定的檢測極限大約為1.5log10。每組有5隻小鼠。實例5CCL5與CCL3多肽序列的比較如實例2詳述，趨化因子CCL5而非CCL3(MIP-1α)或CCL4(MIP-1β)抑制上皮細胞RSV感染。這表明RSV利用不同於CCR5的受體。因此，為了進一步闡述CCL5所介導的RSV感染的抑制的序列和/或結構要求，通過胺基酸序列比對(表6)、水療法曲線(圖4A和圖4B)和分子模型化/直觀化(數據未顯示)來比較CCL5和CCL3多肽。CCL5(SEQIDNO1)和CCL3(SEQIDNO21)的胺基酸序列首先通過有間隙的「BLAST2序列」比對算法(BLASTP版本2.2.6；預設矩陣BLOSUM62)進行比較，這種算法是採用對於成對蛋白-蛋白(或DNA-DNA)序列比較的BLAST引擎並且通過使用動態程序設計來延伸重要比對殘基對而產生有間隙的比對的交互式工具(Tatusova和Madden，1999)。CCL5胺基酸序列展現在BLASTP比對上方(加框殘基)，並且CCL3胺基酸序列展現在比對下方(表6)。CCL5(胺基酸殘基4-68)和CCL3(胺基酸殘基3-69)的BLAST比對表明所述多肽共享32個一致胺基酸(即48％序列一致性)，並且具有約78％胺基酸序列相似性。比對包括CCL5(SEQIDNO1)的Tyr7與Tyr8之間的一個胺基酸間隙，CCL5前3個NH2-末端胺基酸的遺失(SEQIDNO1的Ser1-Tyr3)，CCL3前2個NH2-末端胺基酸的遺失(SEQIDNO21的Ser1-Leu2)和CCL3的COOH-末端胺基酸的遺失(SEQIDNO21的Ala69)。全長CCL5與全長CCL3的水療法曲線(Kyte和Doolittle，1982)的比較(圖4A和圖4B)指示CCL5與CCL3之間的最大水療序列分歧發生在這些多肽的NH2-末端內。舉例來說，CCL5的前4個NH2-末端胺基酸(Ser1-Pro2-Tyr3-Ser4)為親水性，而CCL3的前4個NH2-末端胺基酸(Ser1-Leu2-Ala3-Ala4)主要是疏水性(數據未顯示)。CCL5和CCL3的前四個胺基酸的水療法評分不能以滑動窗口尺寸9加以計算，且因此這些胺基酸在圖4A和圖4B中所展示的水療法曲線中省略。CCL5的NH2-末端保持親水性直至胺基酸8(Ser8)，隨後接著是NH2-環結構的疏水性胺基酸Pro9-Cys10-Cys11-Phe12-Ala13-Tyr14-lso15-Ala16。令人感興趣的是，CCL3的NH2-末端，直至約胺基酸30，與CCL5的水療法特徵具有倒轉的關係(或鏡像)。相反，從約胺基酸31至COOH-末端的結尾，這兩個多肽的水療法特徵幾乎一致(圖4A)。用公開可用的(即通過ExPASy全球資訊網伺服器可得到的)軟體包SWISS-MODEL和Swiss-PdbViewer(Guex和Peitsch，1997)模型化CCL5(PBD1RTO；Skelton等人，1995)與CCL3(PBD1B53；Czaplewski等人，1999)的能量最低結構。這兩個蛋白的三級結構(或摺疊)重疊，而NH2-末端胺基酸1至7和COOH-末端胺基酸64至68(數據未顯示)除外。碳骨架的最佳擬合分析(SWISS-MODEL「MagicFit」)描繪(繪製帶狀圖)全長CCL5多肽(SEQIDNO1的胺基酸Ser1至Ser68)和全長CCL3多肽(SEQIDNO22的胺基酸Ser1至Ala69)。與水療法曲線相似，CCL5與CCL3之間的最大結構序列分歧發生在NH2-末端胺基酸殘基內。最後，從結構上分析包含肽1片段(即胺基酸1至15)的CCL5蛋白的NH2-末端部分(數據未顯示)，其被證明針對RSV感染是最具抑制性的。用BrookhavenProteinDataBank分子坐標(分別以1RTO、1EQT和1B3A名存放)通過計算機模擬(SWISS-MODEL和Swiss-PdbViewer)計算CCL5、Met-CCL5和AOP-CCL5的二面角(φ和ψ)。這些計算的結果展示於表7中。實例6趨化因子促效劑測定趨化因子測定。根據由Proudfoot等人(1996)修改的Gong和Clark-Lewis方法(1995)實現THP-1細胞趨化性(細胞遷移)。簡單來說，將200μl培養基(含有0.01MHEPES、10％熱滅活胎牛血清、2mML-穀氨醯胺和0.005％慶大黴素(gentamicin)的RPMI1640)中的5.6×105細胞置於安裝有5-μm濾紙的96孔Boyden微腔(NeuroProbe；CabinJohn，MD)的上腔室中。