光學分析裝置、光學分析方法和用於光學分析的電腦程式的製作方法

2023-08-09 04:48:51 2

專利名稱：光學分析裝置、光學分析方法和用於光學分析的電腦程式的製作方法
技術領域：
本發明涉及對來自分散或溶解於溶液中的原子、分子或團聚體(在下文中，這些均稱作「粒 子」)的光進行檢測以用於分析溶液中的粒子的狀態的光學分析裝置、光學分析方法和用於光學分析的電腦程式，更具體地，本發明涉及如下的光學分析裝置、光學分析方法和用於光學分析的電腦程式其能夠通過使用諸如共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學系統等能對來自溶液中的微小區域的光進行檢測的光學系統來獲取對分析例如蛋白質、肽、核酸、脂質、糖鏈、胺基酸或其團聚體等生物分子以及例如病毒、細胞或非生物粒子等粒狀物等等各種粒子的狀態(相互作用、結合或離解狀態，等等)有用的信息。
背景技術：
根據近年來光學測量技術的發展，通過使用共聚焦顯微鏡的光學系統和能夠對光子計數(單光子檢測)的超高靈敏度光檢測技術，使得單光子或單螢光分子水平的微弱光的檢測和/或測量成為可能。因此，提出了藉助於這種微弱光檢測技術對生物分子等的分子間相互作用、結合或離解反應進行檢測的各種裝置或方法。例如，在螢光相關光譜分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy :FCS,參見例如專利文獻I和2以及非專利文獻1-3)中，藉助於雷射共聚焦顯微鏡的光學系統和光子計數技術，對樣品溶液中的微小區域(顯微鏡的雷射會聚的聚焦區域，稱作「共聚焦體積」)內進出的螢光分子或螢光標記分子(螢光分子等)的螢光強度進行測量，並且基於由測得的螢光強度的自相關函數值所確定的螢光分子等在微小區域中的平均駐留時間(平移擴散時間)和駐留分子數的平均值，實現了諸如螢光分子等的運動速度、尺寸或濃度等信息的獲取和/或諸如分子的結構或大小的變化、分子的結合或離解反應或者分散和團聚等各種現象的檢測。此外，在螢光強度分布分析(Fluorescence Intensity Distribution Analysis :FIDA,例如專利文獻3)或者光子計數統計分析(Photon Counting Histogram :PCH,例如專利文獻4)中，生成了通過與FCS類似的方式測得的進出共聚焦體積的螢光分子等的螢光強度的直方圖，並且通過將統計模型公式與直方圖的分布擬合來計算螢光分子等的特徵亮度的平均值以及共聚焦體積內駐留的分子的平均數，從而，將基於這些信息估算分子的結構或尺寸變化、結合或離解狀態或者分散和團聚狀態。此外，在專利文獻5和6中，提出了基於使用共聚焦顯微鏡的光學系統測得的樣品溶液中螢光信號的時間演進來檢測螢光物質的方法。專利文獻7提出了一種信號計算處理技術，其利用光子計數技術測量來自流過流式細胞儀的螢光微粒或者來自固定在基板上的螢光微粒的微弱光，以檢測螢光微粒是否存在於流體中或者基板上。特別地，根據諸如FCS和FIDA等採用了使用共聚焦顯微鏡的光學系統和光子計數技術來對微小區域進行螢光測量的技術的方法，與現有技術相比，測量所需的樣品量可以極少(一次測量所使用的量最多幾十μ L)且濃度極低，並且測量時間也大幅縮短(在一次測量中，反覆進行若干次時間為秒量級的測量)。因此，特別是在對醫學或生物學研究和開發領域中常用的稀有或昂貴的樣品進行分析時，或者在諸如疾病臨床診斷或生物活性物質的篩選等對大量的樣本進行試驗時，期望這些技術與傳統的生化方法相比是使得能夠以低成本和/或快速地進行實驗或試驗的強力的手段。現有技術文獻專利文獻專利文獻I :日 本特開2005-098876專利文獻2 :日本特開2008-292371專利文獻3 日本特許第4023523號專利文獻4 :國際公開2008-080417專利文獻5 :日本特開2007-20565專利文獻6 :日本特開2008-116440專利文獻7 :日本特開平4-337446號公報非專利文獻非專利文獻I :金城政孝，「蛋白質，核酸,酵素」，Vol. 44，No. 9,1431 — 1438頁，1999 年。非專利文獻2 F. J.梅耶-阿姆茲(F. J. Meyer-Alms),螢光相關光譜學(Fluorescence Correlation Spectroscopy), R.裡格爾(R. Rigler)編，施普林格(Springer)，柏林，2000 年,204 — 224 頁。非專利文獻3 :加藤則子外4名，遺傳子醫學，Vol. 6，No. 2，271 — 277頁。

發明內容
發明要解決的問題在諸如FCS、FIDA和PCH等上述光學分析技術中，簡要地說，通過統計處理算出測得的螢光強度的時間波動的大小，然後基于波動的大小確定在樣品溶液中的微小區域內進出的螢光分子等的各種特性。因此，為了在上述光學分析技術中獲得顯著的結果，優選的是，以如下方式準備被用作樣品溶液中的觀測對象的螢光分子等的濃度或數密度使得在平衡狀態下，在秒量級長度的一次測量時間內，有使得統計處理能夠進行的數量的螢光分子等將進出微小區域，優選地，使得在微小區域中將總是存在大約一個螢光分子等(典型地，由於共聚焦體積的體積為大約lfL，所以優選的是螢光分子等的濃度為大約InM以上)。換言之，當樣品溶液中被觀測粒子的濃度或數密度遠遠低於使得統計處理能夠進行的水平(例如，遠遠低於InM)時，會出現在測量時間內很少有被觀測對象進入到微小區域內的狀態，因此，螢光強度的測量結果會包括很長一段時間的在微小區域內完全不存在被觀測對象的狀態，並且顯著的螢光強度的觀測量也會減小，因此，不能夠期望在如上所述基於螢光強度的統計波動的光學分析技術中有顯著的或精確的分析結果。在專利文獻5和6中描述的使用共聚焦顯微鏡的光學系統檢測螢光物質的方法中，在未對螢光強度波動如上所述地進行統計處理的情況下，能夠根據遍及數秒的測量時間內是否產生具有顯著強度的螢光信號來確定樣品中是否存在被觀測螢光分子等，並且公開了，已經獲得具有顯著強度的螢光信號的頻率與樣品中螢光分子等的數量之間的相關性。特別地，在專利文獻6中啟示，攪動樣品溶液的內部的隨機流動的發生改善檢測敏感度。然而，即使在那些方法中，也僅僅檢測到是否存在由於擴散或隨機流動而隨機地進出微小區域的螢光分子等，而不能掌握微小區域內的螢光分子等的粒子的行為，所以，例如沒有實現粒子的計數或者粒子的濃度或數密度的定量計算。此外，專利文獻7中描述的技術在於檢測流式細胞儀中的流體內是否存在單個螢光微粒或者檢測是否存在固定於基板上的單個螢光微粒，而不是用於對在樣品溶液中在通常狀態下被溶解或分散的諸如分子和膠體等粒子、即在樣品溶液中隨機移動的粒子進行檢測的技術，因此，沒有實現定量地算出樣品溶液內溶解或分散的粒子的濃度或數密度。此外，由於專利文獻7的技術包括諸如流式細胞儀中的測量或將螢光粒子固定於基板的處理等過程，所以與諸如FCS、FIDA和PCH等光學分析技術的情況相比，大大地增加了試驗所需的樣品量，並且對於進行試驗的人員可能要求複雜且先進的操作技術。因此，本發明的一個目的在於提供一種新的光學分析技術，該技術不包括諸如FCS,FIDA和PCH等光學分析技術中進行的統計處理，使得能夠在包含的被觀測粒子的濃度或數密度比諸如FCS、FIDA和PCH等光學分析技術所能夠處理的水平低的樣品溶液中檢測被觀測粒子的狀態或特性。
