編碼與酵母的凝集性相關的蛋白質的基因及其用途的製作方法

2023-07-10 00:22:46 4

專利名稱:編碼與酵母的凝集性相關的蛋白質的基因及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及編碼與酵母的凝集性相關的蛋白質的基因及其用途，特別涉及具有適 度凝集性的製造酒精飲料的釀造酵母、使用該酵母製造的酒精飲料、其製造方法等。更加具 體地說，本發明涉及通過控制編碼與釀造酵母的凝集性相關的蛋白質的MHPl基因，特別是 啤酒酵母的特徵基因nonScMHPl的表達量而具有適當凝集性的酵母、其選擇方法、育種方 法、以及使用該酵母的酒精飲料的製造方法等。
背景技術：
在製造酒精飲料的過程中，供與釀造使用的酵母的凝集性非常重要，這裡，酵母的 凝集性是指各酵母細胞之間相互作用形成凝集塊，在液體培養基中沉降於液體底部的性 質。
例如，現在普遍喜歡飲用的儲藏型啤酒，其釀造中使用的酵母的特徵在於，接近發 酵結束時酵母發生凝集沉降於發酵液的底部，所以稱其為下層發酵酵母。在啤酒釀造過程 中，要回收發酵結束後的酵母以在下次發酵中使用(將此稱為連續釀造)，所以從釀造過程 的工作效率來看酵母的凝集性是非常重要的特性。也就是說，凝集性低的酵母即使發酵結 束時也不發生沉降，存在回收時必需進行例如離心分離等多餘工序的問題。另一方面，凝集 性太高的酵母在發酵途中發生沉降，有可能不能進行充分的發酵，這種情況下會極大影響 產品的香味，所以使用其凝集性適合於製造目的酒精飲料的酵母非常重要。
此外，不僅限於酒精飲料，在工業用酒精生產(參照新型凝集性酒精發酵酵母、日 本國特公平6-36734號公報)、廢水處理(高凝集活性突變株、日本國特許第3044284號)， 以及酒精飲料的生產領域，更加要求效率性，所以有關酵母凝集性的研究非常盛行。
這樣在有關產業上具有重要性質的酵母凝集性的大量研究中，作為與酵母的凝集 性相關的基因，到目前為止確定有FLO基因家族(FL01、FL05、FL08、FL09、FL010、FLOl 1)和 SFLl 等。
作為這方面的研究，例如已對FLOl基因進行了分子水平的分析(Bidardet al.， YEAST, 11 (9), 809 (1995)),已對通過使用Flolp控制啤酒酵母的凝集性的方法進行了研究 (日本國特許第3643404號)。此外還報導了下述方法，即，通過FL08基因的表達調節控制 酵母凝集性的方法(日本國日本特開平08-270號公報)、使用FL05基因的鹼基序列判定凝 集性的方法(國際公開號W001/040514)等。
另一方面，還知道幾種凝集性酵母的特異性酵母細胞表面蛋白，但對每一種蛋白 質的認識還不足以達到用於控制啤酒酵母的凝集性的研究。

發明內容
在上述狀況下，要求利用編碼與釀造酵母凝集性相關的蛋白質的基因以及該蛋白 質，對其凝集性適合於製造目的酒精飲料的酵母進行育種，以能夠高效率製造酒精飲料。
本發明者為了解決上述課題進行精心研究，結果從啤酒酵母中成功鑑定、分離出編碼與酵母的凝集性相關的蛋白質的基因。此外，製備所得基因的表達得到控制的轉化酵 母，證明凝集性可實際上得到控制，從而完成了本發明。
本發明涉及編碼與釀造酵母的凝集性相關的蛋白質的基因、該基因編碼的蛋白 質、該基因的表達受到調節的轉化酵母、通過使用該基因表達受到調節的酵母來控制酵母 凝集性的方法等。具體來說，本發明提供下述所示的多核苷酸、含有該多核苷酸的載體或 DNA片段、導入該載體或DNA片段的轉化酵母、使用該轉化酵母的酒精飲料的製造方法等。
(1)多核苷酸，其選自下述(a) (f)組成的群組
(a)多核苷酸，其含有具有序列號1的鹼基序列的多核苷酸；
(b)多核苷酸，其含有編碼蛋白質的多核苷酸，所述蛋白質具有序列號2的胺基酸 序列；
(c)多核苷酸，其含有編碼蛋白質的多核苷酸，所述蛋白質具有在序列號2的氨基 酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1個或多個胺基酸後的胺基酸序列，且具有賦予酵母 凝集性的活性；
(d)多核苷酸，其含有編碼蛋白質的多核苷酸，所述蛋白質具有與序列號2的氨基 酸序列有60%以上同一性的胺基酸序列，且具有賦予酵母凝集性的活性；
(e)多核苷酸，其含有一種多核苷酸，該種多核苷酸在嚴格條件下與具有與序列號 1的鹼基序列互補的鹼基序列的多核苷酸進行雜交，且編碼具有賦予酵母凝集性的活性的 蛋白質；以及
(f)多核苷酸，其含有一種多核苷酸，該種多核苷酸在嚴格條件下，與具有與編碼 具有序列號2的胺基酸序列的蛋白質的多核苷酸的鹼基序列互補的鹼基序列的多核苷酸 進行雜交，且編碼具有賦予酵母凝集性的活性的蛋白質。
(2)如上述⑴所述的多核苷酸，其選自下述(g) ⑴組成的群組
(g)多核苷酸，其含有編碼蛋白質的多核苷酸，所述蛋白質具有序列號2的胺基酸 序列或在序列號2的胺基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1 10個胺基酸後的氨基 酸序列，且具有賦予酵母凝集性的活性；
(h)多核苷酸，其含有編碼蛋白質的多核苷酸，所述蛋白質具有與序列號2的氨基 酸序列有90%以上同一性的胺基酸序列，且具有賦予酵母凝集性的活性；以及
(i)多核苷酸，其含有一種多核苷酸，該種多核苷酸在高嚴格條件下，與具有序列 號1的鹼基序列的多核苷酸或具有與序列號1的鹼基序列互補的鹼基序列的多核苷酸進行 雜交，且編碼具有賦予酵母凝集性的活性的蛋白質。
(3)如上述(1)所述的多核苷酸，其含有具有序列號1的鹼基序列的多核苷酸。
(4)如上述(1)所述的多核苷酸，其含有編碼具有序列號2的胺基酸序列的蛋白質 的多核苷酸。
(5)如上述(1) (4)中任一項所述的多核苷酸，其為DNA。
(6)多核苷酸，其選自下述(j) (m)組成的群組
(j)多核苷酸，其編碼RNA，該RNA具有與上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的轉錄 產物互補的鹼基序列；
(k)多核苷酸，其編碼RNA，該RNA通過RNAi效應抑制上述(5)所述的多核苷酸 (DNA)的表達；[0028](1)多核苷酸，其編碼RNA，該RNA對上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的轉錄產物 具有特異切割活性；以及，
(m)多核苷酸，其編碼RNA，該RNA通過共抑制效應抑制上述(5)所述的多核苷酸 (DNA)的表達。
(7)蛋白質，其為被上述(1) (5)中任一項所述的多核苷酸編碼的蛋白質。
(8)載體，其含有上述⑴ (5)中任一項所述的多核苷酸。
(8a)上述(8)所述的載體，其包括表達盒，該表達盒包括下述構成要素(X) (ζ)
(χ)在酵母細胞內可轉錄的啟動子；
(y)上述⑴ (5)中任一項所述的多核苷酸，其連接在該啟動子的正義方向或反 義方向；以及
(ζ)涉及RNA分子的轉錄終止及多腺苷酸化作用，並在酵母內起作用的信號。
(8b)上述(8)所述的載體，其包括表達盒，該表達盒包括下述構成要素(X) (ζ)
(χ)在酵母細胞內可轉錄的啟動子；
(y)上述(1) (5)中任一項所述的多核苷酸，其連接在該啟動子的正義方向；以 及
(ζ)涉及RNA分子的轉錄終止及多腺苷酸化作用，並在酵母內起作用的信號。
(8c)上述(8)所述的載體，其包括表達盒，該表達盒包括下述構成要素(X) (ζ)
(χ)在酵母細胞內可轉錄的啟動子；
(y)上述⑴ (5)中任一項所述的多核苷酸，其連接在該啟動子的反義方向；以 及
(ζ)涉及RNA分子的轉錄終止及多腺苷酸化作用，並在酵母內起作用的信號。
(9)載體，其含有上述(6)所述的多核苷酸。
(10)酵母，其為導入上述⑶ (9)中任一項所述的載體的酵母。
(11)如上述(10)所述的酵母，其凝集性得到增大。
(12)如上述(11)所述的酵母，其中，凝集性的增大是通過增加上述(7)所述的蛋 白質的表達量而獲得。
(13)酵母，其為通過
(A)導入上述⑶ (9)中任一項所述的載體，
(B)破壞上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的基因，或
