修復和/或再生受損心肌的方法和組合物的製作方法

2023-07-20 14:01:41 2

專利名稱：：修復和/或再生受損心肌的方法和組合物的製作方法
技術領域：
：本發明總地涉及心臟學領域，特別是涉及用於處理患有心血管疾病，包括但不只限於動脈硬化、心肌缺血、高血壓、再狹窄、心絞痛、風溼性心臟病、先天性心血管缺陷和動脈炎症以及其他動脈、小動脈和毛細血管疾病的病人的方法和細胞組合物。本發明包括處理、治療及可用於取代傳統的、侵入性治療方法，如旁路外科或與這些方法聯合使用的方法學。再者，本發明涉及下列任何一個或多個方面包括治療有效量的單獨體幹細胞或與選自千細胞因子(SCF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞-巨嗜細胞集落刺激因子(GM-CSF)、體細胞衍生因子、青灰因子、血管內皮生長因子、巨嗜細胞集落刺激因子、粒細胞-巨嗜細胞刺激因子或白介素-3或任何能夠刺激和/或遷移幹細胞的細胞因子結合的方法和/或藥物組合物。細胞因子可以單獨投用或者與能夠刺激或遷移幹細胞；維持前期或後期血細胞生成(見下述)；活化單核細胞(見下述)；巨嗜細胞/單核細胞增殖；分化、生存和存活(見下述)的任何其他細胞因子聯合投用，以及與醫藥上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑結合使用。幹細胞優先是成年幹細胞，例如造血細胞或心肌幹細胞或其組合或心肌幹細胞與任何其他類型幹細胞的組合。在循環組織或肌肉組織或循環肌肉組織，例如心肌組織，如心臟或血管，如進或出心臟的靜脈、動脈，如直接與心臟連接的或隨後進入心臟的靜脈和動脈，例如主動脈中，植入、沉積、投用或引起植入、沉積或投用幹細胞，例如單獨的造血或心肌幹細胞以及其他類型的幹細胞(如另一類型的成年千細胞)，或與選自幹細胞因子(SCF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞-巨嗜細胞集落刺激因子(GM-CSF)、體細胞衍生因子、青灰因子、血管內皮生長因子、巨嗜細胞集落刺激因子、粒細胞-巨嗜細胞刺激因子、白介素-3或任何能夠刺激和/或遷移幹細胞的細胞因子結合(其中"與細胞因子-一"可包括依次植入、沉積、投用或引起植入或沉積或投用千細胞和細胞因子，或共植入或共沉積或共投用或引起移植、沉積或投用幹細胞和細胞因子)。可以結合移植物進行這種移植、沉積或投用或引起植入、沉積或投用。最好應用這種遷移或增殖處理或治療或預防心肌條件，例如處理心臟無力或斑痕形成或預防這些區域的進一歩出現，或處理刺激這些區域的條件，例如心肌梗塞或缺血或其他，如遺傳、導致心臟無力或瘢痕形成的條件(也見下面提到的心臟條件)。這些處理、治療或預防中使用的介質包括兩種或多種細胞因子。包括用於這些處理、治療或預防的配方的細胞因子的試劑盒。包括細胞因子的組合物和製備這種組合物的試劑盒。本文描述了製備試劑盒和組合物的方法。包含這些幹細胞和至少一種細胞因子的組合物，以及製備這種組合物的試劑盒。本文公丌了製造試劑盒和組合物的方法。植入或沉積幹細胞或引起植入或沉積幹細胞的方法。—包含引起心幹細胞或心原始細胞遷移和/或增殖成循環組織或肌肉組織或循環肌肉組織，例如心肌組織，如心臟或血管，例如進或出心臟的靜脈、動脈，如直接相接或隨後進入心臟的動脈，例如主動脈的治療有效量的一種或多種細胞因子的方法和/或藥物組合物。這種遷移和/增殖優先被應用與處理或治療或預防心肌狀態，例如處理心臟中無力或瘢痕形成的區域，或防止這樣的區域的出現或進一歩出現，或處理引起或刺激這些區域，例如心肌梗塞或心肌缺血或其他心臟狀態，如無力或瘢痕形成(也參見下面提到的心肌狀態)。包含兩種或多種細胞因子的用於上述處理、治療或預防的藥物。包含用於這些處理、治療或預防的配方的細胞因子的試劑盒。包括細胞因子的組合物和製備這種組合物的試劑盒。本文描述了製備試劑盒和組合物的方法。包含用於引起心幹細胞或心原始細胞遷移和/或增殖成循環組織或肌肉組織或循環肌肉組織，例如心肌組織，如心臟或血管，例如進或出心臟的靜脈、動脈，如直接相接或隨後進入心臟的動脈，例如主動脈的治療有效量的一種或多種細胞因子，結合治療有效量的用於處理高血壓、心肌梗塞、缺血、心絞痛，或其他冠脈或血管疾病的藥劑(例如AT1受體阻斷劑如losartan、鏈激酉每、PeoPro(abciximab)、enalapril、Rapilysin(ret印lase)、Dilatrend(carvedilol)、Activase(alt印lase)，以及其他有本領、土或己矢口具有相1以的用途的藥劑)的方法和/或藥物組合物。利用上述藥物組合物治療患有高血壓、心肌梗塞、缺血、心絞痛或其他冠脈或血管疾病的方法。含有一種或多種細胞因子，結合用於治療高血壓、心肌梗塞、缺血、心絞痛，或其他冠脈或血管疾病的藥劑的試劑盒。製造和使用上述試劑盒和組合物的方法。分離、擴展和活化幹細胞，特別是心肌幹細胞的方法。用於培養、擴展和/或活化幹細胞，特別是心肌幹細胞的培養基。治療動脈和/或血管阻塞或阻斷的方法，包括可在一種或多種細胞因子存在下，投用幹細胞，特別是心肌幹細胞，尤其是活化的心肌幹細胞。
背景技術：
：心血管疾病是整個工業化世界的主要健康危害。與心血管疾病最相關的動脈硬化是心臟病發作和肢端壞疽的基本原因，因此是美國人死亡的主要原因。動脈硬化是一種涉及許多細胞類型和分子因素的複雜疾病(詳細評述參見Ross，1993，Nature362:801-809)。缺血是以一種以由於灌注不足而使器官組織內缺乏氧供應為特徵的病理狀態。這種灌注不足可以由許多自然原因引起，包括動脈硬化或再灌注損傷、貧血或卒中等。許多醫學幹預，例如旁路外科期間的血流幹預，也可導致缺血。除了有時因患病的心血管組織引起外，缺血有時也可影響心血管組織，如缺血性心臟病。然而，缺血可以發生在氧供應缺乏7的任何器官。心臟缺血的最常見原因是心肌梗塞(MI)，通常所謂的心臟發作是最熟知類型的心血管疾病。1998年的估計顯示，美國有730萬人患有MI，這一年有超過1百萬的人經歷了MI(美國心臟協會，2000)。這些病人中，25%是男性，38%是女性，病人在被首次認定為MI後的一年內死亡(美國心臟協會，2000)。MI由突然和持續性心臟區域缺血引起，大多由冠狀動脈狹窄引起。沒有足夠的血液供應，組織逐漸缺血，導致心肌細胞和血管結構的死亡。存活率決定於梗塞的部位，隨著梗塞面積的增大，恢復的可能漸小。例如，在人類，左心室有46%梗塞即可造成不可逆的心源性休克和死亡(99)。目前，MI的治療集中於再灌注療法，其試圖啟動通向受影響區域的血流，阻止組織的進一歩丟失。再灌注療法的主要選擇是使用抗血栓劑，或進行氣球血管成形術，或冠狀動脈旁路移植術。抗凝血劑溶解可能阻塞動脈的血凝塊，而氣球血管成形術可使導管通入阻塞部位的動脈，通入的導管的尖端被充氣，推開動脈。更具侵入性的方法包括分流手術，外科醫生除去病人的部分靜脈，用它在心臟中造成新的動脈，從旁路通過被阻斷的部分，繼續向病變區域供應血液。1998年，估計有553,000個人接受過冠狀動脈分流移植手術，有539，000個病人作過皮下冠血管成形手術。這些手術平均每個病人分別花費27，091和8，982美圓(美國心臟協會，2000)。這些治療可能在從新建立血液供應中獲得成功，但在再灌注處理丌始之甜會發生不可逆的組織損傷。為此，對合適的MI病人要儘可能快地丌始再灌注治療，以限制梗塞的面積。大多數研究集中在減少梗塞的大小上。有少數人試圖移植心肌細胞或成肌細胞再生壞死組織(Leoretal.，1996;Murry，etal.，1996;Taylor，etal.，1998;Tomita，etal.，1999;Menasche，etal.，2000)。雖然細胞在移植後可以存活，但他們不能重新建立功能和結構上的健康心肌和冠狀血管。正常成年人的所有細胞都來源於身體各個部分之內。這些細胞本身均衍生於稱為祖細胞的未成熟細胞，可在半固體培養基例如甲基纖維素或瓊脂中，於l-3周內觀察是否發育成連續克隆來檢測這些祖細胞。分裂後，幹細胞能夠自身更新並分化成祖細胞。因此，分裂的幹細胞產生附加的原始幹細胞和分化的祖細胞。幹細胞除了具有發育成血細胞的已知作用外，幹細胞也能產生見於肝、腦和心臟等其他組織的細胞。幹細胞有能力無限分化，並專門化變成特殊類型的細胞。在受孕後即存在並開始分裂的全潛能幹細胞具有全部潛能，並且能夠變成任何類型的細胞。細胞一旦達到母細胞階段，細胞的潛能便受到損傷，雖然細胞仍能發育成體內的任何細胞，但並不能發育成胚胎發育8所需的支持組織。細胞被認為是多潛能的，因為他們仍能發育成許多類型的細胞。在發育期間，這些細胞更加專門化，成為具有特殊功能的細胞。見與成年人的這些多潛能的細胞被稱為成年幹細胞。已知幹細胞定位於骨髓中，並且有小量外周血幹細胞能通過血流循環(國家衛生院，2000)。由於幹細胞的再生特性，所以認為它們是完成組織和器官潛在工程的頂端來源。這就為針對心肌狀態使用幹細胞提供了優點。可提到的文獻有美國專利6，117,675號涉及視網膜幹細胞於體內或體外分化成視網膜細胞，可用於恢復視力的治療。芙國專利6，001，934號涉及由朗漢氏幹細胞發育成功能性小島。美國專利5，906,934和6，174,333號涉及使用間充質幹細胞修復軟骨，並使用間充質幹細胞再生韌帶；例如，其中將幹細胞包埋在凝膠基質中，然後植入以取代所需要的軟組織。美國專利6，099，832和6，110，459號涉及移植物和細胞移植。PCT申請PCT/US00/08353(W000/57922)和PCT/US99/17326(W000/06701)號涉及心肌內注射自體骨髓，但該發明中沒有教導或提示投用、植入、沉積或使用造血幹細胞，特別是本發明中的造血幹細胞是分離和純化的成年造血幹細胞。此外，由於其他原因，這些專利文獻中至少有些沒有教導或提示本發明。有用幹細胞的來源限於再生所需組織類型的已知來源。因為給定組織中常常只有很少幹細胞，所以得到和純化這些特殊細胞可能是極其困難的。相反，本發明的優點在於幹細胞能夠與心肌損傷的根源建立各種譜系級連，並可分化成適當的細胞類型，而不需要從心肌直接回收幹細胞，並且各種類型的幹細胞均可使用，並沒有危及再生組織的功能性。並且，其他一些專利文獻則利用幹細胞作為各種化學組合物的來源，而沒有利用它們的增殖能力，因而沒有教導或提示本發明。目前文獻中公丌的已開始的幹細胞潛能研究，僅僅有助於修復已知的專門化組織。幹細胞能夠穿過胚芽層邊界的這種可塑性，僅僅是一個早期概念(Kempermannetal.，2000;Te即le，2001)。Kocher等人(2001)討論了梗塞後使用成年骨髓誘導神經血管化，以作為用於左心室重建的可代用療法(參見Rosenthl和Tsao，2001)。其他研究集中在使特殊類型的幹細胞(即如Malour等人顯示的肝幹細胞)分化成心肌細胞。另外再有的工作則集中於骨髓衍生幹細胞的可能性(Krause，etal.，2001)。幹細胞在醫學上較早應用是用於治療腫瘤。這些治療中，將骨髓移植到本身骨髓已受到放射破壞的病人體內，然後被移植骨髓中的幹細胞即產生新的、健康的白血細胞。這些治療中，幹細胞被移植到其正常環境，在這裡發揮其正常功能。到目甜為止，認為特定的幹細胞只是能夠產生3至4個類型的細胞，這樣，它們只能在證明它們能夠變成的細胞類型的治療中得到應用。已開始揭示治療心肌疾病的其他選擇，但上未限定幹細胞在其中的作用。這類工作的例子將呈現於本發明的證據中。器官移植已被廣泛用於非功能組織的取代治療。最近，作為一種潛在的治療手段，己出現放大宿主組織功能缺陷的細胞移植。該方法的一個例子是在患有帕金森氏病的個體中公開使用胎兒組織(參見Tompson，1992)，其中由移植的細胞分泌多巴胺，使病人的缺陷得到緩解。在其他研究中，將移植的成肌細胞與杜興氏病病人的內源性肌管融合；重要的是，移植的肌管表達多種類型的肌營養不良蛋白(Gussoietal.，1992)。儘管它們也關係到其他領域，但這些研究並沒有描述可成功用於心臟的細胞移植技術，其中取代受損心肌的能力具有明顯的臨床相關性。另外，使用針對長期表達血管生成因子和離子移變肽的心肌內移植物，將對心肌缺血或先天性心臟病的個體具有治療價值。從該發明背景看，有必要改善心臟中的心肌再生技術。這樣的技術不僅導致心臟的組織再生，也能夠直接向心臟釋放有用的組合物。本發明就是針對這些需要提出的。因此，相信現有技術沒有教導或提示如本公開和本文所述方法提到的，單獨或與至少與一種細胞因子聯合投用、沉積，或引起沉積、移植或投用幹細胞，以及這些幹細胞在用於治療、處理或預防的藥物配方中的應用，並且本文所述方法、組合物、試劑盒和應用是新的、非顯而易見和具有發明性的，也就是說，現有技術中沒有教導或提示本發明，所以本發明是新的、非顯而易見和具有發明性的。
發明內容令人驚奇發現，心肌梗塞後，向梗塞周圍的心肌移植體幹細胞，這些體幹細胞即可遷移到受損區域並分化成心肌細胞、內皮細胞和平滑肌細胞，然後增殖並形成包括心肌、冠狀動脈、小動脈、毛細血管等的結構，恢復梗塞心肌的結構和功能完整性。同樣令人驚奇地發現，心肌梗塞後，給病人投用細胞因子，即可刺激病人體內定居和/或循環的幹細胞，使它們進入血流並定居到梗塞的區域。還發現，一旦細胞定居於梗塞區，它們便遷移到受損組織，在那裡分化成心肌細胞、內皮細胞和平滑肌細胞，然後增殖並形成包括心肌細胞、冠狀血管和動脈、小動脈和毛細血管等，使梗塞區域的結構和功能完整性得以恢復。目前，已在人(82)和大鼠(83、84)心臟中鑑定了定居的心肌幹細胞(CSC)。雖然這些原始細胞大多積聚在動脈中，但它們也存在於整個心肌內(82、83、84)。CSC表達常見於造血和骨骼肌幹細胞的表面抗原(85、86)。對於所有心肌譜系，CSC是克隆發生、自身更新和多潛能的。因為CSC的生長特性，受損傷的心臟具有自身修復的潛力。然而，這種可能性卻受到我們對CSC在新組成並發揮功能的心肌內克隆化、增殖和分化的了解的限制(61、87)。同樣的障礙也適用於機體內任何其他來源的幹細胞(88)。對造血細胞和肝幹細胞(89、90、91)，特別是隨體骨骼肌細胞(92)上c-Met的識別，已促成了檢測其配體(肝細胞生長因子(HSF))是否對CSC具有生物學作用。梗塞後，立即估計HSF遷移並促進CSC從解剖儲存區向損傷部位轉位。通過表達和活化基質金屬蛋白酶-2(94、95)，可見HGF對細胞遷移的積極影響(93)。金屬蛋白酶家族可破壞細胞外基質構成的屏障，從而有利於CSC移動、定居和組織儲存。同樣，胰島素樣生長因子-1(IGF-1)是促有絲分裂和抗凋亡的，並且是神經千細胞繁殖和分化所必須的(96、97、98)。以相似方式，IGF-1通過增加它們的數目和它們的存活性影響CSC。成年小鼠心臟中的，IGF-1的過表達特徵在於心肌細胞增殖(65)，並且這種細胞的生長可能取決於CSC活化、分化和存活。因此，本發明提供了修復和/或再生最近損傷的心肌和/或心肌細胞的方法和組合物，包括投用有效量的一種或多種細胞因子，例如HGF和IGF-1，以引起心肌幹細胞或心肌原始細胞的遷移和/或增殖成循環組織或肌肉組織或循環肌肉組織。這種遷移和/或增殖優先應用於處理或治療或預防心肌狀態，如治療心臟無力或瘢痕形成，或防止受損區域的出現或進一歩出現，或治療導致或刺激這些區域的病理狀況，例如心肌梗塞或缺血或影響心臟無力或瘢痕形成的遺傳因素和狀態。有必要提示，本發明使用的方法優於通過移植心肌細胞(42、79)、成骨骼肌細胞，或利用胚胎細胞(100、101)來置換壞死或瘢痕形成心肌的方法。雖然這些嘗試在維持被移植細胞的存活性上是成功的，但它們沒有重建結構和功能上與心室壁的完好部分相整合的健康心肌和冠狀血管。在應激條件下，CSC調節心臟的正常細胞更新，參與受損心室結構和功能的恢復(82、102)。本發明還提供了包括治療有效量的一種或多種引起心肌幹細胞或心肌原始細胞向循環組織或肌肉組織或循環肌肉組織遷移和/或增殖的細胞因子。這種遷移和/或增殖優先應用於處理或治療或預防心肌狀態，例如治療心臟無力或瘢痕形成或防止這樣的區域的出現或治療引起或刺激這些區域的狀態，例如心肌梗塞或缺血或其他情況，例如影響心臟無力或瘢痕形成的狀態。本發明也提供用於這些處理、治療或預防的藥物。本發明進一歩提供包括用於這些處理、治療或預防的一種或多種細胞因子的試劑盒。本發明還提供製備本文所述試劑盒和組合物的方法。本發明進一歩提供用於修復和/或再生最近受損的心肌和/或心肌細胞的方法和/或組合物，其包括投用體千細胞，如成年幹細胞或心肌幹細胞或造血幹細胞或其組合，如成年心肌幹細胞或造血幹細胞或它們的組合，或心肌幹細胞與另一類型幹細胞的組合，例如成年心肌幹細胞與另一類型成年幹細胞的組合。一個方面，本發明提供投用幹細胞之前用於體外培養和/或擴展幹細胞的培養基。本發明進一歩提供用於修復和/或再生最近受損的心肌和/或心肌細胞的方法和/或組合物，其包括投用至少一種細胞因子。本發明進一歩提供用於修復和/或再生最近受損的心肌和/或心肌細胞的方法和/或組合物，其包括與用於處理心肌或血管狀態的藥劑一起聯合投用至少一種細胞因子。本發明進一步涉及用於修復和/或再生最近受損的心肌的方法和/或組合物，其包括投用體幹細胞，如成年幹細胞或心肌幹細胞或造血幹細胞或其組合，如成年心肌或成年造血幹細胞或它們的組合，或心肌幹細胞與另一類型幹細胞的組合，例如成年心肌幹細胞與另一類型成年幹細胞和/或細胞因子的組合。本發明進一歩提供製備前述組合物的方法，其包括將醫藥上可接受的載體與體幹細胞和/或細胞因子混合。本發明還提供包括了修復和/或再生最近受損的心肌和/或心肌細胞的藥物組合物的試劑盒。本發明提供涉及在循環組織或肌肉組織或循環肌肉組織，例如心肌組織，如心臟或血管如進或出心臟的靜脈、動脈，例如直接連接或隨後進入心臟的靜脈和動脈如主動脈中，單獨或與選自幹細胞因子(SCF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞-巨嗜細胞集落刺激因子(GM-CSF)、體細胞衍生因子-1、青灰因子、血管內皮生長因子、巨嗜細胞集落刺激因子、粒細胞-巨嗜細胞刺激因子或白介素-3或任何能夠刺激和/或遷移幹細胞的細胞因子結合(其中"與細胞因子---"可包括依次植入、沉積、投用或引起植入或沉積或投用幹細胞和細胞因子，或共植入或共沉積或共投用或引起共植入或共沉積或共投用，或同時植入、沉積或投用幹細胞和細胞因子)，植入、沉積、投用或引起植入或沉積或投用幹細胞，如成年幹細胞、例如心肌幹細胞或造血幹細胞或其組合，或心肌千細胞(如成年心肌幹細胞)與另一類型的幹細胞(例如另一類型的成年幹細胞)聯合的方法。這種植入、沉積或投用，或引起植入、沉積、投用可與移植結合。這樣的植入、沉積或投用或引起植入、沉積或投用優先被應用於處理或治療或預防心肌狀態，例如處理心臟衰弱或瘢痕形成的區域，或防止這樣的區域出現或進一步出現，或處理引起或刺激這樣的區域，例如心肌梗塞或缺血或其他，例如遺傳和影響心臟衰弱或瘢痕形成的其他病理狀態(也參見上文提到的心肌狀態)。本發明還提供在用於這些處理、治療或預防的藥物配方中，單獨使用或與所說的細胞因子聯合使用幹細胞。因此，本發明還提供用於這樣的處理、治療或預防的藥物，其包括幹細胞和細胞因子。本發明提供包括用於處理、治療或預防的配方中的幹細胞和因子的試劑盒。幹細胞和細胞因子可以包裝在分立的容器或同一個容器中；並且試劑盒可以包括給藥裝置(如注射器)和/或給藥和/或混合指南。本發明也提供包括這些幹細胞和細胞因子的組合物，以及製備這種組合物的試劑盒(如包括幹細胞和細胞因子的試劑盒；幹細胞和細胞因子可以在分立的容器或同一個容器中包裝；並且試劑盒可包括給藥裝置(如注射器)和/或給藥和/或混合指南)，以及製造上述組合物的方法。本發明還提供來自體外的生成和/或再生心肌的方法，其中包括可在細胞因子存在下，體外培養體幹細胞和心臟組織。體幹細胞分化成心肌細胞、平滑肌細胞和內皮細胞，並且體外增殖形成心肌組織和/或細胞。這些組織和細胞可以集合成動脈、小動脈、毛細血管和心肌組織等心肌結構。然後可以將體外形成的組織和/或細胞移植到病人體內，以恢復結構和功能完整性。本發明另外提供產生用於治療動脈或血管阻塞的大血管的方法。這樣的方法可以用於取代傳統的心臟旁路外科方法，或與之結合使用。本發明的方法涉及分離、擴增和活化心肌幹細胞，其中心肌幹細胞是通過與一種或多種細胞因子接觸活化的。然後在阻斷或閉塞部位釋放或植入活化的心肌幹細胞。—再者，本發明提供可用於培養和擴增幹細胞，特別是心幹細胞的生長培養基。還提供可用於活化幹細胞，特別是心肌幹細胞的生長培養基。也可以投用生長於所說的培養基中的未活化的幹細胞，以再生心肌或血管。可投用生長於該培養基中的活化的千細胞以再生心肌或血管，其中血管包括如生物學旁路手術中使用的大動脈和靜脈。本公開中，術語"由-一組成"、"含有"、"具有"等可以有美國專利法中描述的含義，並且可以有"包括"、"包含"等的意思；術語"基本上由---組成"具有美國專利法中描述的含義，並且是開放性的術語，只要所列舉的內容沒有改變基本的或新的特徵，並且不包括現有技術的實施方案，其允許羅列更多。按照美國法典第287巻第(c)(2)(A)(iii)條的規定，本發明的方法被認為是生物技術方法，其提供醫療活動的侵權除外，但並不適用於生物技術專利的實踐。公開了這些和其他實施方案，或者下列詳細描述使這些實施方案更為明顯。下列詳細描述部分藉助實施例描述本發明，但不構成對所述具體實施方案的限制，結合下列附圖可更容易理解本發明。圖1顯示log-log作圖。其中顯示FACS分類(基於c-kit表達)的EGFP轉基因小鼠的Lin—骨髓細胞(c-kitP。s細胞(上框)為6.4%。下框顯示為c-ki卩'"'細胞。c-kitP。s細胞比c-kit^'"細胞亮1-2log);圖2A顯示M1誘導小鼠的組織切片的照片(該照片顯示注射了骨髓Lin—c-kit^s細胞(箭頭)、仍存活的心肌(VM)、和再生的心肌(箭頭)的心肌梗塞(MI)區域。放大12倍)；圖2B顯示放大較高倍數的圖2A的某些組織切片圖，其中給出放大50倍的MI中心區；圖2C、D顯示低倍和高倍放大的、注射了Lin—c-kitPos細胞的MI區域組織切片的照片，其中2C放大25倍，2D放大50倍；圖2E顯示注射了Lin—c-kit,'細胞的MI區域的組織切片的照片，其中只有脊部明顯且放大為50倍(*壞死心肌細胞。紅色為心肌肌球蛋白，綠色為核的PI標記)；圖3A-C顯示MI誘導的小鼠的組織切片的照片，其中顯示注射Lin—c-kitPQs細胞的MI區域(可可見心內膜(EN)向心外膜(EP)再生的心肌部分。所有照片圖均被標記，以顯示心內膜下(IT)和心內膜下多餘心肌細胞(SM)梗塞組織的存在。圖3A被染色以顯示EGFP(綠色)的存在。放大250倍。圖3B染色顯示心肌肌球蛋白(紅色)的存在。放大250倍。圖3C染色顯示EGFP和肌球蛋白(紅-綠色)，以及PI染色的核(蘭色)的存在。放大250倍)；圖4A顯示移植物對心肌梗塞左心室終末舒張壓(LVEDP)、左心室舒張壓(LVDP)、LV+壓力升高速率(dP/dt)和LV-壓力衰變速率(dP/dt)的影響(從左到右框表示假手術的小鼠(S0，n二ll);未注射Lin—c-kitP。s細胞的小鼠(MI，注射Lin—c-kitN":(;細胞的n=5;未注射的n=6);注射Lin—c-kit^s細胞的小鼠。誤差欄是標準差。*t相對於SO和MI，p<0.05);圖4B為顯示心肌和和功能性相關組織中Lin—c-kit^s細胞分化的草圖5A-1顯示MI誘導的小鼠組織切片的照片，其中顯示注射Lin—c-kit^s細胞的MI區域中的再生心肌(圖5A染色以顯示EGFP的存在(綠色)。放大300倍。圖5B染色以顯示小動脈中a平滑肌肌動蛋白(紅色)的存在。放大300倍。圖5C染色以顯示EGFP和a平滑肌肌動蛋白(黃-紅色)，以及PI染色的核的存在(蘭色)。