寡核苷酸及其類似物的純化方法
2023-07-09 08:29:01 1
專利名稱：寡核苷酸及其類似物的純化方法
背景技術：
作為重要生物分子的合成寡核苷酸具有廣泛的應用。這些應用包括使用合成寡核苷酸作為DNA測序、擴增反應(如，多聚酶鏈式反應，反轉錄酶反應)的雜交探針、接頭、引物，潛在的反義治療應用和用於診斷與遺傳和病毒疾病相關的研究技術和診斷工具。此外，合成寡核苷酸類似物已經被FDA正式批准用於治療CMV，目前幾個寡核苷酸類似物正在進行臨床試驗。
在過去幾年中，在大規模(例如，以千克量)合成寡核苷酸及其類似物方面已經有了重大的進展。許多進展是歸結於在一次合成中能生產微摩爾到摩爾量的產物的自動化固相DNA合成儀的發展。通常，合成寡核苷酸的合成最經常是通過一系列的合成反應來進行的，導致特定寡核苷酸(在它們的5′羥基末端用一種保護基團保護(如，二甲氧基三苯甲基(DMT))逐步添加到連接到固相載體上的初生寡核苷酸鏈上。
然而，儘管生產合成寡核苷酸的技術取得了進展，但是隨著單體每一次逐步添加到初生寡核苷酸鏈上，大約有1-2％的偶聯反應失敗(即，沒有發生單體加成)。因此，合成產物通常是不同長度的寡核苷酸的非均勻混合物，其中不希望得到的汙染物(如，失敗序列)的數量與希望得到的產物的長度及合成的總產量成比例。結果引起了對於發展用於純化寡核苷酸的生產工藝的興趣。
已經發展了一些用於從失敗序列中分離或純化全長靶寡核苷酸的技術，包括薄層色譜法(TLC)、凝膠電泳(如，聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE))和液相色譜技術(如，高效液相色譜法(HPLC))。兩種主要的色譜技術—陰離子交換色譜法和反相色譜法已被用於大規模分離合成寡核苷酸。然而，這些常規的色譜分離方法不但費時費力，而且費錢。
在使用反相色譜法分離合成寡核苷酸的方法中，一種疏水的5′-保護基團，如5′-O-三苯甲基被用於在偶聯和氧化步驟中保護寡核苷酸的5′-羥基。然後，疏水的5′-保護基團能被用於從更短的失敗序列中分離「其上有三苯甲基」的全長靶寡核苷酸，其中的失敗序列沒有疏水的5′-保護基團(即，「其上無三苯甲基」序列)。分離後，能用酸從靶寡核苷酸中除去三苯甲基。儘管這是一種有效的方法，但是費時費力並且需要後續的水解和抽提步驟來分離純化的產物。
在使用陰離子交換色譜法分離合成的寡核苷酸的方法中，一種含有固定的正電荷的陰離子交換成分被用於結合靶寡核苷酸及失敗序列(兩者都是聚陰離子)。靶寡核苷酸及失敗序列與該陰離子交換成分的結合強度與它們的長度成正比。因此，要洗脫結合的靶寡核苷酸和失敗序列，通常用鹽梯度來削弱寡核苷酸與陰離子交換成分之間的相互作用。因為結合強度與寡核苷酸的長度成比例，所以最短的寡核苷酸首先被洗脫，而更長的寡核苷酸在更高的鹽濃度下被洗脫。在通過陰離子交換分離寡核苷酸中使用鹽梯度有許多不利的原因。首先，希望得到的洗脫的寡核苷酸在用於下遊應用中之前通常不得不除去鹽分。因此，這需要後續的脫鹽步驟，後續脫鹽步驟將增加分離所需的時間、精力和開支。其次，在洗脫液中使用高濃度的鹽也能導致用於陰離子交換分離的儀器內不鏽鋼零件(如，HPLC泵、接頭、閥、柱子、管)腐蝕的增加。
因而，需要有一種能克服或改善與當前方法有關的缺陷和問題的用於分離寡核苷酸的改進方法。
發明簡述本發明涉及從雜質中分離寡核苷酸的方法。在本發明的方法中，在包含靶寡核苷酸與雜質的混合物中，使用一種可滴定的陰離子交換成分從雜質中分離靶寡核苷酸。靶寡核苷酸結合到可滴定的陰離子交換成分上，並且隨著時間的推移，讓pH有所增加的洗脫液流過其上結合有靶寡核苷酸的可滴定的陰離子交換成分。優選地，洗脫液實質上不增加鹽濃度。然後將靶寡核苷酸洗脫，並因此從雜質中分離，其中雜質的洗脫在與靶寡核苷酸不同的pH下進行。任選地，在靶寡核苷酸洗脫之前進行一或多次洗滌步驟。
本發明的方法能使用不同的可滴定的陰離子交換成分，包括包含伯胺、仲胺和叔胺的可滴定的陰離子交換成分。適合的可滴定的陰離子交換成分包括包含聚咪唑、聚組氨酸、聚賴氨酸或聚亞乙基亞胺的陰離子交換成分。在一個實施方案中，可滴定的陰離子交換成分被連接到載體上，例如，一種合成聚合物載體，如矽膠、多糖、聚苯乙烯等等，尤其是一種苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯或瓊脂糖，例如那些可獲得的商標名為Sepharose的瓊脂糖。優選地，可滴定的陰離子交換成分共價連接到載體上，任選地通過一種連接基團。載體可以是一種功能化的載體。在本領域中這種功能化的載體的例子是公知的，並且包括例如羥基或氨基功能化的載體，尤其是羥基或氨基功能化的聚苯乙烯。