另外，本發明的另一目的在於提供一種實現上述新的光學分析技術的光學分析裝置、方法或用於光學分析的電腦程式，其中，能夠在與諸如FCS、FIDA和PCH等光學分析技術相似的短的測量時間內利用少量樣品(例如，數十μ L的水平)完成測量，還能夠定量地確定被觀測粒子的諸如濃度或數密度等特性。用於解決問題的方案總的來說，在本發明中，提出了一種新型光學分析技術，該技術藉助於諸如共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學系統等能夠對來自溶液中的微小區域的光進行檢測的光學系統對分散在樣品溶液中且在樣品溶液中隨機地移動的發光的粒子(以下稱為「發光粒子」)發出的光進行檢測，該技術在使微小區域的位置在樣品溶液中移動的同時(即，在利用微小區域掃描樣品溶液的內部的同時)對來自微小區域、即光檢測區域的光進行檢測，由此單個地檢測橫穿微小區域的內部的發光粒子，並且使得能夠對發光粒子計數和能夠獲取關於樣品溶液內的發光粒子的濃度或數密度的信息。根據本發明的一個方面，提供了一種光學分析裝置，其通過使用共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學系統對來自發光粒子的光進行檢測，所述發光粒子分散在樣品溶液中且在所述樣品溶液中隨機地移動，其特徵在於，所述光學分析裝置包括光檢測區域移動部，其使所述光學系統的光檢測區域的位置在所述樣品溶液中移動；光檢測部，其對來自所述光檢測區域的光進行檢測；和信號處理部，其產生在所述光檢測區域的位置在所述樣品溶液中移動的過程中利用所述光檢測部檢測的來自所述光檢測區域的光的時間序列光強度數據，對所述時間序列光強度數據進行平滑處理，並且隨後在經過平滑處理的所述時間序列光強度數據中單個地檢測來自每個所述發光粒子的光信號。在該結構中，「分散在樣品溶液中且在樣品溶液中隨機地移動的發光粒子」是能發光且分散或溶解在樣品溶液中的諸如原子、分子或其團聚體等粒子，並且可以是在溶液中自由地進行布朗運動而未固定於基板的任意微粒物質等。該發光粒子典型地為螢光粒子，但是也可以是通過磷光、化學發光、生物發光、光散射等發光的粒子。共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學系統的「光檢測區域」是那些顯微鏡中的檢測光的微小區域，該區域與當照明光從物鏡發出時將照明光會聚到的區域對應(該區域根據共聚焦顯微鏡中的、特別是物鏡和針孔之間的空間關係來確定。對於在沒有照明光的情況下發光的發光粒子，例如根據化學發光或生物發光的粒子，在顯微鏡中不需要照明光。)。在這方面，在本說明書中，「光信號」是指「表示光的信號」。如從以上可以理解到的，在本發明的裝置的基本結構中，首先，在使光檢測區域的位置在樣品溶液中移動的同時，即在利用光檢測區域掃描樣品溶液的內部的同時，順次地進行光的檢測。因此，當移動的光檢測區域包括隨機地移動的發光粒子時，通過光檢測部檢測來自發光粒子的光，由此，通過捕獲該光，將檢測到存在一個發光粒子。在那種情況下，當一個發光粒子是單個或多個螢光分子時，光從發光粒子隨機地發出，並且會在微小時間內產生光信號值的落差。並且當產生這樣的落差時，指明與一個發光粒子的存在對應的信號變得困難。因此，將該裝置的信號處理部設計成根據光檢測部檢測到的信號順次地產生時間序列光強度數據；並有對該時間序列光強度數據應用平滑處理，以使得光信號值的落差可以被忽略的方式處理數據，並且隨後在經過平滑處理的時間序列光強度數據中單個地檢測來自每個發光粒子的光信號。在該方面，典型地，光檢測部通過光子計數檢測來自光檢測區域的光，因此，在那種情況下，時間序列光強度數據是時間序列光子數數據。當在溶液中隨機移動的發光粒子如上所述變得可被單個地檢測時，將獲取關於溶 液中的發光粒子的狀態的各種信息。具體地，例如，在本發明的裝置中，信號處理部可以被設計成通過對單個地檢測到的發光粒子的光信號的數量計數(發光粒子的計數)，對在光檢測區域的位置移動的過程中檢測到的發光粒子的數量計數。根據該結構，通過將發光粒子數與光檢測區域的位置的移動量相關聯，將獲取關於樣品溶液內的發光粒子的數密度或濃度的信息。特別地，通過用任意方法確定光檢測區域的位置的移動軌跡的總體積，例如通過使光檢測區域以預定的速度移動，能夠具體地計算出發光粒子的數密度或濃度。當然，代替直接確定絕對的數密度值或濃度值，可以計算出數密度或濃度相對於多個樣品溶液或者相對於作為濃度或數密度的基準的標準溶液的相對比率。在本發明的裝置的信號處理部的處理中，可以基於經過平滑處理的時間序列光強度數據中的光信號的形狀判定是否有一個發光粒子已經進入光檢測區域。在實施方式中，典型地，當檢測到具有比預定閾值大的強度的光信號時，可以檢測出一個發光粒子已經進入到光檢測區域內。此外，在上述本發明的裝置中，基於發光粒子的特性或樣品溶液內發光粒子的數密度或濃度來適當地改變光檢測區域的位置在樣品溶液中的移動速度。如本領域普通技術人員所理解的，來自發光粒子的檢測到的光的狀態可以根據發光粒子的特性或樣品溶液內發光粒子的數密度或濃度而改變。特別地，當光檢測區域的移動速度變快時，從一個發光粒子獲得的光量將減小，所以，優選的是能夠適當地改變光檢測區域的移動速度，使得能夠以精確的或足夠的靈敏度測量來自一個發光粒子的光。此外，在本發明的裝置中，優選地，將光檢測區域的位置在樣品溶液中的移動速度設定為高於作為待檢測對象的發光粒子的擴散移動速度(粒子由於布朗運動而移動的平均移動速度)。如上所述，當光檢測區域通過存在發光粒子的位置時，本發明的裝置檢測到從發光粒子發出的光，由此單個地檢測發光粒子。然而，當發光粒子由於布朗運動而隨機地移動以致多次進出光檢測區域時，將多次檢測到來自一個發光粒子的光信號(表明存在發光粒子)，所以，使存在一個發光粒子與檢測到的光信號相關聯變得困難。因此，如上所述，將光檢測區域的移動速度設定為高於發光粒子的擴散移動速度，由此，變成能夠使一個發光粒子與一個光信號(表明存在發光粒子)相對應。在這方面，由於擴散移動速度取決於發光粒子而不同，所以，優選地，如上所述可以將本發明的裝置設計成能夠根據發光粒子的特性(特別是擴散常數)來適當地改變光檢測區域的移動速度。可以以任意方式來完成用於使光檢測區域的位置移動的光學系統的光路的改變。例如，可以通過使用雷射掃描型光顯微鏡中採用的電流鏡改變光路來改變光檢測區域的位置，或者在不移動光檢測區域時，可以通過移動樣品溶液的位置(移動顯微鏡的載物臺)來移動樣品溶液中的光檢測區域的位置。光檢測區域的位置移動軌跡可以任意地設定，例如，該移動軌跡可以從圓形、橢圓形、矩形、直線和曲線中選擇。在實施方式中，可以將使用共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學系統對來自樣品溶液中的發光粒子的光進行檢測的本發明的光學分析裝置設計成在使光學系統的光檢測區域以比樣品溶液內發光粒子的擴散移動速度快的速度在樣品溶液中移動的同時，對進入到光檢測區域內部的各個發光粒子發出的光信號單個地進行檢測，並且通過對光信號計數來對進入到光檢測區域的發光粒子數進行檢測。在上述本發明的裝置中與使光檢測區域的位置在樣品溶液中移動一起進行光檢測、並且對來自各個發光粒子的光信號單個地進行檢測的光學分析技術的處理也可以通過通用計算機來實現。因此，根據本發明的另一方面，提供了一種用於光學分析的電腦程式，其用於通過使用共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學系統對來自發光粒子的光進行檢測，所述發光粒子分散在樣品溶液中且在所述樣品溶液中隨機地移動，其特徵在於，所述電腦程式使計算機執行如下進程使所述光學系統的光檢測區域的位置在所述樣品溶液中移動；在使所述光檢測區域的位置在所述樣品溶液中移動的同時對來自所述光檢測區域的光進行檢測，並且產生時間序列光強度數據；對所述時間序列光強度數據進行平滑處理；和在經過平滑處理的所述時間序列光強度數據中單個地檢測來自每個發光粒子的光信號。