放大300倍。圖5D-F和G-I顯示心肌肌球蛋白陽性細胞中MEF2和Csx/Nkx2.5的存在。圖5D顯示PI染色的核(蘭色)。放大300倍。圖5E染色顯示MEF2和Csx/Nkx2.5標記(綠色)。放大300倍。圖5F染色顯示心肌肌球蛋白(紅色)，以及PI著染的MEF2或Csx/Nkx2.5(核為淺螢光)。放大300倍。圖5G顯示PI染色的核(蘭色)。放大300倍。圖5H染色顯示MEF2和Csx/Nkx2.5標記(綠色)。放大300倍。圖51染色顯示心肌肌球蛋白(紅色)，及PI著染的MEF2和Csx/Nkx2.5標記(核顯示淺螢光)。放大300倍)；圖6(圖6A-F)顯示MI誘導的小鼠組織切片的照片，其中顯示注射Lin—c-kitP。s細胞的MI區域中的再生心肌(圖6A-C顯示已在抗UrdU抗體存在下保溫的組織，圖6A染色顯示PI標記的核(蘭色)。放大900倍。圖6B染色顯示BrdU和Ki67標記的核(綠色)。放大900倍。圖6C染色顯示a-肌節肌動蛋白(紅色)的存在。放大900倍。圖6D_F顯示在抗Ki67抗體存在下保溫的組織。圖6D著染顯示PI標記的核(蘭色)的存在。放大500倍。圖6E顯示BrdU和Ki67標記的核(綠色)。放大500倍。圖6F染色顯示a-平滑肌肌動蛋白(紅色)的存在(紅色)。放大500倍。亮螢光PI與BrdU(C)或Ki67(F)的組合)；圖7(圖7A-C)顯示MI誘導的小鼠組織切片的照片，其中顯示注射Lin—c-kitP。s細胞的MI區域(儘管是邊界帶，但可見與梗塞的未修復組織區域(箭頭)分隔的心肌(VM)和心肌帶(NB)。圖7A染色顯示EGFP的存在(綠色)。放大280倍。圖7B染色顯示心肌肌球蛋白的存在(紅色)，放大280倍。圖7C染色顯示EGFP和肌球蛋白的存在(紅-綠色)，以及PI染色的核(蘭色)。放大280倍)。圖8(圖8A-F)顯示MI誘導的小鼠組織切片的照片，其中顯示注射Lin—c-1<1仁°5細胞的MI區域中的再生心肌(圖8A染色顯示EGFP的存在(綠色)。放大650倍。圖8B是染色顯示心肌肌球蛋白(紅色)的存在。圖8C是染色顯示EGFP肌動蛋白(黃色)，以及PI染色的核(蘭色)的存在。放大650倍。圖8D染色顯示EGFP(綠色)的存在。放大650倍。圖8E染色顯示小動脈中平滑肌肌動蛋白(紅色)的存在。放大650倍。圖8F染色顯示EGFP15和a-平滑肌肌動蛋白(黃-紅色)及PI染色的核的存在(蘭色)。放大650倍)；圖9(圖9A-C)顯示MI誘導的小鼠組織切片的照片，其中顯示注射Linc-kitP。s細胞的MI區域中的再生心肌(箭頭)(其中圖9A染色顯示心肌肌球蛋白(紅色)。放大400倍。圖9B是染色顯示Y線粒體(綠色)。圖9C染色顯示Y線粒體和(淺蘭色)PI標記的核(深蘭)的存在。注意心內膜下和心內膜下其餘心肌細胞(SM)梗塞組織(IT)中缺乏Y線粒體。放大400倍)；圖10(圖10A-C)顯示MI誘導的小鼠組織切片的照片，其中顯示心肌肌球蛋白陽性細胞中的GATA-4(圖10A顯示PI染色的核(蘭色)。放大650倍。圖10B顯示GATA-4標記(綠色)的存在。放大650倍。圖10C是染色顯示與GATA-4和PI(核中的亮螢光)結合的心肌球蛋白(紅色)。放大650倍)；圖11(圖11A-D)顯示MI誘導的小鼠組織切片的照片(圖IIA顯示梗塞和存活組織之間的邊界帶。放大500倍。圖11B顯示再生的心肌。放大800倍。圖11C染色顯示連接蛋白43(黃-綠色)，箭頭顯示心肌細胞之間的接觸。放大800倍。圖llD染色顯示a-肌節肌動蛋白(紅色)和PI染色的核(綠色)。放大800倍)；圖12(圖12A-B)顯示MI誘導的小鼠組織切片的照片，其中顯示注射Lin—c-kit^s細胞的MI區域並顯示再生的心肌(圖8A染色顯示心肌肌球蛋白(紅色)和PI染色的核(黃-綠色)的。放大1，000倍。圖12B如圖12A—樣，但放大700倍)；圖13A-B顯示MI誘導的小鼠組織切片的照片，其中較高倍數放大(80倍-相鄰框)顯示有心肌形成的細胞因子處理的小鼠的大梗塞區(MI)(箭頭)(放大50倍)。圖13B顯示未處理小鼠的MI。醫治包括整個梗塞區(箭頭)(放大50倍)。較大放大倍數下，可見瘢痕形成(80倍-相鄰框)。紅色=心肌肌球蛋白；黃-綠色=核的碘化丙錠標記；蘭色_品紅=1和111型膠原蛋白)；圖13C處理和未處理的MI誘導小鼠的死亡率和心肌再生(細胞因子處理的梗塞小鼠，n=15;未處理的小鼠，n=52。Log-排列實驗:p〈0.0001);圖14為顯示定量測定梗塞面積大小的圖(梗塞或假手術後27天死亡的假手術的(S0，n=9)、梗塞後未治療的(MI，n=ll)和細胞因子處理的小鼠的左心室游離壁(LVFW)中的心肌細胞總數。心肌細胞丟失的百分比與梗塞面積大小一致。X士SD，承與SO相比p〈0.05);圖15A-C為顯示心肌梗塞、心臟解剖和功能的圖(圖15A-C顯示手術後27天死亡的小鼠的LV直徑；假手術的(S0，n=9)、梗塞後未處理的(MI，n=9)和細胞因子處理的梗塞小鼠(MI-C，n=10);16圖15D顯示以超聲波心動描記法(心回波描記術)檢測的EF;(S0，n=9;MI_C，n=9);圖15E-M顯示S0(e-g)、MI(h-j)和MI-C(k-m)的M型超聲波心動圖(新形成的收縮心肌(箭頭))；圖15N是顯示心室壁應力，SO(n=9)、MI(n=8)和MI-C(n=9)(結果以均數土標準差表示)。*林與SO和MI比較p〈0.05);圖16A-G在心肌梗塞、心臟解剖和心室功能方面顯示移植物(圖16A-D顯示SO(n=9)、MI(n=9)和MI-C(n=9)中的超聲波心動描記的LVSD(a)、LVEDD(b)、PWST(c)和PWDT(d)。圖16E-G分別顯示S0(n=9)、MI(n=9)和MI-C(n=10)死亡時解剖測量的腔壁厚度(e)、小室直徑(f)和縱軸(g))。林氺與SO和MI相比p〈0.05;圖16H-P顯示S0(h-j)、MI(k-m)和MI-C(n-p)的兩經向(2D)影象和M模式示蹤；圖17(圖17A-D)圖解顯示心室功能(圖17A-D顯示心肌梗塞或假手術後27天，測得麻醉死亡小鼠的血液動力學;SO(n=9)、M工(n=9)和MI-C(n=10)。符號和統計參見圖13);圖18A-E圖解顯示心肌再生的有關方面(圖18A是MI和MI-C第27天，LVFW組織中仍存活(Re)、丟失(Lo)和新形成(Fo)的心肌組織；SO為沒有梗塞的心肌。圖18B顯示其餘心肌中細胞肥厚量。圖18C顯示再生心肌中的細胞增殖。BrdU和Ki67標記的心肌細胞(M)、EC和SMC;n=ll。***相對於M和EC，p<0.05。圖18D-E圖解顯示所形成的心肌內心肌細胞的數目(n=ll)和類別分布(桶形大小，IOO陶:';n=4，400);圖18F-H顯示MI誘導的小鼠的組織切片照片，可見TER-119標記的紅細胞膜(綠色螢光)；蘭螢光二PI染色的核；紅螢光二MSC中的a-平滑肌肌動蛋白(圖18F放大800倍。圖18G-H放大1，200倍);圖19(圖19A-D)與抗Ki67(A，B)和BrdU(C，D)—起保溫的MI誘導的小鼠組織切片的照片(圖19A心臟肌球蛋白標記的心肌細胞。核的亮螢光反映PI和Kid67的組合。放大800倍。圖19B顯示a-平滑肌肌動蛋白標記SMC。核的亮螢光反映PI與Ki67的組合。放大1，200倍；圖19C顯示a-平滑肌肌動蛋白標記SMC。亮螢光反映PI與BrdU的組合。放大1，200倍。圖19D顯示因子W1標記的新形成的心肌中EC。核的亮螢光反映PI和BrdU的組合。放大1，600倍;圖20(圖20A-F)是MI誘導的小鼠組織切片的照片，顯示分化的心肌細胞的標記(圖20A以巢蛋白染色顯示心肌細胞的標記(黃色))。紅色螢光指示心肌肌球蛋白。放大1，200倍。圖20B染色顯示橋粒蛋白的標記(紅色)。放大800倍。圖20C染色顯示連接蛋白的標記(綠色)。紅色螢光指示心肌肌球蛋白。放大1,400倍。圖20D顯示VE-鈣粘著蛋白，並且黃-綠色螢光反映flk-l標記的EC(箭頭)。放大1,800倍。圖20E顯示EC中因子VDI的紅色螢光，黃-綠色螢光反映flk-1標記的EC(箭頭)。放大1,200倍。圖20F顯示flk-l標記的SMC胞漿(綠色螢光)，和flk-1標記的內皮襯層。紅色螢光指示a-平滑肌肌動蛋白。蘭色螢光指示核的PI標記。放大800倍；圖21A-C顯示MI誘導的小鼠組織切片(圖21A使用亮螢光顯示核的PI標記與Csx/Nkx2.5的結合。放大1,400倍。圖20B使用亮螢光顯示核的PI標記與GATA-4的結合。放大1，200倍。圖20B使用亮螢光顯示核的PI標記與GATA-4的結合。放大1,400倍。圖20C使用亮螢光顯示核的PI標記與MEF2的結合。放大1，200倍(紅色螢光顯示心肌肌球蛋白抗體染色，蘭色螢光顯示核的PI標記。用Csx/Nkx2.5、GATA-4和MEF2標記的心肌細胞核部分分別為63±5%(取樣的核=2，790;N=ll)、94±5%(取樣的核=2,810;N二ll)和85±14%(取樣的核=3,090;N二ll);圖22A-L為顯示TF.常的、生長因子處理的和未處理梗塞心臟中心肌原始細胞的聚焦顯微鏡檢查。圖22A-F顯示假手術小鼠心房心肌的切片。圖22A和B、22C和D、22E和F是顯示不同染色的同一心房心肌區域的成對的聚焦顯微鏡檢查照片。c_kitP°s(22B，綠色)細胞(22B，黃-綠色)中表達了c-Met(22A，黃色)。同樣，MDR1"0S(22D，綠色)細胞(22D，黃-綠色)中檢測到IGF-1R(22C，黃色)。MDR1P0S(22F，綠色)細胞(22F，紅-黃-綠色)中發現共同本地化的c-Met(22E，紅色)和IGF-1R(22E，黃色)。箭頭指出c-kitP°^tlMDRr。s細胞中的c-Met和IGF-1R。心肌細胞胞漿染成紫紅色，並含有心肌肌球蛋白。22G:黃色線分隔生長因子處理小鼠的梗塞心肌(MI)與來自活心肌細胞(蘭色核，只顯示PI)邊界區(BZ)的凋亡心肌細胞(亮核，PI和髮夾1)。MI和BZ中存在活的c-kitP°s細胞(蘭色核，PI;c-kit，綠色)(箭頭)。心肌細胞胞漿染成紅色並含有心肌肌球蛋白。22H:黃色線分隔生長因子處理的小鼠MI與來自活心肌細胞(蘭色核，只顯示PI)BZ的壞死心肌細胞(亮核，PI和髮夾結構2)。MI和BZ中存在活的MDRlP。s細胞(蘭色核，PI;MDRl，綠色)(箭頭)。心肌細胞胞漿染成紅色並含有心肌肌球蛋白。22I和22J:兩支未處理的小鼠梗塞區域中的凋亡心肌細胞(22I和22J，淺核，PI和髮夾1)和c-kit^s(221，綠環)及MDRr。s(22J，綠環)細胞經受凋亡(22I和22J，亮核，PI和髮夾1;箭頭)。可見的細胞有蘭色核(僅PI)。活c-kitP。s細胞存在於梗塞的心肌內(221，綠環，蘭核，只有PI，箭頭)。心肌細胞胞漿染成紅色並顯示有心肌肌球蛋白。22K和22L:生長因子處理小鼠的梗塞心肌(黃色斑點為凋亡的核)存在c-kitP°s(22K，綠環；箭頭)和MDR1P°S(22L，綠環；箭頭)。c-kitP0S(22K)和MDRl"s(22L)細胞中的亮螢光相當於它們的核的Ki67標記。22A-L，欄=10咖。22M和22N圖解顯示手術後7-8小時和投用生長因子(處理的)或鹽水(S0，未處理的)後2-3小時處死的，假手術(S0)、梗塞後處理的(治療的)和梗塞後未處理的(未治療的)小鼠心臟各區域中的存活和死亡的c-kitP°s(22K)和MDRr。s(22L)細胞。縮寫詞如下A，心房；LV，左心室；R，遠離梗塞的活心肌細胞；B，梗塞周邊的活心肌細胞；I，非存活的梗塞心肌。22M和22N中的結果以均數士標準差表示。***表示與S0和處理的相比p<0.05。圖23A-B圖解顯示梗塞的大小並估計左心室血液動力學。結果以均數士標準差表示。***表示對假手術小鼠和(SO)為未處理梗塞小鼠(MI)的顯著性分別p〈0.05。縮寫詞如下MI-T，處理的梗塞小鼠；LV，左心室和隔。23A:根據左心室和隔膜中心肌細胞的丟失檢測梗塞面積以儘可能地減小存活心肌和治癒壞死區心肌肥大對梗塞大小的影響。這種檢測不取決於活組織和壞死心肌皺縮(因瘢痕形成引起)的反應性肥大(87)。23B:根據LV末端舒張壓、左心室舒張壓、LV舒張壓、LV+dP/dt和LV-dP/dt的數據估計VL血液動力學。23C至23H顯示未處理的(23C和23D)和處理的(23E和23H)小鼠左心室大梗塞區的聚焦顯微照片。圖23D、23F和23H(欄4.mm)以較高放大倍數顯示由23C、23E和23(欄4mm)中的框限定的區域。圖23C和23D顯示因壁的梗塞區中有I和II型膠原蛋白(蘭色)聚集而缺少心肌再生(箭頭)。多餘心肌細胞和炎性細胞的核很明顯(綠色，PI)。心內膜下存在小的活心肌細胞層(紅色，心肌肌球蛋白)。23E-H中，心肌肌球蛋白抗體的紅色螢光顯示心肌細胞再生。在梗塞區中檢測到小的I型和III型膠原蛋白積聚灶(蘭色，箭頭)。核為黃-綠色(PI)。縮寫詞如下IS，心室內隔膜；MI，心肌梗塞；RV，右心室。圖24顯示冠狀動脈結紮前和結紮後15天，單個小鼠心臟的超聲心動描記結果。聚焦顯微鏡術顯示同一心臟的切片。24A顯示心臟結紮前的基線超聲心動描記結果。24B和24C顯示24A和24D中評估的心臟切片的低倍(24B，欄4mm)和高倍(24C，欄=0.lmm)放大的聚焦顯微照片。所使用的縮寫詞是RV，由心室；IS，心室內隔；MI，心肌梗塞。24D顯示梗塞後15天同一心臟收縮功能的超聲波心動描記(箭頭)。24E圖解顯示射血分數，結果以均數士標準差表示。***表示分別與假手術小鼠(S0)和未處理的梗塞小鼠(MI)相比p<0.05。MI-T是指處理的梗塞小鼠。圖25A-F是揭示再生心肌的性質的聚焦顯微鏡照片。圖24G-J中，這些性質是定量的。25A和25B顯示酶裂解的再生部分的心肌細胞，和細胞因子處理的梗塞心室的存活心肌。25A染色顯示小心肌細胞(紅色，心肌肌球蛋白)、亮核(PI和BrdU)和蘭核(只PI)。25B顯示大的、肥厚的心肌細胞(紅色，心肌肌球蛋白)、亮核(PI和BrdU)和蘭色核(只PI)。25A和25B中，欄距等於50Mm。顯示生長因子處理的小鼠梗塞後，新的(25C和25)和其餘(25E和25F)心肌細胞的機械性質。R是指這些心肌細胞的舒張狀態，C是收縮狀態。給出N(新的小心肌細胞)和S(其餘的肥厚心肌細胞)的結果，顯示對細胞縮短(G)、縮減速度(H)、峰值縮短時間(I)和50%再延長時間(J)的刺激作用。結果以均數土標準差表示。承表示與S相比p〈0.05。圖26顯示成對的聚焦顯微鏡檢照片，其中顯示成熟心肌細胞的各種標誌(26A-N，欄距二10mm)。在圖26A-F，圖26A、26C和26E中的BrdU標記顯示為綠色，並且顯示再生心肌切片的心肌細胞中的巢蛋白(26B，紅色)、橋粒蛋白(26D，紅色)和心肌肌球蛋白(26F，紅色)的定位。26B、26D和26F中的核僅被PI標記(蘭色)，並且26G、26D和26F中則被BrdU和PI—起標記(亮的)。26G-N顯示發育的心肌(26G-26J)和分離的心肌細胞(26K-N)的切片中鑑定的肌聯蛋白43(26G、2626K和26H，黃色)和N-鈣粘著蛋白(261、26J，26M和26N，黃色)。心肌細胞被心肌肌球蛋白著染(26H、26J、26M和26N，黃色)，並且核只被BrdU著染(26G、261、26K和26M，綠色)、只被PI(26H和26J，蘭色)著染和被BrdU與PI—起著染(26H、26J、26L和26N，亮的)。圖27是顯示新形成的冠狀血管的一系列聚焦顯微照片。圖27A-27D中，顯示帶有TER-119標記的紅細胞膜(綠色)，PI染色的核(蘭色)，和平滑肌細胞著染的a-平滑肌肌動蛋白(紅色)。所有顯微照片中，欄距等於10Mm。圖28:免疫磁珠(a)和FACS(b)得到的心肌Lin—c-kit^s細胞的鑑定和生長。A，b，Lin—c-kitP。s細胞在NSCM中被評定為心肌細胞譜系的胞漿蛋白陰性；顯示PI染色的核(蘭色)和c-kit抗體標記的c-kit(綠色)。c-f，在DM和PI中，由紫色剛螢光顯示培養的細胞，它們的核顯示Nkx2.5(c)、MEF2(d)、GATA-4(e)和GATA-5標記。G、h、NSCM選擇幹細胞並以低密度(g)發育成小的單個克隆(h)。欄距-10Wn。圖29:克隆細胞的自身更新和多潛能。a，克隆中的c-ki卩。s細胞核=蘭色，c-kit=綠色(箭頭)。B，3個中的兩個c-kitPQs細胞(綠色，箭頭)在核(蘭色)中表達Ki67(紫色，箭頭)。c，d,Ki67陽性(c)中期染色體(紅色)。d，c-kitP。s細胞細胞中，由Ki67和PI(紫色)標記的中期染色體。e-h,克隆中，M(e)、EC(f)、SMC(g)和F(h)分別被心肌肌球蛋白、因子VEI、a-平滑肌肌動蛋白和波形蛋白著染。核=蘭色。存在Lin—c-kitP。s細胞(綠色，箭頭)。欄距=10陶。圖30:克隆發生細胞和球形克隆。a，NSCM懸液中的球形克隆(箭頭)。b，克隆內的20C-kitP。s和陰性細胞簇。核=蘭色。c，有包裝的細胞核(蘭色)和大量巢蛋白(紅色)的球形體。d，球形體內聚集未降解的巢蛋白(紅色)。核=蘭色。e，將球形體鋪敷MD中，其中有移出圓的細胞。f-h，遷移出球形體並分化的M(f)、SMC(g)和EC(h)具有分別被心肌肌球蛋白、因子VI、a-平滑肌肌動蛋白著染的胞漿(紅色)。核=蘭色。欄=10剛。圖31:心肌修復。a-c，梗塞後治療的大鼠(MI)的心肌生成(a，b，箭頭)。新的M=肌球蛋白(紅色)；核=黃_綠色。注射位點(箭頭)。c，梗塞未治療大鼠的心肌瘢痕形成(蘭色)。*多餘的心肌細胞。d-l，M(f，肌球蛋白)和冠狀血管(i，EC二因子WI;1，SMC二d-平滑肌肌動蛋白)被BrdU(綠色)陽性細胞(e，h，k)識別。蘭色核二PI(d，g，j)。m-t，心肌細胞在第20天(o，p，s，t)比第10天(m，n，q，r)分化得更好。m-p:肌聯蛋白43=黃色(箭頭)，q-t:N-鈣粘著蛋白二黃色(箭頭)；肌球蛋白二紅色。核二蘭色。BrdU二綠色(箭頭)。欄距^mm，100,，10Mffl(d-t)。圖32:新產生的心肌細胞。a，酶裂解的來自再修復心肌帶的細胞。心肌細胞=紅色；核=蘭色。b-e，新心肌細胞的分化。肌聯蛋白43=黃色(b，c);1鈣粘著蛋白=黃色(d，c);心肌肌球蛋白=紅色。BrdU=綠色；核=蘭色(箭頭)。欄距=10陶。圖33:心肌細胞的機械性質。a-d，分別由梗塞後治療的大鼠的再生的，和餘留心肌得到的新的(N)和多餘(S)的心肌細胞；1^=舒張的，C—夂縮的。e-h，對N(e，h)和S(f，h)心肌細胞的細胞縮短和縮短速度的刺激作用。i-1，結果以均數土標準差表示。*表示與S相比p〈0.05。圖34:大鼠心臟中的原始細胞。月齡為22個月的Fisher大鼠的左心室心肌切片，A，碘化丙錠(PI)蘭色螢光顯現的核。B，綠色螢光記錄c-kit陽性細胞，C，綠色和蘭色螢光顯示PI和c-kit的組合。a-平滑肌肌動蛋白抗體著染的紅色螢光識別心肌細胞胞漿。聚焦顯微鏡術；欄距=10陶。圖35:c-kit"s細胞的FACS分析。得自雌性Fisher344大鼠左心室心肌細胞的二元分酉己，顯示與細胞DNA相比c-kit的表達水平。細胞以107ml懸浮在PBS中。用ELITEESP流式細胞儀/細胞分選儀(CoulterInc.)檢測細胞螢光，其中使用與氦-鎘雷射結合的氬離子雷射(488nm發射)，發射紫外光。箭頭指示c_kit的最小域值再生水平。為了進行FACS分析，將細胞與藻紅素(R-PE)結合的大鼠單克隆c-kit抗體(Pharmingen)—起保溫。使用R-PE異型標準品作為陰性對照。圖36:NSCM(B)中，心肌c-kitP。s細胞(A)和心肌c-kit"s細胞培養物的收集方法。A，使表達c-kit表面受體的未增殖細胞與c-kit抗體接觸，然後再與包被了IgG抗體21的免疫磁珠接觸。用磁力收集細胞並在NSCM中培養。B，免疫磁珠連接到c-kitP。s細胞的表面(箭頭)。顯現不存在c-kitPQs細胞。相差顯微鏡；欄距=10,。圖37:用免疫磁珠收集的新分離的細胞中的c-kit蛋白質。c-kit抗體的綠色螢光顯示c-kit蛋白質。紅色螢光顯示附著於細胞上的小珠。蘭色螢光反映核的PI標記。因此，發現用磁珠分離的細胞是C-kitPGs細胞。聚焦顯微鏡術；欄距=10陶。圖38:心肌細胞分化的轉錄因子。除去磁珠後，或FACS分離後立即進行塗片和細胞染色，以檢測Nkx2.5、MEF2和GATA-4。面板A_C中的蘭色螢光相當於核的PI標記。核中的紫色螢光反映Nkx2.5(A)、MEF2(B)和GATA-4(C)的表達。聚焦顯微鏡術；欄=10陶。圖39:骨骼肌分化的c-kitP。s細胞和轉錄因子。面板D-F用核內(紅色螢光，PI標記)的綠色螢光顯示MyoD(D)、肌細胞生成素(E)和Myf5(5)的陽性對照(C2C12成肌細胞系)。c-kitP。s細胞的這些骨骼肌轉錄因子為陰性。聚焦顯微鏡術；欄距-10陶。圖40:c-kitPQs細胞在分化培養基(DM)中的生長。會合細胞單層得自鋪板的c-kitP。s細胞。用DNA酶I輕輕消化以除去免疫磁珠。該步驟降解磁珠和抗IgG抗體間的短DNA接頭。相差顯微鏡術；欄距=20剛。圖41:DM中的成環細胞核。該視野中的大部分核中表達了Ki67(紫色螢光)。蘭色螢光反映核的PI標記。聚焦顯微鏡術；欄距=10陶。圖42:c-kitPQs衍生的細胞的生長速率。細胞在P2和P4時的指數生長曲線；t，細胞數目倍增所需要的時間。每個點相當於5或6次對檢測。垂直欄，SD。圖43:心肌Lin—c-kitP。s細胞的鑑定和生長。在P3期的DM中，M(A)、SMC(C)和EC(D)分別被心肌肌球蛋白、因子VIII、a-平滑肌肌動蛋白和波形蛋白(因子W1陰性)著染。核=紅色。欄距=10剛。圖44:神經細胞的胞漿標誌。面板A-C顯示Pl期DM中的細胞(紅色螢光，a-平滑肌肌動蛋白；紅色螢光，PI標記)。面板D-F以胞漿(蘭色螢光，PI標記)中的綠色螢光顯示MAPlb(D，神經原2A細胞系)、神經微絲200(E，神經原細胞系)和GFAP(F，III型星形膠質細胞，克隆C8-D30)的陽性對照。對於這些神經蛋白質，c-kitP。s衍生的細胞為陰性。聚焦顯微鏡術；欄距=10剛。圖45:成纖維細胞的胞漿標誌。面板A-C顯示NSCM中未分化的細胞(綠色螢光，c-kit;蘭色螢光，PI標記)。面板D-F以胞漿(蘭色螢光，PI標記)中的紅色螢光顯示纖連蛋白(D)、I型原膠原蛋白(E)和波形蛋白(F)的陽性對照。聚焦顯微鏡術；欄距=10陶。圖46:FACS分離的c-kit細胞克隆發生細胞的多潛能性。克隆中，M(A)、EC(B)、SMC(C)和F(D)分別被心肌肌球蛋白、因子VIl、a-平滑肌肌動蛋白和波形蛋白著染。蘭色螢光為核的PI標記。呈現Lin—c-kit^s細胞(綠色螢光，箭頭)。聚焦顯微鏡術；欄距=10亂圖47:早期分化階段的心肌細胞譜系。A，B，早期分化的細胞胞漿中巢蛋白(nestin)克隆(綠色螢光)的表達。C，D，發育的細胞(箭頭)中巢蛋白(綠色，C)和心肌肌球蛋白(紅色，D)的表達。E，F，發育的內皮細胞(箭頭)中巢蛋白(綠色，E)和因子VEI(紅色，F)的表達。G，H，發育的平滑肌細胞(箭頭)中巢蛋白(綠色，G)和a-平滑肌肌動蛋白(紅色，H)的表達。聚焦顯微鏡術；欄距=10陶。圖48:梗塞大小和心肌修復。A，第10天，冠狀動脈阻塞導致未處理和處理的大鼠左心室心肌細胞數分別丟失49%和53%。第20天，冠狀動脈阻塞導致未處理(MI)和處理的(Ml-T)大鼠左心室心肌細胞數分別丟失55%和70。/。。