本發明的方法也能被用於分離不同的寡核苷酸，包括例如單鏈和/或雙鏈核酸。這樣的寡核苷酸包括天然來源的寡核苷酸，如脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。可選地，本發明的方法也能被用於分離合成的寡核苷酸，例如磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、氨基磷酸酯和嵌合體。
在一個實施方案中，要被分離的靶寡核苷酸是5′-O-保護的(例如，具有一種5′-O-三苯甲基，如一種5′-O-二甲氧基三苯甲基保護基團)。任選地，當靶寡核苷酸結合到可滴定的陰離子交換劑上時，在靶寡核苷酸洗脫前此5′-O-保護基團被除去。在靶寡核苷酸洗脫之前，通過用足夠量的一種酸性溶液(如，一種包含醋酸水溶液的溶液(如，20％-80％v/v醋酸))流過在其上結合有靶寡核苷酸的可滴定的陰離子交換成分以除去此5′-O-三苯甲基保護基團。
多種的洗脫液也能被用於洗脫靶寡核苷酸，條件是能它們增加pH。從一種雜質中分離一種靶寡核苷酸無需隨著時間的過去實質上增加其鹽濃度而就能完成。適合的洗脫液是那些開始的pH值適合靶寡核苷酸結合到可滴定的陰離子交換成分上，並且隨著時間的過去，pH增加使得可滴定的陰離子交換成分不能結合靶寡核苷酸的洗脫液。在一個實施方案中，該洗脫液實質上不含有金屬鹽。
本發明的方法能被用於從多種雜質中分離靶寡核苷酸。這樣的雜質包括任何具有與靶寡核苷酸不同分子結構的化合物。在一個實施方案中，要與靶寡核苷酸分離的雜質是與靶寡核苷酸相比具有更短長度的一或更多種寡核苷酸(如，一種或更多種失敗序列)。在該實施方案中，雜質(即，與靶寡核苷酸相比具有更短長度的一種或更多種寡核苷酸)在比靶寡核苷酸更低的pH下洗脫。在另一個實施方案中，要與靶寡核苷酸分離的雜質包含一種或更多種鹽，尤其是金屬鹽。
本發明的方法也能被用於增加靶寡核苷酸的濃度。在一個實施方案中，靶寡核苷酸是通過用比最初包含該靶寡核苷酸的體積還少體積的溶液洗脫該靶寡核苷酸而被濃縮的。
本發明的方法的有利之處在於他們避免了分離或純化寡核苷酸通常所需的耗費更多精力和時間的常規步驟。為了減少了在分離寡核苷酸中所需步驟的數目，本發明提供了一種用於大規模地純化寡核苷酸的快速、簡單、更有效和花費更低的方法，發明詳述本發明的優選的實施方案描述如下。
本發明涉及從雜質中分離或純化寡核苷酸的方法。在本文中，術語「分離」和「純化」可被互換地使用，並涉及一個以物理方式將具有特定分子結構的寡核苷酸從具有不同分子結構的雜質中分離的過程。這種分離可以是部分的或全部的。
在本文中定義的「寡核苷酸」包括通過任選地修飾的磷酸二酯鍵共價連接的核苷酸的一種寡聚物或聚合物。核苷酸具有一種共有的結構，包含一個任選地修飾的磷酸酯基團，其連接著一個戊糖，該戊糖依次連接著一個有機鹼基。如果該戊糖是核糖，則該核酸就是RNA並且該核苷酸就是核糖核苷酸。如果該戊糖是2′-脫氧核糖，則該核酸就是DNA並且該核苷酸就是脫氧核糖核苷酸。在具有大於大約2的pH值的水溶液中，核酸的十分親水的糖-磷酸酯聚合物骨架為每一個磷酸二酯提供了一個負電荷還為每一個末端的磷酸單酯提供了一或兩個負電荷。因而，寡核苷酸是聚陰離子，它們擁有的淨負電荷近似地與它們的長度成比例。不同種類的鹼基可以結合到戊糖上，但是五種鹼基在天然來源的DNA和RNA中佔支配地位，它們是腺嘌呤(「A」)、胸腺嘧啶(「T」，主要在DNA中)、尿嘧啶(「U」，主要在RNA中)、鳥嘌呤(「G」)和胞嘧啶(「C」)。
在本文中，術語「寡核苷酸」和「多核苷酸」是可以互換的並且是指一種具有從幾個，如2-20，到許多，如20到幾百或更多個，例如最高達250個核苷酸的核苷酸多聚體或寡聚體。寡核苷酸包括雙鏈和單鏈核酸，如單鏈或雙鏈DNA、RNA或DNA-RNA雜合體。寡核苷酸還包括天然來源的寡核苷酸和合成的寡核苷酸。
在本文中，天然來源的寡核苷酸是指在有機體中發現的核酸，例如，核酸包括但不限於基因組DNA、互補DNA(cDNA)、染色體DNA、質粒DNA、mRNA、tRNA和rRNA。這些天然來源的核酸也能包括修飾的核酸，例如，含有一個或更多個核苷酸的添加、刪除或修飾的天然來源的核酸(如，多態或等位變體)。天然來源的寡核苷酸包括分離自有機體的核酸，例如，使用本文中所描述的方法和/或其它已知的方法分離的核酸。