隨後，將含有配體和Met-CCL5適當稀釋液的370μl上述培養基(減去胎牛血清)置於96孔Boyden微腔的下腔室中。在37℃、5％CO2下培養60分鐘後，從上方孔中移出細胞，並且加入200μl含有20μMEDTA的磷酸鹽緩衝鹽水以分開粘附於濾紙上的細胞。在4℃下培養30分鐘後，在1800×g下離心所述板10分鐘，並且從下方孔中移除上清液。通過CellTiter96TM非放射性細胞增殖測定(Promega)來測量遷移細胞數目，此測定監控四唑藍(tetrazoliumblue)轉化成其甲(formazan)產物。如Fincham等人(1988)所述測量單核細胞和嗜中性粒細胞的趨化性。簡單來說，將50ml新鮮血液收集於含有0.1MEDTA、3％右旋糖和3％葡萄糖的15-ml溶液中以防止聚集。使所述混合物在37℃下沉澱1小時。通過將14ml血漿在7mlFicoll上分層並且將所述離心機解除制動而在15℃下296×g離心20分鐘來分離PMN和淋巴細胞。淋巴細胞位於Ficoll與血漿的界面處，而PMN形成球粒(pellet)。通過低滲溶解從PMN移除汙染的紅血球(主要是嗜中性粒細胞)，並且洗滌殘餘白血球並以106個白血球/毫升的濃度重懸於RPMI1640培養基中。通過加入106個綿羊紅血細胞/毫升並且在4℃下散開(rosetting)60分鐘，接著再進行Ficoll梯度離心，而從淋巴細胞部分純化大約40-50×106個單核細胞/毫升。在PBS緩衝液(140mMNaCl、3mMKCl、8mMNa2HPO4、1.5mMKH2PO4，pH7.4)中洗滌單核細胞，並且重懸於RPMI1640培養基中。用96孔Boyden微腔測定單核細胞和嗜中性粒細胞的趨化性。在培養基(含有2mML-穀氨醯胺、25mMHEPES和10％熱滅活胎牛血清的RPMI1640)中製得受試抗病毒分子(例如，經修飾的NH2-末端CCL5肽片段)的連續稀釋液。向測定孔的下方腔室中加入25μl趨化因子(chemoattractant)，並且用不含聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯膜覆蓋，所述膜的孔隙大小對嗜中性粒細胞而言為3μm，而對單核細胞為5μm。向頂部孔中加入含有106個細胞/毫升的50μl溶液。對於嗜中性粒細胞，將測定板在37℃下培養20分鐘，而對於單核細胞，培養30分鐘。隨後用PBS緩衝液洗滌膜的上表面，且將膜下側的細胞固定於甲醇中。用Field’sA和B染劑的混合物(Bender和Hobein)對膜進行染色，並且風乾。隨後用ZeissAxiophot顯微鏡和VIDAS圖像分析軟體(KONTRONElectronics，Zurich，Switzerland)計數膜表面下的細胞。鈣流動測定。用重組或合成CCL5和10-10M濃度範圍的受試抗病毒分子來測量嗜中性粒細胞細胞內鈣的流動。在37℃下，以2μMFura-2染料在KrebsRinger緩衝液(1.36mMNaCl、1.8mMKCl、1.2mMKH2PO4、1.2mMMgSO4、5mMNaHCO3、1.2mMCaCl2、0.21mMEGTA、5.5mMD-葡萄糖、20mMHEPES)中培養細胞30分鐘。Fura-2染料在340nm下受激發，並且用螢光計在500nm下監控螢光發光。用等式[Ca]＝Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)計算細胞內Ca2+，其中Kd是Ca2+結合染料的離解常數，且F是任意螢光單位。加入過量的10mMEGTA以螯合Ca2+並且計算Fmin。通過加入20mM三羥甲基氨基甲烷來調節pH值至8.5，並且用50μM毛地黃皂苷(digitonin)溶解細胞。由將所溶解細胞暴露於過量1mMCa2+後的螢光值計算Fmax。參考文獻美國專利5,258,454美國專利5,556,747美國專利5,789,166美國專利6,391,548美國專利5,817,879Akerlind等人，″Respiratorysyncytialvirusheterogeneityofsubgroupstrains″，JGenVirol，692145-2154，1988。Altschul等人，″Basiclocalalignmentsearchtool″，J.Mol.Biol.