S0，假手術的動物3與SO相比p〈0.05。B，經細胞移植(MI-T)處理的動物，冠狀動脈阻塞後第IO和20天(d)，心室壁梗塞區域內新形成的心肌的百分比。*對10天？〈0.05。C，D，形態學檢測細胞移植後第10和20天新形成的心肌的量(實線欄)。陰影欄和交叉陰影欄分別顯示梗塞後保留的(R)和丟失的(U心肌層。生成的組織(F)以同樣量增加了保留心肌(R+F)，並減少了丟失心肌(L-F)。因此，心肌修復減小了各組經細胞移植處理的大鼠的梗塞面積。承與MI相比p〈0.05。卞與Ml-T中Lo和Fo相比p<0.05。圖49:心肌修復。A，B，兩隻處理的梗塞心臟中的再生心肌帶。紅色螢光相當與心肌肌球蛋白著染的新形成的心肌細胞。黃綠色螢光反映核的PI標記。蘭色螢光(箭頭)顯示心室壁梗塞區域內膠原蛋白的積聚灶。聚焦顯微鏡術；欄距二100剛。圖50:毛細血管的新生物。根據內皮細胞的BrdU標記識別移植細胞在毛細血管中的分化。A，核的Pl標記(蘭色)；核的BrdU標記(綠色)。C，BrdU標記的Brdli標記的毛細血管內皮(紅色)和內皮細胞核(蘭色和綠色)。聚焦顯微鏡術；欄距=10陶。圖51:再生心肌的體積組成。間隔10和20天期間，心肌細胞(M)、毛細血管(Cap)(和小動脈(Art)的體積分別增加25%、62%和140%。相反，I型(C-I)和III型膠原蛋白(C-m)的百分體積分別減少73%和71%。結果以均數士標準差表示。*表示相對與第10天p<0.05。圖52:再生心肌的細胞增殖。間隔10和20天期間，心肌細胞(M)、內皮細胞(EC)和平滑肌細胞(SMC)的部分分別增加25%、62%和140%。相反，I型和III型膠原蛋白的百分體積分別減少73%和71%。結果以均數士標準差表示。*表示相對於第10天p<0.05。圖53:BrdU標記對再生心肌細胞的識別。A，D，PI的蘭色螢光顯示核。B，E，綠色螢光顯示核的BrdU標記。C，F，用a-心臟輔肌動蛋白(C)或a-肌節肌動蛋白(F)的紅色螢光識別心肌細胞胞漿。在新的心肌細胞中，暗和亮蘭色螢光反映心肌細胞核的PI和BrdU標記的組合(C，F)。聚焦顯微鏡，欄距=10,。圖54:時間對新形成的心肌細胞數目和體積的影響。在10至20天的間隔期間，發育的心肌細胞顯著增加了大小。但細胞數目基本上保持恆定。第20天比10天大小分布寬。圖55:時間對新形成的冠狀血管發育的影響。10至20天期間，新形成的小動脈(Art)和毛細血管的數目密度顯著增加。結果以均數土標準差表示。*表示與第IO天相比p<0.05。圖56:梗塞心室中多餘的心肌細胞。A，B，從左心室和心室內間隔保留的活組織中分離的肥大心肌細胞。紅色螢光相當於心肌肌球蛋白抗體染色，蘭色螢光相當於PI染色。細胞邊緣的黃色螢光反映連接蛋白(A)和鈣粘著蛋白(B)。聚焦顯微鏡術；欄距=10剛。圖57:細胞移植和超聲波心動描記。心肌再生減小了心肌擴張(A)，對壁的厚度和存活蛋白質沒有影響，增加了心室梗塞區域的厚度(C)並改善射血分數(D)。SO假手術；MI二未處理的梗塞；MI-T二處理的梗塞。結果為均數土標準差。傘與S0相比p〈0.05，林與MI相比p<0.05。圖58:超聲波心動描記示蹤。未處理的(A-C)和處理的梗塞大鼠(D-F)的二維影象和M型示蹤。面板A和D相當於冠狀動脈阻塞前的基線條件。面板B和D相當於手術後9天，沒有(B)或存在(D)CPC注射。面板C和F相當於手術後19天，沒有(C)或存在(F)CPC注射。面板F顯示收縮的再現(箭頭)。在本說明書實施例9的B部分(心肌梗塞和細胞移植)中，可以找到對該的支持。.圖59:心室功能和壁壓。細胞移植改善了心室功能，並減小了梗塞後心室壁的舒張壓。SO二假手術；MP未處理的梗塞；MI-T處理的梗塞；LVEDP左心室終末舒張壓；LVDP二左心室舒張壓，+dP/dt壓力升高速率；-dP/dt二壓力衰減速率。結果為均數土標準差。*與SO相比p〈0.05，**與MI相比p<0.05。圖60:正常心肌的細胞移植。在P2期給假手術大鼠注射BrdU標記的細胞。20天後，只鑑定出很少未分化的細胞。A，C，綠色螢光顯示核的BrdU標記。B，D，a-心肌肌動蛋白的紅色螢光識別心肌胞槳。PI的蘭色螢光顯示核。注射的細胞中(箭頭)，亮蘭色螢光反映PI與BrdU標記的結合(B，D)。聚焦顯微鏡術；欄距-10Mffl。圖61和62。遷移和侵入檢測。結果表示為均數士標準差。*是指統計學顯著性差異，即沒有接觸生長因子的細胞P<0.05。圖63:基質金屬蛋白酶活性檢測。由明膠受體所得到的凝膠的數碼照片。圖64:顯示表達生長因子受體的原始細胞。顯示在手術後7-8小時和投用生長因子(處理的)或鹽水(S0，未處理的)後2-3小時處死的假手術(S0)、梗塞處理(處理的)和梗塞後未處理(未處理的)的小鼠，心臟各個區域中c-kit^s和MDRr"s細胞上c-met的分布。這些檢測包括將要壞死的c-kitP°1nMDRr。s細胞。所使用的縮寫詞如下A，心房；LV，左心室；R，遠離梗塞的活的心肌；B，鄰近梗塞的活的心肌；I，未存活的梗塞心肌。結果均表示為均數士標準差。圖65:顯示循環原始細胞的定位。顯示在手術後7-8小時和投用生長因子(處理的)或鹽水(S0，未處理的)後2-3小時處死的假手術(S0)、梗塞後處理(處理的)和梗塞後未處理(未處理的)的小鼠，心臟各個區域中活的Ki67標記的C-kitP°lBMDRr's細胞的百分數。所使用的縮寫詞如下A，心房；LV，左心室；R，遠離梗塞區的活的心肌；B，鄰近梗塞區的活的心肌；I，未存活的梗塞心肌。結果均表示為均數士標準差。圖66:顯示非循環(實線)和循環的(虛線；Ki67Y陽性核)心肌細胞的DNA含量分布頻率。新的和老的心肌細胞均顯示相當於2n個染色體的染色質。大於2n的DNA含量限於循環核。所檢測的非循環核展現與二倍體心肌細胞差不多的螢光強度。取樣包括600個新的心肌細胞，1000個老的心肌細胞和1000個淋巴細胞。圖67:顯示心肌梗塞對心臟解剖和舒張負載的影響。結果以均數土標準差給出。***表示與假手術小鼠(S0)和未處理的梗塞小鼠(MI)相比p〈0.05。MI-T是指處理的梗塞小63眠。圖68:顯示心肌細胞大小的頻率分布。在橋粒蛋白和層粘連蛋白抗體及PI染色的切片中，檢測新產生的心肌細胞的體積。只包括有中心核的縱向排列的細胞。收集每個心肌細胞(假設為圓桶形狀)中核的長度和直徑以計算細胞體積。每個心臟檢測400個細胞。圖69:顯示心肌修復。基於假手術(SO)小鼠LV的體積和梗塞大小，未處理的小鼠為42%，處理的小鼠(MI-T)為67%,計算兩組梗塞的小鼠(圖9)將保留(R)和註定要丟失(L)的心肌體積。定量檢測處理的小鼠新形成心肌的體積。心肌再生增加了保留的心肌的體積，並以同樣量減少了心肌丟失的體積。因此，處理的小鼠的梗塞面積減小了15%。圖70A-J:分離和培養人心肌祖細胞的顯微照片。接種人心肌樣品以長出心肌(A和B);大約第2周，移出環繞中心定位的細胞簇。呈現c-kit陽性(C;波形蛋白，綠色)、MDR1(E，品紅，箭頭)和Sca-l樣蛋白(F，黃色，箭頭)。有些核表達GATA4(H，，品紅)，MEF2C(F，品紅)。在過度生長的細胞和小的c-kitP。s細胞(綠色，箭頭)中，檢測出心肌細胞(G，a-肌動蛋白，紅色)、SMC(H，a-SM肌動蛋白，品紅)、EC(I;威勒布拉特因子，黃色)以及神經微絲200(J，白色)陽性細胞。圖72:人c-kitP"s細胞再生梗塞的心肌。72A-C是顯微照片。72A顯示注射人c-kit1^s細胞並於21天後處死的免疫缺陷小鼠的梗塞心臟。大的橫切片顯示梗塞內有一個再生的心肌帶(箭頭)。BZ，邊緣區。下板中以高倍放大顯示包括在矩形中的兩個區域。核中的綠色螢光斑點顯示新形成的心肌細胞中Alu探針的定位。肌節肌動蛋白識別新形成的心肌細胞(紅色，箭頭)。碘化丙錠標記心肌細胞核(蘭色)。星點指示多餘的心肌細胞。B和C:在免疫缺陷小鼠(B)和免疫抑制大鼠(C)中，梗塞並注射人細胞後21和14天再生心肌細胞的實例。a-肌節肌動蛋白鑑定新形成的心肌細胞。Alu(綠色)和BrdU(白色)標記心肌細胞核。星點指示多餘的小鼠和大鼠心肌細胞。72D包括顯示加樣流程的蘇木精和伊紅(H-E)染色的切片；也提供用於檢測再生的梗塞心肌中的人DNA的凝膠照片；人血液(人)和完整的大鼠心肌(大鼠)作為陽性和陰性對照。梗塞心肌中的大鼠MLC2vDNA的信號反映壁的心內膜下和/或心外膜下區域多餘心肌細胞的存在(參見圖72A-C)。72E和F，以及G和H顯示同一視野的顯微照片。新形成的心肌細胞(E-H;肌鈣蛋白I，qdot655，紅色)表達GATA4(E;qdot605，黃色。層粘連蛋白qdot525，白色)。用Alu標記心肌細胞核(F和和；綠色)。用心肌肌球蛋白重鏈檢測發育的心肌細胞之間的連接蛋白43(1，qdot605，黃色，箭頭)和N-鈣粘著蛋白(J，qdot605，黃色，箭頭)。這些結構是Alu陽性的。某些新形成的心肌細胞顯現肌節紋路(E-J)。A，B，E，F，I，J:梗塞的免疫缺陷小鼠，細胞移植後21天。C，D，G，H:梗塞的免疫抑制大鼠，細胞移植後14天。圖73:73A-F和H是顯示冠狀微血管和細胞融合的顯微照片。人冠狀小動脈具有SMC層(A-C，a-SM肌動蛋白，qdot655，紅色)。在D中，威勒布拉特因子顯示C中小動脈的內皮襯層(qdot605，黃色)。E和F:人毛細血管(威勒布拉特因子，qdot605，黃色)。用Alu標記核(A-F，綠色)。73G顯示人心肌血管發生的程度。結果為均數土標準差。H:可見再生心肌中的人X染色體(白色斑點，箭頭)和梗塞中部區域的血管。在接近再生的人心肌細胞的邊緣區，心肌細胞中存在小鼠X染色體(品紅斑點；箭頭)。除細胞融合外，核有不超過2個人X染色體。圖74:心肌再生和心臟功能。74A-C顯示透壁梗塞的顯微照片。74A中顯示未處理大鼠的透壁梗塞(箭頭)；下面板中以較高放大倍數顯示矩形區域。死亡的心肌細胞沒有核(死的，a-肌節肌動蛋白，紅色)。結蹄組織細胞核(蘭色)。超聲心動圖顯示壁的梗塞區缺乏收縮(箭頭)。B:處理的大鼠的透壁梗塞(箭頭)；下面板中以較高放大倍數顯示矩形區域。人心肌細胞(a-肌節肌動蛋白，紅色)由ALu標記(綠色)。超聲心動圖顯示壁的梗塞區域中存在收縮(箭頭)。面板C以較高放大倍數顯示處理的大鼠另一個梗塞透壁區域(箭頭)，其中以Alu(綠色)標記梗塞中部區域再生的人心肌細胞(a-肌節肌動蛋白，紅色)。超聲心動圖顯示壁的梗塞區域中存在收縮(箭頭)。74D是圖解顯示增加了突出部分的處理的大鼠心臟的心肌再生。如前面指出的，只使用超聲心動術檢測處理小鼠的收縮。"74E和F顯示心肌再生對梗塞心臟解剖和功能的影響。數據以均數士標準差給出。*t分別與so和MI比較p<0.05。圖75:顯示C-kit^s細胞的多潛能性。C-kitP。s細胞在各個不同的代(P)均能夠獲得心肌定型(GATA4陽性)並產生心肌細胞(a-肌節肌動蛋白陽性)、SMC(a-MS肌動蛋白陽性)和EC(威勒布拉特因子陽性)。結果以均數士標準差給出。圖76:超聲心動圖顯示再生人心肌細胞的特徵。梗塞和移植人心肌細胞後再生的心肌細胞和冠狀小動脈；存在新形成的心肌細胞(A;心肌肌球蛋白重鏈，紅色)、SMC(B，D，E;a-MS肌動蛋白，品紅)禾QEC(C，F，G;威勒布拉特因子，黃色)。白色螢光顯示心肌細胞之間層粘連蛋白的分布(A)。面板D和E以及面板F和G顯示同一視野。存在分散的SMC(D和E;箭頭)和EC(F和G箭頭)。分別在SMC和EC中檢測到GATA6(D;核中的紅色點)和Etsl(F;核中的品紅點)。這些結構是Alu探針陽性的(綠色)。A-G:梗塞的免疫缺陷小鼠，細胞移植後21天。圖77:顯示人心肌細胞的體積。梗塞小鼠和大鼠新形成的人心肌細胞的大小分布。圖78:為顯示功能性感受態人心肌的顯微照片。處理的小鼠的透壁梗塞(箭頭)，其中梗塞中部區域的再生人心肌細胞是a-肌節肌動蛋白陽性(紅色)。以Alu探針標記(綠色)人細胞核。超聲心動圖顯示壁的梗塞區域存在收縮(箭頭)。圖79:活化的CSC的返巢和移入。a，梗塞後24小時，表達EGFP的、GM活化的移生CSC的注射位點。12小時，有些活化的CSC是TdT標記的(b;品紅，箭頭)，24小時，有幾個細胞為周期蛋白Ki67陽性(c;白色，箭頭)。d，注射後12、24和48小時活化的CSC細胞的凋亡和增殖速率。數據以均數土標準差表示。林與24小時相比p〈0.05。e，梗塞並注射細胞後48小時，在EGFP陽性心肌祖細胞(箭頭)之間，和EGFP陰性受體細胞(箭頭)之間表達連接蛋白43、N-鈣粘著蛋白、E-鈣粘著蛋白和L-選擇蛋白(白色)；心肌細胞被a-肌節肌動蛋白(紅色)著染，成纖維細胞被前膠原著染(黃色)。f，凋亡的EGFP陽性細胞(TdT，品紅，箭頭)沒有表達L-選擇蛋白(白色)。g，在完整的非梗塞心臟中，移植後一個月GM活化的移生CSC的注射位點，EGFP陽性(綠色)。核被PI著染(蘭色)。圖80:血管再生。a，2周時梗塞後處理的心臟顯示定位於多餘心肌(箭頭)和邊緣帶(BZ，箭頭)內的新形成的冠狀血管(上面板，EGFP，綠色)。也可見分支血管(開口箭頭)。下面板(橘黃色)顯示EGFP和ci-平滑肌肌動蛋白(a-SMA)的定居。指出了血管的小直徑。直徑為180陶的血管有內部彈性層狀體(插入；IEL，品紅)。在先存在的冠狀血管是EGFP陰性(上面板)和a-SMA陽性的(下面板，紅色，星號)。注射位點(SI)存在EGFP陽性細胞簇。a-肌節肌動蛋白(a-SA)標記心肌細胞。b，2周時，心外層多餘的心肌含有幾個大的再生冠狀動脈(上面板，EGFP，綠色)，其表達EGFP和a-SMA(下面板，EGFP-a-SMA，橘黃色)。c，壁的中央區域梗塞的心肌顯示再生的中間體和小冠狀動脈(上面板，EGFP，綠色)，其表達EGFP和a-SMA(下面板，EGFP-a-SMA，橘黃色)。d，心臟中血管形成的量度，數值為均數士標準差。e，再生的冠狀動脈中SMC和EC顯示最多有兩個X-染色體。EGFP-a-SMA，橘黃色。X-染色體，白色斑點。圖81:新形成的冠狀血管是有功能活性的。a-f，2周(a-c)和一個月(d-f)時，位於處理的大鼠心外膜層的活的(a，f)和梗塞的(b-e)心肌中，大冠狀動脈和其分支含有若乃,標記的葡聚糖(紅色)，並具有EGFP陽性壁(綠色)。在活的心肌的梗塞區(b-e)和大多數血管周圍(a，f)富含膠原蛋白(蘭色)。指出了血管直徑。面板e中血管和其分支被EGFP陽性細胞環繞，其位於梗塞的心肌內。面板f證明新形成的血管(EGFP陽性壁，綠色)與定居血管(EGFP陰性壁)的功能性整和。白色環界定吻合位點。g，心室解剖和梗塞大小。h，心室功能。左心室終末舒張壓、LVEDP、LV舒張壓和LVDP。數據以均數土標準差表示。未治療的心肌梗塞，MI。治療的心肌梗塞，MI-T。圖82:實驗程序。結紮左前降支冠狀動脈(LAD)，誘導持久性冠血管阻塞。利用兩種形式的處理1，注射總共80,000-100,000個克隆發生的EGFPP°sc-kiV'，SC(未活化的CSC);注射體內移植前每2小時體外用GF預處理的EGFPp°sc-kitP°sCSC。在結紮線的上方、外側和下面，以及遠離邊緣帶(BZ)的多個位點(黑色點)注射。MI，心肌梗塞。圖83:心肌幹細胞死亡。a，注射後24小時，許多克隆發生的EGFP陽性(綠色)CSC被TdT標記(品紅，箭頭)。核被碘化丙錠標記(PI，蘭色)。b，注射後12、24和48小時凋亡和增殖的速率。數值為均數士標準差。圖84:血管再生。a，一個月時，心外膜層的多餘心肌細胞含有幾個大的再生冠狀動脈(上面板，EGFP，綠色)，其表達EGFP和a-SMA(下面板，EGFP-a-SMA，橘黃色)。b，心室壁中間區域的梗塞心肌顯示有再生的大的中間體和小的冠狀動脈(上面板，EGFP，綠色)，其表達EGFP和a-SMA(下面板，EGFP-a-SMA，橘黃色)。c，梗塞心肌中的表達EGFP(綠色)和威勒布拉特因子的再生毛細血管被EC特異性植物凝集素標記(白色)。詳細描述本發明提供包括治療有效量的體幹細胞，或與選自幹細胞因子(SCF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞-巨嗜細胞集落刺激因子(GM-CSF)、體細胞衍生因子-1、青灰因子、血管內皮生長因子、巨嗜細胞集落刺激因子、粒細胞-巨嗜細胞刺激因子、肝細胞生長因子(HGF)、胰島素樣生長因子或白介素-3或任何能夠刺激和/或遷移幹細胞的細胞因子結合的方法和/或藥物組合物。細胞因子可以單獨或與任何能夠刺激和/或遷移幹細胞；維持早期和晚期紅細胞生成(見下述)；活化單核細胞(見下述)、巨嗜細胞/單核細胞增殖；維持細胞增殖、遊動性和存活(見下述)；處理心肌或血管狀態的其他細胞因子或藥劑，以及醫藥上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑(包括其組合)聯合投用。本發明也提供包含引起心幹細胞或心原始細胞遷移和/或增殖成循環組織或肌肉組織或循環肌肉組織，例如心肌組織，如心臟或血管，例如進或出心臟的靜脈、動脈，如直接相接或隨後進入心臟的動脈，例如主動脈的治療有效量的一種或多種細胞因子的方法和/或藥物組合物。在一個優選方面，包括藥物組合物在內的方法和/或組合物含有治療有效量的兩種或多種細胞因子。更具體地說，該方法和/或組合物較好含有有效量的肝細胞生長因子和胰島素樣生長因子。本發明藥物組合物中的細胞因子，也可以包括已知參與維持早期和晚期紅細胞生成的介體，例如ct-lL-l和e-Ll-l、IL-6、IL-7、IL-8、IL11和IL-13;集落刺激因子、血小板生成素、紅細胞生成素、幹細胞因子、jit3配體、肝細胞生長因子、a腫瘤壞死因子、白血病抑制因子、轉化生長因子e1和P-3;以及a-巨嗜細胞炎性因子1、血管生成因子(成纖維細胞生長因子1和2、血管內皮生長因子)，以及以結締組織形成細胞(血小板衍生的生長因子A、表皮生長因子、a和p-2轉化生長因子、制癌蛋白M和胰島素樣生長因子-l)，或神經元細胞(祌經生長因子)(Sensebe，L.,etal.，Stemcell1997;15:133-43)為常用靶的介體、存在於血小板和巨核細胞中的VEGF多肽(Wartiovaara，U.，etal.，Thrmb.Haemost.,1998;80:171-5;Mohle，R.，Proc.NatlAcadSci.，USA1997;94:663-8)、HIF-1(—種結合併剌激參予低氧反應的基因啟動子的強力轉錄因子、內皮PAS區域蛋白1(EPAS1)、增強側支功能的單核細胞衍生的細胞因子，例如單核細胞趨29化性蛋白-1(MCP-1)。在另一個優選方面，本發明的方法和/或組合物(包括藥物組合物)包括與適當的用於治療心和/或血管狀態的藥劑聯合的、有效量的兩種或多種細胞因子。在一個優選方面，本發明的藥物組合物是通過注射遞送的。這些投用(遞送)途徑包括但不只限於皮下或包括靜脈內、動脈內、肌肉內、腹腔內、心肌內、透心內膜、透心外膜、鼻內途徑，以及鞘內和灌注技術在內的胃腸道外途徑。因此，優選的藥物組合物是適於注射的劑型的。當投用本發明的治療組合物時，最好將其配製成可注射的單位劑量形式(溶液、懸液、乳液)。適於注射的藥物配方包括無菌水溶液或分散液，以及用於重新構成可注射的無菌溶液或分散液的無菌粉末。載體可以是含有水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等)，其適當的混合物和植物油的溶劑或分散液。可以使用植物凝集素包被，以在分散劑的情況下維持所需要的粒度，並使用表面活性劑來保持流動性。也可使用非水載體如棉籽油、芝麻油、橄欖油、大豆油、玉米油、葵花子油，或者花生油和酯，例如十四酸異丙酯作為化合物組合的溶劑系統。另外，可以加入提高組合物的穩定性、無菌程度和等張性的各種添加劑，包括抗微生物的防腐劑、抗氧化劑、獒合劑和緩衝劑。可以使用各種抗細菌和抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸等來預防微生物的作用。在許多情況下，可望包括糖、氯化鈉等等滲劑。使用延遲吸收的製劑例如一硬脂酸鋁和明膠延長可注射藥劑的吸收。然而，根據本發明，可以使用任何與化合物相容的載體、稀釋劑或添加劑。必要時，可以在用於實踐本發明的化合物中，摻入所需量的適當溶劑或各種不同量的其他成分，以製備無菌的可注射溶液。為了使用包括治療化合物的本發明的藥物組合物，可給病人投用含有相容載體例如各種載體、佐劑、添加劑或稀釋劑的可注射配方；或者可以以皮下慢釋放的植入物或靶向傳送系統例如單克隆抗體、離子載體、聚合物基質、脂質體和微球的形式給病人投用用於本發明的化合物。可以口服給病人投用本發明的藥物組合物。常規方法包括以片劑、懸浮劑、溶液劑、乳劑、膠囊劑、粉末劑、糖漿劑等劑型投用化合物。優選口服或靜脈內途徑，並優選能夠保留生物學活性的已知技術遞送化合物。在一個實施方案中，可以首先投用本發明的組合物，然後再進一歩給藥維持。例如，可以投用一種類型的本發明的組合物，然後進一歩投用不同或相同類型的組合物。例如，可以靜脈內注射本發明的組合物，使血液水平達到適當的水平。可以根據病人的條件，使用口服或其他給藥形式維持病人的藥物水平。應注意的是，治療病人一般要比小鼠或其他實驗動物時間長，治療的時間長度與疾病過程的時間長度和藥物效力成TH比。劑量可以是單一劑量或幾天的多劑量，但最好是單一劑量。因此，可以不必做過多的實驗，用本公丌和本文所列文獻及本領域己知的技術，由動物實驗如大鼠、小鼠等按比例放大到人。治療的時間長短與病程長短和藥物效力及被治療的病人狀況成正比。藥物組合物的量一般隨被治療的病人不同而變化。在一個優選實施方案中，每天給病人投用2x1(^-1x105個幹細胞和50-500Pg/kg細胞因子。雖然小鼠和人的心臟大小相差很大，但也給人2xl(^-lxl05個幹細胞應是足夠的。然而，應該基於每個病人個體的因素精確確定有效劑量，這些因素包括體重、年齡、梗塞面積的大小和損傷的時間。因此，技術人員可以很容易地掌握給藥劑量。確定組合物中化合物和所選擇的添加劑、載體的量並按照本發明的方法給藥。典型地，任何添加劑(除活性幹細胞(S)禾口/或細胞因子(S)以夕卜)都以0.001-50%(重量)的量存在(磷酸緩衝鹽水溶液)，並且活性成分都以微克至毫克的等級存在，例如大約0.0001至5%(重量)，較好大約0.0001至1%(重量)，最好大約0.0001至0.05%(重量)，或者大約0.001至20%(重量)，較好大約0.01至10%(重量)，最好大約0.05至5%(重量)。當然，為了給動物或人投用組合物並選擇特定的給藥方法，最好在適當的動物模型如小鼠中測定致死劑量和L"。以確定毒性；確定組合物的劑量、其各成分的濃度和引發適當反應的給藥時間。本領域技術人員根據本文公開和所引文獻的知識，進行這樣的確定並不需要作過多實驗。另外，可以不需要過多實驗確定連續給藥的時間。再者，本領域技術人員應該能夠不經過多實驗，確定用於與一種或多種細胞因子聯合使用的適當藥物製劑；本領域技術人員應該能夠基於每個病人個體的因素精確確定有效劑量，這些因素包括體重、年齡、梗塞面積的大小和損傷的時間。因此，技術人員可以很容易地根據本公開和現有知識確定給藥劑量。本發明組合物的例子包括適於經口、鼻、肛管、子宮、胃內、黏膜(例如舌下、肺泡、牙齦、嗅覺和呼吸黏膜)等途徑給藥的液體製劑，例如投用懸浮液、糖漿或弛劑；以及適於胃腸道外、皮下、皮內、肌肉內或靜脈內給藥(例如注射給藥)的製劑，如無菌懸浮液和乳液。這樣的組合物可以是與適當的載體、稀釋劑或賦形劑例如無菌水、生理鹽水、葡萄糖等混合的。這樣的組合物也可以是凍幹的。根據給藥途徑和所需製劑的不同，組合物可以含有輔助物質，例如潤溼或乳化劑，pH緩衝劑、膠凝和黏度增強添加劑、防腐劑、香31味劑和染料等。