合成的寡核苷酸是通過人工方法製備的而不是分離自有機體的寡核苷酸。例如，合成的寡核苷酸包括但不限於，使用公知和/或商業上可獲得的方法(如，使用自動化核酸合成儀或其它化學合成方法)在固相上製備的寡核苷酸。合成的寡核苷酸進一步包括包含一個或更多個修飾的核苷酸的寡核苷酸。在本文中，修飾的核苷酸是一種結構已經被改變以致於與天然來源的核苷酸不同的核苷酸。這種修飾的核苷酸包括含有一個修飾的糖部分、一個修飾的磷酸酯部分和/或一個修飾的核鹼基部分的核苷酸。
糖部分的修飾包括但不限於用己糖、環戊基或環己基環取代核糖環。可選地，天然來源的核酸的D-核糖環能被L-核糖環取代或天然來源的核酸的β-端基異構體能被α-端基異構體取代。
修飾的磷酸酯部分包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯和類似物，或它們的組合。當與相應的僅包含磷酸二酯連接鍵的寡核苷酸比較時，包含這種修飾的磷酸酯連接鍵的寡核苷酸能具有改善的性質。例如，包含修飾的連接鍵的寡核苷酸對可能存在於有機體中的核酸酶的降解能具有增加的抗性(如，當用於反義的應用中時)。
修飾的核鹼基包括7-脫氮鳥嘌呤、7-脫氮-8-氮雜鳥嘌呤、5-丙炔基胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、7-脫氮腺嘌呤、7-脫氮-8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮-6-氧代嘌呤、6-氧代嘌呤、3-脫氮腺苷、2-氧代-5-甲基嘧啶、2-氧代-4-甲硫基5-甲基嘧啶、2-硫代羰基-4-氧代-5-甲基嘧啶、4-氧代-5-甲基嘧啶、2-氨基-嘌呤、5-氟代尿嘧啶、2，6-二氨基嘌呤、8-氨基嘌呤、4-三唑並-5-甲基胸腺嘧啶和4-三唑並-5-甲基尿嘧啶。修飾的核鹼基也包括無鹼基(abasic)部分。
產生包含一種或更多種修飾的糖部分、磷酸酯部分和/或核鹼基部分的寡核苷酸類似物的方法對於本領域的那些技術人員而言是公知的。嵌合的寡核苷酸，例如，含有磷酸二酯鍵和硫代磷酸酯鍵的寡核苷酸也包含在本發明範圍內。
通過在摻入到寡核苷酸中之前、期間或之後進行一種化學修飾，例如使用在本領域公知的方法能生產出修飾的核苷酸。例如，在擴增反應過程中(如，使用多聚酶鏈式反應(PCR))，通過摻入一個修飾的三磷酸核苷到核酸聚合物鏈中產生一種修飾的核苷酸。這種修飾的核苷酸，除了那些已經描述的外，還包括但不限於雙脫氧核苷酸、生物素化的核苷酸、胺修飾的核苷酸、烷基化的核苷酸、螢光團標記的核苷酸、放射性同位素標記的核苷酸、硫代磷酸酯、氨基亞磷酸酯、亞磷酸酯、環原子修飾的衍生物和類似物。含有多個修飾的核苷酸和/或修飾的核苷酸的任意組合的寡核苷酸也包含在本發明的範圍內。寡核苷酸還包含具有修飾的骨架的寡核苷酸聚合物，例如，蛋白-核酸(PNAs)或PNA雜合體。產生這種修飾的寡核苷酸或寡核苷酸聚合物的方法對於本領域的那些技術人員而言是公知的。
在一個實施方案中，本發明的方法被用於從一種雜質中分離一種合成寡核苷酸。在另一個實施方案中，要被分離的合成寡核苷酸具有優選的長度，例如從大約2個到大約100個核苷酸，從大約2個到大約75個核苷酸，或從大約4個到大約50個核苷酸。當前在治療中感興趣的許多合成寡核苷酸包含從8個到大約40個核苷酸。因而，在一個優選的實施方案中，要被分離的寡核苷酸具有從大約8個到大約40個核苷酸的長度。
存在許多種用於獲得寡核苷酸的方法。天然來源的寡核苷酸能從不同的生物材料中獲得，這些生物材料包括但不限於來自獸醫的或人類臨床試樣(如，收集用於診斷和/或預防目的的試樣)的有機體、組織和/或細胞中獲得。獲得這種天然來源的寡核苷酸的方法在本領域中是公知的。例如，細胞能被裂解並因此產生的裂解液能用本領域技術人員所熟悉的技術處理以獲得核酸(如，DNA和/或RNA)的水溶液(參見，例如Ausebel，F等.，Current Protocols in MolecularBiology，Wiley，紐約(1988)；Maniatis，等.，Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，冷泉港，紐約(1982))。
可選地，能用生物學方法、化學方法或生物學和化學方法的組合來生產天然來源的或合成的寡核苷酸。例如，能在生物學上使用重組核酸方法、人工重組(如，多聚酶鏈式反應(PCR))或各種克隆策略(如，那些使用載體和/或限制酶)來生產寡核苷酸。也能在化學上，例如使用自動化核酸合成儀或其它公知的化學合成方法來生產寡核苷酸。今天，大多數的寡核苷酸是使用自動化的合成儀來生產的。典型地，通過逐步地和以預確定的順序，從3′到5′，使5′-保護的核苷酸(它們各自的磷酸酯基團被活化)與在自身結合到固相載體上的生長的寡核苷酸鏈中的末端核苷酸殘基中的去保護的5′-位反應來合成寡核苷酸。最通常的用於5′-位的保護基團具有強的疏水性，例如，5′-O-三苯甲基保護基團(如，5′-O-二甲氧基三苯甲基)。