，215403-410，1990。Appay和Rowland-Jones，″RANTESaversatileandcontroversialchemokine″，TrendsImmunol，2283-87，2001。Arenzana-Seisdedos等人，″HIVBlockedByChemokineAntagonist″，Nature，383400，1996。Baggiolini，″Chemokinesinpathologyandmedicine″，JInternMed，25091-104，2001。Barany等人，Int.J.PeptideProteinRes.30，705-739，1987。Barron和Zuckermann，″BioinspiredPolymericMaterialsIn-BetweenProteinsandPlastic″，Curr.Opin.Chem.Biol.，3681-687，1999。Bartz等人，″Respiratorysyncytialvirusdecreasesthecapacityofmyeloiddendriticcellstoinduceinterferon-gammainnaiveTcells″，Immunology，10949-57，2003。Beaulieu等人，″Expressionofafunctionaleotaxin(CCchemokineligand11)receptorCCR3byhumandendriticcells″，JImmunol，1692925-2936，2002。Becker等人，″RSVinfectionofhumanairwayepithelialcellscausesproductionofthebetachemokineRANTES″，Am.J.Physiol，272L512-520，1997。Berger等人，″ChemokinereceptorsasHIV-1coreceptorsRolesinviralentry，tropismanddisease″，AnnuRevImmunol，17657-700，1999。Blanpain等人，″MultipleactivestatesandoligomerizationofCCR5revealedbyfunctionalpropertiesofmonoclonalantibodies″，Mol.Biol.Cell，13723-737，2002。Bode和Huber，Eur.J.Biochem.204433-451，1992。Bonville等人，″Macrophageinflammatoryprotein-1-alphaandRANTESarepresentinnasalsecretionsduringongoingupperrespiratorytractinfection″，PedAllergyandImmunology，1039-44，1999。Bourgeois等人，″Heparin-likestructuresonrespiratorysyncytialvirusareinvolvedinitsinfectivityinvitro″，JVirol，727221-7227，1998。Burns等人，″Anewmonoclonalantibody，mAb4A12，identifiesarolefortheglycosaminoglycan(GAG)bindingdomainofRANTESintheantiviraleffectagainstHIV-1andintracellularCa2+signaling″，JExpMed，1881917-1927，1998。Chung等人，″TheThree-DimensionalSolutionStructureofRANTES″，Biochemistry，349307-9314，1995。Clark-Lewis等人，M.J.Biol.Chem.，26916075-16081，1994。Crowe等人，″Afurtherattenuatedderivativeofacold-passagedtemperature-sensitivemutantofhumanrespiratorysyncytialvirusretainsimmunogenicityandprotectiveefficacyagainstwild-typechallengeinseronegativechimpanzees″，Vaccine，12783-790，1994。