不經過多實驗製備適當的製劑可以參見標準文獻，例如列為本文參考文獻的"REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCE";第17版，1985。本發明的組合物是作為液體製劑常規提供的，如可以是緩衝至適當pH的等滲水溶液、懸浮乳液或粘稠組合物。如果優選消化道吸收，本發明的組合物可以是丸劑、、片劑、膠囊等，"固體"形式，包括可按時釋放並有液體填料的"固體"製劑，例如明膠包被的液體，明膠在胃內被消化後即可將藥物送到腸。如果希望經鼻或呼吸(黏膜)給藥，組合物可以是用擠壓噴霧器、泵或氣溶膠分配器給藥。氣霧劑通常是在壓力下藉助烴形成的。泵分液器較好是分配有刻度的劑量，特別是有顆粒大小的劑量。本發明的組合物可以含有醫藥上可接受的香料和/或染料，以使它們更具吸引力，特別是在口服給藥的情況下。粘稠組合物可以是凝膠、洗液、軟膏、霜劑等劑型的(用於透皮給藥)，一般都含有足夠量的增稠劑，以使黏度從大約2500至6500cps，但更粘的組合物，甚至高達10，000cps的組合物也可以使用。粘稠組合物的黏度最好為2500-5000cps，超過這個範圍將難以投用。然而，如果超過這個黏度範圍，組合物可接近固體或明膠劑型，這樣其可以作為吞服的藥丸，很容易經口服消化。一般液體製劑要比凝膠、其他粘稠組合物和固體組合物更容易製備。另外，液體製劑有時更便於投用，特別是注射或口服。另一方面，可以在適當的黏度範圍內配製粘稠組合物，以使藥物與黏膜(例如胃和鼻黏膜的襯層)有較長的接觸時l'曰j。很明顯，適當載體和其他添加劑的選擇取決於給藥途徑和劑型的性質，例如液體劑型(無論被配製成溶液、懸浮液、凝膠還是另一種其他劑型)，或固體劑型(無論組合物被配製成丸劑、片劑、膠囊，還是按時釋放或有液體填料的其他劑型)。溶液、懸浮液和膠囊除含有活性化合物外，一般都含有大量的水(純化水)。可以有小量的其他成分，例如pH調節劑(如Na0H鹼)、乳化劑或分散劑、緩衝劑、防腐劑、潤溼劑、膠凝劑(如甲基纖維素)香味劑和染料。組合物可以是等滲的，例如它們可以與血液和淚水有同樣的滲透壓。可以使用氯化鈉或其他醫藥上可接受的試劑，例如葡萄糖、硼酸、酒石酸鈉、聚乙二醇或其他有機或無機溶質矯iH本發明組合物的等滲性。對於含有鈉離子的緩衝液，最好使用氯化鈉。可以使用醫藥上可接受的試劑，使本發明的組合物的黏度保持在一定水平。優選甲基纖維素，因為該化合物很容易得到並易於使用。其他適當的增稠劑包括黃元膠、羧甲基纖維素、羥丙劑纖維素、卡波母等。關鍵的是所使用的量要能夠達到選擇的黏度。-一般加入這樣的增稠劑，即可以由溶液製成粘稠組合物。可以利用藥學上可接受的防腐劑增加組合物的貨架壽命。可以使用苯甲醇，也可以使用對羥基苯甲酸酯、乙基汞硫代水楊酸鈉、氯丁醇或氯化卞垸銨。基於總重量，防腐劑的適當濃度為0.02%至2%，但根據所選用的試劑不同，濃度範圍可以有所變化。本領域技術人員將會理解到，所選擇的組合物成分應是比活性化合物更具化學惰性的。對於熟悉化學和醫藥原理的人來說，這將不成問題，或者這是根據本公丌及所引用的文獻，參照標準教科書或經簡單實驗可以避免的問題。按照一般可接受的方法混合各成分製備本發明的組合物。例如可以在彎管或其他標準裝置中簡單地混合各成分，以產生濃縮的混合物，然後加入水或增稠劑調整終濃度和黏度，也可以加入緩衝液控制pH，或加入其他溶質控制組合物的張力。一般pH可以是3-7.5。組合物的投用劑量可以由醫學和獸醫領域的技術人員按照常規技術，根據年齡、性別、體重、特定病人的條件及所投用的組合物劑型(例如固體或液體)等影響因素全面考慮。可以根據本公丌和所引述的文獻以及現有技術，不經過多的實驗確定人或其他哺乳動物的用藥劑量。初始給藥和繼後連續給藥的攝生方法也可以不同，一般可包括初始給藥，然後接著後續給藥。儘管如此，但本領域技術人員可以根據本公丌和所引述的文獻以及現有技術來確定。使用本發明的醫藥組合物治療的心血管疾病包括但不只限於動脈硬化、缺血、高血壓、再狹窄、心絞痛、風溼性心臟病、冠心病、動脈炎症和動脈、小動脈和毛細血管的其他疾病或相關病痛。因此，本發明涉及單獨或與一種或多種細胞因子聯合投用如本文公開的幹細胞，以治療或預防包括心臟無力在內的任何一種或多種上述病理狀況、用於這些治療和預防的組合物、單獨或與一種或多種如本文公開的細胞因子聯合使用本文公開的幹細胞、配製這樣的組合物，以及包括單獨的或與一種或多種如本文公開的細胞因子聯合的，如本文公開的幹細胞的試劑盒，以製備這些用於治療或預防的組合物。最適於治療這些病理狀況的優選途徑包括皮下或胃腸道外途徑，包括靜脈內、動脈內、肌肉內、腹腔內、透心外膜、透心外膜、鼻內等注射途徑，和/或鞘內給藥或灌注技術。在本發明的一個實施方案中，提供了治療血管病變和疾病，包括冠狀動脈或血管閉塞或阻斷的方法和組合物。本發明提供可用於治療或與心臟旁路外科聯合用於治療的方法和組合物。本發明涉及向有需要的心肌區域提供分離、擴增、活化和移植或遞送活化的幹細胞，較好是活化的心肌千細胞。這樣的遞送或移植可使用本文描述的或本領域己知的方法完成，包括但不只限於使用NOGA導管系統使被治療的區域可能顯現，並且通過與導管系統聯繫的可回縮的針遞送治療劑。本領域技術人員將會理解到，其他有用的遞送或移植方法也可用於本發明，包括Dawn，2005(其全文列為本文參考文獻)中描述的方法。在本發明的另一個實施方案中，由需要治療的病人體內收穫心肌組織。本發明提供分離幹細胞，較好是心肌幹細胞，最好是c-kit,心肌幹細胞，然後體外培養和增殖這些細胞的方法。在本發明的另一個實施方案中，提供用於培養和擴增的幹細胞，較好是心肌幹細胞，最好是c-kit^s心肌幹細胞的培養基。這樣的培養基可以包括DMEM/F12、病人血清、胰島素和亞硒酸鈉。在一個實施方案中，培養基可進一歩包括一種或多種人重組bFGF、人重組EGF、尿苷和肌苷。在一個實施方案中，培養基的成分可以以下列範圍存在成分終濃度病人血清.5-20%重量人重組bFGF10-100ng/ml人重組EGF10-100ng/ml胰島素2-20Pg/ml轉鐵蛋白2-20Pg/ml亞硒酸鈉2-10ng/ml尿苷2.24-2.44mg/ml肌苷0.27-2.68mg/ml在另一個實施方案中，可以如本領域已知的取代培養基的成分。例如，可以用胰島素樣生長因子取代胰島素。可以用其他核苷酸，例如腺苷、鳥苷、胸苷和胞苷的混合物取代尿苷和肌苷。在本發明的另一個實施方案中，培養和擴增心肌幹細胞期間，可以利用上述培養基在心臟損傷或梗塞的區域產生或造成新的心肌。在本發明的另一個實施方案中，在移植或傳送之前活化、培養和擴增的幹細胞，較好是心幹細胞，最好是c-kit""心幹細胞。在一個實施方案中，幹細胞與一種或多種細胞因子接觸。適用的生長因子可以是上述的任何生長因子，包括但不只限於激活素A、血管緊張素II、骨形成蛋白2、骨形成蛋白4、骨形成蛋白6、心肌營養素-1、成纖維細胞生長因子1、成纖維細胞生長因子4、Flt3配體、神經膠質衍生的神經營養因子、肝素、肝細胞生長因子、胰島素樣生長因子-1、胰島素樣生長因子-II、胰島素樣生長因子結合蛋白-3、胰島34素樣生長因子結合蛋白-5、白介素-3、白介素-6、白介素-8、白血病抑制因子、midkine、血小板衍生的生長因子AA、血小板衍生的生長因子BB、黃體酮、腐胺、幹細胞因子、基質衍生的因子-1、血小板生成素、轉化生長因子-a、轉化生長因子-e1、轉化生長因子-P2、轉化生長因子-P3、血管內皮細胞生長因子、Wntl、Wnt3a和Wnt5a(參見Ko，2006;Kanemura，2005;Kaplan,2005;Xu，2005;Quinn，2005;Aimeida，2005;Barnabe-Heider，2005;Madlambayan，2005;Kamanga-Sollo，2005;Heese，2005;He，2005;Beattie。2005;Sekiya，2005;Weidt，2004;Encabo，2004和Buytaeri-Hoefen，2004，這些文獻的全文列為本文參考文獻)。本領域技術人員可以選擇一種或多種適當的生長因子。在一個優選實施方案中，幹細胞與肝細胞生長因子(HGF)禾Q/或胰島素樣生長因子(IGF-1)接觸。在一個實施方案中，HGF以大約0-400ng/ml的量存在。在另一個實施方案中，HGF以大約25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375或大約400ng/ml的量存在。在另一個實施方案中，IGF-1以大約0-500ng/ml的良存在。在另一個實施方案中，IGF-1以大約25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475或大約500ng/ml的量存在。在另一個實施方案中，培養基中可以存在本文提供的一種或多種適當的生長因子，DMEM/F12、病人血清、胰島素、轉鐵蛋白和亞硒酸鈉，以及一種或多種人重組bFGF、人重組EGF、尿苷和肌苷。期望培養基的成分可以以本文所述的量存在，但本領域技術人員將能夠確定一種或多種生長因子的足夠量，以使與之接觸的任何幹細胞得以活化。在本發明的一個實施方案中，活化的幹細胞，較好是心幹細胞，最好是c-kirs心幹細胞被傳送或移植到需要治療或修復的血管區域。例如，在一個實施方案中活化的幹細胞被傳送或移植到阻斷或閉塞的心血管或動脈部位。在本發明的一個實施方案中，含有jlik-l表位的心肌幹細胞被遞送或移植到需要治療或修復的區域。在另一個實施方案中，活化的幹細胞在它所遞送或移植到的部位形成動脈或血管。在另一個實施方案中，所形成的動脈或血管至少125、150、175、200、225、250或275Wn。在本發明的另一個實施方案中，所形成的動脈或血管在需要治療或修復的區域周圍(包括環繞閉塞或阻斷)提供"生物學旁路"，從而使血流、血壓和循環得以恢復或改善。在本發明的另一個實施方案中，投用活化的幹細胞可與其他治療手段聯合進行，其他治療包括但不只限於投用一種或多種細胞因子。可使用本發明的組合物作為治療劑應用。本文使用的術語"處理"和"治療"包括治癒作用、緩解作用和預防作用。本文使用的術語"病人"可以是任何脊椎動物，包括但不只限於人、哺乳動物、爬行動物和魚。病人優先是哺乳動物如人，或者是馴養的哺乳動物，如狗、貓、馬等，或者可生產的哺乳動物，如牛、羊、豬等。本文所說的"體幹細胞"或"幹細胞"或"造血細胞"是指自體或同種異體幹細胞，其可以從骨髓、外周血或其他來源得到。本文所說的"成年"幹細胞是指非胚胎來源的，不是從胚胎或胎兒衍生的幹細胞。本文所說的"最近損傷的心肌"是指開始治療的一周內損傷的心肌。在一個優選實施方案中，心肌是在治療開始的三天內損傷的。在另一個實施方案中，心肌是在開始治療的12小時內損傷的。可以優先將幹細胞單獨或與本文公丌的細胞因子聯合應用於最近損傷的心肌。本文所說的"損傷的心肌"是指心肌細胞已暴露於缺血狀態。這些缺血狀態可以由心肌梗塞或其他心血管疾病或相關病痛引起。缺乏氧的供應引起周圍區域細胞的死亡，留下梗塞，最終形成瘢痕。本文所說的"回歸"是指向損傷的心肌和/或心肌細胞吸引和遷移體幹細胞。本文所說的"集合"是指將分化的體幹細胞集合成功能性結構，即心肌和/或心肌幹細胞、冠狀動脈、小動脈和毛細血管。因此，本發明涉及體幹細胞的應用。這些幹細胞小量存在於動物體內，但收集幹細胞的方法是己知的。在本發明的一個方面，所選擇的細胞是譜系陰性的。術語"譜系陰性"的意思是本領域技術人員已知的，是指細胞沒有表達具有特異性細胞譜系的抗原。有利的是，所選擇的譜系陰性幹細胞是c-kit陰性細胞。本領域技術人員知道，術語c-kit是指幹細胞表面上的受體，其常規被用於從周圍其他細胞中鑑定和分離幹細胞。本發明進一步涉及應用於心臟的幹細胞的治療有效量或量。有效量是足以獲得有益的效果或臨床結果所需的量。可以分一次或多次投藥，投用所說的劑量。例如給小鼠模型投用2xl4-lxl05個幹細胞。雖然小鼠和人的心臟大小不同，但人使用這個數量範圍的幹細胞同樣是足夠的。可以根據每個病人個體的年齡、體重、梗塞面積大小和損傷的程度等因素，精確確定有效劑量。本領域技術人員特別是內科醫生或心臟病學家，應該能夠不經過多實驗確定構成有效劑量的幹細胞數目。在本發明的另一個方面，幹細胞被傳遞到心臟，特別是傳遞到梗塞的邊緣區。本領域技術人員應該知道，梗塞區域是大體上可見的，將幹細胞放在這個特定部位是可能的。注射，特別是心肌內注射可有利地投用幹細胞。本領域技術人員應該了解，因為心臟是一種功能性肌肉器官，所以這是傳送幹細胞的優選方法。向心臟注射幹細胞不會由於心臟的收縮運動而造成幹細胞的丟失。在本發明的另一個方面，通過透心內膜和透心外膜途徑投用幹細胞。這個優選的實施方案是使幹細胞穿過保護性外周膜，這對於保證細胞的心肌內注射是必要的。本發明的優選實施方案包括使用基於導管的方法進行透心內膜注射。使用導管不需要使用打開胸腔的更具侵入性的方法。如本領域技術人員所知道的，使用有最小侵入性的方法(包括導管方法)將允許獲得最佳恢復時間。導管進入包括使用如N0GA導管或相似系統這樣的技術。N0GV導管系統提供有用區域的電機圖，以及可用於轉送靶向注射的，或浸浴待治療的靶向區域的可回縮針，從而使給藥更為方便。根據本發明的任何一個實施方案，可使用這樣一個系統給藥，以遞送注射藥物或提供治療藥物。本領域技術人員將會理解到，能夠通過整合成象和導管遞送系統，提供靶向治療的其他代用系統也可用於本發明。可以參見Sherman,2003;Patel，2005;Perrin2003(均全文摻入本文作為參考文獻)，找到關於如何使用NOGV和相似系統的信息。根據本發明的一個實施方案，要求幹細胞遷移到梗塞區域並分化成心肌細胞、平滑肌細胞和內皮細胞。本領域已知，為恢復結構和功能完整性，必須存在有這些類型細胞。修復梗塞或缺血組織的其他方法包括直接向心臟內植入這些細胞或將其作為培養的移植物使用，例如參見美國專利6，110，459和6,099,832號。本發明的另一個實施方案包括增殖分化的細胞，並使細胞形成包括冠狀動脈、小動脈、毛細血管和心肌在內的心臟結構。本領域技術人員知道，所有這些結構都是心臟的適當功能所必要的。文獻中已顯示，包括內皮細胞和平滑肌細胞在內的的細胞的移植，將允許植入的細胞在梗塞區域存活，但它們並不一定形成能夠使心臟恢復全部功能的必要結構。恢復功能和結構完整性也是本發明的另一個方面。發明的另一個方面涉及投用細胞因子。該細胞因子可選自一組細胞因子，或者可包括細胞因子的組合。幹細胞因子(SCF)和粒細胞集落刺激因子(G-CSF)是本領域技術人員已知的，它們是引起幹細胞向血流內遷移的刺激因子(Biancoetal，2001;Clutterbuck，1977;Kronenwettetal，2000;Laluppaetal，1997;Patchenetal，1998)。已顯示體細胞衍生的因子-1能刺激幹細胞呈趨化性轉移，而青灰因子具有趨化性和化學激活性質(Caceres-Cortesetal，2001;Joetal，2000;KimandBroxmeyer，1998;Ikutaetal，1991)。估計血管內皮生長因子連接一個有利於轉移期間遷移的旁分泌環(Bautzetal，2000;Janowska-Wieczoreketal，2001)。巨噬細胞集落刺激因子和粒細胞-巨噬細胞刺37激因子以與SCF和G-CSF相同的方式發揮它們的功能，刺激幹細胞的轉移。已顯示白介素-3刺激幹細胞的轉移，特別是與其他細胞因子聯合使用時能力更強。可通過能在體內表達細胞因子的載體投用細胞因子。適於體內表達的載體可以是本文參考文獻中列出的，或現有技術中使用的載體或細胞或表達系統，例如病毒載體，如腺病毒、痘病毒(例如痘苗、黃雀痘病毒、MVA、NNYVAC等)、慢病毒或DNA質粒載體；細胞因子也可以是通過這樣一個載體或細胞或表達系統或其他，如杆狀病毒表達系統、細菌載體如大腸桿菌和哺乳動物細胞如CS0細胞從體外表達的(例如參見美國專利6,265,189、6,130,066、6,004,777、5，942，235和5，833，975號)。對於幹細胞製劑，細胞因子組合物可以通過所宣稱的途徑以外的途徑給藥；但對幹細胞製劑，細胞因子組合物也可以通過所宣稱的途徑給藥。本發明的再一個方面涉及投用細胞因子的有效劑量或量。有效劑量是足以獲得有益效果和預期結果的用量。所說的劑量可以一次或多次投用。在一個優選實施方案中，這個劑量應在治療丌始後的大約2-3天給予。但可以基於每個病人的體重、年齡和梗塞的大小、單一細胞因子或聯合使用細胞因子以及梗塞的時間等因素精確確定。本領域技術人員，特別是內科醫生或心臟病學家應該能夠不經過多實驗即可確定有效劑量。本發明還涉及經注射，特別是皮下或靜脈內注射遞送治療效劑量的細胞因子。本領域技術人員知道，皮下注射或靜脈內遞送是極其常見的，並且是遞送特定劑量的有效方法，其允許藥物的定時攝入和在血流中循環。本發明的再一個方面包括所投用的細胞因子刺激病人的幹細胞，並使幹細胞轉移到血流中。如前面提到的，所給予的幹細胞能夠促進所說的轉移是本領域技術人員熟知的。如通過下面的實施例可以很清楚的，幹細胞一旦轉移到血流中，它們就可定居在心臟的受損區域。本發明的再一個實施方案涉及遷移到受損區域並在心肌細胞、平滑肌細胞和內皮細胞中分化的幹細胞。本領域已知，為恢復結構和功能完整性，這些類型的細胞都必須存在。本發明的再一個實施方案包括向梗塞區域投用有效量的一種或多種細胞因子。有效劑量是足以獲得有益效果和期望的結果的量。所說的劑量可以一次或多次投用。但可以基於每個病人的具體影響因素，例如體重、年齡和梗塞的大小、單一細胞因子或聯合使用細胞因子以及梗塞的時間等因素來精確確定。本領域技術人員，特別是內科醫生或心臟病學家應該能夠不經過多實驗即可確定有效劑量。本發明的再一個實施方案包括注射向心臟投用有效量的一種或多種細胞因子。細胞因子最好被遞送到梗塞區域或接近梗塞區域。本領域技術人員應該知道，因為梗塞區域是大體上可見的，所以將幹細胞放在這個特定部位是可能的。細胞因子有利於注射，特別是通過心肌內注射給藥。如本領域技術人員應該知道的，因為心臟是功能性肌肉，所以這種給藥方法是遞送細胞因子的優選方法。向心臟注射細胞因子確保它們不會因心臟收縮性運動而漏失。根據本發明的另一個方面，透心內膜和透心外膜投用細胞因子。該優選的實施方案允許細胞因子透過保護性周圍膜，所以心肌內注射的實施方案是必要的。本發明的優選實施方案包括使用基於導管的方法進行透心內膜注射。使用導管可避免使用需要打丌胸腔的、更具侵入性的方法。如本領域技術人員所知道的，使用有最小侵入性的方法(包括導管方法)將允許獲得最佳恢復時間。本發明的優選實施方案包括單次給藥遞送細胞因子。本發明的再一個實施方案包括多次向心臟投用同樣劑量的細胞因子。本發明的再一個實施方案包括向心臟投用多劑量的細胞因子，以便形成一個梯度。本發明的再一個實施方案包括增殖分化的細胞，並使細胞形成包括冠狀動脈、小動脈、毛細血管和心肌在內的心臟結構。如本領域技術人員所知道的，所有這些結構對於心臟的適當功能都是很重要的。文獻中巳顯示，移植包括內皮細胞和平滑肌細胞在內的細胞，將允許植入的細胞在梗塞區域存活，但它們並不一定形成能夠使心臟恢復全部功能的必要結構。恢復功能和結構完整性也是本發明的另一個方面。在本發明的實踐中，投用幹細胞和細胞因子是修復受損心肌的最有效方法。優先選擇的用於本發明的幹細胞是譜系陰性的。本領域技術人員知道，術語"譜系陰性"是指細胞沒有表達具有特異性細胞譜系的抗原。有利的是，所選擇的譜系陰性幹細胞為c-kit陰性。本領域技術人員知道，術語c-kit是指幹細胞表面上的受體，其常規被用於從周圍其他細胞中鑑定和分離幹細胞。在某些實施方案中，給心臟應用、遞送或投放有效劑量的細胞因子，或者將這些因子移植到心臟中。有效劑量是足以產生有益效果或預期的臨床作用的量。所說的劑量可以一次或分多次投用。下述實施例中，在小鼠模型中投用2x104-lxl5個幹細胞。雖然小鼠和人的心臟大小不同，但人使用這個數量範圍的幹細胞同樣是足夠的。然而，可以根據每個個體的年齡、體重和梗塞面積大小和損傷的量等因素，精確確定有效劑量。本領域技術人員特別是內科醫生或心臟病學家，應該能夠根據本公開和現有技術知識，在不經過多實驗的情況下，確定構成幹細胞有效劑量的細胞數目和類型；再者，在關於製備配方和投用配方或其成分方面，可以提到實施例中的技術，並且本領域技術人員可以基於被治療病人的體重，與實施例中應用於任何動物的劑量相比較，按比例放大成用於人的劑量。幹細胞是骨髓或心肌幹細胞；更好是成年骨髓(造血幹細胞)或成年心肌幹細胞或其組合，或心肌幹細胞如成年心肌幹細胞與另一類型的幹細胞如另一類型的成年幹細胞的組合。在本發明的另一個方面，幹細胞被遞送到心臟，特別是到梗塞的邊緣區域。本領域技術人員應該知道，因為梗塞區域是大體上可見的，所以將幹細胞放在這個特定部位是可能的。細胞因子有利於注射，特別是通過心肌內注射給藥。如本領域技術人員應該知道的，因為心臟是功能性肌肉，所以這種方法是遞送細胞因子的優選方法。向心臟注射細胞因子確保它們不會因心臟收縮性運動而漏失。在本發明的另一個方面，透心內膜和透心外膜投用細胞因子。該優選的實施方案允許細胞因子透過保護性周圍膜，所以心肌內注射的實施方案是必要的。本發明的優選實施方案包括使用基於導管的方法進行透心內膜注射。使用導管可避免使用需要打丌胸腔的、更具侵入性的方法。如本領域技術人員所知道的，使用有最小侵入性的方法(包括導管方法)將允許獲得最佳恢復時間。本發明的實施方案包括投用細胞因子。細胞因子可選自一組細胞因子，或者可包括細胞因子的組合。本發明的另一個方面包括投用治療有效劑量的細胞因子。有效劑量是足以產生有益效果或預期的臨床作用所需的量。所說的劑量可以一次或分多次投用。在一個優選實施方案中，劑量應在治療開始後的大約2-3天給予。但可以基於每個病人的具體因素例如體重、年齡和梗塞的大小、單一細胞因子或聯合使用細胞因子以及梗塞的時間等因素作出精確確定。本領域技術人員，特別是內科醫生或心臟病學家，參照本公開和現有技術的知識，應該能夠不經過多實驗即可確定細胞因子的足夠量。注射，特別是皮下或靜脈內注射遞送治療效劑量的細胞因子。本領域技術人員知道，皮下注射或靜脈內遞送是極其常見的，並且常常是遞送特定劑量藥物的有效方法，這種給藥方式允許藥物的定時攝入和在血流中循環。本發明的再一個方面包括所投用的細胞因子刺激病人的幹細胞，並引起幹細胞轉移到血流中。如前面提到的，所給予的幹細胞能夠促進所說的轉移是本領域技術人員熟知的。再者，幹細胞一旦轉移到血流中，它們就定居在心臟的受損區域。因此，某些實施例中，移植的幹細胞和遷移的幹細胞遷移到梗塞區域並分化成心肌細胞、平滑肌細胞和內皮細胞。本領域己知，存在這些類型的細胞有利於恢復結構和功能完整性。本發明的再一個實施方案包括增殖分化的細胞，並使細胞形成包括冠狀動脈、小動脈、毛細血管和心肌在內的心臟結構。如本領域技術人員知道的，所有這些結構都是心臟發揮適當的功能所必要的。文獻中已顯示，包括內皮細胞和平滑肌細胞在內的的細胞的移植，將允許植入的細胞在梗塞區域內存活，但它們並不一定形成能夠使心臟恢復全部功能性的必要結構。可以於體內產生心臟結構，然後以移植物的形式移植；移植物可以是單獨的幹細胞，或這是幹細胞與本公開所說的至少一種細胞因子的聯合，例如成年心臟幹細胞或造血幹細胞如成年心臟和/或成年造血幹細胞，或成年心臟幹細胞與另一類型的幹細胞例如另一類型的成年幹細胞的聯合。體內產生和/或再生心肌的方法是可以在細胞因子的存在下，摻入體外培養的體幹細胞和心臟組織。體幹細胞分化成心肌細胞、平滑肌細胞和內皮細胞，並且體外增殖形成心肌組織和/或細胞。這些組織和細胞可以集合成包括動脈、小動脈、毛細血管和心肌的心臟結構。然後可以將體外形成的組織和/或細胞通過移植物移植到病人體內，以恢復結構和功能完整性。