也能用不同的分子生物學技術和/或如前和/或隨後所述的要在本發明中使用的分離技術來生產寡核苷酸。這樣的分離技術的例子包括但不限於親和分離(如，核酸雜交)、電泳分離(如，使用大小分級瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠)和/或色譜分離(如，HPLC、離子交換色譜法、反相色譜法)(見，例如，Ausebel，F，等.，Current Protocols in Molecular Biology，Wiley，紐約New York(1988)；Maniatis，等.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，冷泉港，紐約(1982))。本發明方法也能與其他的分離方法結合使用(例如，陰離子交換色譜法、反相色譜法)。
在本發明的方法中，寡核苷酸存在於混合物中。包含寡核苷酸的混合物包括含有靶核苷酸的溶液。這樣的混合物包括含有天然來源的寡核苷酸的樣品(如，含有在活的或死亡的天然來源的或人工培養的單細胞或多細胞有機體中發現的核酸的樣品)。可選地，該混合物可以包括含有合成的寡核苷酸的樣品。
在一個實施方案中，包含靶寡核苷酸的混合物還包含一種或更多種長度比靶寡核苷酸更短的寡核苷酸。在一個優選的實施方案中，該混合物是合成的寡核苷酸的混合物，例如，使用自動化合成儀獲得的合成的混合物。在此實施方案中，混合物除了包含靶寡核苷酸之外，還包含截短的失敗序列。其它可含有寡核苷酸的混合物包括但不限於緩衝液，如基於Tris的溶液、基於MOPS的溶液、基於HEPES的溶液、基於醋酸鹽的溶液和基於磷酸鹽的溶液。也包括通常在化學或生物學應用中使用的包含溶液的混合物。這樣的混合物包括在靶寡核苷酸合成中獲得的樣品(如，包含PCR產物的樣品，從自動化合成儀獲得的樣品)、在靶寡核苷酸測序中獲得的樣品或在寡核苷酸分離中獲得的樣品(如，從色譜分離獲得的樣品)。也包括含有多於一種類型的寡核苷酸的組合物的混合物(如，包含天然來源的和合成的寡核苷酸的混合物)。
本發明的方法從一種雜質中分離一種靶寡核苷酸。在本文中定義的雜質是一種具有與靶寡核苷酸不同分子結構的組合物。從靶寡核苷酸中分離雜質可以是部分地或完全充分地。在某個實施方案中，要與靶寡核苷酸分離的雜質包含一種或更多種長度比靶寡核苷酸更短的寡核苷酸。在一個優選的實施方案中，要與靶寡核苷酸分離的雜質包含一種或更多種在靶寡核苷酸合成過程中產生的失敗序列。產生這些失敗序列是因為在合成寡核苷酸的生產過程中，在單體每一次逐步添加到初生的寡核苷酸鏈的過程中，大約有1-2％的偶聯反應失敗(即，沒有發生單體添加)。因此，所得到的產物通常是一種具有不同長度的寡核苷酸的非均勻混合物，其中不希望得到的雜質或汙染物(如，失敗序列)的數量與希望得到的產物的長度及合成的總產量成比例。為了更進一步的應用，通常需要將靶寡核苷酸和這樣的失敗序列分離。
在進一步的實施方案中，要與靶寡核苷酸分離的雜質包含一種鹽(即，一種離子鹽)，尤其是一種金屬鹽。鹽是在含有靶寡核苷酸的樣品中經常發現的常見的雜質，例如，在使用陰離子交換色譜法獲得的樣品中。在使用該靶寡核苷酸之前，含有靶寡核苷酸的樣品中存在的鹽典型地需要一次或更多次後續的分離或脫鹽步驟以除去鹽。在本文中所述的本發明的方法在這方面是有利的，其不需要鹽梯度來洗脫寡核苷酸並且因此無需後續的脫鹽步驟。因此，本發明的方法能被用於達到實質上降低鹽雜質的濃度的目的。使用本發明的方法能與寡核苷酸分離的鹽包括但不限於NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、NaHCO3、Na2CO3、NaOH、NH4Cl、NaOC(O)CH3和NaClO4。可以用本發明的方法分離的其它鹽是本領域技術人員公知的。
當鹽存在於含有靶寡核苷酸的混合物中時，能通過兩種機制將該鹽與靶寡核苷酸分離。如果該鹽不結合靶寡核苷酸或陰離子交換成分，其可簡單地流過可滴定的陰離子交換成分並因此可與靶寡核苷酸分離，該靶寡核苷酸的結合和實質上的洗脫是在更高的pH下進行的。可選地，如果鹽結合靶寡核苷酸或陰離子交換成分，其可通過在洗脫靶寡核苷酸之前用合適的洗滌溶液洗滌其上結合有靶寡核苷酸的陰離子交換成分來除去。因而，在一個實施方案中，在洗脫前對其上結合有靶寡核苷酸的陰離子交換成分進行一次或更多次洗滌步驟。適合於本發明方法的洗滌溶液是那些具有合適的pH和能除去雜質而不導致靶寡核苷酸從可滴定的陰離子交換成分上釋放的溶液。這樣的洗滌溶液包括但不限於水和緩衝液(如，基於Tris的溶液、基於MOPS的溶液、基於HEPES的溶液、基於醋酸鹽的溶液、基於磷酸鹽的溶液)。能被用於洗滌其上結合有靶寡核苷酸的陰離子交換成分的其它合適的溶液是本領域公知的。