Crowe等人，″LivesubgroupBrespiratorysyncytialvirusvaccinesthatareattenuated，geneticallystable，andimmunogenicinrodentsandnonhumanprimates″，JInfectDis，17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TyrIle151015210321115212PRT213智人4003ThrProCysCysPheAlaTyrIleAlaArgProLeuProArgAla151015210421115212PRT213智人4004IleAlaArgProLeuProArgAlaHisIleLysGluTyrPheTyr151015210521115212PRT213智人4005AlaHisIleLysGluTyrPheTyrThrSerGlyLysCysSerAsn151015210621115212PRT213智人4006TyrThrSerGlyLysCysSerAsnProAlaValValPheValThr151015210721114212PRT213智人4007ProAlaValValPheValThrArgLysAsnArgGlnValCys1510210821115212PRT213智人4008ThrArgLysAsnArgGlnValCysAlaAsnProGluLysLysTrp151015210921115212PRT213智人4009CysAlaAsnProGluLysLysTrpValArgGluTyrIleAsnSer1510152101021115212PRT213智人40010GluLysLysTrpValArgGluTyrIleAsnSerLeuGluMetSer1510152101121112212PRT213智人40011ThrThrProCysCysPheAlaTyrIleAlaArgPro15102101221112212PRT213智人40012ProCysCysPheAlaTyrIleAlaArgProLeuPro15102101321112212PRT213智人40013CysPheAlaTyrIleAlaArgProLeuProArgAla15102101421112212PRT213智人40014HisIleLysGluTyrPheTyrThrSerGlyLysCys15102101521112212PRT213智人40015SerGlyLysCysSerAsnProAlaValValPheVal15102101621119212PRT213智人40016CysPheAlaTyrIleAlaArgProLeuProArgAlaHisIleLysGlu151015TyrPheTyr2101721124212PRT213智人40017CysPheAlaTyrIleAlaArgProLeuProArgAlaHisIleLysGlu151015TyrPheTyrThrSerGlyLysCys202101821134212PRT213智人40018SerProTyrSerSerAspThrThrProCysCysPheAlaTyrIleAla151015ArgProLeuProArgAlaHisIleLysGluTyrPheTyrThrSerGly202530LysCys2101921119212PRT213智人40019TyrPheTyrGluLysIleHisAlaArgProLeuProArgAlaIleTyr151015AlaPheCys2102021134212PRT213智人40020CysLysGlySerThrTyrPheTyrGluLysIleHisAlaArgProLeu151015ArgProAlaTleTyrAlaPheCysCysProThrThrAspSerSerTyr202530ProSer2102121115212PRT213智人40021IleTyrAlaPheCysCysProThrThrAspSerSerTyrProSer1510152102221169212PRT213智人40022SerLeuAlaAlaAspThrProThrAlaCysCysPheSerTyrThrSer151015ArgGlnIleProGlnAsnPheIleAlaAlaTyrPheGluThrSerser202530GlnCysSerLysProGlyValIlePheLeuThrLysArgSerArgGln354045ValCysAlaAspProSerGluGluTrpValGlnLysTyrValSerAsp505560LeuGluLeuSerAla6權利要求1.