另外，被移植的組織來源可以形成用於心臟移植物的組織的其他來源。以前也出現過的，恢復或部分恢復心臟組織的功能和結構完整性是本發明的另一個方面。因此，在其他方面，本發明包括製備組合物例如醫藥組合物的方法，該組合物包括體幹細胞和/或至少一種細胞因子，其被用於治療心血管疾病或狀態或心臟狀態。還藉助下列非限制性的實施例描述了本發明，以便更好地了解本發明及其許多優點。下列實施例中的所有材料、試劑、化學物質、檢測方法、細胞因子、細胞因子、抗體和各種物品都是通過供應商容易得到的，供應商包括但不只限於Genzyme、Invitrogen、GibcoBRL、Clonetics、FisherScientific、R&DSystems、MBLIntenationalCorporation、CNBiosciencesCorporate、SigmaAldrich禾口CedarLaneLaboratories,Limited。例如，幹細胞因子以SCF(多種劑型的重組人、重組小鼠SCF，和各自的抗體)的名字得自R&DSystems(614McKinleyPlaceN。E;Minneapolis,MN55413);粒細胞集落刺激因子以G-CSF(多種劑型的重組人、重組小鼠SCF，和各自的抗體)的名字得自R幹細胞抗體以SCFA-1的名字得自MBLIntenationalCorporation(200DexterAvenue,SuiteD，Watertown，MA02472);多抗性抗體以Anti-MDR的名字得自CNBiosciencesCorporate;c-kit抗體以c-kit(Ah-1)多克隆抗體的名字得自CNBiosciencesCorporate(MerckKgaA41的分支機構，德國Darmstadt,公司總部位於10394PacificCenterCourt,SanDiego，CA92121)。具體實施例方式實施例l:造血幹細胞修復梗塞的心肌A.收穫造血幹細胞從表達增強的綠色螢光蛋白(EGFP)的雄性轉基因小鼠的股骨和脛骨收穫骨髓。外科手術除去股骨和脛骨後，離移肌肉並在表面上切掉骨的上和下表面，收集侵潤骨髓的緩衝液。在管中例如1.5mlEpindorf管中收集含有緩衝液的液體和細胞。將骨髓細胞懸浮在含有5%胎牛血清(FCS)PBS中，並在冰上與對下列造血譜系特異的大鼠抗小鼠單克隆抗體保溫CD4和CD8(T淋巴細胞)、B-220(B淋巴細胞)、Mac-1(巨嗜細胞)、GR-1(粒細胞)(CaltagLaboratories)和TER-119(紅細胞)(Parmaingen)。在PBS中淋洗細胞，並與羊抗大鼠免疫球蛋白(PolysciencesInc.)包被的磁性小珠一起保溫30分鐘。用生物磁除去譜系陽性細胞(Lin+)並用ACK-4-生物素(抗c_kit單克隆抗體)著染譜系陰性細胞(Lin-)。在PBS中淋洗細胞，用鏈酶抗生物素連接的藻紅蛋白(SA-PE)(CaltagLab.)著染，並使用FACS裝置(BectonDickinson)以螢光雷射細胞分類術進行分選。EGFP和ACK-4-生物素-SA-EP的刺激出現在488nm波長。Lin-細胞被分為c-kit陽性(c_kitP°s)和c-kit陰性(c-kitNIX;)，兩者的染色強度有l-2log的差異(圖l)。將c-kitP"細胞以lx104至1x105的濃度懸浮在5WtiPBS中，並將c-kit卿細胞以1x105的濃度懸浮在5rtnPBS中。B.誘導小鼠的心肌梗塞按照Li等人所述方法誘導兩個月齡雌性C57BL/6小鼠的心肌梗塞。梗塞後的3至5小時，重新打開小鼠的胸腔，將含有2.1Lin-c-kir's細胞的PBS溶液注射到梗塞邊緣活心肌的前、後面(圖2)。使用左側未注射或者注射了c-kit^'細胞的心肌梗塞小鼠，以及假手術小鼠，也就是打丌胸腔但是並沒有誘導心肌梗塞的小鼠作為對照組。手術後9土2天後處死所有小鼠。實驗原始記錄已被學院評論委員會認可。實驗結果以平均值土SD給出。通過Student'st檢驗和bonferroni方法(ScholzenandGerdes，2000)確定兩組檢測之間的差異顯著性和進行多重比較。當P〈0.05，差異性顯著。在雄性小鼠梗塞的左心室外圍注射Lin—c-kit^骨髓細胞，導致心肌再生。圍梗塞區域是梗塞邊緣的活心肌區域。30隻小鼠中有12隻心肌梗塞得到了修復。梗塞區域再生失敗歸因於向每分鐘跳動600次(bpm)的組織中移植細胞的難度很大。然而，對供體骨髓細胞Y染色體上組織相容性抗原的免疫反應，說明某些雌性受體修復不夠。緊密包裹的心肌細胞佔梗塞區域的68±11%，從心室的前面延伸到後面(圖2A-2D)。在注射Lin—c-kit,'細胞的小鼠中沒有發現新生的心肌細胞(圖2E)。C.心室功能的檢測用水合氯醛(400mg/kg體重，，腹腔注射)麻醉小鼠，從右頸動脈插入壓力換能器的一個微型頭，在封閉的胸腔中測量左心室(LV)壓和LV+與-dp/dt，以確定是否來自HSC移植的心肌細胞對於心室功能有影響。統計中，將未經注射或者注射了Lin—c-kit^'細胞的心肌梗塞小鼠結合。與假實驗組相比較，梗塞組的小鼠表現出心力衰竭指徵(圖3)。用LirTc-kiV'Qs細胞處理的小鼠，左心室終水舒張壓降低36%，左心室舒張壓和LV+和-dp/dt分別升高32%，40%和41%。D.細胞增值和EGFP檢測腹腔動脈內插管，在舒張期，心臟注射氯化鎘(CdCl》，對心肌逆行灌注10%緩衝的福馬林。用蘇木精和伊紅著染，從左心室底端到頂端得到的三個組織切片。冠脈閉塞後9±2天，從大體和組織學上看，心室的梗塞部分是很容易識別的(圖2A)。檢測了各切片中界定梗塞區的心內膜和心外膜表面，以及整個左心室心內膜與心外膜的長度。隨後，計算出商數，得到每種情況下梗塞程度。這是使用與顯微鏡連接的圖像分析儀在4倍放大情況下完成的。在未處理的小鼠，限定梗塞區的心內膜和心外膜周圍部分沒有差異，為78±18%(n=8)、用Lin—c-kirs細胞處理的小鼠為75±14%(n=12)，或者經過Lin—c-kit^細胞處理的為75±15%(n=ll)。為了說明是否Lirfc-kirs細胞引起了心肌細胞再生，連續4至5天給小鼠服用BrdU(按每公斤體重50mg，腹腔注射)，然後處死，檢測在積極生長時期累積的細胞分裂。將切片與抗BrdU的抗體一起保溫，然後檢測S期心肌細胞核的BrdU標記。此外，用兔多克隆抗小鼠Ki67抗體(Dako公司)處理樣品後，測定細胞核中Ki67的表達(Ki67可以在Gl，S，G2期和早期有絲分裂期的細胞中表達)。用FITC-結合的羊抗兔IgG作為第二抗體(圖5和圖6)。用兔的多克隆抗GFP抗體(MolecularProbe)檢測EGFP。用小鼠的多克隆抗心肌球蛋白重鏈(MAB1584，Chemicon)，或小鼠的抗a-肌節肌動蛋白抗體(clone5C5;Sigma)識別心肌細胞，用小鼠抗人因子VIII多克隆抗體(Sigma)識別內皮43細胞，用小鼠抗a-平滑肌肌動蛋白多克隆抗體(clonelA4;Sigma)識別平滑肌細胞。細胞核用104g/ml碘化丙啶(PI)染色。以聚焦顯微鏡觀察得到BrdU與Ki67標記的心肌細胞(M)、內皮細胞(EC)和平滑肌細胞(SMC)核的百分數。這可以將標記的細胞核數除以檢査到的細胞核總數來完成。每個細胞群中，加樣的細胞核數如下BrdU標記M=2903，E02153,SM04877;Ki67標記:M=3771，EC=4051，SMC=4752。計數EGFP標記的細胞數M=3278，EC=2056，SMC=1274。在每種情況下，再生心肌組織中心肌細胞的比例，以心肌肌球蛋白染色細胞所佔據的區域除以梗塞區域代表的總區域來確定。分別根據BrdU和Ki67標記檢測發現，心肌細胞增殖比內皮細胞高93%(p<0.001)和60%(p〈0.001)，比平滑肌細胞高225%(p<0,001)和176%(p〈0.001)。根據EGFP的表達確定所形成的心肌細胞的來源(圖7和8)。EGFP表達受到細胞漿和新生成的心肌細胞細胞核中Y染色體的限制。EGFP與標記特異性蛋白質的心肌細胞、內皮細胞和平滑肌細胞相結合。這就可以識別每種心臟細胞的種類，辨別出冠狀血管中的內皮細胞和平滑肌細胞(圖5、7、8)。新生成的心肌細胞，內皮細胞和平滑肌細胞的EGFP表達分別是53±9%(n=7)，44±6%(n=7)，49±7%(n=7)。這些數據與移植了表達EGFP的Lin—c-kiti"'s骨髓細胞的部分符合，44±6%(n-6)。供體轉基因小鼠的心肌細胞、內皮細胞和平滑肌細胞的EGFP表達平均值為54±8%(n=6)。E.Y染色體的檢測為了進行原位雜交螢光(FISH)分析，使切片與含有70%二甲基甲醯胺的變性溶液相接觸。乙醇脫水後，使切片與CEPY(隨體III)光譜綠色(Vysis)DNA探針雜交3小時。細胞核被PI染色。在存活的心室部位沒有檢測到Y染色體。但在新生成的心肌細胞中可以檢測到Y染色體，說明Y染色體來源於注射的骨髓細胞(圖9)。F.轉錄因子和連接蛋白43的檢測將組織切片與兔多克隆抗MEF2(C-21,SantaCruz)、兔多克隆抗GATA-4(H-112,SantaCruz)、兔多克隆抗Csx/Nkx2.5(得自Izumo博士)和兔多克隆抗連接蛋白43(Sigma)保溫。使用FITC連接的羊抗兔IgG(Sigma)作為第二抗體。為了為了確證新形成的心肌細胞代表的是具有完整功能的成熟細胞，檢測心肌細胞增強因子(MEF2)的表達、心肌特異性轉錄因子GATA-4和心肌細胞早期發育的標誌蛋白Csx/Nkx2.5的表達。在心臟中，MEF2蛋白通過GATA-4協同活化幾種心肌基因例如肌球蛋白輕鏈、肌鈣蛋白T、肌鈣蛋白1、(i-肌球蛋白重鏈、橋粒蛋白、心房利鈉尿因子和a-肌動蛋白基因的啟動子而被募集(Durocheretal,1997;Morinetal,2000)。Csx/Nkx2.5是一+受限於心肌細胞分化的初始期的轉錄因子(Durocheretal，1997)。在心臟修復過程中，所有的肌球蛋白標記的細胞核都表達MEF2(圖7D-7F)和GATA-4(圖10)，但僅有40±9%表達了Csx/Nkx2.5(圖7G-71)。為了進一步描述這些心肌細胞的特性，還檢測了連接蛋白43的表達。這種蛋白質的功能是負責細胞間連接並通過在心肌細胞間產生漿膜通道進行電偶聯(Beardsleetal，1998，Musiletal.,2000)。連接蛋白43在胞漿中和緊密排列的分化細胞表面明顯(圖11A-1D)。這些結果與心肌表型的預期功能相一致。另外，在同一和不同的帶內檢測到不同成熟階段的心肌細胞(圖12)。實施例2:動員骨髓細胞修復梗塞的心肌A.心肌梗塞和細胞因子切除15隻兩個月齡C57BL/6雄性小鼠的脾臟，兩周後皮下注射重組的大鼠幹細胞因子(SCF)(200iig/kg/天)，和重組的人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)(Amegen)(50yg/kg/天)，每天一次，連續注射5天(Bodineetal,1994;Orlicetal，1993)。麻醉下，手術暴露左心室(LV)，並結紮冠狀動脈(Orlicetal，2001;Lietal，1999)。投用SCF和G-CSF3天以上。對照組包括切除脾臟的梗塞小鼠和注射生理鹽水的假手術小鼠。處死前，每天一次給予BrdU(50mg/kg體重)，連續13天；第27天處死小鼠。方案經過紐約醫學院證明是可行的。實驗結果為均數士標準差。以Student's檢驗和Bonferroni方法比較兩組間的差異顯著性。用時序檢驗法(log-rank)計算致死率。P〈0.05為差異性顯著。當骨髓Lin—c-kitP°s細胞具有了轉分化為心原性的細胞系的能力，便使用原始方案使它們在外周血中的循環數量最大化，以增加它們定居於死亡心肌區域的可能性。對於一般動物，血液中Lin—c-kirs細胞的出現頻率，要遠低於骨髓中相似細胞出現頻率(Bodineetal，1994;Orlicetal，1993)。如以前文獻中記載的，細胞因子處理能促進骨髓中Lin-c-kitP0S細胞數目的顯著增長，還能改變這些細胞從骨髓向外周血的再分布。該實驗方案可以使循環的Lin—c-ki嚴細胞增加250倍。在目前的研究中，BMC被SCF和G-CSF動員，使梗塞小鼠的存活率大大提高；用細胞因子治療，使73%的小鼠(11of15)存活達到27天，而未經進行治療的心肌梗塞小鼠死亡率則很高(圖13A)。該組中的大量動物梗塞後3至6天死亡，只有27%的小鼠(52支中9支)存活達到27天(p<0.001)。MI後，48小時內死亡的小鼠並未包括在死亡率曲線中，以儘可能地減小手術創傷的影響。第27天，根據左心室游離壁(LVFW)心肌細胞的缺失數目測知，注射細胞因子(64±11%(n=ll))和生理鹽水(62±9%(n=9))動物的梗塞面積相似(圖14)。更重要的是，手術後27天處死的所有11隻細胞因子處理的梗塞小鼠，動員骨髓細胞可以促進心肌的再生(圖13B)。在第6天(n二2)和第9天(n=2)死亡的4支早產小鼠也可見梗塞區內心肌細胞的生長。心肌修復的特徵在於大部分梗塞損傷區域被新生成的心肌細胞所佔據。形成中的組織從左心室游離壁(LVFW)邊緣區域向損傷區域擴展，並從LVFW的心內膜向心外膜擴展。在缺乏細胞因子的情況下，未觀察到心肌的替代和治癒，而且瘢痕形成明顯(圖13C)。相反，在處理的小鼠只能檢測到一小部分區域有膠原蛋白的聚積。B.以超聲心動描記術和血液動力學方法檢測服C的轉移超聲波心動描記術是在清醒的大鼠身上使用裝配有13MHz線性換能器(15L8)的Sequoia256c(Acuson)上完成的。前胸區域剔毛，記錄乳突狀肌水平看到的自胸骨旁短軸的二維(2D)圖像和M-模式示蹤。根據M-模式示蹤，獲得心臟舒張期和收縮期的解剖學參數(Pollicketal.，1995)。射血分數(EF)得自2D短軸側觀察到的左心室橫斷剖面(Pollicketal.，1995):EF=[(LVDA-LVSA)/LVDA]*100，其中LVDA和LVSA相當與舒張期和收縮期的LV面積。用水合氯醛(400mg/kg體重，腹腔注射)麻醉小鼠，將連接圖表記錄儀的微型頭壓力換能器(SPR-671,Millar)穿進左心室，以測量關閉的胸腔中的壓力以及+和-dp/dt(0rlicetal，2001;Lietal.，1997;Lietal.,1999)。在冠脈閉塞後的第9天、16天和26天測量，經過處理的小鼠比未經處理的小鼠EF分別高48%，62%和114%(圖15D)。經過細胞因子處理的小鼠，其收縮功能在梗塞區域隨著時間逐漸形成(圖15E-M，圖16H-P，www.Pnas.org.)。相反，在未經處理的小鼠的左心室終術舒張壓(LVEDP)增高了76%。在沒有經細胞因子治療的小鼠，左心室收縮期壓(未展示)、左心室舒張壓((LVEDP))，及+和-dp/dt也都發生了更嚴重的改變(圖17A-D)。另外，在邊緣和遠離梗塞部位的區域舒張壓增加，而經過細胞因子處理的小鼠，相比較舒張壓要低69-73%(圖15N)。因此，細胞因子介導的梗塞修復，可以明顯恢復再生心肌的收縮性，降低舒張壁應力，增強心室工作。在體內心肌梗塞進展期間，心肌再生可以減輕體內心腔的擴張和腔壁變薄。心肌梗塞後9天、16天和26天，超聲心動描記顯示，相對於經過細胞因子處理的的小鼠，在未經處理的小鼠LV收縮終末直徑(LVESD)和舒張終末直徑(LVEDD)明顯增加(圖16A-B)。梗塞防礙了對收縮期(AWST)和舒張期(AWDT)甜壁厚度的測量。如果可以測量時，收縮期(PWST)和舒張期(PWDT)的後壁厚度均比經過處理的小鼠厚(圖16C-D)。解剖學方面，與細胞因子處理的小鼠相比，未經處理小鼠的心室壁邊緣和和遠離梗塞的區域厚度增加了26%和24%。BMC誘導的修復，使壁厚度/室腔半徑的比例增加42%(圖15A)。另外，組織再生使心腔直徑的擴張降低14%，縱向軸降低5%(圖16C-D)，而且心室體積降低26%(圖15B)。更重要的是，心室質量對室腔體積的比例要比經過處理的動物高36%(圖15C)。因此，骨髓細胞的動員會導致新生心肌細胞群體的增殖和分化，並且血管結構削弱限定心肌代償失調的解剖學變化。C.心臟解剖和梗塞大小的檢測經過血液動力學檢測後，腹大動脈插管，用CdCL使心臟在舒張期停止心搏動，並向心肌灌注10%的福馬林。在壓力與體內測得的舒張終末壓相等時，對左心室腔填充固定物(Lietal，1997;Lietal，1999)。測量LV腔內軸，從底部、中間區域和頂部分別取三個橫向組織切片用石蠟包埋。使用中段組織測量LV厚度、室腔直徑和體積(Lietal，1997;Lietal，1999)。根據LVFW心肌細胞丟失的數目確定梗塞大小(Olivettietal，1991;Beltramietal，1994)。為了確定生長帶對心室質量的定量貢獻，首先測定每組小鼠的LVFW體積(體重除以1.06g/ml)。數據分別是，假實驗組(SO)小鼠為56土2nW，梗塞後未處理的小鼠為62±4鵬:'(活的FW=41±3;梗塞的FW=21±4)，梗塞後細胞因子處理的小鼠為56±9mm:i(活的FW=37±8;梗塞的FW49士5)。這些數值與第27天心肌剩餘和丟失的預期數值差不多，所以給出了未經處理和經細胞因子處理小鼠的梗塞大小。根據SO組小鼠LVFW體積(56誦'1)和未經處理小鼠的梗塞區面積佔62%,處理小鼠的梗塞區面積佔64%，可以計算出冠狀血管阻塞後29天，未梗塞區域預定保留(未處理21mm3，處理20mm3)和預定丟失的的心肌體積(未處理35mm3，處理36mm:')(圖18A)。只有在細胞因子處理的實驗小鼠中，發現新生成的心肌組織體積是14腿3(圖18A)。因此，修復帶減小了梗塞面積，從64%降到39%。由於第27天，LVFW的剩餘部分在未處理和處理的小鼠為41iM'和37mm:i，所以餘留的心肌分別經受了95%(p〈0.001)和85%(p<0.001)的肥厚(圖18a)。因此，與心肌細胞體積增加了94%和77%相一致(圖18B)。D.測定所形成的心肌總體積測量三個切片中被恢復的組織所佔有的面積和切片厚度，以確定再生心肌的體積。這兩個變量的乘積可以得出每個切片中組織修復的體積。將三個切片的數值相加，就可以得出形成的心肌組織的總體積。另外，測定每隻小鼠心臟中400個心肌細胞的體積。用橋粒蛋白、層粘連蛋白抗體和碘化丙錠(PI)著染組織切片。只包括具有中心定位核的縱向細胞。假定細胞是圓柱形的，測定每個心肌細胞越過核的長度和直徑即可以計算出細胞體積(Olivettietal，1991;Beltramietal，1994)。對心肌細胞進行分類並根據各類細胞總體積與每個細胞的平均體積的商，計算出各類心肌細胞的數目(Kajsturaetal，1995;Reissetal，1996)。也可以按照前面所述方法計算心肌細胞每個單位面積的小動脈和毛細血管數目。切片與BrdU或者Ki67抗體保溫。心肌細胞(M)用小鼠單克隆抗肌球蛋白抗體識別，內皮細胞(EC)用兔抗因子VIII抗體識別，平滑肌細胞(SMC)用小鼠單克隆抗a-平滑肌肌節肌動蛋白抗體識別。聚焦顯微鏡觀察得知核被BrdU或者Ki67標記的M、EC和SMC。隨機選定11隻細胞因子處理的小鼠的核；BrdU:M=3541，EC=2604，SMC=1824。Ki67:M=3096，EC二2465，SMC=1404。第14天到26天，每天注射BrdU，以測定積累的增殖程度，同時用Ki67檢測，以確定處死小鼠時循環細胞的數目。Ki67識別處於G1,S,G2(前期和中期)的細胞，減少處於細胞分裂後期和末期的細胞(Orlicetal，2001)。BrdU或者Ki67陽性細胞百分比例分別是內皮細胞的1.6倍和1.4倍，是平滑肌細胞的2.8倍和2.2倍(圖18C，19)。新形成的心肌佔梗塞區域的76±11%，其構成分別是心肌細胞佔61±12%，新血管佔12±5%，其他成分佔3±2%。含有15xl06個再生心肌細胞的帶處於活性增長階段，並且有範圍較寬的分布(圖18D-E)。內皮細胞和平滑肌細胞的生長導致新生心肌組織中每平方毫米有15±5個小動脈和348士82個毛細血管的形成。有多層平滑肌細胞和10-30Wn管腔直徑的厚壁小動脈代表了早期分化中血管。同時，在固定過程中，冠狀動脈分支和修復的心肌組織的不完全灌注，導致小動脈和毛細血管中含有紅細胞(圖18F-H)。這些結果為新生成的血管具有完整功能並且與冠脈循環相連接提供了證據。因此，組織修復減少了梗塞面積，並且心肌細胞生長勝過血管生成；肌肉物質替代是梗塞心臟的主要特徵。E.細胞分化的檢測利用胞漿和核標記物。心肌細胞核兔多克隆Csx/Nkx2.5、MEF2和GATA抗體。胞漿小鼠單克隆巢蛋白(Kachinskyetal，1995;)、兔多克隆肌橋粒蛋白(HemannandAebi，1998)、肌球蛋白，小鼠單克隆a-肌節肌動蛋白和兔多克隆連接蛋白43抗體(Orlicetal，2001)。EC胞漿小鼠單克隆flk-1、VE-鈣粘著蛋白和因子VIII抗體。鑑定五種胞漿蛋白質，以確證心肌細胞的分化狀態(Orlicetal，2001;Kachinskyetal，1995;HermannandAebi，1998):巢蛋白、橋粒蛋白、a-肌節肌動蛋白、肌球蛋白和連接蛋白43。巢蛋白在分散穿過形成帶的單個細胞中被識別(圖20A)。此外，所有其他心肌細胞都表達橋粒蛋白(圖20B)、a-肌節肌動蛋白、肌球蛋白和連接蛋白43(圖20C)。檢測到了參與活化某些心肌結構基因啟動子的三個轉錄因子(Orlicetal，2001;Linetal'1997;Kasaharaetal，1998):Csx/Nkx2.5、GATA-4和MEF2(圖21A-C)。修復的組織中存在兩個標誌，即flk-1和VE-鈣粘著蛋白(Yamaguchietal，1993;Breiretal，1996)陽性單細胞(圖20D，E);檢測分離的SMC中或小動脈壁內的flk-l(圖20F)。在血管形成過程中，酪氨酸激酶受體促進SMC的遷移。因此，梗塞心臟的修復涉及到心肌細胞群的生長和分化，導致心肌更新。實施例3:成年小鼠心臟中原始細胞的遷移為了確定是否原始細胞存在於成年心室的心肌中，而且這些細胞是否具有遷移能力，利用肝細胞生長因子(HGF)、幹細胞生長因子(SCF)、粒細胞單核細胞集落刺激因子(GM-CSF)等三種主要生長因子作為化學吸引劑進行檢測。選擇SCF和GM-CSF是由於它們可以促進造血幹細胞的移位。儘管HGF可以誘導造血幹細胞的遷移，但這種生長因子主要還是參予早期心臟發生過程中心肌細胞前體的有絲分裂、分化和遷移。基於此，按照它們的大小，從小鼠心臟中分離酶裂解的細胞。從心臟組織中解離的心肌細胞的方法是本領域技術人員熟知的，所以無須作過多的實驗(參見美國專利6255292號，其全文列為本文參考文獻)。在有5ym微孔、明膠包被的濾膜的Boyden微室(Boydenetal，J.Exprtl.Med.115:453-456)中，對包括小的未分化細胞、直徑5-7ym、具有高細胞核/胞槳比例的解離的心肌細胞群體進行遷移試驗。在三種生長因子存在下，檢測到遷移細胞的劑量反應曲線沒有很大差異。然而，在濃度為100ng/ml時，HGF看來可遷移大量的細胞。另外，細胞顯示出對由15%Lin—c_kitTOS細胞、50%多藥抗性-1標記的細胞和30%幹細胞抗原-1(Sca-1)表達細胞組成的HGF的趨化性反應。當在15%的胎牛血清中培養遷移的細胞時，這些細胞就分化成為心肌細胞，內皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞。心臟球蛋白陽性心肌細胞佔製劑的50%,而因子VIII標記的細胞佔15%，a-平滑肌肌動蛋白染色的細胞佔4%，波形蛋白陽性因子VIII陰性的成纖維細胞佔20%。