(C)使啟動子突變、或重組啟動子，
而使上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的表達受到抑制的酵母。
(14)如上述(13)所述的酵母，其凝集性得到降低。
(15)酒精飲料的製造方法，其中，使用上述(10) (14)中任一項所述的酵母。
(16)如上述(15)所述的酒精飲料的製造方法，其中，釀造的酒精飲料是麥芽飲 料。
(17)如上述(15)所述的酒精飲料的製造方法，其中，釀造的酒精飲料是葡萄酒。[0057](18)酒精飲料，其為採用上述(15) (17)中任一項所述的方法製造的酒精飲料。
(19)評價被檢酵母的凝集性的方法，其包括使用根據具有序列號1的鹼基序列且 編碼具有賦予酵母凝集性活性的蛋白質的基因的鹼基序列而設計的引物或探針。
(19a)利用上述(19)所述的方法，選擇出凝集性高或低的酵母的方法。
(19b)使用根據上述(19a)所述的方法選擇的酵母，製造酒精飲料(如啤酒)的方 法。
(20)評價被檢酵母的凝集性的方法，其包括培養被檢酵母；以及測定具有序列 號1且編碼具有賦予酵母凝集性活性的蛋白質的基因的表達量。
(20a)酵母的選擇方法，其包括根據上述(20)所述的方法評價被檢酵母；以及選 擇出編碼具有賦予酵母凝集性活性的蛋白質的基因的表達量高或低的酵母。
(20b)使用根據上述(20a)所述的方法選擇的酵母，製造酒精飲料(如啤酒)的方法。
(21)酵母的選擇方法，其包括培養被檢酵母；定量上述(7)所述的蛋白質或者測 定具有序列號1的鹼基序列且編碼具有賦予酵母凝集性活性的蛋白質的基因的表達量；以 及選擇所述蛋白質的量或所述基因表達量與目標凝集性相應的被檢酵母的方法。
(22)如上述(21)所述的酵母的選擇方法，其包括培養標準酵母和被檢酵母；測 定具有序列號1的鹼基序列且賦予酵母凝集性的基因在各酵母中的表達量；以及選擇該基 因的表達高於或低於標準酵母的被檢酵母。
(23)如上述(21)所述的酵母的選擇方法，其包括培養標準酵母和被檢酵母；定 量各酵母中的上述(7)所述的蛋白質；選擇其中該蛋白質的量多於或少於標準酵母的被檢 酵母。S卩，培養多個酵母；對各酵母中的上述(7)所述的蛋白質進行定量；以及選擇各酵母 中該蛋白質的量較多或較少的被檢酵母。
(24)酒精飲料的製造方法，其包括，使用上述(10) (14)中任一所述的酵母或根 據上述(21) (23)中任一所述的方法選擇的酵母，進行製造酒精飲料的發酵，並調節酵母 的凝集性。
根據本發明所述的使用轉化酵母的酒精飲料的製造方法，通過使用其凝集性適合 於製造目的酒精飲料的酵母，能夠高效率地製造酒精飲料。


圖1表示啤酒釀造試驗中酵母增殖量的經時變化，橫軸表示發酵時間，縱軸表示 0D660 值。
圖2表示啤酒釀造試驗中浸出物(糖)消耗量的經時變化，橫軸表示發酵時間，縱 軸表示表觀浸出物濃度_% )。
圖3表示啤酒釀造試驗中的酵母中nonScMHPl基因的表達行為，橫軸表示發酵時 間，縱軸表示檢出的信號強度。
圖4表示nonScMHPl破壞株的凝集性試驗結果，縱軸表示凝集性指標沉降指數。
具體實施方式
本發明者根據日本國特開2004-283169公開的方法解讀的啤酒酵母基因組的信息，分離、鑑定出編碼與釀造酵母的凝集性相關的蛋白質的基因nonScMHPl，該鹼基序列用 序列號1表示，此外由該基因編碼的蛋白質的胺基酸序列用序列號2表示。
1.本發明的多核苷酸
首先，本發明提供(a)多核苷酸，其含有具有序列號1的鹼基序列的多核苷酸；以 及(b)多核苷酸，其含有編碼具有序列號2的胺基酸序列的蛋白質的多核苷酸。多核苷酸 可以是DNA也可以是RNA。
作為本發明對象的多核苷酸，並不限定於編碼上述來自於啤酒酵母的與凝集性相 關的蛋白質的多核苷酸，而且還包括編碼與該蛋白質具有同等功能的蛋白質的其他多核苷 酸。作為具有同等功能的蛋白質，例如可以為(c)蛋白質，其為具有在序列號2的胺基酸序 列中缺失、取代、插入及/或添加1個或多個胺基酸後的胺基酸序列，且賦予酵母凝集性的 蛋白質。
此類蛋白質可以為具有在序列號2的胺基酸序列中如缺失、取代、插入及/或添加1 100個、1 90個、1 80個、1 70個、1 60個、1 50個、1 40個、1 39個、1 38個、1 37個、1 36個、1 35個、1 34個、1 "-33個、1 -32個、1 31個、1 30個、1 29個、1 28個、1 27個、1 26個、1 25個、1 24個、1 23個、1 22個、1 21個、1 20個、1 19個、1 18個、1 17個、1 16個、1 15個、
1 14個、1 13個、1 12個、1 11個、1 10個、1 9個、1 8個、1 7個、1 6 個(1 數個)、1 5個、1 4個、1 3個、1 2個、或1個胺基酸殘基後的胺基酸序列， 且賦予酵母凝集性的蛋白質。上述缺失、取代、插入及/或添加的胺基酸殘基的個數，一般 優選小的數目。並且此類蛋白質還可以為(d)蛋白質，其具有與序列號2的胺基酸序列有 約60%以上、約70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、 77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85% 以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、 94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99. 1 %以上、99. 2 %以上、 99. 3%以上、99. 4%以上、99. 5%以上、99. 6%以上、99. 7%以上、99. 8%以上、或99. 9%以 上的同一性的胺基酸序列，且賦予酵母凝集性。上述同源性的數值一般優選大的數值。
此外，對於酵母的凝集性，例如可以根據日本特開平H8-205890號公報所述的方 法進行測定。
本發明還包括(e)多核苷酸，其含有一種多核苷酸，該種多核苷酸在嚴格條件下 與具有與序列號1的鹼基序列互補的鹼基序列的多核苷酸進行雜交，且編碼賦予酵母凝集 性的蛋白質；以及(f)多核苷酸，其含有一種多核苷酸，該種多核苷酸在嚴格條件下，與具 有與編碼具有序列號2的胺基酸序列的蛋白質的多核苷酸的鹼基序列互補的鹼基序列的 多核苷酸進行雜交，且編碼賦予酵母凝集性的蛋白質。
這裡所述的「嚴格條件下進行雜交的多核苷酸」，是指將具有與序列號1的鹼基序 列互補的鹼基序列的多核苷酸的全部或一部分、或將編碼序列號2的胺基酸序列的多核苷 酸的全部或一部分作為探針，使用菌落雜交法、噬菌斑雜交法、southern雜交法等得到的多 核苷酸，例如 DNA。雜交方法可以利用如 Molecular Cloning 3rd Ed. ,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997 等所述的方法。
本說明書所述的「嚴格條件」，可以為低嚴格條件、中嚴格條件、高嚴格條件中的任一種。「低嚴格條件」，如為5XSSC、5XDenhardt溶液、0. 5% SDS、50%甲醯胺、32°C的條件； 此外，「中嚴格條件」，如為5XSSC,5XDenhardt溶液、0. 5% SDS、50%甲醯胺、42°C的條件； 「高嚴格條件」，如為5XSSC、5XDenhardt溶液、0. 5% SDS、50%甲醯胺、50°C的條件。在這 些條件下，預期溫度越高越能有效得到同源性高的多核苷酸，如DNA。雖然影響雜交的嚴格 度的因素有多種，如溫度、探針濃度、探針長度、離子強度、時間、鹽濃度等，但本領域技術人 員可通過適當選擇這些要素得到類似的嚴格度。
使用市售的試劑盒進行雜交時，如可以使用Alkphos Direct LabellingReagents (Amersham Pharmacia公司製造)。這種情況下，按照試劑盒中附帶的 說明書，與標記探針過夜培養後，在55°C的條件下用含有0. 1% (w/v)SDS的第一次洗滌緩 衝液將膜洗滌後，由此檢測雜交的多核苷酸，例如DNA。