一種包含CCL5多肽的抗病毒組合物，其中所述CCL5多肽抑制哺乳動物受檢者受副粘液病毒科(副粘病毒)病毒的感染。2.根據權利要求1所述的組合物，其中所述副粘病毒是呼吸道合胞病毒(RSV)。3.根據權利要求2所述的組合物，其中所述CCL5多肽通過阻斷RSV融合(F)蛋白與哺乳動物上皮細胞之間的互作來抑制RSV感染。4.根據權利要求1所述的組合物，其中所述CCL5多肽是合成CCL5多肽或經重組表達的CCL5多肽。5.根據權利要求4所述的組合物，其中所述CCL5多肽在哺乳動物受檢者中作為趨化因子是無生物活性的。6.根據權利要求1所述的組合物，其中所述哺乳動物受檢者是人類。7.根據權利要求1所述的組合物，其中所述哺乳動物受檢者是經馴養的非人類哺乳動物，其選自由牛、馬、豬、狗、貓、山羊和綿羊組成的群組。8.根據權利要求1所述的組合物，其中所述CCL5多肽包含SEQIDNO1胺基酸序列。9.根據權利要求1所述的組合物，其中所述CCL5多肽是NH2-末端經修飾的CCL5多肽。10.根據權利要求9所述的組合物，其中所述NH2-末端經修飾的CCL5多肽是選自由氨氧基戊烷-CCL5(AOP-CCL5)、Met-CCL5、Nα-壬醯基-CCL5(NNY-CCL5)、Δ1-2截短型CCL5和Δ1-8截短型CCL5組成的群組。11.根據權利要求1所述的組合物，其進一步包含一個或一個以上的CCL5肽片段，其中所述片段包含SEQIDNO1的CCL5多肽的約10至20個相鄰胺基酸。12.根據權利要求11所述的組合物，其中所述一個或一個以上的CCL5肽片段是選自由SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO7、SEQIDNO8、SEQIDNO9、SEQIDNO10、SEQIDNO11、SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14、SEQIDNO15、SEQIDNO16、SEQIDNO17和SEQIDNO18組成的群組。13.根據權利要求12所述的組合物，其中所述CCL5肽片段包含SEQIDNO2胺基酸序列。14.根據權利要求13所述的組合物，其中所述SEQIDNO2肽片段進一步被定義為SEQIDNO1的NH2-末端肽。15.根據權利要求1所述的組合物，其中所述CCL5多肽進一步被定義為人類CCL5多肽。16.根據權利要求1所述的組合物，其進一步包含SEQIDNO1的CCL5多肽的NH2-末端的肽模擬物。17.根據權利要求16所述的組合物，其中所述CCL5多肽的NH2-末端的肽模擬物是包含SEQIDNO19、SEQIDNO20或SEQIDNO21胺基酸序列的逆轉CCL5多肽。18.根據權利要求1所述的組合物，其進一步包含結合CCR3趨化因子受體的有機分子。19.根據權利要求18所述的組合物，其中所述有機分子是CCR3受體拮抗劑。20.根據權利要求19所述的組合物，其中所述有機分子包含一個或一個以上的式I、II或III的化學結構。21.根據權利要求1所述的組合物，其中所述組合物是通過鼻內投藥或非經腸投藥而投與哺乳動物受檢者。22.根據權利要求1所述的組合物，其進一步包含為CCR1拮抗劑或CCR5拮抗劑的有機分子。23.一種重組表達載體，其包含編碼根據權利要求1所述的CCL5多肽的多核苷酸序列。24.一種經根據權利要求23所述的載體轉染、轉化或侵染的宿主細胞。25.一種包含CCL5多肽的NH2-末端肽片段的抗病毒組合物，其中所述片段包含CCL5多肽的NH2-末端的約10至20個相鄰胺基酸，其中所述片段抑制哺乳動物受檢者受副粘液病毒科(副粘病毒)病毒的感染。26.根據權利要求25所述的組合物，其中所述副粘病毒是RSV。27.根據權利要求25所述的組合物，其中所述CCL5多肽包含SEQIDNO1胺基酸序列。28.