剩餘細胞是一些小的未分化細胞和不能被這四種抗體染色的細胞。綜上所述，小鼠心臟具有可以被生長因子動員的原始細胞。HGF可以促使細胞移位，並在體外分化為四種心肌細胞譜系。49實施例4:體外心肌C-Kit陽性細胞的增殖和體內產生心肌細胞為了確定原始c-kit^細胞是否出現在衰老的Fischer344大鼠中，將分離的心肌細胞暴露於包被了c-kit受體抗體(ACK-4-生物素，抗-c-kitmAb)的磁性小珠。分離後，在10%的胎牛血清中培養這些小的未分化的細胞。幾天後，細胞貼壁，並在一周後開始增殖。第7-10天開始匯合。第P2和P4代，細胞倍增時間分別需要30和40小時。細胞衰老前，可以生長分裂到P18代(第90代)。通過Ki67標記確定複製能力，在P2代，88±14%細胞的細胞核中含有Ki67蛋白。另外，對Pl代與P4代細胞附加檢測，40%的細胞表達(1-肌節肌動蛋白或者心肌肌球蛋白、13%表達橋粒蛋白、3%表達(1-平滑肌肌動蛋白，15%表達因子VIII或CD31，和18%表達巢蛋白。在體外條件下，沒有觀察到明顯的肌纖維組織和排列整齊的肌纖維節，也沒有觀察到自發性收縮。同樣，血管緊張素II(AngII)，去甲腎上腺素、異丙腎上腺素、機械性伸展和電場刺激都不能啟動收縮功能。基於此，決定估計這些附屬於生肌細胞、平滑肌細胞和內皮細胞系的細胞是否喪失了其生物學特性，或者體內重新建立它們的作用。隨後用BrdU標定第P2代的細胞。在冠狀動脈梗塞3-5小時後，向梗塞的Ficher344大鼠的受損區域注射BrdU標定的陽性細胞。兩周後，處死大鼠，對心肌梗塞區域的情況進行測定。可以檢測到心肌組織中生成沿著縱軸平行分布的肌纖維，以及BrdU標定的細胞核。而且，出現了包括細動脈和毛細血管的血管結構，並且對BrdU顯陽性。綜上所述，當被植入功能降低的受損心肌組織後，原始c-kit'"'s陽性細胞在衰老的心臟中增加，並維持細胞增殖和分化成實質細胞和冠狀血管的能力。實施例5:心臟幹細胞介導年輕和衰老大鼠心臟中的心肌細胞複製心臟不是一個有絲分裂後的器官，但含有生理學上進行細胞分裂以取代死亡的細胞的心肌細胞亞群。在病理負擔過重時，心肌細胞的加強了增殖，以擴大肌肉質量並維持心臟功能。然而，這些增殖中的心肌細胞的來源仍然有待鑑定。因此，要研究Fischer344大鼠心肌中具有幹/祖細胞特徵的原始細胞。研究年輕和年老動物，確定是否老化會對幹細胞群和分裂細胞的數量造成影響。4個月時，大鼠的c-kit和MDR1陽性細胞的數量分別為11±3細腿2，18±6/100mra2。27個月的大鼠的c-kit和MDR1陽性細胞的數量分別是35±10/100nim2和42土13/100mm2。檢測到的一些新生成的小心肌細胞仍然是c-kit和MDR1陽性。50在循環細胞的核中表達的Ki67蛋白，在4個月和27個月實驗大鼠的心肌細胞中，檢測率分別為為1.3±0.3%和4.1±1.5%.在6次或者56次注射後，BrdU定位方法發現，4個月和27個月實驗小鼠的心肌細胞中，檢測率分別是4個月為1.0±0.4%和4.4±1.2%，27個月為4.0±1.5%和16±4%。在組織切片中對細胞分裂指數進行測定，發現心肌細胞的細胞核在有絲分裂時，4個月的是82土28/106，27個月的是485土98/106。這些檢測結果證實了分裂細胞的有絲分裂指數。用這種方法，有可能確認多核心肌細胞的細胞核是同時進行有絲分裂的.而這個信息在組織切片中是無法獲取的。收集的數據顯示，4個月時有95士31/106個心肌細胞分裂，而27個月的老年大鼠有620±98/106個心肌細胞分裂。在兩個年齡間期，都有有絲分裂紡錘體和收縮環形成，有核膜分解，以及核分裂和胞漿分裂。這種關係說明心臟幹細胞可以調控老化心肌細胞增殖水平與命運。實施例6:人心臟的嵌合性與幹細胞的作用在受損心臟的重建中，居留的原始細胞發揮的重要作用是有目共睹的。當移植雌性心臟與雄性受體進行器官嵌合吋，居留的原始細胞也扮演著重要角色。為了這個目的，將8隻雌性大鼠的心臟植入到雄性受體中並進行分析。通過FISH法檢測Y染色體，測知雄性細胞向移植的雌性心臟的移位。通過這個方法，Y染色體標記的細胞在心肌組織、冠狀細動脈和毛細血管中的百分比分別是9%，14%和7%。同時，在植入的雌性心臟中檢測未分化的c-kit和多抗性l(MDR-1)陽性細胞的數目。另外，也檢測這些細胞含有Y染色體的可能性。心臟移植涉及保存受體心臟心房部分，因為供體心臟要與受體自身的部分心房相接處。這個手術方法對於了解是否來源於受體和供體的心房都含有未分化的細胞是很重要的，而這些未分化的細胞有助於移植的心臟的複雜重建過程。在未移植心臟的對照組中，c-kit和多抗性l標記的細胞(MDR-1)數量是很低的左心室的心肌中，c-kit和MDR-1標記的細胞分別有3個/100mi^和5個/100醒2。而在受體心臟心房中，c-kit和MDR-1標記的細胞數分別是15個/100mm'和42個/100mm2。供體心臟心房的相應值分別是15個/100腿2禾口52個/100mm2，心室中分別是11個/100醒2和21個/100mm2。移植的特徵在於心臟中原始未分化細胞顯著增加。宿主心房中幹細胞有Y染色體，而在供體心房和心室中c-kit和MDR-1標記的細胞平均數分別是55%和63%。所有c-kit和MDR-1陽性細胞都是CD45陰性的。這些觀察說明，將雄性細胞易位在被移植的心臟，對供體心肌的重建有很大影響。總之，幹細胞廣泛的分布在成年心臟中，由於它們的可塑性和遷移能力，可以產生高度分化的心肌細胞、冠狀小動脈和毛細血管結構。實施例7:成年大鼠心臟中幹細胞的識別和定位心肌細胞的更新發生在正常心臟中，心肌受損導致心肌細胞的增殖和血管的生長。這些適應性增加了多潛能原始細胞出現在心臟中的可能性，涉及到對死亡的心肌細胞的生物學替代，也涉及心肌受損後的細胞生長反應。在這個基礎上，利用幹細胞因子受體c-kit、能夠將細胞染料、毒性物質和藥物從細胞中擠出的P-糖蛋白，即多抗藥性-1(MDR-1)、參予細胞信號傳遞和細胞粘附的幹細胞抗體-1(Sca-1)等表面標記物，檢測正常小鼠心臟中未分化細胞的存在。對左右心房、心室的底部、中部和頂端四個分立的區域進行分析。按照數據由高到低的次序排列，c-kit陽性細胞在心房、心室頂端、底部和中部的數目分別是26土11個，15±5個，10±7個和6±3個/100mm2。與心室的底部和中部切片相比，在心房和心室頂端大部分的c-kit陽性細胞差異顯著。MDR1陽性細胞的數目多於表達c-kit的細胞，但它們具有相似的定位特徵。在心房、心室的頂端、底部和中部的數目分別是43±14個，29±16個，14±7個和12士10個/100mm2。在心房和心室頂端，MDR1陽性細胞的數要高於其他兩個區域。Sea-1標記的細胞則顯示有最高的數值；發現心房部位的陽性細胞數目高達150±36個/100腿2。C-kit、MDR-1和Sea-1陽性細胞均為CD45陰性，並且對於心肌細胞、內皮細胞、平滑肌細胞和纖維細胞胞漿蛋白質也表現為CD45陰性。另外，檢測同時對c-kit和MDR-1表現為陽性的細胞的數目，以識別具有兩個幹細胞標誌的細胞。在整個心臟中，有36%c-kit標記的細胞表達了MDR-1，而且有19%MDR-1標記的細胞也表達c-kit。總之，幹細胞分布在小鼠整個心臟的各個部位，但是傾向於積聚在受到較低壓力的區域，如心房和心室頂端。。實施例8:居留的心臟幹細胞的遷移、侵入和表達以修復梗塞的心肌鑑定造血幹細胞和肝細胞(126，90)，特別是衛星骨骼肌細胞(92)和胚胎心肌細胞(127)上的HGF受體，dtet。這些發現促使我們確定是否c-Met存在於心臟幹細胞中，而且它的配體HGF對這些未分化的細胞是否具有生物學效應。假設HGF促進體外心臟幹細胞的遷移和侵入，並且在體內有助於從儲藏區域向心肌梗塞部位的移位。HGF通過表達和激活基質金屬蛋白酶-2(94，95)影響細胞遷移(128)。這個酶家族可以破壞細胞外基質，促進心臟幹細胞的移動、回歸和組織修復。IGF-1是促有絲分裂的和抗細胞凋亡的，而且對於神經幹細胞的增殖和分化是必要的(96，97，98)。如果心臟幹細胞表達IGF-1R，IGF-1便可以以差不多的方式影響CSC，在遷移到受損的心肌組織過程中保護它們的存活性。IGF-1過表達的特徵在於使成年小鼠心臟中的心肌細胞增殖(65)，並且這種細胞增長形式取決於心臟幹細胞的活化、分化和存活。本項研究的開始部分是，進行細胞遷移和侵入試驗，以確定在趨化性肝細胞生長因子存在的情況下，c-ki,s和MDRrs細胞的移動性特徵。酶促解離心臟細胞並棄去心肌細胞(124)。將小細胞懸浮在無血清培養基(SFM)中。使用改良的有上下兩層小孔的Boyden小室(NeuroProbe，Gaithersburg，DM)檢測細胞遷移。48孔平板的濾膜由孔徑為5um的明膠包被的聚碳酸酯膜構成。底孔用含有0.1%BAS和遞增濃度的HGF的SFM填充，將50y1小細胞懸濁液放入上面的小孔。5小時後，用4%仲甲醛固定濾膜40分鐘，並且用PI、c-kit和MDR1抗體染色。用FITC聯接的抗IgG作為第二抗體。在不同濃度的HGF中進行6個獨立分丌的實驗。每次實驗在各個小孔隨機挑選40個視野進行細胞計數，以劃出劑量-反應曲線(圖61)。使用IGF-1或者聯合使用IGF-1與HGF進行的遷移試驗，排除了IGF-1對小細胞的運動發生效應。使用有24孔的小室和12個細胞培養插入物(Chemicon，Temecula，CA)進行侵入分析。在插入物的表面散布一薄層無生長因子的細胞外基質。相反，將100ng/ml的HGF滴加在下面的小室內。侵入的細胞消化外膜後，粘附在聚碳酸酯膜的底部。按照細胞遷移的分析方法，48小時後檢測移位細胞的數目。分別進行4個獨立實驗(圖62)。與細胞遷移實驗中獲得的分析結果相符，IGF-1對細胞侵入沒有影響(數據未示出)。兩種類型細胞的遷移相似，並在有100ng/mlHGF的條件下達到高峰。第5小時，轉移到下面小室中的c-kit,和MDRrs細胞分別是對照組的3倍和2倍。較高的HGF濃度並不會改善細胞遷移(圖61和62)。基於此，也使用濃度為100ng/ml的HGF檢測c-kitP"1nMDRrs細胞穿透侵入小室的合成的細胞外基質的能力。48小時中，生長因子使小室下部分中c-kit，口MDRrs細胞的數目分別增加了8被和4倍(圖61和62)。在濃度為25至400ng/ml範圍內，IGF-1對於心臟幹細胞的移動沒有影響。將IGF-1加入到HGF中，也不能改變單用EGF時所得到的c-kit^和MDRrs細胞的遷移和侵入特徵。用磁珠收集小的、未分化的c-Mers細胞，並用酶譜法測定細胞裂解明膠的能力(圖63)。簡單地說，從心臟(『4)中分離小細胞，然後再用c-Met抗體包被的微球(Miltenyi，Auburn，CA)分離。將細胞暴露於100ng/ml的HGF中37。C保溫30分鐘。在與0.1。/。明膠(Invitrogen，Carlsbad,CA)共聚合的10%聚丙烯醯胺凝膠上電泳分離細胞裂解產物。將凝膠放在5%考馬斯亮藍染色溶液(0.5%)中染色，並根據對照灰色背景所反映出的清淅帶檢測液化明膠活性的面積。這可以證明是否c-MetPos細胞表達了基質金屬蛋白酶(MMP)，並能夠消化凝膠中存在的底物(94，95)。獲得的陽性結果(圖63)說明這些原始細胞的移動性至少在一定程度上是由於金屬蛋白酶的活化。總之，這些體外實驗表明，HGF對CSC有趨化功能。HGF的作用似乎由於它與c-Met受體結合後而被介導，隨後刺激薩P合成(94,95)。小鼠的心肌梗塞造成心肌梗塞小鼠，5小時後，從心房到邊緣區域4次注射含有HGF和IGF-1的溶液。投用漸增濃度的HGF後，在儲存的CSC和死亡的組織之間形成一個趨化梯度。引入這個實驗方案提高CSC回歸到受損區域的數目並產生新的心肌組織。假如是這樣的情況，大量由於心肌梗塞而死亡的動物就會減少，並通過這種幹預限制心肌梗塞的面積和延長存活時間。實驗中使用129SV-EV雌性小鼠。麻醉(150mg氯胺酮，lmg乙醯丙嗪)後，給小鼠插管，暴露心臟並結紮左冠狀動脈(61，87)。用生長因子處理的小鼠，冠狀動脈結紮時，要儘可能地靠近主動脈起點，以誘導形成大的梗塞。然後，封閉胸腔並使動物恢復。5個小時後，麻醉小鼠，重新打丌胸腔，從心房到梗塞的邊緣區域4次注射含有HGF和IGF-1的溶液，每次2.5ul。最後兩次注射，在邊緣區域的對面完成。在梗塞方向，HGF的濃度逐步增加，從50到100和200ng/tnl。投用恆定濃度200ng/ml的IGF-1。從第6天到16天，對實驗小鼠進行BrdU(50mg/kg體重)注射，以便在這個間隔時間裡鑑定小細胞、新形成的和增植的心肌細胞。假手術和梗塞後未處理的小鼠，分別在四個相同位點注射生理鹽水。在討論心臟幹細胞對器官修復的影響之前，在對照組小鼠的心房和左心室，檢測c-Met和IGF-1R在表達c-kit和MDR1的細胞上的存在。對遭受冠狀動脈阻塞的小鼠的心房與梗塞和未梗塞的LV進行同樣的分析。在投用生長因子後2到3小時，即冠狀動脈堵塞後7到8個小時進行這項檢測(目的是記錄侵入死亡組織和周邊活的心肌組織的原始細胞，及參予這個過程的HGF和IGF-1)。檢測散布於正常(n=5)，梗塞後處理的(n=6)和梗塞後未處理(n=5)心臟區域中的c-kit怖和MDRr怖細胞內的c-Met和IGF-1R(圖22，A-F)。大部分的c-kit')。s和MD胞表達了c-Met和IGF-1R之一或兩者。在心肌中有或沒有c-Met和IGF-1R的情況下，心肌梗塞和投用生長因子都沒有以一致的方式改變CSC的相對比例(圖64)。使用髮夾l(凋亡)和髮夾2(壞死)標記和細胞核(循環細胞)中的Ki67表達，分別確定心臟受損和未受損的不同部分中c-kitPos和MDRrs細胞的存活性和活化(圖22，G-L)。54在對照小鼠心房中，CSC的數目要比心室中更多。急性心肌梗塞和投用生長因子都會明顯地改變心臟中原始細胞的數量和分布。在梗賽區的邊緣帶和遠距離區域中的剩餘心肌組織，以及發生梗塞後死亡的心肌組織中，活的c-kit^和MDRrs細胞顯著增加。重要的是，心房中的CSC減少(圖22，M，N)，提示原始細胞從儲存區域向受到應力的活的和死亡的心肌組織轉位。梗塞後未處理的小鼠的一個不同現象是，心房中活的CSC數目仍然高於心室中的數目。對照組和梗塞後處理的小鼠中，梗塞和周邊心肌組織內的c-kit""s和MDR1P°S細胞中未發現凋亡和壞死現象。分布在邊緣帶和梗塞區的Ki67標記的未分化細胞分別是35%和20%(圖65)。在梗塞後未處理的小鼠中，梗塞區域的大部分c-kit^和MDRrs細胞是凋亡的(圖22，M，N)。但未看到壞死細胞。實驗中觀察到，凋亡的CSC存在著從梗塞區域到遠距離心肌和心房組織變化的死亡梯度。這些小鼠中，只有10-14%的活c-ki嚴和MDRr's細胞表達了Ki67(圖65)。因此，這些結果支持了這樣的觀點，即CSC表達c-Met和IGF-1R，所以HGF和IGF-1對梗塞心臟中CSC的回歸、增殖和存活有積極的影響。基於體外和體內的實驗數據，HGF似乎在細胞遷移中發揮優勢作用，而IGF-1對細胞分裂和存活起主要作用。在梗塞後未處理的小鼠中，CSC並沒有移位到梗塞區域，並且已存在的原始細胞因凋亡而死亡。一個重要的問題是，位於梗塞區內的CSC是否能夠分化成不同的心臟細胞譜系並重建死亡的心肌。積極發現會為梗塞後處理的小鼠的心臟修復提供一個機制，並可能解釋為什麼梗塞後未處理的小鼠沒有發生心肌再生。為了進行解剖學檢測，注射CdCL使心臟停止在舒張期並用10%福馬林灌注心肌。在壓力等於與體內測量的終末舒張壓的條件下，對左心室腔填充固定液。測量左心室腔內軸並使用中段組織切片測得LV厚度和室腔直徑。根據包括心室間隔在內的LV心肌細胞的丟失數目檢測梗塞面積(87)。第16天，心肌梗塞導致未處理的小鼠和HGF與IGF-1處理的小鼠左心室以及室間隔分別丟失42%(n=15)和67%(11=22)的心肌細胞(圖23A)。儘管梗塞大於60%，生長因子處理的小鼠卻能夠更好地保留心臟功能(圖23B)。HGF與IGF-1導致左心室終水舒張壓的小幅度升高以及+和-dp/dt的小幅降低。梗塞大小差異並沒有影響到細胞的移動性，這與兩組小鼠的數據即未處理組為43%，處理組為40%相似。重要的是，接受生長因子後，雖然心肌梗塞影響左心室面積達LV的60。/。以上，但是22隻小鼠中有14隻存活。其中，7隻小鼠梗塞影響範圍達到LV的75%到86%。未經處理的小鼠心肌梗塞範圍沒有超過LV的60%(圖23，C,D)。與注射的小鼠相反，為使未經處理的動物存活，必須保留小鼠的一部分左心室壁和整個心室間隔。梗塞面積大於LV的60y。的大鼠、小鼠、狗、以及其它哺乳動物的壽命各不相同。人類的心肌梗塞面積為46%，便發生不可逆的心源性休克和死亡(99)。冠狀動脈堵塞後16天，有可能根據假手術小鼠的左心室體積和梗塞後未處理的小鼠以及處理的小鼠的梗塞面積，計算出心肌組織中留存部分和損失部分的體積。除了生長因子處理的小鼠外(面積是8mm3)，檢測新生成的心肌組織，包括心肌細胞，血管結構和其他組織成分。因此，修復帶使梗塞面積從67%減小到57%(圖68和69)。HGF-IGF-1的趨化性和促有絲分裂特性，導致梗塞區域原始細胞的遷移、增殖和分化，產生新的心肌。儘管這種方法學手段在小動物中具有複雜性，但是在85%的小鼠心臟梗塞區域有心肌帶形成(在26隻小鼠中有22隻)。新生成的心肌帶佔據了受損區域的65±8%，位於梗塞區域的中間部分，與心室壁外層和內層距離相等。在很大的梗塞中，整個心室壁厚度被發育的心肌組織所替代(圖23，E至H)。在解剖學上，兩組梗塞小鼠的心臟縱軸和心腔直徑都相似，表明治療幹預能夠促進心室的積極修復。這個見解與處理的小鼠60%以上梗塞的結果相符。此外，與未處理的小鼠相比，處理的小鼠的壁厚與室內半徑的比率降低。結合處理的小鼠左心室終末舒張壓的小幅度提高，這種比例關係明顯的削弱了該組小鼠舒張期室壁壓力的增加(圖67)。用單克隆c-kit和MDR抗體標記原始細胞(82，83)。用BrdU抗體檢測BrdU的慘入(61，87)。用因子VIII抗體識別內皮細胞，，並使用抗a-平滑肌肌動蛋白抗體識別平滑肌細胞。為了研究心肌細胞分化，使用了巢蛋白、橋粒蛋白、心臟肌球蛋白、a-肌節肌動蛋白、N糹丐粘著蛋白和連接蛋白43等各種抗體。用抗I型和III型膠原蛋白抗體的混合物檢測梗塞組織中的疤痕形成(83，61，87)。形態學上評價修復心肌的組合物。使用對心肌細胞、內皮細胞及平滑肌細胞特異的抗體識別實質細胞和血管結構(61，87)。而且，用BrdU標記的細胞作為指示整個時間単再生組織的標誌。心肌細胞佔帶的84±3%，冠狀動脈血管佔12±3%，其他結構成分佔4±1%。新形成的心肌細胞體積為600至7200y1113不等，平均體積為2200士400um3(圖68和69)。同時，3.1±1.1百萬個細胞的形成補償了2.4±0.8百萬個細胞的丟失。細胞再生中的這種輕微過量是隨心肌細胞大小而變化的。在假手術的心臟中，心肌細胞的體積為18000±3600nm3，是生長的細胞體積的8.2倍。更重要的是，梗塞後的第16天，重建了16%的肌肉質量(丟失的肌肉質量18000x2.4乂106=43誦3;再生的肌肉質量2200x3.Ixl06=7.0誦3;7.0:43=16%)。雖然新的心肌細胞仍然在成熟過程中，但體內超聲心動描記和體外力學方法卻證明了細胞在體內和體外已具有完整的功能。使用配備了13MHz線性換能器(87)的AcusonSequoia256c系統，以超聲心動描記方法檢査清醒的小鼠。在乳頭肌水平從胸骨旁短軸切面記錄二維影像和M-模式示蹤。從二維短軸切面的LV橫斷面積推算出射血分數(EF):EF=[(LVDA-LVSA)/LVDA]X100，其中LVDA和LVSA相當於舒張與收縮期的LV面積。為了進行血液動力學檢査，麻醉小鼠，將連接圖像記錄儀的Millar微頭壓力換能器穿入左心室，監測封閉胸腔中的血壓以及+和-dp/dt。在第15天，超聲心動描記顯示，處理的梗塞心室壁的再生部分收縮活動己部分恢復。處理的小鼠的射血分數高於未處理的小鼠(圖24，A至E)。因此，結構修復與功能修復是聯合在一起的。為了證實新的心肌細胞具有功能活性，並且有助於改善心室性能，從心室壁梗塞區的心肌組織中酶促分離這些細胞(129)並於體外評估其收縮行為(124，130)。經膠原酶消化，分離處理的小鼠的心肌細胞，將這些細胞放入含1.0mMCa"的細胞浴中(30±0.2°C)，用0.5Hz的去極化矩形脈衝電流刺激，兩次舒張壓閾值的間隔時間為3-5毫秒。將得自視頻圖像的參數儲存在電腦中。發育中的心肌細胞較小，並且有位於肌膜下區域細胞周圍的肌原纖維。新的心肌細胞像新生細胞一樣自動複製DNA。它們比其餘肥大的心室心肌細胞小得多(圖25，A，B)。與存活的老心肌細胞相比，生長中的細胞則表現出更高的峰值縮短和縮短的速度，並且到達峰值縮短的時間較少(圖25，C至J)。用Ki67著染分離的新生心肌細胞，確定這些細胞是否為循環的，並因此能合成DNA的細胞。用同樣的實驗方案分離梗塞後處理的小鼠的活的肥大的細胞。在這個基礎上，藉助PI染色和聚焦顯微鏡測定每個單核和雙核細胞中的心肌細胞核的DNA含量(圖25，A和B)。以對照雙倍體小鼠淋巴細胞作為基線。目的是要確定在它們分化為各種細胞譜系之前，CSC中是否發生細胞融合。最近的體外實驗已提示了這種可能性(131，132)。非循環的新的心肌細胞和增大的剩餘心肌細胞只有二倍體核，排除這種現象在心臟修復中起作用(圖66)。為了確定再生帶內正在成熟的心肌細胞的分化水平，估測巢蛋白、橋粒蛋白、心臟肌球蛋白重鏈、a-肌節肌動蛋白、N鈣粘著蛋白和連接蛋白43的表達。N-鈣粘著蛋白識別筋膜粘著和連接蛋白43以及閏板中的縫隙連接。這些蛋白質受到發育上的調節。連接蛋白43對電偶聯和心肌細胞的同步收縮也是重要的。在基本上所有新形成的心肌細胞中檢測這六種蛋白質(圖26，A到N)。BrdU標記的心肌細胞佔了84±9%，表明再生組織中的細胞增殖IH在進行。心臟修復包括毛細血管和細動脈的形成(圖27，A到D)。在血管內腔中出現了紅細胞，說明生成的血管已經參與了冠狀循環。心肌修復階段的特點在於，抗性小動脈的生長比毛細血管結構的生長更佔優勢。目前的發現表明，居留的CSC可以從它們的儲存區遷移到梗塞的心肌組織，然後分化成為心臟細胞譜系，致使組織再生。這裡所說的幹預是指能夠挽救患有與哺乳動物的生命不相容的梗塞的動物。實施例9:獲得體內功能活性的心臟幹細胞體外分化A.細胞收集和克隆分離20至25周齡雌性Fischer大鼠的心臟細胞(111,112)。分離完整細胞並棄去心肌細胞。重新懸浮小細胞，並使用濾網除掉集聚體。將細胞與識別位於細胞膜外面的N水端抗原決定部位的兔c-kit抗體(H300,SantaCruz)保溫(121)。將細胞暴露於包被抗兔IgG(Dynal)的磁珠，通過磁場收集c-kit^細胞(n二13)。為了進行螢光激活細胞分選(FACS)(n=4)，細胞用r-藻紅蛋白連接的大鼠單克隆抗c-kit抗體(Phamingen)染色。用這兩種方法，從小細胞群中分選到6_9%不等的c-kit^細胞。對於心肌細胞(a-橫紋肌肌動蛋白、肌球蛋白、橋粒蛋白、心臟輔肌動蛋白、連接蛋白43)、內皮細胞(因子VII、CD3K波形蛋白)，平滑肌細胞(a-平滑肌肌動蛋白)和成纖維細胞(F;波形蛋白)胞漿蛋白質，c-kit"os細胞評分為陰性。測得心肌細胞系的核標誌物(Nkx2.5，MEF2，GATA-4)為細胞的7-10%,胞漿蛋白為細胞的卜2%。c-kit"('s細胞不表達骨骼肌轉錄因子(MyoD，肌細胞生成素，Myf5)或者髓樣細胞、淋巴樣細胞和類紅細胞的標記物(CD45、CD45R0、CD8、TER-119)，表明這些細胞是Lin-c-kiV'。s細胞。