除此之外可能雜交的多核苷酸還可以為，通過FASTA、BLAST等同源性檢索軟體用 系統設定的默認參數進行計算時，與編碼序列號2的胺基酸序列的多核苷酸有約60%以 上、約70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、 78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86% 以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、 95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99. 1以上％、99. 2以上％、99. 3%以 上、99. 4%以上、99. 5%以上、99. 6%以上、99. 7%以上、99. 8%以上、或99. 9%以上的同一 性的多核苷酸。
胺基酸序列、鹼基序列的同一性，可以使用Karlin及Altschul的 BLASTAlgorithm (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2264-2268,1990 ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA，90，5873，1993)來確定。以 BLAST Algorithm 為基礎的稱為 BLASTN、BLASTX 的程序已 被開發(Altschul SF，et al J Mol Biol. 215 :403，1990)。使用 BLASTN 分析鹼基序列時， 參數為如score = 100、wordlength = 12 ；此外使用BLASTX分析胺基酸序列時，參數為如 score = 50,wordlength = 3 ；使用BLAST和Gapped BLAST程序時，採用各程序系統設定的 默認參數值。
本發明的多核苷酸還包括(j)多核苷酸，其編碼RNA，該RNA具有與上述(5)所述 的多核苷酸(DNA)的轉錄產物互補的鹼基序列；(k)多核苷酸，其編碼RNA，該RNA通過RNAi 效應抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的表達；(1)多核苷酸，其編碼RNA，該RNA對上 述(5)所述的多核苷酸(DNA)的轉錄產物具有特異切割的活性；以及(m)多核苷酸，其編碼 RNA，該RNA通過共抑制效應抑制上述(5)所述的多核苷酸(DNA)的表達。將這些多核苷酸 整合到載體內，將該載體導入至待轉化細胞內，從而抑制上述(a) (i)的多核苷酸(DNA) 的表達。因此，當上述DNA的表達受到抑制為優選時，可適宜使用這些多核苷酸。
本說明書中所述的編碼具有與DNA的轉錄產物互補的鹼基序列的RNA的多核苷 酸，指的是反義DNA。反義技術是公知的抑制特定的內源基因表達的方法，在各種文獻中都 有記載(如參照平島及井上新生化學實驗講座2核酸IV基因的複製和表達(日本生化 學會主編，東京化學同人)PP.319-347，1993等)(平島b J t/井上新生化學実験講座2核 酸IV遺伝子O複製i発現(日本生化學會編，東京化學同人)pp. 319-347，1993)。反義DNA 的序列，優選為與內源基因或其中一部分互補的序列，但只要能夠有效抑制基因的表達，不 完全互補也可以。被轉錄的RNA，優選其與靶基因的轉錄產物有90%以上的互補性，更優選有95%以上的互補性。反義DNA的長度至少為15個鹼基以上，優選為100個鹼基以上，更 優選為500個鹼基以上。
本說明書中所述的編碼通過RNAi效應抑制DNA表達的RNA的多核苷酸，指 的是通過RNA幹擾(RNAi)來抑制內源基因表達的多核苷酸。「RNAi」是指將具有與靶 基因序列相同或類似的序列的雙鏈RNA導入細胞內，導入的外源基因及內源靶基因的 表達均被抑制的現象。這裡使用的RNA，例如可以是21 25鹼基長度的產生RNA幹 擾的雙鏈 RNA，如 dsRNA(double strand RNA)、siRNA(small interfering RNA)或 shRNA (short hairpin RNA)。此類RNA可以通過脂質體等輸送系統局部輸送到所需的 部位，或者使用可生成上述雙鏈RNA的載體能夠使其局部表達。這種雙鏈RNA(dsRNA、 siRNA或shRNA)的製備方法、使用方法等，在多種文獻中是公知的(參照日本國特表 2002-516062 號公報；US 2002/086356A ；Nature Genetics，24 (2)，180-183，2000Feb.； Genesis,26 (4)，240-244,2000April ；Nature,407 6802,319-20,2002Sep. 21 ；Genes & Dev.，Vol. 16，(8)，948-958,2002Apr. 15 ；Proc.Natl.Acad. Sci. USA.，99(8)，5515-5520， 2002Apr. 16 ；Science,296 (5567)，550-553, 2002Apr. 19 ；Proc Natl. Acad. Sci. USA, 99 9,6047-6052,2002Apr. 30 ；Nature Biotechnology, Vol.20 (5)，497-500,2002May ； NatureBiotechnology, Vol. 20(5),500-505,2002May ；Nucleic Acids Res. ,30 :10， e46, 2002May 15 等)。
本說明書中所述的編碼對DNA轉錄產物具有特異切割活性的RNA的多核苷酸，一 般是指核酶(Ribozyme)。核酶是指具有催化活性的RNA分子，通過切割靶DNA的轉錄產物 來阻斷其基因功能。關於核酶的設計可以參照各種公知文獻(如參照FEBS Lett. 228 :228， 1988 ；FEBS Lett. 239 :285，1988 ；Nucl. Acids. Res. 17:7059，1989 ；Nature 323 :349，1986 ； Nucl.Acids. Res. 19 6751,1991 ；Protein Eng 3 733,1990 ；Nucl. Acids Res. 19 3875, 1991 ；Nucl. Acids Res. 19:5125,1991 ；Biochem Biophys Res Communl86 :1271，1992等)。 此外，編碼通過共抑制效應抑制DNA表達的RNA的多核苷酸是指通過共抑制來阻斷靶DNA 功能的核苷酸。
本說明書中所述的「共抑制」，是指通過轉化作用在細胞內導入具有與內源靶基因 相同或類似序列的基因，導入的外源基因和內源靶基因的表達均被抑制的現象。具有共抑 制效應的多核苷酸的設計也可以參照各種公知文獻(例如參照Smyth DR =Curr. Biol. 7 R793,1997、Martienssen R :Curr. Biol. 6 :810，1996 等)。
2.本發明的蛋白質
本發明還提供由上述(a) (i)中任意一種多核苷酸所編碼的蛋白質。本發明的 優選蛋白質是具有在序列號2的胺基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1個或多個氨 基酸後的胺基酸序列，且賦予酵母凝集性的蛋白質。
此類蛋白質包括具有在序列號2的胺基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加上述 數量的胺基酸殘基後的胺基酸序列，且賦予酵母凝集性的蛋白質。此外，此類蛋白質還包括 具有與序列號2的胺基酸序列有上述同源性的胺基酸序列，且賦予酵母凝集性的蛋白質。
Jtk^ISSMnT^ffl ((Molecular Cloning 3K ((Current Protocols inMolecular Biology》、「Nuc. Acids. Res. ，10, 6487 (1982) ，，、「Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79 6409(1982)，，、「Gene，34 315(1985)，，、「Nuc. Acids. Res.，13 4431 (1985)，，、「Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 82 =488(1985) 」等所述的定點誘變法獲得。