本發明的方法使用了可滴定的陰離子交換成分來純化核酸。在本文中所述的陰離子交換成分是一種含有正電荷和帶有負電荷的可置換的離子(平衡離子)的成分。因此，陰離子交換成分能結合帶有負電荷的分子(例如，寡核苷酸)並因此置換了帶有負電荷的平衡離子。本發明的陰離子交換成分優選是固體成分。
用於本發明的陰離子交換成分是可滴定的。在本文中，「可滴定的陰離子交換成分」是一種當pH增加時能失去正電荷的陰離子交換成分。優選地，用於本發明的可滴定的陰離子交換成分當pH從大約7.0增加到大約12.0時失去正電荷。可滴定的陰離子交換成分包括包含伯胺、仲胺或叔胺的成分。合適的可滴定的陰離子交換成分包括包含聚咪唑、聚組氨酸、聚賴氨酸、聚亞乙基亞胺、聚亞丙基亞胺、修飾的聚亞乙基亞胺和聚(亞乙基-亞胺/氧化乙烯)的陰離子交換成分。在一個優選的實施方案中，可滴定的陰離子交換成分是聚亞乙基亞胺，當pH從大約8增加到大約11時，其失去正電荷。
不希望受特定理論的限制，認為用於本發明的可滴定的陰離子交換成分具有質子化了的並且因此在中性和低pH時帶有正電荷的原子(如，氮原子)。例如，聚亞乙基亞胺在pH為大約5-8(或更低pH)時具有帶有正電荷的氮原子。當洗脫液的pH逐漸地增加時，聚亞乙基亞胺的氮原子開始變成去質子化的。因而，例如，在從失敗序列中分離靶寡核苷酸的過程中，與更長的帶有更多的負電荷的靶寡核苷酸相比，使用聚亞乙基亞胺可使得比靶寡核苷酸更短的(和因此具有更少的負電荷的)失敗序列在更低的pH下從聚亞乙基亞胺上釋放。當pH增加時，聚亞乙基亞胺上越來越多的氮原子變成去質子化的，其使得更長的失敗序列釋放和最後使靶寡核苷酸釋放。最終，在更高的pH處，聚亞乙基亞胺上所有的氮原子都變成去質子化的並且因此不能保留帶負電荷的寡核苷酸。
因此，使用可滴定的陰離子交換成分(如，聚亞乙基亞胺)消除了使用鹽梯度來洗脫結合的寡核苷酸的必要性並提供了更快速、有效和經濟的分離寡核苷酸的方法。
在一個實施方案中，將可滴定的陰離子交換成分連接到載體上。可以通過本領域公知的方法(如，共價連接、任選地通過連接基團如二乙烯基碸接頭或環氧氯丙烷接頭)將可滴定的陰離子交換成分連接到載體上。優選地，連接被進行使得可滴定的陰離子交換成分的固定的正電荷和帶有負電荷的可取代的離子(平衡離子)容易接近寡核苷酸(即是表面暴露的)。合適的載體包括固體或半固體載體，例如合成的聚合物載體，如矽石(如，矽膠)、多糖、合成的聚烯烴包括聚苯乙烯(如苯乙烯-二乙烯基苯共聚物)、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸(如，聚丙烯醯胺、聚丙烯酸酯)和瓊脂糖，例如那些商業上可獲得的商標名為Sepharose的瓊脂糖。在本領域中公知的其它合適的載體也包含在本發明的範圍內。在一個優選的實施方案中，可滴定的陰離子交換成分是從聚亞乙基亞胺衍生的矽膠或從聚亞乙基亞胺衍生的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。在另一實施方案中，可滴定的陰離子交換成分不結合載體。而是該固體的可滴定陰離子交換成分自己充當了載體，寡核苷酸可與之結合併從中釋放。
在本發明的某個實施方案中，通過使用可從Millipore購買的商標名為Matrex Silica的聚亞乙基亞胺衍生的二氧化矽(Silica)可滴定陰離子交換成分，例如Matrex Silica PEI-300和Matrex Silica PEI-1000，可以得到良好的結果。
用於本發明的方法的可滴定陰離子交換成分的濃度和數量取決於許多的因素，如包含寡核苷酸的混合物的數量和特性、混合物中寡核苷酸的濃度和特性及混合物中雜質的濃度和特性。本領域的技術人員無須進行過度的試驗就很容易地確定適合於結合靶寡核苷酸的可滴定的陰離子交換成分的適當數量。
同樣地，本領域的技術人員無須進行過度的試驗就能確定用於進行分離的適當的參數。例如，對於包含靶寡核苷酸的相對純的混合物或對於包含結構上與靶寡核苷酸完全不同的雜質的混合物而言，分離能進行得相對地快些，如使用增加的流速。可選地，對於高度非均勻的混合物或含有與靶寡核苷酸類似的雜質的混合物，其可通過減慢分離速度(如，使用減小的流速)和/或使用附加的可滴定陰離子交換成分以期望增加解析度。