根據權利要求27所述的組合物，其中所述NH2-末端肽片段包含選自由以下序列組成的群組的胺基酸序列SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO7、SEQIDNO8、SEQIDNO9、SEQIDNO10、SEQIDNO11、SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14、SEQIDNO15、SEQIDNO16、SEQIDNO17和SEQIDNO18。29.根據權利要求28所述的組合物，其中所述NH2-末端肽片段包含SEQIDNO2胺基酸序列。30.根據權利要求25所述的組合物，其中所述組合物在哺乳動物受檢者中作為趨化因子是無生物活性的。31.根據權利要求25所述的組合物，其中所述組合物是通過鼻內投藥或非經腸投藥而投與哺乳動物受檢者。32.根據權利要求25所述的組合物，其中所述NH2-末端CCL5肽片段通過阻斷RSV融合(F)蛋白與哺乳動物上皮細胞之間的互作來抑制RSV感染。33.根據權利要求25所述的組合物，其進一步包含一個或一個以上選自由氨氧基戊烷-CCL5(AOP-CCL5)、Met-CCL5、Nα-壬醯基-CCL5(NNY-CCL5)、Δ1-2截短型CCL5和Δ1-8截短型CCL5組成的群組的NH2-末端經修飾的CCL5多肽。34.根據權利要求25所述的組合物，其進一步包含SEQIDNO1的CCL5多肽的NH2-末端的肽模擬物。35.根據權利要求34所述的組合物，其中所述CCL5多肽的NH2-末端的肽模擬物是包含SEQIDNO19、SEQIDNO20或SEQIDNO21胺基酸序列的逆轉CCL5多肽。36.根據權利要求25所述的組合物，其進一步包含為CCR1受體、CCR3受體或CCR5受體的拮抗劑的有機分子。37.一種重組表達載體，其包含編碼根據權利要求25所述的NH2-末端CCL5肽片段的多核苷酸序列。38.一種經根據權利要求37所述的載體轉染、轉化或侵染的宿主細胞。39.一種有機小分子模擬物，其是通過使用SEQIDNO1的前15個CCL5NH2-末端胺基酸的原子X、Y、Z坐標的基於計算機的分子模型化設計而成，其中所述X、Y、Z坐標見於選自由1RTN、1RTO、1EQT和1B3A組成的群組的BrookhavenProteinDataBank文件中。40.一種包含根據權利要求39所述的有機分子的抗病毒組合物。41.一種CCL5多肽的NH2-末端的肽模擬物，其中所述肽模擬物抑制哺乳動物受檢者受副粘液病毒科(副粘病毒)病毒的感染。42.根據權利要求41所述的肽模擬物，其中所述模擬物是通過使用SEQIDNO1的前15個CCL5NH2-末端胺基酸的原子X、Y、Z坐標的基於計算機的分子模型化設計而成，其中所述X、Y、Z坐標被包含於選自由1RTN、1RTO、1EQT和1B3A組成的群組的BrookhavenProteinDataBank文件中。43.根據權利要求41所述的肽模擬物，其中所述模擬物是回折模擬物。44.根據權利要求43所述的肽模擬物，其中所述回折模擬物是β-轉角模擬物、單環β-轉角模擬物、雙環β-轉角模擬物、γ-轉角模擬物或單環γ-轉角模擬物。45.一種包含根據權利要求41所述的肽模擬物的抗病毒組合物。46.一種用於預防或抑制哺乳動物宿主受副粘液病毒科(副粘病毒)病毒感染的方法，所述方法包含對所述宿主投與醫藥學有效量的根據權利要求1所述的組合物。47.一種用於預防或抑制哺乳動物宿主中副粘病毒感染的方法，所述方法包含對所述宿主投與醫藥學有效量的根據權利要求25所述的組合物。48.一種用於預防或抑制哺乳動物宿主中副粘病毒感染的方法，所述方法包含對所述宿主投與醫藥學有效量的根據權利要求39所述的組合物。49.一種用於預防或抑制哺乳動物宿主受副粘液病毒科(副粘病毒)病毒感染的方法，其中所述方法包含對所述宿主投與醫藥學有效量的根據權利要求41所述的組合物。全文摘要本發明針對用於投與易受副粘病毒感染，尤其是呼吸道合胞病毒(RSV)感染的哺乳動物宿主(例如人類)的抗病毒素。在某些實施例中，本發明的抗病毒分子是多肽、趨化因子多肽、趨化因子多肽片段、有機小分子或肽模擬物，其中所述抗病毒分子抑制或預防哺乳動物細胞的副粘病毒感染。文檔編號A61P31/14GK1902223SQ200480039227公開日2007年1月24日申請日期2004年12月28日優先權日2003年12月30日發明者傑拉爾德·歐文·漢考克,保羅·威廉·特比申請人:惠氏公司