本發明所述的在蛋白質的胺基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1個或多個氨 基酸殘基，是指在同一序列中的任意1個或多個位置缺失、取代、插入及/或添加1個或多 個胺基酸殘基，並且缺失、取代、插入及添加中的2種以上情形可同時發生。
下面列舉可互相取代的胺基酸殘基，同一組中包含的胺基酸殘基可互相取代。A 組亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、ο-甲基 絲氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、環己基丙氨酸；B組天冬氨酸、穀氨酸、異天冬氨 酸、異穀氨酸、2_氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C組天冬醯胺、穀氨醯胺；D組賴氨酸、精氨 酸、鳥氨酸、2，4_ 二氨基丁酸、2，3- 二氨基丙酸；E組脯氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨 酸；F組絲氨酸、蘇氨酸、高絲氨酸；G組苯基丙氨酸、酪氨酸。
本發明的蛋白質也可以通過Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基 法)等化學合成法製造，並且也可以利用Advanced Chem Tech公司、PerkinElmer公 司、Pharmacia 公司、Protein Technology Installment 公司、Synthecell-Vega 公司、 PerSeptive公司、Shimazu公司等製造的肽合成儀進行化學合成。
3.本發明的載體及導入該載體的轉化酵母
本發明提供含有上述多核苷酸的載體。本發明的載體含有上述(a) (i)中任一 項所述的多核苷酸(DNA)或上述(j) (m)中任一項所述的多核苷酸。並且，構成的本發明 的載體通常包括表達盒，該表達盒包括的結構要素為(x)在酵母細胞內可轉錄的啟動子； (y)在該啟動子的正義或反義方向連接的上述(a) (i)中任一項所述的多核苷酸(DNA)； 以及(ζ)涉及RNA分子的轉錄終止及多腺苷酸化作用並在酵母內起作用的信號。
在本發明中，在下述酒精飲料(如啤酒)的釀造中，為使上述本發明的蛋白質進行 高表達，將上述(a) (i)中任一項所述的多核苷酸(DNA)以該啟動子的正義方向導入，以 促進這些多核苷酸(DNA)的表達。此外，在下述酒精飲料(如啤酒)釀造中，要抑制上述本 發明的蛋白質表達時，將上述(a) (i)中任一項所述的多核苷酸(DNA)以該啟動子的反 義方向導入，以抑制這些多核苷酸(DNA)的表達。
此外，要抑制上述本發明的蛋白質表達時，也可將上述(j) (m)中任一項所述的 多核苷酸導入其能夠表達的載體內。此外，在本發明中，通過破壞作為靶基因的上述基因 (DNA)，可以抑制上述DNA的表達或上述蛋白質的表達。基因的破壞可通過下述方式進行， 在與靶基因的基因產物表達相關的區域如編碼區或啟動子區的內部添加或缺失一個或多 個鹼基，或者使上述區域整體缺失。上述基因破壞的方法可參照公知文獻(例如參照Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76，4951 (1979)、Methods in Enzymology，101，202 (1983)、日本國特 開平6-253826號公報等)。
在本發明中，通過使啟動子突變或通過同源重組對啟動子進行重組，能夠控制靶 基因的表達量。這種突變的導入方法在Nucleic Acids Res. 29、4238_4250 (2001)中有 記載，此外，通過改變啟動子來控制基因表達的方法如在Appl Environ Microbiol. ,72, 5266-5273(2006)中有記錄。
導入酵母時使用的載體可以是多拷貝型(YEp型)、單拷貝型(YCp型)、染色體整 合型(YIp型)中的任意一種。例如作為YEp型載體，已知有YEp24(J. R.Broach et al.， Experimental Manipulation of Gene Expression,Academic Press,New York,83,1983),作為 YCp 型載體，已知有 YCp50 (Μ. D. Rose et al.，gene，60，237，1987)，作為 YIp 型載體， 已知有 YIp5 (K. Struhl et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76，1035，1979)，上述載體都容
易獲得。
只要在釀造用酵母中起作用的同時不受發酵液中的成分影響，用於調節酵母中基因表達的啟動子/終止子可以任意組合。例如可使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(TDH3)的 啟動子、3-磷酸甘油酸激酶基因(PGKl)的啟動子等。這些基因都已被克隆，如在M. F. Tuite et al. , EMBO J.，1，603 (1982)中有詳細記載，通過已知的方法能夠容易地獲得。
作為轉化時使用的選擇性標記，因釀造用酵母不能利用營養缺陷型標記，可利用 遺傳黴素抗性基因(G418r)、銅抗性基因(CUPl) (Marin et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81，337 1984)、淺藍菌素抗性基因(fas2m, PDR4)(豬腰淳嗣等，生物化學，64，660，1992 ； Hussain et al.，gene, 101，149，1991。日語原名；豬腰淳嗣 6，生化學，64，660，1992 ； Hussain et al.，gene, 101，149，1991)等。
將上述構建的載體導入宿主酵母內，宿主酵母的實例包括可在釀造中使用的任 何酵母，如啤酒、葡萄酒、清酒等釀造用酵母等。具體可以為如酵母屬(Saccharomyces) 等酵母，在本發明中，可使用啤酒酵母，如巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus) W34/70 等、Saccharomyces carlsbergensisNCYC453 或 NCYC456 等、Saccharomyces cerevisiae NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953 或 NBRC1954 等。並且還可使用威士忌酵母 如Saccharomycescerevisiae NCYC90等，葡萄酒酵母如日本釀造協會的葡萄酒用1號、 葡萄酒用3號、葡萄酒用4號等，清酒酵母如日本釀造協會的清酒用7號、清酒用9號等， 但並不限於這些酵母。在本發明中，優選使用啤酒酵母例如巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)。
酵母的轉化方法可利用一般使用的公知方法，如可以根據下述方法實施，電 穿孑L 法(Meth. Enzym.，194 182 (1990))、原生質球法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)) 」、醋酸鋰法(J. Bacteriology, 153 163 (1983))、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929(1978) > Methods in yeast genetics,2000 Edition :A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等所述的方法，但並不限於這些方法。