另一個重要的可被改變以得到合適的分離的變量是洗脫液的pH變化的速率。此外，基於分離的特性，本領域的技術人員將可以確定合適的pH洗脫圖(如，連續的pH梯度、分步的pH梯度、快速改變pH、慢速改變pH)。
很多種pH增加的能用於本發明方法的洗脫液，包括被適當地緩衝以達到期望的pH的溶液，如基於Tris的溶液、基於MOPS的溶液、基於HEPES的溶液、基於醋酸鹽的溶液、基於磷酸鹽的溶液。也包含本領域公知的其它代表性地用於陰離子交換分離的溶液。洗脫液也能含有一種或更多種的離子鹽，如NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、NaHCO3、Na2CO3、NaOH、NH4Cl、NaOH和同類物，然而，在本文中所述的洗脫液不使用鹽梯度。在本發明的方法中使用的洗脫液的體積應該足夠使得可滴定的陰離子交換成分飽和。
在一個優選的實施方案中，流過其上結合有靶寡核苷酸的可滴定的陰離子交換成分的洗脫液的pH隨著時間的過去而增加，但在同樣的過程中其鹽濃度實質上不增加。如本文中所定義，缺乏鹽濃度「實質上增加」意味著任何鹽濃度的增加，當這種增加發生時不會對從可滴定的陰離子交換成分上洗脫靶寡核苷酸產生重要的影響。
在另一個實施方案中，用於本發明的洗脫液具有實質上不變的鹽濃度。在本文中所用的「實質上不變」的鹽濃度意味著任何鹽濃度的變化(增加或減少)是足夠地小到使它們無法對從可滴定的陰離子交換成分上洗脫靶寡核苷酸產生重要的影響。可選地，洗脫液的鹽濃度能隨著時間的過去而降低。在另一個實施方案中，洗脫液實質上不含有金屬鹽。在本文中所用的「實質上不含有金屬鹽」是指溶液含有無實質數量的金屬鹽的這種事實(即，沒有金屬鹽或含很少的金屬鹽以致於不能影響後續的寡核苷酸的應用)。不象典型的寡核苷酸的陰離子交換分離，本發明的一個重要的方面是本發明的方法使用pH梯度而非鹽梯度來進行洗脫。
在本發明中使用的洗脫液包括在分步方法中pH增加的溶液和在連續方法中pH增加的溶液。在一個實施方案中，用於洗脫靶寡核苷酸的溶液的pH以線性方式隨著時間的過去而增加。在另一個實施方案中，用於洗脫靶寡核苷酸的溶液的pH從大約8增加到大約11。優選地，在此實施方案中，所使用的可滴定的陰離子交換成分包含聚亞乙基亞胺。該洗脫液也包含一種或更多種適合用於改變pH的緩衝介質。在一個實施方案中，洗脫液包含一種或更多種的NaHCO3、Na2CO3、NaOH、NH4OH和/或NH4HCO3。在一個優選的實施方案中，洗脫液不含金屬鹽並且有利地包含在乾燥時不穩定的鹽，如NH4HCO3，尤其是NH4OH。雖然洗脫速率通常是不重要的，但是通常以大約350到550cm/hr的流速，更通常以大約420到450cm/hr的流速施用用於洗脫靶寡核苷酸的溶液。
可以意識到包含鹽的洗脫液具有鹽的濃度實質上低於在鹽梯度洗脫中所採用的鹽的濃度。通常，在pH梯度洗脫液中的鹽濃度不超過0.1M，如從大約0.01到大約0.07M，例如大約為0.05M。在許多實施方案中，隨著pH梯度，總的pH的增加並不使得洗脫液中的鹽濃度的增加超過大約100％。在某一特定的實施方案中，鹽濃度實質上可以保持不變或甚至減少。洗脫液的鹽濃度通常不超過0.2M，優選地不超過0.1M。與使用鹽梯度形成對照的是，其鹽濃度典型地至少是大約0.5M，通常增加到2M或更高，例如3到4M。
本發明的方法能被用於分離5′-O-保護的寡核苷酸。在某個實施方案中，能將5′-O-保護基團從靶寡核苷酸上除去，而該靶寡核苷酸仍然結合在可滴定的陰離子交換成分上。合適的5′-O-保護基團為本領域所公知，並包括例如取代或未取代的三苯甲基基團(如，4，4′-二甲氧基三苯甲基(DMT))。在一個優選的實施方案中，本發明的方法用於分離5′-O-三苯甲基保護的寡核苷酸(如，5′-O-二甲氧基三苯甲基保護的寡核苷酸)。從結合的寡核苷酸上除去保護基團(即，在洗脫掉可滴定的陰離子交換成分之前)可通過讓合適的試劑流過可滴定的陰離子交換成分來完成。為了從靶寡核苷酸上除去三苯甲基保護基團，一種合適的試劑是足夠量的酸性溶液。在許多實施方案中，使用醋酸水溶液，例如20％-80％v/v的醋酸水溶液可以除去靶寡核苷酸上的三苯甲基保護基團(如，5′-O-DMT)。
本發明的方法的有利之處在於他們避免了典型地用於分離或純化寡核苷酸所需的既費力又費時的的常規分離步驟。排除了在陰離子交換分離中使用鹽梯度的必要性，本發明的方法減少了典型地必需的分離寡核苷酸的步驟的數目。因而，本發明為大規模地純化寡核苷酸提供了一種快速、簡單、更有效和花費更低的方法。而且，排除了在洗脫液中使用高濃度的鹽，本發明的方法減少了對不鏽鋼和/或色譜儀的活動部件和其它陰離子交換分離裝置(如，HPLC泵、接頭、閥、柱子、管)的損害。