將c-kit'"'s細胞以1-2xl(T細胞/ml的密度培養在NSCM中，用於神經幹細胞的篩選和生長(122)。該培養基由Dulbecco'sMEM和Ham'sF12(比例為1:1)、bFGF(10ng/ml)、EGF(20ng/ml)、HEPES(5mM)、胰島素-轉鐵蛋白-亞硒酸鹽組成。兩周後c-kirs細胞貼壁並開始增殖(圖.28a，b)。用分化培養基(DM)取代NSCM，並在7-10天細胞匯合。胰蛋白酶消化後進行細胞傳代。根據Ki67的表達確定，循環細胞從第一代到第五代(Pl-P5)(每5隻動物)的細胞數從74士12%增加到84±8%。第二代(P2)到第四代(P4)細胞倍增時間平均為41小時。細胞繼續分裂到第23代(P23)，沒有受到生長限制和發生衰老，此時將細胞冰凍。從原代到23代鑑定心臟細胞譜系。在原代(P0)(n=7)、第三代(P3)(n=10)、第十代(PIO)(n二10)和第二十三代(P23)(n二13)，心肌細胞佔29-40%，內皮細胞佔20-26%，平滑肌細胞佔18-23%，成纖維細胞佔9-16%。在液氮中培養的第23代細胞的等分樣品，生長6個月後，細胞表達了如親代細胞的同樣表型。在分化培養基生長的原代和第一代細胞，50%表達Nkx2.5，60%表達MEF2，30%表達GATA-4，55。/。表達GATA-5(圖28c-f)。相反，沒有鑑定出骨骼肌細胞(MyoD，肌細胞生成素，Myf5)、血細胞(CD45，CD45R0，CD8，TER-119)和神經細胞(MAPlb，神經絲200，GFAP)標誌物。為了克隆，將細胞以10-50個細胞/ml的密度接種到NSCM中(圖28g)(109，110)。一周後，從單個細胞衍生成克隆(圖28h);除了在成纖維細胞系外，其他細胞譜系不存在纖連蛋白、I型前膠原和波形蛋白。用克隆圓桶分開單個克隆並鋪板培養。選擇發育形成的多克隆和單一克隆進行定性分析。使用含有10%FSC和10—8M地塞美松的MEM誘導細胞分化(DM)。為了亞克隆化，將得自多克隆的細胞以10-50個細胞/ml的密度鋪板在NSCM中。分離單個亞克隆並鋪板在分化培養基(EM)中。每個亞克隆歩驟，都在懸浮液中培養等量的細胞，以發育成克隆球。每個克隆都包含2-3個c-kit,細胞簇(圖29a)，大多數這樣的細胞(約20-50個)都分散在c-kin田胞之間。有些細胞是Ki67陽性並偶而看到有絲分裂(圖29b-d)。在各個克隆中鑑定表達心肌肌球蛋白和a-肌節肌動蛋白的心肌細胞、表達因子VIII、CD31和波形蛋白的內皮細胞、表達a-平滑肌肌動蛋白的平滑肌細胞和只表達波形蛋白的成纖維細胞(圖29,e-h)。也存在含有的巢蛋白的小細胞聚集體(補充的信息)。因此，從心肌組織中分離的Lin—c-kit""s細胞具有幹細胞的性質。它們是克隆發生、自我更新和多潛能的，而且是主要心臟細胞類型的來源。對幾個初級克隆所作的亞克隆分析證實了初級克隆表型的穩定性克隆發生、自我更新和多潛能性。大部分亞克隆的表型可以與初級克隆的表型區別開。然而，八個亞克隆中有兩個，一個只得到心肌細胞，另一個則鑑定為內皮細胞。懸浮生長在Corning未處理的培養皿中的克隆發生細胞產生了球形克隆(圖30a)。這種錨地獨立生長是典型的幹細胞'4'15。球狀體由c-ki嚴和c-ki嚴細胞簇以及大量的巢蛋白組成(圖30b-d)。與其他幹細胞相似"'15，在DM中鋪板後球狀體會逐漸貼壁，然後細胞遷移出球形體並開始分化(圖3e-h)。將細胞固定在4%仲甲醛中並用c-kit抗體標記未分化的細胞。心肌細胞的標記物包括Nkx2.5、MEF2、GATA-4、GATA-5、巢蛋白、a-肌節肌動蛋白、a-心臟輔肌動蛋白、橋粒蛋白和心臟肌球蛋白重鏈。平滑肌細胞的標記物包括a-平滑肌肌動蛋白和橋粒蛋白，內皮細胞的標記物是因子VIII、CD31和波形蛋白，成纖維細胞的標記物中沒有因子VIII、纖連蛋白、1型前膠原、MyoD，用肌細胞生長素和Myf5作為骨骼肌細胞的標誌物。CD45，CD45R0，CD8，TER-119用於除去造血細胞系。MAPlb、神經微絲200和GFAP用於識別神經細胞系。，87)，細胞核被PI著染。心肌細胞和CSC不能進行體外收縮。血管緊張素II、腎上腺素、異丙腎上腺素、去甲腎上腺素和電刺激不能促進收縮。在整個分化過程中，內皮細胞也不能表達標誌物如eN0S。B.心肌梗塞和細胞移植植入BrdU標記的細胞(第二代；、陽性細胞=88±6%)。使2個月齡雌性Fisher大鼠鼠發生心肌梗塞(111)。5個小時後，分別在22隻大鼠梗塞區域的兩側邊緣處注射2xl05個細胞；第10天處死其中的12隻大鼠，第20天處死另外10隻。在每次間隔期間，給8-9隻梗塞的和10隻假手術的大鼠注射生理鹽水，5隻注射Lin-c-kit;Ms細胞作為對照組。用氯胺酮麻醉後，分別在第9天和第19天以超聲心動描記法進行監測，第20天處死大鼠。以M模式跟蹤法測得終末舒張壓、左心室直徑和壁厚度。封閉胸腔後，計算射血分數。第IO天和20天麻醉動物，測定左心室血壓以及+和-dp/d(111)。手術後第10天和第20天，處理的比未處理的大鼠死亡率低，但是統計學差異不顯著，各組的平均死亡率為35%。研究所審查委員會認可該實驗報告。C.解剖和功能檢査結果使心臟停止在舒張期並用福馬林固定。根據左心室心肌細胞丟失多少確定梗塞大小(87)，第10天處理緩和未處理的大鼠分別為53±7%和49±10%;第20天處理和未處理的大鼠分別為70±9%和55±10%(P〈0.〈每個心臟中檢測400個新生心肌細胞的體積。用橋粒蛋白、層粘連蛋白和PI著染組織切片。收集有中央核的縱向排列的心肌細胞，根據細胞長度和跨核直徑計算細胞體積(87)。將組織切片與BrdU和Ki67抗體一起保溫。第10天，12隻梗塞後處理的大鼠中有9隻檢測到再生的心肌帶，第20天所有10隻梗塞後處理的大鼠都檢測到再生的心肌帶。第10天帶窄薄而且不連續，第20天帶變寬厚，而且存在於整個梗塞區域(圖31a-c)。分別藉助沒有因子VIII的肌球蛋白、因子VIII、a-肌節肌動蛋白和波狀蛋白識別心肌細胞(M)、內皮細胞(EC)、平滑肌細胞(SMC)和成纖維細胞(F)。也可以用心臟肌球蛋白抗體及PI識別心肌細胞。在第10天和第20天，測得新的心肌組織體積分別為30和48mm3。組織再生減小了發生心肌梗塞的面積，第10天從53±7%減小到40±5%(P<0.001)，第20天從70±9%減小到48±7%(P〈0.001)。用聚焦顯微鏡觀察BrdU和Ki67標記的細胞。BrdU標記取樣的細胞核數為M=5229、EC=3572、SMC=4010、F=5529。相應Ki67標記取樣的細胞為M=9290、EC=9190、SMC=8392。利用肌球蛋白、a-肌節肌動蛋白、a-心臟輔肌動蛋白、N鈣粘著蛋白和連接蛋白43確定60心肌細胞的分化。用I型和III型膠原蛋白抗體檢測膠原蛋白。由於植入的細胞是由BrdU標記的，所以可以使用這個標記鑑定發育中的心肌細胞的來源。檢査心肌細胞、細動脈(圖31f-n)和毛細血管剖面。第10天，心肌細胞、毛細血管和細動脈的比例較低，但膠原蛋白含量高於第20天。藉助Ki67估計細胞生長，第10天較大，而第20天減小(補充的信息)。檢測心肌細胞中的肌球蛋白、a-肌節肌動蛋白，a-心臟輔肌動蛋白，N鈣粘著蛋白和連接蛋白43(圖31m-t，補充的信息)。第10天心肌細胞體積小，很少被檢測到橫紋肌肌節，而且N-鈣粘著蛋白和連接蛋白43幾乎都在胞漿中(圖31m,n，q，r)。心肌細胞的平均體積是1500Wn3，並且形成了13.9xl0b個心肌細胞。第20天心肌細胞緊密堆集在一起，肌纖維更為豐富；N-鈣粘著蛋白和連接蛋白43限定閏板中的筋膜粘著和縫隙連接(圖31o，p，s，t)。心肌細胞平均體積為3400Mffl3並且存在13xl6個心肌細胞。原位連接有單一鹼基突出的髮夾寡核苷酸探針，檢測心肌細胞凋亡。為檢查細胞凋亡取樣的細胞核數目是第10天30464個，第20天12760個。從第10天到第20天，心肌細胞數目的保存是與Ki67標記減少和細胞凋亡增加相一致的(0.33±0.23%至0.85±0.31%，P〈0.00D，因此，早期心肌細胞增值佔優勢，而後期細胞增大佔優勢。第10-20天血管數目接近加倍。以前已經描述了確定新生心肌細胞的力學特性的方法:"'。將從梗塞後處理的大鼠(n=4)體內分離的心肌細胞放到含有1.OmMCa"的細胞浴中(30±0.2°C)，用0.5Hz的去極化矩形脈衝電流剌激，兩次舒張壓強度的閾值間隔為3-5毫秒。從電腦中存儲的視頻圖像獲取力學參數。第20天，檢測得自處理的心臟的梗塞和未梗塞區域的心肌細胞的力學行為(圖32a-e)。新生成的細胞有鈣耐受性並對刺激有反應。然而，與剩餘的心肌細胞相比，成熟細胞減少了峰值縮短和縮短速度；兩組細胞到達峰值縮短的時間和到達50%再延長的時間相似(圖33a-l)。發育中的心肌細胞和肌纖維幾乎都分布在外圍；橫紋肌的肌節條紋明顯(圖32a-e)。細胞移植減小了梗塞區域的面積和心腔膨大，同時增加了心室壁的厚度和射血分數。梗塞的心室壁重新出現收縮，並且第20天終末舒張壓、舒張壓以及+和-dP/dt開始改善。處理的小鼠的舒張壓低52%(補充的信息)。因此，心臟修復降低了舒張壓並改善了心室行為，從而促進心臟結構上和功能上的矯正。儘管兩組大鼠梗塞面積相同，但都出現了這種有益的效果。移植細胞的定居、複製、分化，以及組織的再生需要c-kit"os細胞和受損的心肌組織。注射到假手術大鼠體內的C-kitP。s細胞轉移效果較差，而且不能分化。在梗塞區域邊緣注射c-kit^細胞對心臟修復沒有效果。本文報導的Lirfc-kitPQs細胞多潛能表型，與雞(113)、斑馬魚(114)、哺乳動物(115)的心臟細胞譜系檢測(包括從各個不同譜系來源的心肌細胞、SMC和EC)形成明顯的對照。然而，並不是所有的研究大能夠達成一致(116)。因為這些試驗(113、114、115、116)並沒有說明任何標記細胞的發育潛力，就像本實驗所作的，不同的結果可能作為一個特例代表了TF.常發育命運與發育潛力之間差異。另外，最近已報導了(101、52)利用人類胚胎幹細胞(117)、始祖內皮細胞和克隆發生細胞(52)的可塑性作為修復受損心肌的工具。實施例10:生長因子誘導的心臟幹細胞遷移促進梗塞心肌的修復並改善清醒狗的局部和整個心臟功能除了下文描述的以外，也使用先甜的非限制性實施例中描述的方法。在齧齒動物，幹細胞回歸和分化使梗塞後的心肌再生所遺留下了一個未能回答的問題是，在大型哺乳動物中是否也會發生類似的心臟修復。而且，尚不知道新生成的心肌是否影響恢復收縮的梗塞部分的功能異常性。為了這個目的，對狗的血液動力學和局部心室壁功能進行長時間的儀器監測。同時也測量心搏動體積和射血分數。圍繞左前降支冠狀動脈，擴大水壓咬合器以誘導心肌梗塞。四小時後，在梗塞區周邊注射HGF和IGF-1，以動員和活化幹細胞。對狗監測30天。生長因子使梗塞反向膨出而誘導慢性心臟修復節片縮短從-2.0±0.7%增加到+5.5±2.2%，心搏工作從-18±11增加到+53±10臓x誦Hg，心博體積從22±2增加到45±4ml，射血分數從39±3增加到64±4%。梗塞後8小時處理的狗的原始細胞數目從240±40個c-kit"'s細胞的底線增長到1700±400個細胞/mra2(遠距離心肌)，4400±12000個細胞/mm2(邊緣帶)和3100±900個細胞/mm2(梗塞區域)。根據Ki67標記檢測，在遠距離、邊緣帶和梗塞區域的c-kit陽性細胞分別是48。/。、46%、26%。因此可見，這些細胞都在以高水平複製。未處理的梗塞狗基本上沒有這些效果。冠狀動脈堵塞後10至30天，對經植入晶體所限定的梗塞心肌進行定量分析，以補充急性實驗。新生成的心肌組織從無規則的運動到規律的收縮，這種改變的特徵在於心肌細胞的產生，體積從400陶3到16，000陶3不等，平體積為2，000±640陶3。有BrdU標記的內皮細胞和平滑肌細胞的阻力血管為87±48個/隱2組織。毛細血管數是小動脈的2-3倍。總之，有16±9%的梗塞被健康心肌所替代。因此，犬的居留的原始細胞可以從儲存部位被動員到死亡的心肌處。幹細胞的活化和分化促進梗塞心臟的修復，改善局部心壁的運動和全身血液動力學。實施例11:在梗塞的心臟動員居留的心臟幹細胞構成血管緊張素II造成的阻塞的另一個重要治療手段除了下文描述的以外，也使用先前的非限制性實施例中描述的方法。心肌梗塞兩個主要的並發因素是肌肉組織的損失和心腔擴大，從而不利於左心室的修復並阻抑心臟工作。嘗試幹擾MI的有害影響，動員並活化居留的心臟幹細胞以促進組織再生，並且投用ATI受體阻抗劑losartan(Los)(20mg/kg體重/天)，以減弱細胞肥大和室腔體積的擴大。在這個基礎上，造成小鼠的MI並將動物分成四組第一組為假手術組(SO)，第二組為梗塞組(MI)，第三組為投用losartan的梗塞組(MI-Los)，第四組為投用losartan和CSC的梗塞組(MI-Los-CSC)。心肌梗塞(MI)後一個月後殺死動物，並估測LV功能、梗塞範圍以及心臟重建。也檢測CSC處理的小鼠的心肌再生情況。基於心肌細胞的損失數量的多少，推測梗塞面積分別是LV的47%(MI)，51%(MI-Los)，和53%(MI-Los-CSC)。與發生心肌梗塞未處理的(MI)和單純注射losartan的小鼠(MI-Los)相比，注射losartan和CSC的小鼠(MI-Los-CSC)受損心臟有更加良好的結果，心腔直徑與MI組比較為-17%，與MI-Los組比較為-12%;縱軸與MI組比較為-26%(P〈0.001)，與MI-Los組比較為-8%(P〈0.02);心腔體積與MI組比較-40%(P〈0.01)，與MI-Los組比較-35%(P〈0.04)。MI-Los-CSC組左心室質量與心腔體積比例分別比MI和MI-Los組高47%(P〈0.01)和56%(P<0.01)。MI-Los-CSC組的組織修復是900Mm:i，包括10xl(^個新的心肌細胞。而且，該組小鼠每平方毫米心肌組織中有70個小動脈和200個毛細血管。新生成的9mm3心肌組織使梗塞面積減小了22%(即從左心室的53%減到41%)。超聲波心動描記顯示，MI-Los-CSC組小鼠室壁梗塞區重新出現了收縮功能。血液動力學研究顯示，MI-Los-CSC組小鼠有較低的LVEDP和較高的+和-dP/dt。總之，由CSC移位到梗塞區域所介導的心臟修復過程可以增強losartan對心室修復的積極影響。被動員的心臟幹細胞減少梗塞區面積和心室膨大，因此進一步改善了梗塞心臟的收縮行為。—實施例12:肝細胞生長因子(HGF)誘導c-met移位到細胞核，激活GATA-4的表達和心臟肝細胞(CSC)的分化除了下文描述的以外，也使用先前的非限制性實施例中描述的方法。在初步研究中，我們能夠證明c-kit和MDR-1陽性CSC表達表面受體c-met。c-met是HGF受體，配體結合通過合成基質金屬蛋白酶促進細胞遷移。然而，尚不知道c-met活化對心臟幹細胞的生物學和功能是否還有其他影響。為此目,的，我們使CSC上表達的c-met暴露於NSCM中的HGF(50ng/ml)，經細胞內在化和移位看是否對的生長因子有反應。令人驚奇的是，聚集顯微鏡檢査發現，ciet定位在這些保留了原始特徵的受刺激的細胞的細胞核中。HGF對於c-met的這種不尋常的影響，提出了這樣一種可能性，即被動員的受體可能與其他參予CSC的細胞生長和分化的核蛋白質相互反應。因為心臟的特異性轉錄因子GATA-4在細胞譜系的定型中起重要作用。使用免疫沉澱和蛋白質印跡法，檢測出c-met和GATA-4的蛋白質複合物。單一HGF剌激後的時間依賴性分析，顯示15分鐘到第3天c-met和GATA-4複合物逐漸增加。原始細胞分化成心肌細胞和其他心臟細胞是與時間相聯繫的。為了確定c-met和GATA-4在DNA水平上的分子相互作用，對分離自經過一小時HGF刺激的細胞中的核提取物進行凝膠遲滯測定。使用包括GATA序列的探針得到一條移位帶。但加入GATA-4抗體，卻產生一條超移位條帶。相反，加入c-met抗體減弱了GATA帶的光密度。由於在c-met啟動子中鑑定了GATA序列上遊到TATA盒的序列，所以進行第二次移位分析。這種情況下，HGF刺激的細胞的核提取物產生出一條可在加入c-met抗體後減小的帶。相反，GATA-4抗體則誘導了超移動帶。因此，HGF在細胞核水平上介導ciet移位，可以賦予c-met轉錄因子功能，今後的研究將會證明是否DNA結合能夠增強GATA-4的表達，導致未成熟心臟細胞的分化。實施例13:分離和擴增人心臟幹細胞及所用培養基的製備在手術室無菌環境下收穫心肌組織(平均重量1克或更少)。使用425-450毫升DMEM/F12(Cambrex12719F)、5-10%血清(50-75毫升血清得自100-150毫升病人血液，與心房心耳組織一起獲得)、20ng/ml人重組bFGF(P印rotechI00-18B)、20ng/ml人重組EGF(SigmaE9644)、5lVml胰島素(RayBiotechIP-01-270)、5^g/ml轉鐵蛋白(RayBiotech的IP-03-363)，5ng/ml亞硒酸鈉(SigmaS5261)、1.22mg/ml尿苷(SigmaU型3003)和1.34mg/ml肌苷(Sigma1-1024)製備生長培養基。將組織浸泡在加有生長培養基的無菌培養皿中，然後在無菌條件下切成小塊(200-400毫克)。將每塊組織放入1.2ml凍存管中，加入lml凍存液(凍存液由與DMSO混合的生長培養基組成(9:l體積)；例如，9ml培養基與lmlDMS0混合)。將凍存管放在程序降溫盒中，預冷卻在-70°C至-80°C，然後在-70°C至-80°C至少儲存3天。將樣品放在37°C含70%乙醇-蒸餾水的水浴鍋中解凍。2分鐘後，將凍存管拿到超淨臺打丌，用移液器吸走上清液，並加入生理鹽水保持室溫。然後將樣品轉移到100毫米培養皿中，用生理鹽水洗兩次。用Steri250滅菌鉗(Inotech)手工從心臟標本中分離纖維組織和脂肪。然後將樣本轉移到生長培養基中，剪成1-2mm2碎片。將碎片鋪敷在無蓋培養皿中，附蓋含上述富含5-10%人血清的生長培養基的蓋玻片。將培養皿置於37°C含5y。C02的培養箱中。接種組織l-2周後，可見CSCs的生長暈。在細胞擴增的整個過程中，每周更換兩次培養基。培養基儲存在4°C，使用甜37°C預熱。100mm培養皿中加8ml培養基。為保護培養碎片或細胞所產生的條件培養基，每次只更換6ml新鮮培養基。再經過兩周後，每個組織碎片周圍生長大約5，000個心肌細胞的細胞簇。在細胞匯合之前，吸走生長培養基，每皿加入4ml胰蛋白酶(0.25%)(Carnbrexcattt10170;不含內毒素)消化5-7分鐘。加入6ml含血清的培養基終止反應。然後使用Myltenyi免疫磁珠分選獲得c-kit皿細胞。通過間接技術進行細胞分選，其中利用抗c-kitH-300(sc5535SantaCruz)作為第一抗體並使用結合了抗兔抗體的免疫磁珠作為第二抗體(130048602Miltenyi)。將從心肌樣本中長出的細胞培養在15mlFalcon管中，並以850g4"C離心10分鐘。除去培養基並將細胞重新懸浮在10mlPBS中。再以850g於4r離心10分鐘，洗細胞一次。去掉PBS後，將細胞沉澱物重新懸浮在975WPBS中，然後轉移到1.5ml管中。加入25W抗c-kit抗體(相當於25^g抗體)H-300(sc-5535SantaCruz)。在360度旋轉的搖床上，4。C保溫一小時。保溫後，以850g4'C離心10分鐘，用lmlPBS重懸細胞並再次離心。然後在180度旋轉搖床中使細胞在小瓶內與結合免疫磁珠的第二抗體(80WPBS和抗體)4。C保溫45分鐘。保溫後，加400WPBS，使細胞懸液通過磁性分離柱(Miltenyi130042201)分選細胞。回收附著在分離柱上的C-kit+細胞並放在1.5ml管中。離心細胞並重懸在lml37'C預熱的培養基內，接種在24孔板中。之後使c-kit+細胞在生長培養基中擴增。3-4個月後((±1個月)，大約獲得100萬個細胞。在細胞擴增的過程中，每周更換兩次培養基。培養基儲存於4"C，使用前37'C預熱。在24孔板中，每孔使用lml培養基。為了獲得注射所需的細胞數，在細胞匯集之前傳代3次1)35mm培養皿中加2tnl培養基；2)60mm培養皿中加4ral培養基；3)100誦培養皿中加8ml培養基。為保護培養細胞所產生的條件培養基，每次傳代只更換培養基的2/3。利用c-kit抗體和抗心肌譜系定型(即心肌細胞，內皮細胞，平滑肌細胞)的其他標誌物的抗體，以免疫細胞化學和螢光激活細胞分選儀(FACS)分析c-kit+細胞(CSCs)的特徵。所說的標誌物包括(a)轉錄因子如GATA4、MEF2C、Etsl和GATA6和(b)其他抗原如a-橫紋肌肌節肌動蛋白、肌鈣蛋白I、肌球蛋白重鏈(MHC)、連接蛋白43、N-鈣粘著蛋白、馮*維勒布蘭得因子(vonWillebrand因子)和平滑肌肌動蛋白。如果需要，還可以分析細胞的其他標誌物和/或抗原決定部位，包括flik-1。為了活化CSC，將CSC與添加了200Pg/ml幹細胞生長因子和200ng/ml胰島素樣生長因子-1的培養基保溫兩個小時。實施例14:人心臟幹細胞的分離和擴充以及其在治療心肌梗塞中的使用經上述51位經歷了心臟外科手術的患者的同意，取得丟棄的心肌樣品。將樣品研碎後接種於未包被的培養皿的表面上，培養皿中分別添加有肝細胞生長因子(200ng/ml)和類胰島素生長因子-I(200ng/ml)。有29個樣品的細胞正常擴增。接種後大約4天長出細胞，兩周以後每個組織周圍大約有50007000個細胞(圖70A-C)。用免疫微球從生長的細胞中篩選出c-kit類型的細胞並培養之(Beltrami，2003;Linke,2005)。用上述的免疫細胞化學和FACS鑑定細胞表型(Beltrami，2003;Oric，2001;Urbanek，2005)。固定篩選的c-kit,細胞並檢查心臟細胞、骨骼肌、神經以及造血細胞譜系的標誌物(見下列表l)，以確定譜系陰性(Lin-)-hCSCs(Beltrami,2003;Linke,2005;Urbanek,2005)。第PO代從心肌樣品長出的部分細胞表達了幹細胞抗原c-kit、MDRl和類Sca-1(圖.70D-F);它們分別佔整個細胞群體的1.8士1、7%，0.5±0.7%和1.3±1.9%。這些細胞是造血細胞標誌物陰性的，所說的標誌物包括CD133，CD34,CD45，CD45R0，CD8，CD20和血型糖蛋白A(下列表l)。表l.陰性譜系(Lin-)CSCs和早期定型細胞(ECCs)的鑑定tableseeoriginaldocumentpage66缺失缺失直接GATA2§缺失缺失直接CD45*缺失缺失直接CD45R0*缺失缺失直接CD8*缺失缺失直接CD20*缺失缺失直接血型糖蛋白A*缺失缺失直接骨骼肌系譜MyoD§缺失缺失直接肌細胞生成素§缺失缺失直接Myf5§缺失缺失直接骨骼肌球蛋白卞缺失缺失直接神經系譜神經絲200卞缺失缺失直接GFAP§缺失缺失間接MAPlb§缺失缺失間接肌細胞譜系GATA4§缺失存在直接Nkx2.5J缺失存在直接MEF2C:t缺失存在直接心臟球蛋白卞缺失存在間接/QDa-肌節肌動蛋白缺失存在間接/QD巢蛋白缺失存在間接橋粒蛋白缺失存在間接連接蛋白43缺失存在間接/QDN-鈣粘著蛋白缺失存在間接/QD血管平滑肌細胞譜系GATA4§缺失存在直接GATA6$缺失存在直接67tableseeoriginaldocumentpage68表格1:直接標記技術相當於利用螢光色素連接的第一抗體，而間接標記技術則需要使用未連接的第一抗體和螢光素連接的第二抗體。所採用的螢光素連接的第一抗體的混合物包括*混合劑1，§混合劑2，卞混合劑3，J標誌4。