更具體地說，將宿主酵母在標準酵母營養培養基(如YEPD培養基「Genetic Engineering. Vol. 1, Plenum Press, New York，117 (1979) 」 等)中培養至 0D600nm 值為 1 6。將該培養酵母離心分離並收集，洗滌，用濃度約為IM 2M的鹼金屬離子，優選為 鋰離子進行預處理。上述細胞在約30°C下，靜置約60分鐘後，與欲導入的DNA(約1 μ g 20 μ g)同時在約30°C下，靜置約60分鐘。添加聚乙二醇，優選添加約4，000道爾頓的聚乙 二醇，使最終濃度約為20% 50%。約30°C下靜置約30分鐘後，將上述細胞在約42°C下 加熱處理約5分鐘。優選用標準酵母營養培養基將上述細胞懸浮液洗滌，然後加入到預定 量的新鮮標準酵母營養培養基中，在約30°C下靜置約60分鐘。然後，將其接種於含有作為 選擇性標記使用的抗生素等的標準瓊脂培養基上，獲得轉化體。此外，一般的克隆技術可參 照《Molecular Cloning 3》、「Methods in Yeast Genetics， A laboratory manual(Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor，NY)，，等。
4.本發明的酒精飲料製造方法以及根據該方法製造的酒精飲料
將上述本發明的載體或DNA片段導入適於釀造目標酒精飲料的酵母中，通過控制該基因的表達量，能夠得到凝集性適於目的酒精飲料的酵母，從而能夠高效率地製造酒精 飲料。也就是說，使用導入上述本發明的載體或DNA片段的酵母、上述本發明的多核苷酸 (DNA)的表達受到控制(促進或抑制)的酵母、或通過下述本發明的酵母的評價方法選擇的 酵母，進行製造酒精飲料的發酵，通過調節凝集性(增大或降低)，能夠製造所期望的酒精 飲料。目標酒精飲料包括但並不限於，例如啤酒，發泡酒(happoushu)等啤酒味飲料，葡萄 酒，威士忌，清酒等，除此之外，還可以為作為燃料用的實用酒精等。
製造上述酒精飲料時，除使用本發明得到的釀造酵母代替親株之外，還可利用公 知的方法。因此，原料、製造設備、製造管理等可與傳統方法完全相同，不會因製造酒精飲料 而增加成本。即，根據本發明，使用已有的設備就可高效率地製造酒精飲料而不增加成本。
5.本發明的酵母的評價方法
本發明涉及評價方法，該評價方法使用根據具有序列號1的鹼基序列且編碼賦予 酵母凝集性的蛋白質的基因的鹼基序列設計的引物或探針評價被檢酵母的凝集性。上述評 價方法的一般方法為公知方法，例如在W001/040514、日本國特開平H8-205900號公報等中 有記錄。下面，對該評價方法進行簡單說明。
首先，製備被檢酵母的基因組。製備方法可採用Hereford法或乙酸鉀法等任何 ——禾中公知方法(如 Methods in Yeast Genetics, Cold Spring HarborLaboratory Press, 130(1990))。以得到的基因組為對象，使用根據編碼賦予酵母凝集性的蛋白質的基因的鹼 基序列(優選ORF序列)設計的引物或探針，檢測被檢酵母的基因組中是否存在該基因或 該基因的特異序列。可採用公知的方法設計引物或探針。
基因或特異序列的檢測可採用公知的方法實施，例如，用含有特異序列的一部分 或全部的多核苷酸或者含有與其鹼基序列互補的鹼基序列的多核苷酸作為一個引物，用含 有該序列的上遊或下遊序列的一部分或全部的多核苷酸或者含有與所述鹼基序列互補的 鹼基序列的多核苷酸作為另一個引物，通過PCR法擴增酵母的核酸，測定擴增產物的有無、 擴增產物分子量大小等。引物使用的多核苷酸的鹼基對數通常為IObp以上，優選15bp 25bp。此外，夾在兩引物間的鹼基數通常以300bp 2000bp為宜。
PCR法的反應條件無特別限定，如可採用變性溫度90 °C 95 °C，退火溫度 40°C 60°C，延伸溫度60°C 75°C，循環數10次以上等條件。得到的反應生成物可通過 使用瓊脂糖凝膠等的電泳法等進行分離，測定擴增產物的分子量。通過該方法，根據擴增產 物的分子量是否包含特定DNA分子的大小，來預測、評價該酵母的凝集性。並且，通過分析 擴增產物的鹼基序列，可以更準確地預測、評價上述性質。
在本發明中，也可通過培養被檢酵母，測定具有序列號1的鹼基序列且編碼賦予 酵母凝集性的蛋白質的基因的表達量，評價被檢酵母的凝集性。此時，也可以培養被檢酵 母，通過對編碼賦予酵母凝集性的蛋白質的基因的產物mRNA或蛋白質進行定量來實施。 mRNA或蛋白質的定量可以採用公知的方法進行，如可採用Northern雜交法、定量RT-PCR 對mRNA進行定量，如可採用Western印跡法對蛋白質進行定量(Current Protocols in MolecularBiology, John Wiley & Sons 1994-2003)。
培養被檢酵母，測定具有序列號1的鹼基序列且編碼賦予酵母凝集性的蛋白質的 基因的表達量，通過選擇上述基因表達量與目標凝集性相應的酵母，能夠選擇出適合釀造 所期望的酒精飲料的酵母。此外，培養標準酵母及被檢酵母，測定上述基因在各酵母中的表達量，通過比較上述基因在標準酵母和被檢酵母中的表達量，可以選擇出期望的酵母。具體 來說，例如培養標準酵母及被檢酵母，測定具有序列號1的鹼基序列的基因在各酵母中的 表達量，通過選擇與標準酵母相比該基因為高表達(即促進表達)或低表達(即抑制表達) 的被檢酵母，能夠選擇出適合釀造目的酒精飲料的酵母。
或者，培養被檢酵母，通過選擇凝集性高或低的酵母，能夠選擇出適合於釀造所期 望的酒精飲料的被檢酵母。
所述情況下，作為被檢酵母或標準酵母，可以使用如導入上述本發明的載體或DNA 片段的酵母、上述本發明的多核苷酸(DNA)的表達受到控制的酵母、實施突變處理的酵母、 或發生自然突變的酵母等。酵母的凝集性可以根據如日本國特開平H8-205890號公報所述 方法進行測定。突變處理，例如可以使用紫外線照射、放射線照射等的物理方法，EMS(甲基 磺酸乙酯)、N-甲基-N-亞硝基胍等試劑處理的化學方法等任何方法(如參照大Illl泰治編 著、生物化學實驗法39酵母分子遺傳學實驗法、p67-75、學會出版中心等。日語原名；大山鳥 泰治編著、生物化學実験法39酵母分子遺伝學実験法、P67-75、學會出版力 > 夕一)。
能夠作為標準酵母、被檢酵母使用的酵母，可以為可在釀造中使用的任意 酵母，如啤酒、葡萄酒、清酒等釀造用酵母等。具體可以為酵母屬(Saccharomyces) 等酵母(例如Saccharomyce s pastorianus> Saccharomyces cerevisiae 及 Saccharomyces carlsbergensis)。本發明中可使用的啤酒酵母可為，如Saccharomyces pastorianus W34/70 等、Saccharomyces carlsbergensis NCYC453、 NCYC456 等、 Saccharomycescerevisiae NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953 或 NBRC1954 等。並且也可以使 用葡萄酒酵母如日本釀造協會的葡萄酒用1號、葡萄酒用3號、葡萄酒用4號等，清酒酵母 如日本釀造協會的清酒用7號、清酒用9號等，但並不限於這些酵母。在本發明中，優選使 用啤酒酵母如巴斯德酵母(Saccharomycespastorianus)。標準酵母、被檢酵母也可以從上 述酵母中以任意組合選擇。
實施例
以下結合實施例對本發明進行詳細描述，但本發明不限於以下實施例。
實施例1 編碼與酵母的凝集性相關的蛋白質的基因(nonScMHPl)的克隆
使用日本國特開2004-283169中所述的比較資料庫進行檢索，結果發現編碼與釀 造酵母凝集性相關的蛋白質的基因nonScMHPl (序列號1)。根據獲得的鹼基序列信息，分別 設計用於擴增全長基因的引物nonScMHP 1_F (序列號3) /nonScMHP 1_R (序列號4)，通過以基 因組解讀株 Saccharomycespastorianus W34/70 株(簡稱 「W34/70 株」)的染色體 DNA 為 模板的PCR，取得包括nonScMHPl的全長基因的DNA片段。