本發明將通過如下的非限制性的實施例來進一步描述。本文中所引用的所有出版物的教導在此完全結合作為參考文獻。
實施例實施例1-純化通過固相合成製備的寡核苷酸以下的設備和試劑在本文中被提到且為了方便起見，將一次性地列出相關的信息。除非另有說明，所有的試劑和設備在廠商說明書的指導下使用。此外，除非另有說明，其它為本領域的那些技術人員所公知的類似的設備和試劑也可替代使用。
試劑從聚亞乙基亞胺衍生的矽膠(Matrex Ion Exchange Silica PEI-300-15；產品號S674(Millpore，Bedford，MA)；緩衝液A；50mM NaHCO3溶液；pH 8.2；緩衝液B；50mMNaHCO3/Na2CO3溶液；用0.1MNaOH調節pH到11.1；緩衝液C；0.1 NaOH溶液；緩衝液D；0.1MTris，2MNaCl溶液；pH7.5使用固相載體和氨基亞磷酸酯化學方法合成寡核苷酸TCG-TCG-TGT-TTT-CTA-TTT-TCG-UTT(SEQ ID NO.1)。在寡核苷酸合成結束時，用3％溶於二氯甲烷中的二氯醋酸除去5′-O-三苯甲基保護基團。然後，將寡核苷酸從載體上釋放並且用濃的氫氧化銨溶液除去保護基團。然後，通過添加1.0M磷酸溶液將含有靶寡核苷酸的溶液調節pH到7.5(總的寡核苷酸是121，950OD)。
分離寡核苷酸在緩衝液D中製備從PEI-衍生的矽膠漿液(100mL)並以8mL/分鐘的流速裝填入玻璃柱中。隨後將該柱子用緩衝液C、緩衝液D和緩衝液A洗滌直至最終的洗出液pH達到8.2。通過用4倍柱體積的緩衝液A以35mL/分鐘的流速該柱子洗滌來平衡它。
以35mL/分鐘的恆定流速將含有靶寡核苷酸的樣品加載在柱子上。加樣後，用4倍柱體積的緩衝液A洗滌柱子。用通過使用緩衝液A和緩衝液B獲得的pH梯度(pH8.2到11.1)分離靶寡核苷酸(20倍柱體積的0到80％緩衝液B，以435cm/hr的流速)。收集級分並用分析性的陰離子交換HPLC對希望得到的寡核苷酸進行化驗。匯集純度大於90％的級分。使用UF膜過濾或通過與PEI-衍生的矽膠結合來濃縮寡核苷酸產物並脫鹽。然後，將寡核苷酸產物凍幹。
再生柱在分離靶寡核苷酸後，通過用緩衝液C(1倍柱體積)、緩衝液D(2倍柱體積)和最後用緩衝液A(直到洗出液pH達到小於8.5)洗滌來再生柱子。因此，該柱子適合用於另一次分離。
實施例2-將通過固相合成製備的並通過離子交換色譜法純化的寡核苷酸脫鹽試劑從聚亞乙基亞胺衍生的矽膠(Matrex Ion Exchange Silica PEI-300-15；產品號S674(Millpore，Bedford，MA)；緩衝液A；0.25M NH4HCO3溶液；pH 7.5；緩衝液B；0.1M NH4OH；緩衝液C；MILLI-Q水；緩衝液D；0.1M NH4OH，2 MNaCl溶液；pH7.5在緩衝液D中製備PEI-衍生的矽膠漿(100mL)並以8mL/分鐘的流速裝填入玻璃柱中。隨後用兩倍柱體積的緩衝液D洗滌該柱子。然後用緩衝液A再平衡該柱子直至pH小於8。
如實施例1中所述的方法合成寡核苷酸TCG-TCG-TGT-TTT-CTA-TTT-TCG-UTT(SEQ ID NO.1)。合成後，使用標準方法通過離子交換色譜法從副產物中分離靶寡核苷酸，所得到的pH 12的溶液含有純化的寡核苷酸和大約1.5-2.0M的氯化鈉。然後用1.0M醋酸將該溶液的pH調節到7.5。接著以8mL/分鐘的流速將該樣品加載到柱子上(1000OD/mL樹脂)。
將已加樣的柱子首先用5倍柱體積的緩衝液A洗滌，接著用緩衝液C洗滌直至電導率低於0.01毫西門子/cm。然後用緩衝液B將寡核苷酸從柱子上洗脫下來。洗脫後，用兩倍柱體積的緩衝液A洗滌再生柱子。
實施例3除了緩衝液A的pH為6.0外，使用實施例1的方法純化其上有5′-二甲氧基三苯甲基的含有66％全長產物(FLP)的18-聚體的完全硫代磷酸酯化的脫氧核糖核苷酸。對此被純化和洗脫的核苷酸的分析顯示產物的純度大於94％FLP。當PEI衍生的聚苯乙烯珠作為可滴定的陰離子交換載體時，也得到相當的結果。
雖然本發明已經在前述提及的優選實施方案中被特別地說明和描述，但是對於本領域的那些技術人員而言，可以理解其中形式和細節上的不同變化並不背離包含在所附的權利要求中的本發明的保護範圍。