另外，該電腦程式可以包括通過對單個地檢測出的來自發光粒子的光信號的數量計數來對在光檢測區域的位置移動的過程中檢測到的發光粒子的數量進行計數的進程；和/或基於檢測到的發光粒子數來確定樣品溶液內的發光粒子的數密度或濃度的進程。典型地，在檢測來自光檢測區域的光以產生時間序列光強度數據的進程中，通過光子計數來檢測來自光檢測區域的光，並且在那種情況下，時間序列光強度數據為時間序列光子數數據。在使光檢測區域的位置移動的過程中，可以使光檢測區域的位置以預定的速度或者比發光粒子的擴散移動速度快的速度移動，並且可以基於發光粒子的特性或樣品溶液內發光粒子的數密度或濃度來設定光檢測區域的位置的移動速度。此外，在信號處理過程中， 可以基於經過平滑處理的時間序列光強度數據中的光信號的形狀來判定一個發光粒子是否進入到光檢測區域中，例如，基於具有比預定閾值大的強度的光信號的檢測來判定。光檢測區域的位置的移動軌跡可以從圓形、橢圓形、矩形、直線和曲線中選擇。此外，根據上述本發明的裝置或電腦程式，實現了新的光學分析方法，該方法通過與使光檢測區域的位置在樣品溶液中移動一起對光進行檢測，來單個地檢測來自各個發光粒子的光信號。因此，本發明的光學分析方法，其通過使用共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學系統對來自發光粒子的光進行檢測，所述發光粒子分散在樣品溶液中且在所述樣品溶液中隨機地移動，其特徵在於，所述方法包括如下步驟使所述光學系統的光檢測區域的位置在所述樣品溶液中移動；在使所述光檢測區域的位置在所述樣品溶液中移動的同時對來自所述光檢測區域的光進行檢測，並且產生時間序列光強度數據；對所述時間序列光強度數據進行平滑處理；和在經過平滑處理的所述時間序列光強度數據中單個地檢測來自每個發光粒子的光信號。該方法也可以包括通過對單個地檢測出的來自發光粒子的光信號的數量計數來對在光檢測區域的位置移動的過程中檢測到的發光粒子的數量進行計數的步驟；和/或基於檢測到的發光粒子數來確定樣品溶液內的發光粒子的數密度或濃度的步驟。此外，在使光檢測區域的位置移動的步驟中，可以使光檢測區域的位置以預定的速度或比發光粒子的擴散移動速度快的速度移動，並且可以基於發光粒子的特性或樣品溶液內發光粒子的數密度或濃度來設定光檢測區域的位置的移動速度。此外，在信號處理步驟中，可以基於經過平滑處理的時間序列光強度數據中的光信號的形狀來判定一個發光粒子是否進入到光檢測區域中，例如基於對具有比預定閾值大的強度的光信號的檢測來判定。發明的效果通過上述本發明的裝置、方法或電腦程式實現的光學分析技術為自身的光檢測 機構採用了如下結構與諸如FCS、FIDA和PCH等光學分析技術的情況類似，對來自共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡中的光檢測區域的光進行檢測，因此，樣品溶液的量可以同樣地少。然而，由於在本發明中未進行計算螢光強度波動的統計處理，所以本發明的光學分析技術適用於發光粒子的數密度或濃度大大地低於諸如FCS、FIDA和PCH等光學分析技術所需的水平的樣品溶液。此外，由於在本發明中對分散或溶解在溶液中的各個發光粒子單個地進行檢測，所以通過使用關於粒子的信息能夠定量地進行發光粒子的計數、樣品溶液中發光粒子的濃度或數密度的計算或者獲取關於濃度或數密度的信息。例如，雖然專利文獻5和6能夠獲取在預定時間內強度超過預定閾值的螢光信號的頻率的總數與樣品溶液中螢光分子等的粒子數之間的相關性，但是不能掌握通過測量區域的粒子的動態行為(粒子是徑直通過測量區域或是駐留在測量區域內)，因此，強度比預定閾值高的螢光信號與通過測量區域的粒子之間的對應關係不清楚，從而發光粒子的計數從理論上講是不可能的，從而難以精確地確定樣品溶液內粒子的濃度。然而，根據本發明，由於使得通過光檢測區域的發光粒子與檢測到的光信號以I對I的方式相關聯，使得一次將檢測一個發光粒子，所以對分散在溶液中且在溶液中隨機地移動的發光粒子的計數成為可能，並且與傳統技術相比能夠精確地確定樣品溶液中粒子的濃度或數密度。本發明的光學分析技術典型地用於生物微粒對象的溶液的狀態分析，其中生物微粒對象為例如蛋白質、肽、核酸、脂質、糖鏈、胺基酸或者其團聚體等生物分子，以及病毒和細胞等，但是也可以用於溶液中非生物粒子(例如原子、分子、膠束、金屬膠體等)的狀態分析，並且應當理解的是，這些情況也都包含在本發明的範圍內。在該方面，在本發明中，根據在對光檢測部中檢測的來自光檢測區域的光的時間序列光強度數據進行平滑處理之後、在經過平滑處理的時間序列光強度數據中單個地檢測每個發光粒子的光信號的方式，即使在微小時間內的落差因為光從一個發光粒子隨機地發出並且粒子數小而出現在來自一個發光粒子的光信號的值中的情況下(例如當發光粒子時單個螢光分子時)，可以使光強度數據上出現的光信號與發光粒子精確地對應，因此，發光粒子數的更精確的計數、進而在良好的狀況下對發光粒子的濃度或數密度的測量變得可能。[在專利文獻5和6的情況下，時間序列光強度數據上出現的光信號與發光粒子不關聯。另外，在利用傳統的流式細胞儀中的螢光測量來檢測發光粒子的技術的情況下，由於觀測到的發光粒子是攜帶多個螢光分子的粒子，所以在來自一個發光粒子的光信號的值中不會產生微小時間內的極大的落差，因此不對光強度數據進行平滑處理。]本發明的其他目的和優點將通過以下對本發明的優選實施方式的說明變得清楚。


[圖I]圖I的(A)是根據本發明的光學分析裝置的內部結構的示意圖。圖I的(B)是共聚焦體積(共聚焦顯微鏡的觀測區域)的示意圖。圖I的(C)是用於改變鏡7的方向以使光檢測區域的位置在樣品溶液中移動的機構的示意圖。圖I的(D)是用於移動顯微感光板的水平位置以使光檢測區域的位置在樣品溶液中移動的機構的示意圖。[圖2]圖2的(A)和圖2的(B)分別是說明根據本發明的光學分析技術來檢測光的原理的示意圖和測得的光強度隨時間變化的示意圖。圖2的(C)是對光子數數據進行平 滑處理和擬合處理的示意圖。[圖3]圖3的(A)和圖3的(B)分別是發光粒子由於布朗運動而橫穿光檢測區域的情況下的模型圖和示出在該情況下光子數(光強度)隨時間的變化的示例的圖。[圖4]圖4的(A)和圖4的(B)分別是使得光檢測區域的位置以比發光粒子的擴散移動速度快的速度在樣品溶液內移動時發光粒子橫穿光檢測區域的情況下的模型圖和示出在該情況下光子數(光強度)隨時間的變化的示例的圖。[圖5]圖5是說明包括檢測出的信號的二值化處理的、根據通過本發明的光學分析技術測得的光子數(光強度)的時間變化執行發光粒子的計數的信號處理步驟的一個示例的圖。[圖6]圖6是說明包括檢測出的信號的微分處理的、根據通過本發明的光學分析技術測得的光子數(光強度)的時間變化執行發光粒子數的計數的信號處理步驟的一個示例的圖。[圖7]圖7是對通過本發明的光學分析技術來檢測發光粒子以及對發光粒子計數的計算實驗用模型進行說明的圖。[圖8]圖8的(A)示出通過本發明的光學分析技術測得的時間序列光子數數據的示例；圖8的(B)示出經過平滑處理的時間序列光子數數據(通過對時間序列光子數數據實施平滑處理而獲取的數據);圖8的(C)示出對經過平滑處理的時間序列光子數數據進行擬合的高斯函數曲線。圖8的(D)示出用於確定經過平滑處理的時間序列光子數數據中脈衝存在區域的處理。