將上述方法得到的nonScMHPl基因片段，通過TA克隆插入pCR2. 1-T0P0載體 (Invitrogen 公司製造)。用 Sanger 法(F. Sanger, Science, 214 :1215，1981)分析並確定 nonScMHPl基因的鹼基序列。
實施例2 啤酒釀造試驗中的nonScMHPl基因表達的分析
使用啤酒酵母Saccharomyces pastorianus W34/70株進行啤酒釀造試驗。
麥芽汁浸出物濃度 12.69%
麥芽汁體積70L
麥芽汁中溶解氧濃度 8. 6ppm[0131]發酵溫度15°C
酵母添加量12.8/106細胞/11^
對發酵液進行經時採樣，觀察酵母增殖量(圖1)、浸出物表觀濃度(圖2)的經時 變化。與此同時對酵母菌體進行採樣，製備的mRNA用生物素進行標記，使其與啤酒酵母DNA 微陣列雜交。用 GeneChip Operating System(GC0S ；GeneChip Operating Software 1.0， Affymetrix公司製造)進行信號檢出，nonScMHPl基因的表達模式如圖3所示。根據該結 果確認在通常的啤酒發酵中nonScMHPl基因進行表達。
實施例3 nonScMHPl基因的破壞
按照文獻(Goldstein et al.，yeast. 15,1541(1999))的方法，通過以含有抗藥性 標記的質粒(pAG25(natl))為模板的PCR，製作用於破壞基因的片段。作為PCR用的引物， 使用 nonScMHPl_delta_for (序列號 5)、nonScMHPl_delta_rv (序列號 6)。
使用上述方法製作的用於破壞基因的片段，對從啤酒酵母Saccharomyces pastorianus W34/70株分離的孢子克隆株(W34/70-2)進行轉化。根據日本國特開平 07-303475號公報所述的方法進行轉化，使用含有50mg/L諾爾絲菌素(Nourseothricin)的 YPD平板培養基(1%酵母浸出物，2%多聚蛋白腖，2%葡萄糖，2%瓊脂)選擇轉化體。
實施例4 nonScMHPl破壞株的凝集性評價
根據下述方法對實施例3得到的破壞株及親株(W34/70-2株)的凝集性進行評 價。
將酵母接種於50mL的葡萄糖CM培養基(3%葡萄糖，1 %細菌蛋白腖、0. 5%酵母 浸出物，0. 5%KH2P04，0. 2%MgS04*7H20)中，30°C靜置培養2天。將此全部培養物轉移到 450mL的葡萄糖CM培養基中，15°C靜置培養4天。通過離心，隨後用5°C的冷水洗滌2次， 收集酵母菌體。將得到的溼菌體精確稱量1. 5g，使其懸浮於20mL的含2mM Ca的0. IM乙酸 緩衝液中，在15°C恆溫室內使溫度平衡。
以下測定是在15°C恆溫室內進行。使用渦流攪拌機將酵母懸浮液攪拌30秒，然後 注入量筒內，直接抽取2mL作為Omin的樣品。保持原樣靜置，10分鐘後抽取2mL作為IOmin 的樣品。
分別測定抽取的酵母懸浮液的0D600，用下述計算式求出酵母的凝集性沉降指數 (Si)。結果如圖4所示。數值表示η = 2時的測量平均值。
SI = (OD10fflin-OD0fflin)/OD0fflin^lOO
如圖4所示，親株的SI = 244，而破壞株的SI = 139，由此表明nonScMHPl的破壞 使酵母的凝集性降低。
實施例5 nonScMHPl高表達株的構建
將實施例1所述的nonScMHPl/pCR2. 1_T0P0用限制酶SacI及NotI酶解，製備包括 蛋白質編碼區全長的DNA片段。將該片段連接於經限制酶SacI及NotI處理的pYCGPYNot 上,從而構建出nonScMHPl高表達載體nonScMHPl/pYCGPYNot。pYCGPYNot為YCp型酵母表 達載體，導入的基因通過丙酮酸激酶基因PYKl的啟動子進行高表達。酵母的選擇性標記包 括遺傳黴素抗性基因G418/大腸菌的選擇性標記包括氨苄青黴素抗性基因Amp^
使用上述方法製作的高表達載體，根據日本國特開平07-303475所述的方法，對 Saccharomyces pastorianus Weihenstepan34/70 株進行轉化。使用含有 300mg/L 遺傳黴素的YPD平板培養基(1%酵母浸出物，2%多聚蛋白腖，2%葡萄糖，2%瓊脂)選擇轉化體。
上述方法得到的高表達株及親株(W34/70株)的凝集性採用與實施例4同樣的方 法進行評價。
根據本發明的酒精飲料的製造方法，能夠控制發酵中酵母的凝集性，所以通過使 用凝集性適合於製造目的酒精飲料的酵母，能夠高效率地製造酒精飲料。
序列表
三得利株式會社(Suntory Limited)
編碼與酵母的凝集性相關的蛋白質的基因及其用途(Gene encoding a protein responsible forflocculation properties of yeast and use thereof)
0152]G06-0091CN0153]JP2006-491350154]2006-02-240155]60156]PatentIn version 3. 30157]10158]40740159]DNA0160]〈213> 酵母屬(Saccharomyces sp.)0161]10162]atggattccaaggacacgcaaaagttgcttaaggagcaccgaattccctc catcgatgtc600163]ggctggctggtcaggcccaacgcctccgccctcaggcacgagaggtccaa gtcgacggct1200164]gagagcgtggcccccgacgtccagatggacactgctcactcgtccgtctt cgacaagtct1800165]gtagacacgtcttgcggcattctctccccaaatgatagggtgcgccgcca ctccgtggcg2400166]gcggccgctctgatgaataaccagcacatcactgttgcccctaccgcgcc ctccacgaac3000167]ttcccctccggtagaggacggtccaaatccgtggtagagatcacgatgcc aggctccggc3600168]gttgacgccgatgctgacgctggacttcgccatcaccatcaccatcatca ccatcatgcg4200169]gaagacgcagcttcgtcacctgcccccaagaagatcggtttcttcaagag tttatttggc4800170]aaaaggaagggagaacaagagcagcagaagcgcgaaaaagacaaggagga acaagaacaa5400171]aaccgctcgccctccccgggccacgtgaaccgcaactccataagaagaga acgaaccgcg6000172]accatttctgctgagtcacctccgcccttgcagtacgtggccccgccgtc gtacaacgac6600173]accgtggtgccgctgacgaggtccaagactgaatccgaggtgtactacga gaaccatccg7200174]cagaacaacactcacggtcacatccacacgcaacacactttcgatgaagg tcaaactgat7800175]tgcagctcccccatagatggcgccgcctgcagcggcactcgtcctgaccc gagattgatg8400176]gatttcttgcggtactacaaatctaaggactacaaattagccgcctttaa agaggggaac9000177]ttcctgcaatccacgccctcgtcgccgatcaagagaaacacacgggcctc gttttccctt9600178]cagaatgacagacaattgccccccaagttagccgcccgccagaaattcga