序列表110Avecia Biotechnology，有限公司等120寡核苷酸及其類似物的純化方法130SMC 60475-WO1601170PatentIn版本3.1210121124212DNA213人工序列220
223在實施例1和2中純化的寡核苷酸4001tcgtcgtgtt ttctattttc gutt2權利要求
1.一種在包含所述的靶寡核苷酸和所述的雜質的混合物中使用可滴定的陰離子交換成分從雜質中分離靶寡核苷酸與方法，包含下列步驟a)將所述的靶寡核苷酸結合到所述的可滴定的陰離子交換成分上；b)讓一種溶液流過所述的其上結合有靶寡核苷酸的可滴定的陰離子交換成分，其中所述的溶液的pH隨著時間的過去而增加；和c)洗脫所述的靶寡核苷酸，其中所述的雜質在與所述的靶寡核苷酸不同的pH下洗脫。
2.權利要求1的方法，其中所述的可滴定的陰離子交換成分包含一種伯胺、仲胺或叔胺。
3.權利要求1或2的方法，其中所述的可滴定的陰離子交換成分包含聚亞乙基亞胺、聚咪唑、聚組氨酸或聚賴氨酸。
4前述任意一項權利要求的方法，其中在b)中所述的溶液實質上不含有金屬鹽。
5.根據前述任意一項權利要求的方法，其中在b)中所述的溶液隨著時間的過去實質上不增加其鹽濃度。
6.前述任意一項權利要求的方法，其中所述的可滴定的陰離子交換成分連接到一種載體上。
7.權利要求6的方法，其中所述的載體是合成聚合物。
8.權利要求7的方法，其中所述的合成聚合物選自由矽膠、多糖、苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯和瓊脂糖組成的組。
9.權利要求8的方法，其中所述的可滴定的陰離子交換成分是聚亞乙基亞胺衍生的矽膠或聚亞乙基亞胺衍生的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。
10.前述任意一項權利要求的方法，其中所述的靶寡核苷酸是一種合成的寡核苷酸。
11.權利要求10的方法，其中所述的合成的寡核苷酸選自由硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和氨基磷酸酯組成的組。
12.前述任意一項權利要求的方法，其中所述的靶寡核苷酸與所述的可滴定的陰離子交換成分的結合發生在5到8的pH下。
13.前述任意一項權利要求的方法，其中在b)中所述的溶液的pH隨著時間的過去以線性方式增加。
14.前述任意一項權利要求的方法，其中在b)中所述的溶液的pH從大約8增加到大約11。
15.前述任意一項權利要求的方法，其中在b)中所述的溶液包含NH4HCO3和/或NH4OH中的一種或更多種。
16.前述任意一項權利要求的方法，其中所述的靶寡核苷酸具有從大約8到大約40個核苷酸的長度。
17.前述任意一項權利要求的方法，其中所述的雜質是一或更多種長度比所述的靶寡核苷酸更短的寡核苷酸，並且其中所述的雜質在比所述的靶寡核苷酸更低的pH下洗脫。
18.權利要求17的方法，其中所述的雜質是一種或更多種失敗序列。
19.權利要求1-16中任意一項的方法，其中所述的雜質是金屬鹽。
20.前述任意一項權利要求的方法，其中所述的靶寡核苷酸是5′-O-保護的。
21.權利要求20的方法，其中所述的靶寡核苷酸是5′-O-三苯甲基，優選5′-O-二甲氧基-三苯甲基保護的。
22.權利要求21的方法，它進一步包括在洗脫所述的靶寡核苷酸之前，讓所述的可滴定的陰離子交換成分流過足夠數量的酸性溶液以從所述的靶寡核苷酸中除去所述的5′-O-三苯甲基保護基團的步驟。
23.權利要求22的方法，其中所述的酸性溶液包括醋酸水溶液。
24.前述任意一項權利要求的方法，其中在b)中所述的溶液具有小於包含所述的靶寡核苷酸和雜質的混合物體積的體積，因此增加了所述的靶寡核苷酸的濃度。
25.前述任意一項權利要求的方法，在洗脫所述的靶寡核苷酸之前，還包含一次或更多次洗滌步驟。
全文摘要
本發明披露了用於分離寡核苷酸與雜質的方法。在本發明的方法中，在包含靶寡核苷酸與雜質的混合物中，使用一種可滴定的陰離子交換成分分離靶寡核苷酸與雜質。靶寡核苷酸結合到可滴定的陰離子交換成分上並且讓一種隨著時間的過去具有pH增加的洗脫液流過其上結合有靶寡核苷酸的可滴定的陰離子交換成分。優選地，洗脫液實質上不增加鹽濃度。將靶寡核苷酸洗脫，並因此與雜質分離，其中雜質的洗脫在比靶寡核苷酸更低的pH或更高的pH下進行。
文檔編號C07H21/00GK1643145SQ03806393
公開日2005年7月20日 申請日期2003年3月19日 優先權日2002年3月21日
發明者J·T·約翰森 申請人:艾夫西亞生物科技公司