[圖9]圖9示出通過本發明的光學分析技術測得的光子數數據(棒狀線)、通過對數據進行平滑處理而獲得的曲線(虛線)和對存在峰值的區域擬合的高斯函數(實線)的示例。圖中，附有「噪聲」的信號作為由噪聲或雜質產生的信號而被忽視。[圖10]圖10的(A)示出根據本發明的發光粒子數檢測實驗的結果；圖10的(B)示出利用平板讀取器進行的發光粒子的螢光強度測量實驗的結果。圖中，縱向條均表示三次測量的平均值，而誤差條示出三次測量的SD值。圖10的(C)是標出與發光粒子對應的脈衝信號的數量(脈衝數)以及與各樣品溶液中的發光粒子濃度相關的光子總數(光子數)的圖表，其中，在根據本發明進行發光粒子數檢測實驗而獲得的時間序列光子數數據中檢測所述脈衝信號的數量，並且在同一時間序列光子數數據中檢測所述光子總數。[圖11]圖11的(A)是關於含有100fM、lpM和IOpM的發光粒子的樣品溶液，以圖表的形式示出在未應用平滑處理的時間序列光子數數據中被檢測為與發光粒子對應的脈衝信號的信號數量的圖，以及圖11的(B)是關於相同的樣品溶液，以圖表的形式示出在應用了平滑處理的時間序列光子數數據中被檢測為與發光粒子對應的脈衝信號的信號數量的圖。[圖12]圖12示出在計算螢光強度波動的傳統光學分析技術中獲得的光子數(光強度)的時間變化的示例，其中，圖12的(A)示出粒子濃度處於在測量中提供足夠精度的水平的情況，圖12的(B)示出樣品中的粒子濃度顯著地低於情況(A)時的情況。附圖標記說明 I...光學分析裝置(共聚焦顯微鏡)2...光源3···單模光纖4...準直透鏡5···分色鏡6,7,11...反射鏡8...物鏡9...顯微感光板10...井(樣品溶液容器)12...聚光透鏡13···針孔14···阻斷濾片15...多模光纖16···光電檢測器17...鏡偏轉器17a...載物臺位置改變裝置18···計算機
具體實施例方式
在下文中，詳細地描述本發明的優選實施方式。光學分析裝置的結構實現本發明的光學分析技術的光學分析裝置的基本結構可以是如圖I的(A)中示意性地示出的那樣通過將能夠被用來進行FSC、FIDA等的共聚焦顯微鏡的光學系統與光電檢測器組合而形成的裝置。參照附圖，光學分析裝置I由光學系統2-17和計算機18構成，該計算機18用於獲取和分析數據並且控制光學系統的各部件的操作。光學分析裝置I的光學系統可以與通常的共聚焦顯微鏡的光學系統相同，其中，從光源2發出並通過單模光纖3的內部傳輸的雷射(Ex)在光纖的發射端形成以固有NA所決定的角度放射的發散光；並且在利用準直透鏡4形成平行光束之後，光在分色鏡5和反射鏡6、7上反射，從而進入到物鏡8中。典型地，在物鏡8的上方放置被分注了一至數十yL的樣品溶液的樣品容器或者其上配置有井10的顯微感光板9，並且從物鏡8發出的雷射在樣品容器或井10中的樣品溶液內聚焦，從而形成具有強的光強度的區域(激發區域)。螢光粒子或者附有諸如螢光染料等發光標記的粒子等作為被觀測對象的發光粒子在樣品溶液中分散或溶解，並且當發光粒子進入到激發區域時，發光粒子在駐留於激發區域中的過程中被激發，從而發出光。在通過物鏡8和分色鏡5之後，發出的光(Em)在鏡11上反射並且被聚光透鏡12會聚，然後該光通過針孔13、透過阻斷濾片14 (在這裡僅選擇處於特定波長帶區域的光分量)並被導入多模光纖15中，從而到達光電檢測器16，並且在轉換為時間序列電信號之後，該信號被輸入到計算機18中，在計算機18中以稍後說明的方式執行用於光學分析的處理。在這方面，如本領域技術人員所知道的，在上述結構中，針孔13位於物鏡8的聚焦位置的共軛位置處，因此，僅從如圖I的(B)中示意性地示出的雷射的聚焦區域、即激發區域發出的光通過針孔13，而來自激發區域之外的其他區域的光被阻擋。圖I的(B)中示出的雷射的聚焦區域是該光學分析裝置中的有效體積通常為大約I-IOfL的光檢測區域(典型地，光強度與在區域的中央具有峰值的高斯分布一致地展開。有效體積是以光強度減小至峰值強度的Ι/e2的表面為邊界 的近似橢球的體積)，該有效體積稱作「共聚焦體積」。此外，由於在本發明中對來自一個發光粒子的光、例如來自一個螢光染料分子的微弱光進行檢測，所以，優選地，光電檢測器16使用能夠用於光子計數的超高靈敏度光電檢測器。當通過光子計數來進行光的檢測時，以對預定時間內的每個預定單位時間(BIN時間)測量到達光電檢測器的光子的數量的方式，連續地進行光強度的測量。因此，在這種情況下，時間序列光強度數據是時間序列光子數數據。此外，可以在顯微鏡的載物臺(未示出)上設置用於使顯微感光板9的水平位置移動的載物臺位置改變機構17a，以改變被觀測的井10。載物臺位置改變裝置17a的操作可以由計算機18控制。根據該結構，即使存在兩個以上的樣本也能夠實現快速的測量。此外，在上述光學分析裝置的光學系統中，設置有用於利用光檢測區域、即聚焦區域掃描樣品溶液的內部，也就是用於使光檢測區域在樣品溶液內移動的機構。對於用於使光檢測區域的位置移動的該機構，例如，如圖I的(C)中示意性地示出的那樣，可以採用改變反射鏡7的方向的鏡偏轉器17 (使光檢測區域的絕對位置移動的類型)。該鏡偏轉器17可以與配備在通常的雷射掃描型顯微鏡上的電流鏡裝置中的鏡偏轉器相同。或者，可替代地，如圖I的(D)所示，可以採用載物臺位置改變裝置17a來移動分注了樣品容液的容器10(顯微感光板9)的水平位置，以使光檢測區域的相對位置在樣品溶液中移動(使樣品溶液的絕對位置移動的類型)。無論在哪一種類型中，為了得到光檢測區域的位置期望的移動圖形，在計算機18的控制下與光電檢測器16的光檢測協調一致地驅動鏡偏轉器17或者載物臺位置改變裝置17a。光檢測區域的位置的移動軌跡可以從圓形、橢圓形、矩形、直線和曲線中以單個或組合的形式任意地選擇(在計算機18中的程序中，可以設計成能夠選擇多種移動圖形。)。在這方面，雖然未示出，但是可以通過上下移動物鏡8而使光檢測區域的位置在上下方向上移動。在用作被觀測對象的發光粒子通過多光子吸收而發光的情況下，上述光學系統被用作多光子顯微鏡。在那種情況下，由於光僅從激發光的聚焦區域(光檢測區域)發出，所以可以移除針孔13。此外，在用作被觀測對象的發光粒子不是由於激發光而是由於化學發光或生物發光現象而發光的情況下，可以省略用於產生激發光的光學系統2-5。當發光粒子由於磷光或散射光而發光時，照原樣使用上述共聚焦顯微鏡的光學系統。此外，如圖所示，在光學分析裝置I中，可以設置兩個以上的激發光源2，使得能夠根據發光粒子的激發波長適當地選擇激發光的波長。類似地，也可以設置兩個以上的光電檢測器16，使得當樣品包含波長彼此不同的兩種以上的發光粒子時，能夠根據波長對分別從這些發光粒子發出的光分開地進行檢測。本發明的光學分析技術的原理諸如FCS和FIDA等光譜分析技術的優點在於，與傳統的生化分析技術相比，需要的樣品量極少並且能夠迅速地進行試驗。然而，在諸如FCS和FIDA等這些光譜分析技術中，從原理上講是基於螢光強度波動來計算被觀測粒子的濃度和特性，所以，為了獲得精確的測量結果，樣品溶液中的被觀測粒子的濃度或數密度應當處於如圖12的(A)所示意性地繪出的那樣在測量螢光強度的過程中光檢測區域CV內總是存在大約一個被觀測粒子的水平，使得如圖中右手側所示出的那樣在測量時間內總是能夠檢測到顯著的光強度(光子數)。當被觀測粒子的濃度或數密度低於上述水平、例如處於如圖12的(B)所繪出的那樣被觀測粒子很少進入到光檢測區域CV內的水平時，如圖中右手側所示，在一部分測量時間·中將不會出現顯著的光強度(光子數)，因此，精確地計算光強度波動會變得困難。