cgttaagggc10200179]agacctatcccgccgcatccggacaaaccgaggttggcgcccgccttcaa gaagaagaag10800180]caaccagtcgctatggcatcgttggaggccgtggactctaactcagacgt ctcgtcctcc11400181]gcgcagaacaacaacgcggcgccgtcttctcacaagttcggcgcatttct cagaaaggtt1200[0182acctcttacgggaacaacgcctcatcctcctccgccaataccaacaacctgctcaatgcc1260[0183tcgtccacgtccgtatggtctgccaactcgctcgagttcgatcctgcaaagataaccgtc1320[0184gtgcccgggcttgagtacgtcaagcccttgaaacacgtctcctttgctacgaacacctac1380[0185ttcaacgaccctccacagcagatctgtagt3.3.3.3.3.C C C C agaagaggcgaagtggaggtg1440[0186gagcccaacgggtccgtcgttatacacagactgacaccgcaagagaggaagaaaattatg1500[0187gagtcgacaagcctgggcgtCgtCgttgggggcactggccaattgaaactgctaaatcca1560[0188gaagaggacgacatcaacgccaagagcaaagaggagatggctccgcaaaggcaaaacgca1620[0189gccgaagcgcccgatgaggaagatggcaacccgcagagaagaaacatcgttatggctgcc1680[0190gcagaagccgccgcagaagccagagccaaagaggcccccaacgagttgaagcgtattgtc1740[0191acgaacaatgaggaggaagtcatcgttagtaagaccgcgtgtcatttaaccattgataag1800[0192ccgatgatctcaagaaggggtgcttccacaacctctctggcctccatggtgtcgagtgat1860[0193actaatggtacgaacgcagatgacgagaaggagaccatgcccccacccaaccaaaagatc1920[0194ccccacgatatcgtgtatacccgctgctgtcatttaagagaaattttgccaataccggcc1980[0195actttgaaacagttgaaaaagggatccaccgaccccatccccatcttacaattgcgtaac2040[0196ccaagaccctccatggtggaaatttggtcatttagcgacttcttgagtgtggcccccgtt2100[0197ttgtgtctttcgttggacggtgtgcaattaacggtgcaaatgctcagaagcattttgagt2160[0198tctttgattt3.C3.3.CCC3.C3.tttccaaaaactgtccttgagaaacactttcctggatgaa2220[0199gaaggctggaaaatgttatgctattttgtctccaaggccaggtctttgcattccatcgat2280[0200ttgaccatggtcccctccatcaagacaaatgtacagaagccctccaaatcctctttgaag2340[0201tcaaccatcctcagaatgcagtgcaatacagacgacaggtccgacatgaattgggatctc2400[0202ttgactgcttccatcgcccttagaggcggtttggacgaaattgtcatttcgggggcaaaa2460[0203atgaatggagcacaattcaaaaattttatccttgtcgcttgtatcgctaccgaaagactg2520[0204ggcctggcttataatggcttgtccaagagtcaatgtgacgatctggccagttgggtggtg2580[0205caatccgaagtgacaggtttggatatcggattcaatgatctgaatgggaaactatcgtcc2640[0206ttcactaatgctgtcctgggcaaaattcaaaaggtcaacgagaaaaacgtcttcaagttt2700[0207ctatctttaaatggaacaaatttagaagtaaaggaacacgatacttatgaaaacaacgag2760[0208gttttgaaattgatcagtgtcctgtgctattcagaaaacctgaagttcttagatatctcg2820[0209aacaaccctgcaatctttccgtattgtgtcccgacactaattgattttctgcccgttttc2880[0210gtcaacttggtccgtttacaaatcgactac3.3. 3.3. 3.3.gctccaccagtgtggttatg2940[0211ttggctgaagtattgcccatgtgttcgagactgagttacttctccatgttggggacagaa3000[0212ttggatctggcatcctctaaagccctagcggaagccgtgagaaagagctcatcgttgatg3060[0213accttggacgtggattacgcttacatgccagagaatatcaaggaaaaaatttcactatat3120[0214gccatgagaaacattcaaggtgaattgaaaagagttcaaaacgacgacaaagatatcaaa3180[0215gacactcaattttcaagtttacaagaccaactatcgcttttattaactgaaaaggcagac3240[0216gattccgaacaatggtcgaaaacttcatggccaaaatcgcattggcccgt3300[0217atcaagatcagtaaagtggttcacgaccttttcggtttaaaacttaatgg C 3-3- 3-3-3- 3360[0218ttggaaggcaaagaagctttgattagattgtgtttcatcgaggcaagtttggaaagaggt3420[0219tccgacttattaagacaaagacatcataatgctttgaaaccacgaagctcattctcggca3480[0220aaccaaacagacgcaaattcagaaagttgtcaaagaatgttattgagttcatctatccta3540[0221]caaaattcag accacattgc cctgatgcca tttggcagtg cactagtcga aaaatctagc 3600
gcggacgcag aagacgctgt agagtttaga gaaggcgatg attcaaatac caaccatgaa 3660
gagggcccag ctaatgatct acaagcccaa gatcaagtcg atattaagaa taaatactct 3720
atcatcaaaa aagaactaga acacgaaaag cttgttggcg gtggggattt accagtggac 3780
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catttgcatc atattttcaa aaagcaggga aaccaatctg ataaacaaga agacgctacc 3960
cttcaagcga aggatgcgcc agaccagtcc caagcagaca attcaagtga taacatatct 4020
cttacgaccg accaaacatc gacagggttc tgccagtgcc aagacgaaca atga4074
2
1357
PRT
酵母屬(Saccharomyces sp.)