QD指示用量子點(GD)直接標記第一抗體；間接/QD指示用GD直接和間接標記。一些細胞中存在心臟轉錄因子GATA4和心肌細胞轉錄因子MEF2C。很多細胞表達了肌細胞、SMCs和EC胞漿蛋白。某些細胞呈神經絲200陽性(圖.70G-J)。對未分級分離的細胞的FACS分析進一歩證實了得自免疫標記的數據。為了進行細胞化學分析，可以用螢光色素或者量子點直接標記抗體，以避免交叉反應和自體螢光(表l)(Linke,2005;Urbanek，2005)。表2中列出了用於未分級分離細胞的FACS分析和c-kiV"'s細胞的抗體(Beltrami,2003;Urbanek,2005)。表2.用於FACS分析的抗體tableseeoriginaldocumentpage68tableseeoriginaldocumentpage69個單獨培養的細胞產生了53個小克隆。因此，c-kirs-hCSCs有0.8。/。的克隆效率。在克隆中，細胞的數量由200個到1000個不等(圖711)。在這53個克隆中，有12個沒有繼續生長。擴增剩餘的41個克隆並以免疫細胞化學方法定性。倍增時間為29±10小時，5天後90±7%的細胞為BrdlT5。使用地塞米松誘導分化(Beltrami，2003;Linke,2005)，結果檢測到心臟細胞譜系。它們包括肌細胞、SMCs和ECs(圖71J)。心肌細胞是佔優勢的細胞群體，其次是ECs和SMCs(圖75)。心肌梗塞在麻醉的雌性免疫缺陷Scid小鼠(Urbanek,2005)和用標準免疫抑制方法(Zimmermann，2002)處理過的Fischer344大鼠(Beltrami，2003)中產生心肌梗塞。從作過上述心臟手術的8個病人的心機樣本中分離C-kit,細胞(每個病人取大約三個樣本)。在這些研究中，當每份樣本中得到大約200,000個c-kitp°s細胞時，在P2代收集這些細胞。這種方法需要大約7周。冠狀血管阻塞後不久，在邊界帶的相對位點兩次注射大約40,000個人c-kit，細胞(Belt濯i，2003;Orlic，2001;Lanza,2004)。在梗塞和細胞移植後2-3周，將動物暴露於BrdU並殺死(Beltrami,2003;Orlic，2001;Urbanek，2005;Lanza,2004)。在測量左心室壓(LV)和dP/dt之前2-3天進行超聲心動描記術檢查(Beltrami,2003;Orlic，2001;Urbanek,2005;Lanza,2004)。使心臟停止在舒張期並灌注福馬林進行固定。檢測每個心臟的梗塞大小、人類肌細胞的形成、微動脈和毛細血管數(Anversa，2002)。25個只處理的小鼠中有17隻(68%)，19隻處理的大鼠中14隻得到修復(74%)。為更合理的解釋重建梗塞的失敗的原因，將c-kitPM細胞與羅丹明螢光素標記的微球體一同注射，以便識別注射位點並正確投用細胞(Leri，2005;Kajstura，2005)。將未成功處理的動物視為成功處理的動物的恰當對照。為了使實驗更為完善，給12隻免疫缺陷的梗塞小鼠和9隻免疫抑制的梗塞大鼠注射PBS並用作額外對照。所有各組的梗塞大小相似，小鼠平均為48±9%，大鼠平均為52±12%.所有病例中都存在人心肌，其中在梗塞小鼠和大鼠的邊緣內適當地遞送人c-kit^細胞。人類心肌的這些病灶定位於梗塞內，並且可以通過用力^探針檢測人DNA序列識別出來(Just,2003)。在小鼠中丟失的心肌重建範圍小鼠為1.3±0.9mm3，大鼠為3.7±2.9mm3(圖72A-C)。結構的BrdU標記也決定了新生成的細胞的積聚；觀測的整個階段都給動物投用BrdU。雖然人c-kit""s細胞得自8個病人，但是在心臟修復的程度上，不同人的細胞並沒有明顯的區別。組織再生的可變性並不依賴於細胞的來源，從而提示還有其他因素影響被處理的心臟的恢復。用人AluDNA序列識別處理的大鼠的梗塞部分，進一步證實了人心肌的形成。另外，用人AluDNA也鑑定出了人MLC2vDNA序列(圖72D)。在同一隻動物中，存活的心肌並不含有人Alu或人MLC2vDNA序列。存活的心肌中存在大鼠MLC2vDNA。在處理的小鼠中，人心肌由緊密接合在一起的心肌細胞組成，其佔據了新生組織的84±6%，而阻力小動脈和毛細動脈總共只佔了7±3%。經過處理的大鼠相應的值為83±8%和8士4y。。檢測分散於整個梗塞區的人心肌細胞、SMC和EC，連同分離的人血管剖面(圖76)。在未成功注射的梗塞大鼠或用PBS處理的動物中未發現人心肌細胞、SMC和EC。原位雜交和PCR用FITC標記的探針對人特殊性Alu重複序列進行原位雜交，以檢測人細胞(Bioge腦)(Just，2003)。另外，鑑定人X染色體，以及大鼠和小鼠的X染色體(Quaini,2002)。從應用人細胞處理的大鼠活的梗塞的LV組織切片中提取DNA。然後對人的Alu序列(長度約300個鹼基對；特別是發現於原始基因組中；佔人基因組的10%以上；並且在人類的基因組中定位平均距離為4千鹼基)，和小鼠及人肌球蛋白輕鏈2v序列進行PCR操作(見下列表3)。表3.識別大鼠和人細胞檢測肌球蛋白輕鏈2v基因和Alu序列大鼠肌球蛋白輕鏈2v引物rMyl2-S:CCTCTAGTGGCTCTACTGTAGGCTTC(26mer,溶解溫度55。C)25rMyl2-A:TTCCACTTACTTCCACTCCGAGTCC(25mer,溶解溫度59°C)人肌球蛋白輕鏈2v引物hMLC2-S:GACGTGACTGGCAACTTGGACTAC(24mer，溶解溫度57°C)hMLC2-A:TGTCGTGACCAAATACACGACCTC(24mer，溶解溫度58°C)Alu序列引物ARC-261r:GAGACGGAGTCTCGCTCTGTCGC(23mer，溶解溫度61°C)表3:每份樣品均與15u1鉑PCRBlueMix溶液(Initrogen)和各0.2剛引物混合，然後進行PCR。PCR反應操作如下94°C30秒；94°C30秒循環35次，60°C30秒，接著72°Cl分鐘；72°C3分鐘。最後在2y。瓊脂糖凝膠上電泳分離PCR產物。為了避免第二抗體的非特異性標記，直接用螢光染料標記大多數第一抗體(表l)。儘管採取了上述預防措施，但用這種方法仍不可能消除最低水平的自身螢光在組織切片上的黏附(Leri,2005;Linke,2005;Urbanek，2005)。可能的話，為了排除這種人為來源，將第一抗體與量子斑點共軛接合；這些半導體粒子發射的波長超出自身螢光的範圍，從而排除這種混淆的變量(Leri，2005)。量子斑點標記應用於鑑定轉錄因子、心肌細胞的胞漿和膜蛋白質、再生的人心肌中的平滑肌細胞和內皮細胞。用Alu探針識別人細胞後，檢測帶有轉錄因子GATA4和MEF2C的新生心肌細胞中的心臟肌球蛋白重鏈和肌鈣蛋白。另外，在這些發育中的心肌細胞的表面也鑑定出來了接合蛋白質連接蛋白43和N-鈣粘著蛋白(圖72E-J)。在條間部也明顯可見層粘連蛋白。人心肌細胞的大小有很大不同，兩種動物模型中可以從100到2900陶'不等(圖77)。將女性人細胞注射到梗塞的雌性小鼠和大鼠體內。因此，鑑定人X染色體及小鼠和大鼠X染色體，以檢測人細胞是否與小鼠和大鼠細胞融合。結果發現，在新形成的心肌細胞、冠狀小動脈和毛細管剖面都沒有人X染色體與大鼠或小鼠X染色體共同定位(圖73H-M)。重要的是，人類心肌細胞、SMC和FC最多攜帶兩個X染色體。因此，細胞融合併沒有在嵌合的梗塞心臟內人心肌形成中起顯著作用。人的心肌特徵除人SMC和EC以外，所構成的冠狀動脈和毛細血管證明，注射c-kit^細胞介導了血管形成(圖73A-F)。在大鼠及小鼠冠狀血管中，沒有看到人平滑肌細胞(SMC)和內皮細胞(EC)的整合。我們絕沒有發現由人和非人細胞形成的血管。在大鼠及小鼠中人小動脈和毛細血管的數目差不多，並且兩種情況下每8個心肌細胞有一個毛細血管(圖73G)。此外，氧彌散距離平均為18Wn。這些毛細血管參數與見於人胎兒後期和新生兒心臟的參數形似(Anversa，2002)。人心肌是有功能活性的為了確定再生的人心肌是否能夠勝任功能並且是否恢復了部分梗塞心臟的功能，在記錄透壁梗塞的組織學改變之後，在有或沒有新形成的人心肌存在下，進行追朔性的超聲心動描記圖檢査(圖74A-C;圖78)。在心室壁梗塞區域中，心肌的再生與可檢測的收縮功能建時，情況絕不是這樣。人心肌的形成增加了梗塞心室的射血分數(圖74D)。再者，心肌再生會減小心房擴張，增加LV質量對室腔體積的比例(圖74E)，梗塞後通過限制LVEDP的升高、降低LVDP以及正和負dP/dt來改善整個心室的功能(圖74F)。該實施例所有結果都是平均值土標準差。使用Student's試驗和Bonfeironi方法確定顯著性(Anversa，2002)。實施例15:心臟幹細胞形成大的冠狀動脈-生物旁路為了比較注射用HGF和IGF-1(活化的CSC)活化的克隆發生EGFP""s-c-kitP°s_CSCs(未活化的CSCs)和EGFPP°s-c-kitCSCs對血管堵塞的影響，用標準方法阻塞Fischer344大鼠的左冠狀動脈。在接近閉塞的左冠狀動脈附近植入未活化CSCs或活化的CSCs(在植入前2小時活化)。由於結紮線的解剖位置不同，使這些細胞植入的位點遠離心室壁的梗塞區域(圖82)。接種在心肌內的未活化的CSC顯示高的凋亡速率，從12和24小時逐漸增加到48小時(圖83)。在1-2周內，植入的細胞死亡以致完全消失。相反地，植入生長因子活化的CSC則檢測到顯著的積極效果(圖79a)。回歸到心肌處的活化的CSCs最初凋亡勝過細胞複製，然後細胞分裂超過細胞死亡(圖79b-d)。雖然活化和未活化的CSCs在注射部位積累在未受損心肌心肌內，但細胞植入卻受到活化細胞的限制。植入需要合成的表面蛋白質，以建立細胞間的接觸以及細胞與細胞外基質的相互作用(L即idot，2005)。連接蛋白43、N-和E-鈣粘著蛋白以及L-選擇蛋白只在大部分活化的CSC中表達(圖79e)。在心肌的未活化CSC細胞簇中沒有這些連接和粘附蛋白質。凋亡沒有影響到植入的細胞，而僅僅涉及非植入的細胞(圖79f)。這種現象與非移植細胞的失巢相符合，其中因缺乏細胞間的接觸而引發了細胞的程序性細胞死亡(Frisch，2001;Melendez，2004)。為了驗證生長因子對CSCs的活化在細胞移植中所發揮的作用，而且驗證細胞植入與缺血性損傷無關，在非梗塞對照大鼠的完整心肌內注射活化的CSCs。一個月後，大量的細胞出現於心外膜區域(圖79g)。這些細胞表達了連接蛋白43和45、N和E-鈣粘著蛋白以及L-選擇蛋白。植入的細胞保留了未分化表型，很可能是由於缺乏組織損傷，並缺乏再生丟失的心肌的必要物質(Beltrami，2003;0rlic，2001:Mo叫uet,2005)。73處理後第2天定量測量顯示，注射的80，000-100,000個未活化的CSC中只有大約5%(4,800±2，600)存在於心肌中。遞送活化CSC後，檢測到有大量的細胞表達EGFP。然而，他們顯然少於所投用的細胞總數(48,000±13,000個)。這些細胞分別是未植入和植入的CSC的死亡和分裂產物。為了判斷因為冠狀動脈閉塞所造成的心肌環境的變化，是否影響了活化的CSC分化成血管平滑肌和內皮細胞，確定低氧誘導因子-1(HIF-1)和SDF-1的表達(低氧誘導因子-1是SDF-1(即趨化因子12)的轉錄調節劑)，因為HDF-1和SDF-1兩者都受缺血的上調(Abott，2004;Ceradini，2005)，並可能與組織內的氧梯度有關(Butler，2005)。心肌的這種反應可見於梗塞心臟的縱向切片中，其中低氧程度從梗塞心室的基部到中部和頂部逐漸增加。相反，在心臟的頂端死亡的心肌HIF-1和SDF-1的表達很少，中部區域中等，並且接近基部活心肌的缺血部位高度明顯。HIF-1和SDF-l限於血管壁的內皮細胞襯層。免疫標記與蛋白質印跡法測定的HIF-1和SDF-1表達和用ELISA法測定SDF-1水平相符合。冠狀動脈結紮手術和處理後一個月和兩周，檢測活化的CSC對_梗塞心臟中傳導性冠狀動脈和其分支的發育的影響。選擇這些時間點是因為大鼠出生后冠狀動脈樹成熟大約需要l個月的時間(Anversa，2002)，儘管出生後10至15天就出現血管的顯著生長(Olivett，1980;Rakusan，1984)。梗死和細胞移植後2周，在靠近注射位點的心肌外膜中發現大的新生成的EGFP陽性冠狀動脈(圖80a，b)。所產生的血管只透過周圍心肌和接近阻塞冠狀動脈的低部梗塞邊緣區。直徑大於或等於150陶的傳導性動脈具有一個限於心室基底和上中部活心肌的內部彈性層。相比之下，左冠狀動脈起端的直徑為大約275Wii。在鄰近或遠離的再生血管的活的心肌中，沒有發現新形成的EGFP陽性心肌細胞。這一點為CSC對器官的區域要求有選擇性反應提供了證據，這似乎是由於幹細胞生長和分化的條件所致(Baxter,2000)。直徑小於25,的小阻力小動脈的存在限於有瘢痕形成的梗死區(圖80c)。在兩周時沒有在其餘心肌內檢測到這樣大小的阻力小動脈。同樣，少量毛細血管也只存在於梗塞的心肌中。在所有這些情況下，血管壁都是無例外地由EGFP陽性SMC和EC組成的。再生的血管中沒有EGFP陰性SMC或EC。這就排除了血管形成中已有的SMC和EC與譜系定型的活化的CSC協同作用的可能性。血管生成似乎是在這些條件下血管生長的唯一機制。梗塞和細胞治療後觀察一個月，確定是否新形成的冠狀血管代表了繼後萎縮的或變成有功能活性的血管的臨時血管。這個間隔時間不僅關係到檢查其他血管生長，而且也關係到梗塞癒合的表徵。齧齒動物梗塞癒合完成要大約4周的時間(Fishbein，1978)，並導致壞死組織內III型和I型膠原蛋白的蓄積。瘢痕形成的心肌至多包含有幾個分散的血管，因為現有血管大多在癒合早期因凋亡而逐漸死亡(Cleutjens，1999)。因此，於2周和一個月檢測梗塞和未梗塞的心肌中不同類別的EGFP陽性冠狀血管的分布。一個月時，活的心肌和室壁梗塞區域存在有許多直徑範圍為6至250微米的EGFP陽性冠狀血管，提示時間導致冠狀動脈血管的擴展。一個月時，檢測多餘心肌和心室壁梗塞部分中的大、中、小型冠狀動脈和小動脈連同毛細血管剖面。正如第2周所注意到的，再生的血管只由EGFP陽性SMC和EC組成(圖84)。這些觀察得到定量分析結果的支持，表明各類冠狀血管都有一個月的發育期(圖80d)。因此，活化CSC能夠從頭產生大鼠冠狀動脈血管樹的各個部分。為了評估CSC的實際生長潛力，檢査居留的EC和SMC與注射的CSC之間是否有涉及融合過程的冠狀動脈和毛細血管重建(Wager，2004)。檢測血管壁內EGFP陽性EC和SMC核中的性染色體，確定異核體的形成(Urbanek，2005a;Urbanek，2005b;Dawn，2005)。因為雌性克隆發生性CSC植入到了雌性動物的的心臟中，所以可以按照EISH方法鑑定新形成的血管中X染色體的數量(圖80e)。在所有情況下，在再生的EC和SMC中大多發現兩條X染色體，提示在由活化的CSC恢復冠狀血管中，細胞融合所發揮的作用很小。為了確定是否新的心外膜冠狀血管在功能上是與主動脈和現有冠脈循環聯繫的，就要利用來自體內的製備物。用含有若乃明標記的葡聚糖的充氧Tyrode溶液(70,000兆瓦；紅色螢光)通過主動脈連續逆行灌注心臟。葡聚糖這種分子並不能跨越內皮細胞屏障，它允許用雙光子顯微鏡看到整個冠狀動脈血管(Urbanek，2005;Dawn，2005)。由於生物結構散射雷射(Helmchen,2005)，所以這一分析只限於心外膜的最外約150微米；心室壁的厚度約2.0毫米。分別根據缺乏和存在壁的EGFP標記(綠色螢光)區分居留和新生成的冠狀血管。根據二次諧波的產生(藍色螢光)檢測組織膠原蛋白，其中所說的二次諧波是雙光子激發和膠原蛋白的周期性結構的結果(Schenke-Layland，2005)。推測膠原蛋白的分散定位符合活的心肌，而膠原蛋白的廣泛聚集被解釋為有代表性的梗塞心肌。2周時在處理的大鼠未梗塞心外膜內，從主動脈灌注葡聚糖，鑑定直徑近200微米和有EGFP陽性壁的大血管(圖81a)。在靠近血管壁處可見有少量膠原蛋白。兩周和1個月時，在有瘢痕形成的心肌中也發現有類似的血管(圖81b-e)。有時，橫切梗塞的心外膜區域的新冠狀血管(圖81c)被EGFP陽性細胞部取分代，這相當於再生心肌的分散灶(未顯示)。如果解析度允許，可以鑑定原有的(EGFP陰性壁)和新產生的(EGFP陽性壁)冠狀血管之間的直接接合(圖81f)，有數據證明了冠狀血管樹的這些暫時不同的、老的和新的部分的整合。以細胞治療方法改善冠脈循環是與減輕心室擴張和增加室壁厚度/室腔半徑以及心室質量/室腔體積比例相聯繫的(圖81g)。這些結構上變量對心功能及心肌負荷有顯著影響(Pfeffer，1990)。正如所預料的，再生冠脈循環沒有減小心肌梗塞面積(圖81g)。冠血管結紮後不久引入細胞治療，由閉塞的冠狀動脈供應的心肌細胞在4-6小時死亡(Anversa，2002)。然而，左心室血液動力學的改變，包括終末舒張壓、舒張壓、iH和負dp/dt，以及舒張期壓應力都因改善了細胞治療介導的冠脈灌注，而得到有部分地降低(圖81h)。實施例16:在大型動物模型中基於導管的冠狀血管內運送心臟幹細胞為雙重目的對豬實施丌胸手術1)切除和收穫心房附件(心耳)組織，2)通過阻斷遠端左甜降支90分鐘然後再灌注誘發心肌梗塞。從心房附件(心耳組織)收穫CSC，按上所述方法體外培養和擴大，然后冠脈內注射，並在2-3個月後(平均86天)再次對同一隻豬注射。7隻豬接受冠脈內的CSC注射，同時8隻豬接受賦形劑注射。對所有豬進行一系列實驗，檢査心肌標誌物、二維超聲心動圖，並對部分豬進行侵入性血液動力學監測以及它們內部器官的詳細組織病理學檢查。在心臟和組織病理學檢查的各個器官中，沒有顯示與CSC治療有關的不良影響，並且經過治療的豬傾向於改善了心功能。這些結果進一歩證實了在大的缺血性心肌病模型中冠脈內運送CSC的安全性和可行性。參考文獻761，Abott,J.D.etal.Stromalcell-derivedfactor-1alphaplaysacriticalrolemstemcellrecruitmenttotheheartaftermyocardialinfarctionbutisnotsufficienttoinducehomingintheabsenceofinjury.Circulation110,3300-3305(2004).2.Aicher,A.etal.Essentialroleofendothelialnitricoxidesynthaseformobilizationofstemandprogenitorcells.Nat.Med.9,1370-1376(2003).3.Alvare2-D0lad0M，PardalR，Garcia-VerdugoJM，etal.Fusionofbone-iBarrow-derivedcellswithPurkinjeneurons,cardiomyocytesandhepatocytes.Nature2003;425:968-73-4.AmadoLC,SaliarisAP，SchuleriKH，etal.Cardiacrepairwithintramyocardialinjectionofallogeneicmesenchymalstemcellsaftermyocardialinfarction.ProcNatlAcadSciUSA2005;102:11474-9.5.AmericanHeartAssociation,2001HeartandStrokeStatisticalUpdate.Dallas,Texas:AmericanHeartAssociation,2000.6，AmericanHeartAssociation:HeartDiseaseandStrokeStatistics—2005Update.URL:www.americanheart.org/downloadable/heart/1105390918U9HDSStats2005Update.pdf7.Anderson,D丄"Stemcellsandpatternformationinthenervoussystem:thepossibleversustheactual.，，Neuron(2001)30，19-35.8.Anversa，P.&Olivetti,C3.Cellularbasisofphysiologicalandpathologicalmyocardialgrowth.InHandbookofPhysiology:TheCardiovascularSystem:TheHeart,(eds.Page,E.，Fozzard，H,A,&Solaro,R.J.)75-144(OxfordUniversityPress,Oxford,2002).9.Anversa,P.andKajstura，J."Ventricularmyocytesarenotterminallydifferentiatedintheadultmammalianheart,"Circ,Res.(1998)83，1-14.10.Anversa，P.andNadal陽Ginard,B.，"Myocyterenewalandventricularremodelling."Nature.(2002);415(6868):240-3.11.Arsenijevic,Y.andWeiss,S.,丄Neurosci."Insulin-likegrowthfactor-IisadifferentiationfactorforpostmitoticCNSstemcell-derivedneuronalprecursors:distinctactionsfromthoseofbrain-derivedneurotrophicfactor."JNeurosci.(1998)18(6):2118-28.12.Arsenijevic,Y.etal.，"Insulin-likegrowthfactor-Iisnecessaryforneuralstemcellproliferationanddemonstratesdistinctactionsofepidermalgrowthfactorandfibroblastgrowthfactor-2."JNeurosci.(2001)21(18):7194-20213.Asahara，T.eta.Isolationofputativeprogenitorendothelialcellsforangiogenesis.Science275,964-967(1997).14.Bache，R.J.Effectsofhypertrophyonthecoronarycirculation.Prog.Cardiovasc.Dis.30，403-440(1988).5.BalsamLB，WagersAJ,ChristensenJL，KofidisT，WeissmanIL，RobbinsRC.Haematopoieticstemcellsadoptmaturehaematopoieticfatesinischaemicmyocardium-Nature2004;428:668-73.16.Bautz，F.etal.,"Expressionandsecretionofvascularendothelialgrowthfactor-Abycytokinestimulatedhematopoieticprogenitorcells.Possibleroleinthehematop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