另外，當被觀測粒子的濃度顯著地低於在測量過程中光檢測區域的內部總是存在大約一個被觀測粒子的水平時，光強度波動的計算會受到背景的影響，為了獲得足夠用於計算的顯著數量的光強度數據(光子數)，應當延長測量時間。為此，在本發明中，提出了一種基於新的原理的光學分析技術，即使當被觀測粒子的濃度低於諸如FCS和FIDA等上述光譜分析技術中所要求的水平時，該光學分析技術也能夠檢測被觀測粒子的諸如數密度或濃度等特性。在本發明的光學分析技術中，簡要地說，在進行處理時，與通過驅動用於使光檢測區域的位置移動的機構(鏡偏轉器17或載物臺位置改變裝置17a)從而如圖2中所示意性地繪出的那樣使得光檢測區域CV的位置在樣品溶液中移動、即利用光檢測區域CV掃描樣品溶液的內部一起進行光檢測。因此，例如，如在圖2的(A)中，在使光檢測區域CV移動的過程中(圖中，時間t0至t2)，當光檢測區域CV通過存在一個發光粒子(圖中為螢光染料)的區域時(tl)，如圖2的(B)所示顯著的光強度(Em)將被檢測為脈衝狀的信號。因此，通過在如上所述執行使光檢測區域CV的位置移動和光檢測的過程中逐個地檢測如圖2的(B)所示的那樣出現的各顯著的光強度、即各脈衝狀的信號，而單個地檢測發光粒子，並且通過對發光粒子數計數，能夠獲取關於測量區域內存在的發光粒子的數量、濃度或數密度的信息。應當理解的是，在本發明的光學分析技術的原理中，沒有執行諸如計算螢光強度波動等統計計算處理，而是逐個地檢測發光粒子，因此，即使在發光粒子(被觀測粒子)的濃度處於在FCS和FIDA中不能夠進行足夠精確的分析的低的水平的樣品溶液中，也能夠獲取關於發光粒子的濃度或數密度的信息。在這方面，如「發明內容」部分已經指出的，在發光粒子是單分子水平或多分子水平的螢光染料等的情況下，從發光粒子發出的光子的數量少並且光子是隨機發出的。因此，在實際的光強度數據(光子數數據)中，光子數(光強度)的值(PC)如圖2的(C)所示會在微小時間內具有落差，因此，如果試圖從原始光子數數據檢測發光粒子的光信號，來自一個發光粒子的光可能偶然被錯誤地檢測為來自兩個或多個發光粒子的光。例如，在示出的示例中，儘管光子數PC的組被認作來自一個發光粒子的光，但由於微小時間內落差的存在，例如可能將三個信號組和(iii)錯誤識別為對應於不同的發光粒子的信號。因此，在本發明中，使用移動平均法等對原始光子數數據應用平滑處理。當應用平滑處理時，如圖中實線所繪出的，光子數的值變為近似的鐘形脈衝信號，由此與來自一個發光粒子的光對應的信號檢測變得容易，從而減少將來自一個發光粒子的光信號錯誤識別為來自兩個或多個發光粒子的光信號的可能性。此外，通過將諸如圖中虛線所繪出的高斯函數等鐘形函數與經過平滑處理的光子數數據中出現的各個脈衝狀信號擬合，並且基於擬合結果來判定各個脈衝狀信號是否是與來自發光粒子的光對應的信號，可以實現與經過平滑處理的光子數數據中來自發光粒子的光對應的信號的檢測。本發明的光分析裝置的操作和操作過程 具體地，在利用如圖I的(A)所示的本發明的光學分析裝置I的光學分析中，執行(I)測量包含發光粒子(被觀測粒子)的樣品溶液的光強度的過程和(2)分析測得的光強度的過程。( I)樣品溶液的光強度的測量在本發明的光學分析技術中用作被觀測對象的粒子可以是任意粒子，只要該粒子分散在樣品溶液中並且在樣品溶液中隨機地移動即可、諸如溶解的分子等，例如，粒子可以是生物分子，即蛋白質、肽、核酸、脂質、糖鏈、胺基酸等或者這些生物分子的團聚體，也可以是病毒、細胞、金屬膠體或其他非生物分子。當用作被觀測對象的粒子不是發光粒子時，使用以任意方式將發光標記(突光分子、磷光分子、化學發光分子或生物發光分子)貼附於被觀測粒子而製備的粒子。樣品溶液典型地為水溶液，然而不限於此，也可以使用有機溶劑和其他任意液體。除了在測量過程中驅動鏡偏轉器17或載物臺位置改變裝置17a以使光檢測區域的位置在樣品溶液內移動(以掃描樣品溶液的內部)之外，可以以與FCS或FIDA中的光強度測量過程相同的方式在本發明的光學分析中進行光強度的測量。在操作過程中，典型地，在將樣品溶液分注到顯微感光板9的井10內並且將其放在顯微鏡的載物臺上之後，當使用者向計算機18輸入測量開始的命令時，計算機18執行存儲在存儲裝置(未示出)中的程序(使光檢測區域的位置在樣品溶液中移動的進程，和在使光檢測區域的位置移動的過程中從光檢測區域檢測光並且產生時間序列光強度數據的進程)，因此將啟動利用激發光對樣品溶液中的光檢測區域照明和測量光強度。在該測量過程中，根據程序在計算機18的操作過程的控制下，鏡偏轉器17或載物臺位置改變裝置17a驅動鏡7 (電流鏡)或顯微鏡的載物臺上的顯微感光板9以使光檢測區域的位置在井10內移動，與此同時，光電檢測器16順次地將檢測到的光轉換成電信號並將該電信號傳輸至計算機18，計算機18將傳輸的光信號生成時間序列光強度數據並且以任意方式將該時間序列光強度數據存儲起來。在這方面，光電檢測器I6典型地為能夠檢測單個光子的到達的超高靈密度光電檢測器，因此，時間序列光強度可以是時間序列光子數數據。在測量光強度的過程中光檢測區域的位置的移動速度可以是例如通過實驗或者為了滿足分析的目的而任意設定的預定速度。在基於檢測到的發光粒子數來獲取關於數密度和濃度的信息的情況下，需要知道光檢測區域通過的區域的尺寸或體積，因此，以使得能夠掌握移動距離的方式進行光檢測區域的位置的移動。在這方面，因為如果經過時間與光檢測區域的位置的移動距離成比例，則測量結果的解釋將變得容易，所以，基本上優選的是移動速度恆定，然而不限於此。順便提一句，關於光檢測區域的位置的移動速度，為了根據測得的時間序列光強度數據或者對發光粒子數的計數來定量地、精確地、單個地檢測發光粒子，優選的是，將移動速度設定為比發光粒子的隨機運動、即布朗運動中的移動速度快的值。由於本發明的光學分析技術中的被觀測粒子是分散或溶解到溶液中並且自由地隨機移動的粒子，所以其位置由於布朗運動而隨時間移動。因此，當光檢測區域的位置的移動速度比粒子的由於布朗運動而移動的速度慢時，粒子將如圖3的(A)中所示意性地繪出的那樣在區域中隨機地移動，從而如圖3的(B)所示，光強度隨機地變化(如已經指出的，光檢測區域中的激發光強度從區域的中央處的峰值朝向外側降低)，使得確定與各發光粒子對應的顯著的光強度變化變得困難。因此，優選地，如圖4的(A)所繪出的那樣，光檢測區域的位置的移動速度被設定為比粒子的由於布朗運動而移動的平均移動速度(擴散移動速度)快，使得粒子將近似直線地橫穿光檢測區域，並且如圖4的(B)所示，與各個發光粒子對應的光強度的變化的輪廓