2
Met Asp Ser Lys Asp Thr Gln Lys Leu Leu Lys Glu His Arg lie Pro
151015
Ser lie Asp Val Gly Trp Leu Val Arg Pro Asn Ala Ser Ala Leu Arg
202530
His Glu Arg Ser Lys Ser Thr Ala Glu Ser Val Ala Pro Asp Val Gln
354045
Met Asp Thr Ala His Ser Ser Val Phe Asp Lys Ser Val Asp Thr Ser
505560
Cys Gly lie Leu Ser Pro Asn Asp Arg Val Arg Arg His Ser Val Ala
65707580
Ala Ala Ala Leu Met Asn Asn Gln His lie Thr Val Ala Pro Thr Ala
859095
Pro Ser Thr Asn Phe Pro Ser Gly Arg Gly Arg Ser Lys Ser Val Val
100105110
Glu lie Thr Met Pro Gly Ser Gly Val Asp Ala Asp Ala Asp Ala Gly
115120125
Leu Arg His His His His His His His His His Ala Glu Asp Ala Ala
130135140
Ser Ser Pro Ala Pro Lys Lys lie Gly Phe Phe Lys Ser Leu Phe Gly
145150155160
Lys Arg Lys Gly Glu Gln Glu Gln Gln Lys Arg Glu Lys Asp Lys Glu
165170175
Glu Gln Glu Gln Asn Arg Ser Pro Ser Pro Gly His Val Asn Arg Asn
180185190
Ser lie Arg Arg Glu Arg Thr Ala Thr lie Ser Ala Glu Ser Pro Pro
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Ile 835 Gln
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Lys Ser 850
Gly Leu
Thr
Val Phe Lys
His Asp Thr 915 Ser
Cys Asp Asn Ala
Phe 900
Tyr
Thr
Asp
Ile
Val 885 Leu
Glu Arg Asp
Gly 870 Leu
Leu 855 Phe
Leu 840 Ala
Asn Gly Lys Ser Leu Asn
825
Gly Leu Ser Trp Leu
Ala Val
Cys Tyr 930 lie Phe Pro 945 Val
Asn Ser Val Val Tyr Phe
Glu
Tyr Cys Leu Val
Glu Asn Asn Asn Leu
Leu Val Leu Asn Asp His Ala Lys
Ala 1010 Asp 1025 Tyr 1040 Asp 1055 Gln 1070 Tyr 1085 Arg 1100 Leu 1115
Ser 995 Glu
Tyr
Ala
Asp
Leu
Lys
lie
Asn
Met 980 Met
Arg 965 Leu
Val 950 Leu
Ala Leu Gly Arg
Lys 935 Pro
Gln
Glu
Thr
Glu 920 Phe
Asp
lie
Gly 905 Val
Gln 890 Thr
Asn 875
Lys Val
Tyr Asn 845 Val Gln 860 Gly
830
Gly Leu Ser Ser Glu Val
Thr lie Asp Val
Leu Leu Asp Leu lie
Asn Lys Leu lie
Lys Leu Ser Asn Glu Leu Glu
Asp 955 Asn
Ser 940 Phe
lie 925 Asn
Val 910
Ser
Lys 895 Lys
Ser 880 Asn
Glu Val Leu Asn Pro Ala
Ala Val Ala Tyr Met Arg Lys Asp Ser Leu Lys Met Lys lie Gly Gln
Met Asn lie Leu Val Ser Leu
Lys 1015 Pro 1030 lie 1045 Lys 1060 Leu 1075 Glu 1090 Lys 1105 Asn 1120
Glu 1000
Ser
Leu 985 Leu
Tyr 970
Pro Met
Asn Cys Leu Ala
Leu Leu Ser Ser
Pro Val Phe 960 Thr
Asp Ser Ser Leu
Arg 990
Ser
Glu Gln Asp Thr Asn Val Leu
Asn Gly Thr Glu Phe Val Glu
lie Glu Gln Lys Met His Gly
Lys Leu Phe Ala Ala Asp Lys
Lys Arg
Ser 1005 Met Thr 1020 Glu 1035 Lys 1050
Ser Ser 1065 Asp 1080 Lys 1095 Leu 1110 Glu 1125
Asp lie Phe Ala
Ser 975
Leu Ser Lys Ala Leu Asp lie Ser Val Gln Leu Gln Ser Glu Ala Leu Gly Leu Leu lie[0377ArgLeuCysPhelieGluAlaSerLeuGluArgGlySerAspLeu[0378113011351140[0379LeuArgGlnArgHisHisAsnAlaLeuLysProArgSerSerPhe[0380114511501155[0381SerAlaAsnGlnThrAspAlaAsnSerGluSerCysGlnArgMet[0382116011651170[0383LeuLeuSerSerSerlieLeuGlnAsnSerAspHislieAlaLeu[0384117511801185[0385MetProPheGlySerAlaLeuValGluLysSerSerAlaAspAla[0386119011951200[0387GluAspAlaValGluPheArgGluGlyAspAspSerAsnThrAsn[0388120512101215[0389HisGluGluGlyProAlaAsnAspLeuGlnAlaGlnAspGlnVal[0390122012251230[0391AsplieLysAsnLysTyrSerlielieLysLysGluLeuGluHis[0392123512401245[0393GluLysLeuValGlyGlyGlyAspLeuProValAspLysAsplie[0394125012551260[0395LeuAsnArgAlaAlaGlnSerLeuAspSerAspGlnlieLysGlu[0396126512701275[0397PheLeuLeuLysAsnAspValSerThrlieLeuGlyVallieAsp[0398128012851290[0399GluLeuHisSerGlnGlyTyrHisLeuHisHisliePheLysLys[0400129513001305[0401GlnGlyAsnGlnSerAspLysGlnGluAspAlaThrLeuGlnAla[0402131013151320[0403LysAspAlaProAspGlnSerGlnAlaAspAsnSerSerAspAsn[0404132513301335[0405lieSerLeuThrThrAspGlnThrSerThrGlyPheCysGlnCys[0406134013451350[0407GlnAspGluGln[04081355[04093[041040[0411DNA[0412 人工序列(Artificial)[0413[0414 引物(Primer)[04153
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22
權利要求
1.多核苷酸，其編碼由序列號2的胺基酸序列組成的蛋白質。
2.如權利要求
1所述的多核苷酸，其由序列號1的鹼基序列組成。
3.如權利要求
1所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸為DNA。
4.蛋白質，其為被權利要求
1-3中任一項所述的多核苷酸編碼的蛋白質。
5.載體，其含有權利要求
1-3中任一項所述的多核苷酸。
6.酵母，其為導入權利要求
5所述的載體的酵母。
7.如權利要求
6所述的酵母，其凝集性得到增大。
8.如權利要求
7所述的酵母，其中，凝集性的增大是通過增加權利要求
4所述的蛋白質 的表達量而獲得。
9.酵母，其為通過破壞權利要求
3所述的多核苷酸的基因而使權利要求
3所述的多核苷酸的表達受到抑制的酵母。
10.如權利要求
9所述的酵母，其凝集性得到降低。
11.酒精飲料的製造方法，其使用權利要求
6 10中任一項所述的酵母。
12.如權利要求
11所述的酒精飲料的製造方法，其中，釀造的酒精飲料是麥芽飲料。
13.如權利要求
11所述的酒精飲料的製造方法，其中，釀造的酒精飲料是葡萄酒。
14.評價被檢酵母的凝集性的方法，其包括使用根據由序列號1組成的基因的鹼基序 列而設計的引物，其中所述引物使用的多核苷酸的鹼基對數為10-25鹼基對。
15.評價被檢酵母的凝集性的方法，其包括培養被檢酵母；測定由序列號1組成且編 碼具有賦予酵母凝集性活性的蛋白質的基因的表達量。
16.酵母的選擇方法，其包括培養被檢酵母；定量權利要求
4所述的蛋白質或測定由 序列號1組成且編碼具有賦予酵母凝集性活性的蛋白質的基因的表達量；選擇所述蛋白質 的量或所述基因表達量與目標凝集性相應的被檢酵母。
17.如權利要求
16所述的酵母的選擇方法，其包括培養標準酵母和被檢酵母；測定由 序列號1組成且編碼具有賦予酵母凝集性活性的蛋白質的基因在各酵母中的表達量；選擇 其中該基因的表達高於或低於標準酵母的被檢酵母。
18.如權利要求
16所述的酵母的選擇方法，其包括培養標準酵母和被檢酵母；對各酵 母中的權利要求
4所述的蛋白質進行定量；選擇其中該蛋白質的量多於或少於標準酵母的 被檢酵母。
19.酒精飲料的製造方法，其特徵在於，使用權利要求
6 10中任一項所述的酵母或根 據權利要求
16 18中任一項所述的方法選擇的酵母，進行製造酒精飲料的發酵，並調節酵 母的凝集性。
專利摘要
本發明涉及編碼與酵母的凝集性相關的蛋白質的基因及其用途，特別涉及其凝集性適合於釀造目的酒精飲料的釀造酵母、使用該酵母製造的酒精飲料、其製造方法等。更加具體地說，本發明涉及一種酵母，通過控制編碼與釀造酵母的凝集性相關的蛋白質的基因MHP1，特別是啤酒酵母的特徵基因non-ScMHP1的表達量，而賦予該酵母適合於釀造目的酒精飲料的凝集性，還涉及使用該酵母製造的酒精飲料及其製造方法等。
文檔編號C12G1/00GKCN101041822 B發布類型授權 專利申請號CN 200710007767
公開日2011年4月6日 申請日期2007年1月26日
發明者下永朋子, 中尾嘉宏, 兒玉由紀子 申請人:三得利控股株式會社導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2), 非專利引用 (1),