在時間序列光強度數據中變得幾乎一致(當發光粒子近似直線地通過光檢測區域時，光強度變化的輪廓與激發光強度分布類似)，並且能夠容易地確定各發光粒子與光強度之間的對應關係。具體地，擴散係數為D的發光粒子由於布朗運動而通過半徑為Wo的光檢測區域(共聚焦體積)所需的時間At由均方位移關係的表達式(2ffo)2=6D · At(I)給出，為Δ t= (2ffo) 2/6D —(2)，因此，發光粒子由於布朗運動而移動的速度(擴散移動速度)Vdif近似為Vdif=2ffo/At=3D/ffo —(3)因此，參照該公式，可以將光檢測區域的位置的移動速度設定為比Vdif足夠快的值。例如，假設Wo為大約O. 62 μ m,當被觀測粒子的擴散係數預計大約為D=2. OX 10_1(lm2/S時，Vdif將為I. OX 10_3m/s，因此，可以將光檢測區域的位置的移動速度設定為Vdif的10倍以上，例如15mm/s。在這方面，當被觀測粒子的擴散係數未知時，可以通過設定光檢測區域的位置的各種移動速度而反覆地執行預備試驗以找出光強度變化的輪廓變成期望的輪廓(典型地，與激發光強度分布類似)的條件，以此來確定光檢測區域的位置的適當的移動速度。(2)光強度的分析當通過上述處理獲得了樣品溶液的時間序列光強度數據時，通過根據存儲在存儲裝置中的程序的進程(對時間序列光強度數據進行平滑化處理的進程，以及在經過平滑處理的時間序列光強度數據中單個地檢測各發光粒子的光信號的進程)，可以在計算機18中進行如下所述的光強度的分析。(i) 一個發光粒子的檢測當一個發光粒子通過光檢測區域時的軌跡如圖4的(A)中所示近似為直線時，在時間序列光強度數據中與該發光粒子對應的光強度變化具有如圖5的(A)中所示意性地繪出的、反映光檢測區域(由光學系統確定)中的光強度分布的輪廓(通常近似為鐘形)。因此，在用於檢測發光粒子的一個方法中，為光強度設定閾值Ιο，當光強度超過閾值持續的時間寬度△ τ在預定範圍內時，可以判定光強度的曲線對應於通過光檢測區域的一個發光粒子，因而檢測到一個發光粒子。基於從相對於光檢測區域以預定的速度移動的發光粒子發出的光的強度的期望的輪廓來確定光強度的閾值Io和時間寬度△ τ的預定範圍，具體數值可以任意地或通過實驗來確定，也可以根據被觀測粒子的特性選擇性地確定。此外，在檢測發光粒子的另一個方法中，當光檢測區域內的光強度分布可以假設為高斯分布時I=A · exp (_2t2/a2) ---(4),並且，當通過將表達式(4)與顯著的光強度的輪廓(能夠清楚地判定為不是背景的輪廓)擬合而算出的強度A和寬度a均在預定的範圍內時，判定光強度輪廓與通過光檢測區域的一個發光粒子對應，由此完成一個發光粒子的檢測(強度A和寬度a在預定範圍之外的輪廓在分析中可以作為噪聲或雜質而忽略)。
(ii)發光粒子的計數可以通過以任意方式對由上述發光粒子的檢測方法檢測到的發光粒子數進行計數來完成發光粒子的計數。然而，對於大量的發光粒子，例如可以以下面示出的方式完成該過程。參照圖5的(B)，在根據時間序列光強度(光子數)數據對發光粒子數進行計數的方法的一個示例中，首先，對檢測出的時間序列光強度數據(上欄)進行平滑處理(中欄)。由於光從發光粒子隨機地發出，因而在微小時間內的數據值中產生落差，通過平滑處理可以忽視數據值中的該落差。例如可以通過移動平均法來完成平滑處理。隨後，通過在平滑處理後的時間序列光子數數據中對強度在預定閾值以上的數據點(時間)分配I並且對強度小於閾值的數據點分配0，來對時間序列光子數數據進行二值化處理(下欄)。因此，在所有數據中，通過對那些數值從I變為O或從O變為I的部分計數來對測量過程中橫穿光檢測區域的發光粒子的數量計數。在根據時間序列光強度(光子數)數據對發光粒子數計數的方法的又一個示例中，對如圖5的(B)的情況那樣應用了平滑處理的時間序列光子數數據(圖6的(A))應用微分處理(圖6的(B))。在應用了微分處理的該數據中，因為在強度峰值點處，其值沿時間增加的方向減小並且值為O或者其二次微分值為0，所以將通過對這些點計數來對測量過程中橫穿光檢測區域的發光粒子數進行計數。(iii)發光粒子的數密度或濃度的確定當已經完成了發光粒子的計數時，可以使用光檢測區域通過的總區域的體積來確定發光粒子的數密度或濃度。然而，光檢測區域的有效體積取決於激發光的或檢測出的光的波長、透鏡的數值孔徑以及光學系統的調整狀態而變化，因此，難以根據設計參數值來計算光檢測區域的有效體積。因此，在本實施方式中，在與測量待試驗樣品溶液的條件相同的條件下、利用發光粒子濃度已知的溶液(對照溶液)按照上述說明來進行光強度測量、發光粒子的檢測以及發光粒子的計數，然後，根據檢測出的發光粒子的數量和對照溶液中發光粒子的濃度，可以確定光檢測區域通過的總區域的體積、即檢測出的發光粒子的數量與發光粒子的濃度之間的關係。優選地，對照溶液的發光粒子可以是波長特徵與被觀測粒子相同的發光標記(螢光染料等)。具體地，例如，假設在發光粒子濃度為C的對照溶液中檢測出的發光粒子的數量為N，那麼光檢測區域通過的總區域的體積Vt由下式給出Vt = N/C —(5)可替代地，製備發光粒子濃度不同的多種溶液作為對照溶液，並且對各溶液進行測量，然後，將計算出的Vt的平均值確定為光檢測區域通過的總區域的體積vt。因此，當給定Vt時，發光粒子的計數結果為η的樣品溶液的發光粒子的數密度C由下式給出
c=n/Vt ---(6)在這方面，光檢測區域的體積和光檢測區域通過的總區域的體積可以通過任意方法給出，例如代替上述方法而採用FCS和FIDA。此外，在本實施方式的光學分析裝置中，對於假設的光檢測區域的移動圖形，可以將與各種標準發光粒子的濃度C與發光粒子數N之間的關係(表達式(5))有關的信息預先存儲在計算機18的存儲裝置中，使得裝置的使用者在進行光學分析時能夠適當地使用與該關係有關的存儲信息。計算實驗為了確認根據本發明的光學分析技術的原理獲得了與樣品溶液中的發光粒子的數密度對應的發光粒子的計數結果，進行如下計算實驗。圖7示出對計算實驗中假設的模型進行說明的圖。參照該圖，在計算實驗中，首先設想如下模型在該模型中，邊長為L的正方體以正方體的中心成為坐標系的原點的方式放置在X-Y-Z坐標系中，並且正如發光粒子在樣品溶液中自由地隨機移動那樣，使得擴散係數為D的8個粒子的位置在正方體內每隔時間寬度At=IOy秒沿隨機的方向發生移位。正方體的邊長L根據粒子濃度來設定例如，當粒子濃度設定為IOpM時，正方體的邊長被設定為L=Il. Oym0在這方面，為了使得正方體中總是存在8個粒子從而維持初始設定的濃度，進行如下設計當粒子移動超過正方體的界面(X，Y，Z=±L/2的平面)時，使粒子從相對的界面再次進入到正方體中(例如，當某粒子超過X=L/2的平面時，使該粒子從X=_L/2的平面進入到正方體中)。此外，典型地，期望的是，從樣品溶液中實際的發光粒子獲得的光強度根據高斯分布從光檢測區域的中央處的峰值沿徑向變化，因此，在正方體中，以原點為中心的光強度分布被設定為I=A · exp [_2 (X2+Y2+Z2) /Wo2] — (7)，從而假設在正方體中位於坐標點(Χ，Υ，Ζ)的粒子發出由表達式(7)給定的光。在表達式(7)中，A是中心處的強度，其中設定A=I，而Wo是光束束腰，其被設定為Wo=620nm。半徑為Wo的球體與有效光檢測區域對應，該有效光檢測區域的體積被設定為近似lfL。此夕卜，在本發明的光學分析技術中，使得光檢測區域的位置在樣品溶液中移動。即，也可以說成樣品溶液的空間相對於光檢測區域移動。因此，在模型中，為了對光檢測區域以移動速度V在空間(樣品溶液)內沿-X方向移動進行建模，設計成將V · Λ t沿X方向加到正方體內的各粒子的每隔At=IOy秒的位移。圖5的(B)的上欄是在粒子濃度為IOpM的正方體中的粒子根據上述模型以光檢測區域的15mm/s的移動速度移位了 2ms的情況下獲得的光強度數據，並且從該圖可以直觀地理解，確認兩個粒子通過了光檢測區域並且各強度變化的輪廓幾乎形成高斯分布。此外，在假設具有各種濃度的正方體中的粒子根據上述模型的設定對於任意的時間產生位移並發光的情況下,通過依次計算該時間內從空間發出的光強度的總量,產生了時間序列光強度數據，並且根據上述發光粒子的計數方法在獲取的時間序列光強度數據中對發光粒子數進行計數。在上述模型中，在粒子濃度設定為IOpM或O. ΙρΜ、光檢測區域的移動速度設定為15mm/s並且測量時間(粒子的位移執行的時間)為10秒的條件下，在重複進行的5次發光粒子的計算實驗中，粒子的計數值的平均值和CV值(標準偏差/平均值)如下濃度IOpMO. IpM計數值3668個粒子 35. 6個粒子CV 值 1.7%13. 3%如從該結果可以理解到的，獲得了幾乎與設定的粒子濃度成比例的粒子的計數值。即，該結果表明，通過在給定的測量時間、給定的光檢測區域的移動速度、利用給定強度的激發光對發光粒子進行激發的條件下對諸如染料等具有特定的特性的發光粒子進行計 數，能夠獲得與發光粒子的濃度在數量上對應的計數值，並且能夠確定發光粒子的濃度。此夕卜，除了光檢測區域的移動速度設定為60mm/s之外，當以與上述方法相同的方法進行實驗時，粒子的計數值的平均值或CV值(標準偏差/平均值)如下濃度IOpMO. IpM計數值11499個粒子 126個粒子CV 值 1.1%9. 4%根據該結果，表明了，如果增大光檢測區域的移動速度，則CV值減小，從而能夠減小對發光粒子計數時的離散度。此外，在粒子濃度為IfM並且光檢測區域的移動速度為100mm/s時進行的類似實驗中，粒子的計數值的平均值和CV值(標準偏差/平均值)分別變成11. 6個粒子和7. 7%。根據該結果，啟示了，在本發明中，即使被觀測粒子的濃度顯著地低於在FCS和FIDA中通常使用的濃度，也能夠進行發光粒子的計數。因此，根據不包括FCS、FIDA等中進行的諸如螢光強度波動的計算等統計處理的上述本發明的光學分析技術，通過使微小區域、即光檢測區域的位置在樣品溶液中移動，也就是掃描樣品溶液的內部，並且對橫穿光檢測區域的發光粒子單個地進行檢測或者對發光粒子進行計數，能夠對被觀測粒子的濃度或數密度比FCS、FIDA等中使用的水平低的樣品溶液中的被觀測粒子的狀態和特性進行檢測。在這方面，由於本發明的光學分析技術基本上使用與FCS、FIDA等相同的光學系統，所以可以與FCS、FIDA等一起進行。例如，在檢測包含兩種以上的物質的溶液中的這些物質之間的相互作用等的情況下，當物質之間的濃度差異大時，例如當一種物質的濃度是nM數量級而另一物質的濃度是pM數量級時，能夠以如下方式進行測量和分析對於高濃度的物質採用FCS或FIDA來進行測量和分析，而對於低濃度的物質採用本發明的光學分析技術來進行測量和分析。在這樣的情況下，如圖I的(A)所示，準備兩個以上的光電檢測器是有利的。為了驗證上述本發明的有效性，進行下述實驗。在這方面，應當理解的是，以下實施例僅說明本發明的有效性，並非試圖限定本發明的範圍。實施例I使用螢光染料ATTO 633 (西格瑪奧德裡奇(Sigma Aldrich)公司Cat. No. 18620)作為發光粒子來檢驗能夠利用本發明測量的樣品溶液中的發光粒子的濃度範圍。在這方面，作為對照實驗，也測量發光粒子濃度的範圍，該發光粒子濃度的範圍能夠根據螢光強度來測量，而螢光強度利用平板讀取器測得。對於樣品溶液，製備ATT0633的濃度分別為OfM (不含染料)、10fM、100fM、ΙρΜ、10pM、100pM和InM的包含ATT0633的磷酸鹽緩衝液(包含O. 05%的吐溫20)。在這方面，還為對照實驗製備了包含濃度為IOnM和IOOnM的ATT0633的溶液。在根據本發明的光學分析技術的測量中，使用配備有共聚焦螢光顯微鏡的光學系統和光子計數系統的單分子螢光測量裝置MF-20 (奧林巴斯公司)作為光學分析裝置，並且根據上述「(I)樣品溶液的光強度的測量」中說明的方式來獲取上述各樣品溶液的時間序列光強度數據。對於物鏡，使用浸水式物鏡(40X，NA=L 15，WD=O. 26)。為此，光電檢測器16使用能夠檢測單個光子的到達的超高靈敏度光電檢測器，因此光檢測是以對在每個預定的單位時間(BIN TIME)內到達光電檢測器的光子數進 行測量的方式在預定時間內順次地對光子進行計數。因此，時間序列光強度數據是時間序列光子數數據。此外，激發光使用633nm的雷射，並且利用帶通濾波器將檢測到的光波長設定為從660nm到710nm。進行3次每次2秒的測量，其中光檢測區域的位置在樣品溶液中的移動速度設定為15mm/秒並且BIN TIME設定為10μ秒。圖8的(A)中示出通過2秒的測量而獲得的時間序列光子數數據的示例。在上述光強度測量之後，對於各樣品溶液根據以下處理過程對在獲取的時間序列光子數數據中檢測出的光信號進行計數(a)時間序列光子數數據的平滑處理一通過移動平均法對時間序列光子數數據進行平滑處理。一次平均的數據點為9個點，並且重複進行5次移動平均處理。圖8的(B)示出對圖8的(A)中的數據進行平滑處理的結果。(b)時間序列光子數數據中的脈衝狀信號存在區域的檢測——確定出在通過(a)處理獲得平滑處理之後在時間序列光子數數據中各脈衝狀信號的起始點和終止點，並且限定脈衝狀信號存在的區域。具體地，首先，對平滑處理之後的全部時間序列光子數數據，計算出相對於時間的一次微分值，以製備時間序列光子數數據的微分值數據。然後，參照時間序列光子數數據的微分值數據的數值，如圖8的(D)中所示意性地示出的那樣，將脈衝狀信號的微分值的變化變大時的點選作脈衝狀信號的起始點，而將脈衝狀信號的微分值的變化變小時的點選作脈衝狀信號的終止點，從而將起始點和終止點之間的區域限定為脈衝狀信號存在區域。對全部時間序列光子數數據進行脈衝狀信號存在區域的限定。(C)鐘形函數的擬合一作為鐘形函數，將高斯函數的表達式(4)與過程(b)中限定的各脈衝狀信號存在區域擬合。通過最小二乘法進行擬合，其中確定峰值強度A、峰值寬度(最大值的一半時的全寬度)a以及(高斯函數中的)相關係數。圖8的(C)示出與圖8的(B)的數據擬合了的函數。(d)發光粒子的計數——參照擬合的函數的峰值強度、峰值寬度和相關係數，僅將滿足以下條件20 μ秒<峰值寬度 I (光子/10 μ秒)(A)相關係數>0.95的脈衝狀信號判定為與發光粒子對應的光信號，而不滿足上述條件的脈衝狀信號作為噪聲而被忽視，對被判定為與發光粒子對應的光信號的信號的數量作為「脈衝數」進行計數。圖9示出被判定為發光粒子的光信號的信號的示例和被判定為噪聲的信號的示例。
在對照實驗中，利用平板讀取器SH_80001ab (Corona公司)對上述各樣品溶液測量螢光強度。激發光波長設定為633nm ;檢測光的波長為657nm ;激發側和檢測側的帶寬均設定為12nm。在測量螢光強度時，進行3次測量，每次測量應用50次激發光激發，並且將3次測量的平均值作為最終的螢光強度值。圖10的(A)和(B)分別示出在各個濃度的樣品溶液中檢測出的上述本發明的光學分析技術的測量結果(脈衝數)和對照實驗中的測量結果(螢光強度)(各值分別為三次測量的平均值。)。首先參照圖10的(A)，根據本發明測得的脈衝數(被算作發光粒子的光信號的信號數)在發光粒子濃度為IOOfM以上的範圍內幾乎與發光粒子濃度成比例地增大。根據該結果，發現本發明的光學分析技術使得能夠逐個地檢測發光粒子，並且發現，通過根據本發明的光學分析技術對單個發光粒子進行計數，能夠定量地確定發光粒子的濃度。
此外，雖然在圖10的(B)的對照實驗中不能辨別出在發光粒子濃度為OM情況下的螢光強度和發光粒子濃度為IOOpM情況下的螢光強度之間存在顯著差異，但是，在圖10的
(A)的本發明的光學分析技術中，可以看出發光粒子濃度為OM情況下的脈衝數和發光粒子濃度為IOOfM情況下的脈衝數之間存在著顯著的差異。這些結果的原因被認為如下在利用平板讀取器測量的螢光強度中，由於噪聲或雜質而產生的光信號重疊，因此，在噪聲或雜質對螢光強度的貢獻相對大的低濃度範圍內，S/N比變差。另一方面，在本發明的情況下，判定時間序列光信號數據中的各脈衝狀信號是否與發光粒子相對應，並且忽視被判定為噪聲或雜質的信號(見圖9)，因此，即使在噪聲或雜質對螢光強度的貢獻相對大的低濃度區域中，S/N比也維持得比較良好。實際上，如圖10的(C)所示，關於根據本發明的光學分析技術對各樣品溶液測量2秒而測得的時間序列光子數數據中的總光子數，在發光粒子濃度小於IOOpM的範圍內，未觀測到與發光粒子濃度為OM的情況相比有顯著差異。即，已經表明，根據本發明，代替對時間序列光子數數據中的光子數進行計數，通過從時間序列光子數數據檢測發光粒子的光信號並且對其數量進行計數，顯著地改善了濃度檢測的靈敏度(在本實施例的情況下，能夠測量兩位數的低濃度。)。此外，對於上述時間序列光子數數據的信號處理，驗證平滑處理對時間序列光子數數據的效果。圖11的(A)和(B)均是示出關於含有100fM、lpM和IOpM的發光粒子的各樣品溶液的光信號的數量的圖表，分別為通過對未應用平滑處理的時間序列光子數數據和對應用了平滑處理並滿足條件(A)的時間序列光子數數據進行上述處理(b)_ (d)而檢測的光信號。如圖中清晰示出的，在應用了平滑處理並滿足條件(A)的時間序列光子數數據中檢測出的光信號數量、即發光粒子的檢測數量與已經描述的低至IOOfM的發光粒子濃度一起減小，而在未應用平滑處理並滿足條件(A)的時間序列光子數數據中檢測出的光信號數量與IOpM以下的發光粒子濃度不對應。這啟示了，根據本發明的技術，通過對原始時間序列光子數數據進行平滑處理，與發光粒子對應的光信號變得可檢測，並且能夠更精確地確定發光粒子濃度。因此，已經表明，根據本發明的光學分析技術，對於比利用螢光強度的傳統方法所能夠測量的數密度或濃度的極限低的濃度範圍，能夠確定發光粒子的數密度或濃度。此外，雖然諸如FCS、FIDA和PCH等包括例如螢光強度波動的計算等統計處理的光學分析技術中能夠測量的粒子濃度的下限為大約InM，但是本實施例中能夠測量的粒子濃度的下限為 IOOfM,因此也表明，根據本發明，也能夠對濃度比諸如FCS、FIDA和PCH等光學分析技術的情況的濃度顯著低的範圍內的粒子進 行測量。
權利要求
1.一種光學分析裝置，其通過使用共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學系統對來自發光粒子的光進行檢測，所述發光粒子分散在樣品溶液中且在所述樣品溶液中隨機地移動，其特徵在於，所述光學分析裝置包括 光檢測區域移動部，其使所述光學系統的光檢測區域的位置在所述樣品溶液中移動； 光檢測部，其對來自所述光檢測區域的光進行檢測；和 信號處理部，其產生在所述光檢測區域的位置在所述樣品溶液中移動的過程中利用所述光檢測部檢測的來自所述光檢測區域的光的時間序列光強度數據，對所述時間序列光強度數據進行平滑處理，並且隨後在經過平滑處理的所述時間序列光強度數據中單個地檢測來自每個所述發光粒子的光信號。
2.根據權利要求I所述的裝置，其特徵在於，所述信號處理部對單個地檢測到的來自所述發光粒子的光信號的數量計數，以對在所述光檢測區域的位置移動的過程中檢測到的所述發光粒子的數量計數。
3.根據權利要求I或2所述的裝置，其特徵在於，所述光檢測部通過光子計數來檢測來自所述光檢測區域的光，並且所述時間序列光強度數據是時間序列光子數數據。
4.根據權利要求I至3中的任一項所述的裝置，其特徵在於，所述光檢測區域移動部使所述光檢測區域的位置以預定的速度移動。
5.根據權利要求I至4中的任一項所述的裝置，其特徵在於，所述光檢測區域移動部使所述光檢測區域的位置以比所述發光粒子的擴散移動速度快的速度移動。
6.根據權利要求I至5中的任一項所述的裝置，其特徵在於，所述信號處理部基於經過平滑處理的所述時間序列光強度數據中的光信號的形狀來檢測是否有一個發光粒子進入所述光檢測區域。
7.根據權利要求I至6中的任一項所述的裝置，其特徵在於，當在經過平滑處理的所述時間序列光強度數據中檢測到強度比預定閾值大的光信號時，所述信號處理部檢測到一個發光粒子進入所述光檢測區域。
8.根據權利要求I至7中的任一項所述的裝置，其特徵在於，所述信號處理部基於檢測到的所述發光粒子的數量確定所述樣品溶液中的發光粒子的數密度或濃度。
9.一種光學分析方法，其通過使用共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學系統對來自發光粒子的光進行檢測，所述發光粒子分散在樣品溶液中且在所述樣品溶液中隨機地移動，其特徵在於，所述方法包括如下步驟 使所述光學系統的光檢測區域的位置在所述樣品溶液中移動； 在使所述光檢測區域的位置在所述樣品溶液中移動的同時對來自所述光檢測區域的光進行檢測，並且產生時間序列光強度數據； 對所述時間序列光強度數據進行平滑處理；和 在經過平滑處理的所述時間序列光強度數據中單個地檢測來自每個發光粒子的光信號。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於，還包括如下步驟對單個地檢測到的來自所述發光粒子的光信號的數量計數，以對在所述光檢測區域的位置移動的過程中檢測到的所述發光粒子的數量計數。
11.根據權利要求9或10所述的方法，其特徵在於，在檢測來自所述光檢測區域的光並且產生所述時間序列光強度數據的步驟中，通過光子計數來檢測來自所述光檢測區域的光，並且所述時間序列光強度數據是時間序列光子數數據。
12.根據權利要求9至11中的任一項所述的方法，其特徵在於，在使所述光檢測區域的位置移動的步驟中，使所述光檢測區域的位置以預定的速度移動。
13.根據權利要求9至12中的任一項所述的方法，其特徵在於，在使所述光檢測區域的位置移動的步驟中，使所述光檢測區域的位置以比所述發光粒子的擴散移動速度快的速度移動。
14.根據權利要求9至13中的任一項所述的方法，其特徵在於，在單個地檢測來自每個發光粒子的光信號的步驟中，基於經過平滑處理的所述時間序列光強度數據中的光信號的形狀來檢測是否有一個發光粒子進入所述光檢測區域。
15.根據權利要求9至14中的任一項所述的方法，其特徵在於，當在經過平滑處理的所述時間序列光強度數據中檢測到強度比預定閾值大的光信號時，檢測到一個發光粒子進入所述光檢測區域。
16.根據權利要求9至15中的任一項所述的方法，其特徵在於，還包括如下步驟基於檢測到的所述發光粒子的數量確定所述樣品溶液中的發光粒子的數密度或濃度。
17.一種用於光學分析的電腦程式，其用於通過使用共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學系統對來自發光粒子的光進行檢測，所述發光粒子分散在樣品溶液中且在所述樣品溶液中隨機地移動，其特徵在於，所述電腦程式使計算機執行如下進程 使所述光學系統的光檢測區域的位置在所述樣品溶液中移動； 在使所述光檢測區域的位置在所述樣品溶液中移動的同時對來自所述光檢測區域的光進行檢測，並且產生時間序列光強度數據； 對所述時間序列光強度數據進行平滑處理；和 在經過平滑處理的所述時間序列光強度數據中單個地檢測來自每個發光粒子的光信號。
18.根據權利要求17所述的電腦程式，其特徵在於，還包括如下進程對單個地檢測到的來自所述發光粒子的光信號的數量計數，以對在所述光檢測區域的位置移動的過程中檢測到的所述發光粒子的數量計數。
19.根據權利要求17或18所述的電腦程式，其特徵在於，在檢測來自所述光檢測區域的光並且產生所述時間序列光強度數據的進程中，通過光子計數檢測來自所述光檢測區域的光，並且所述時間序列光強度數據是時間序列光子數數據。
20.根據權利要求17至19中的任一項所述的電腦程式，其特徵在於，在使所述光學系統的光檢測區域的位置移動的進程中，使所述光檢測區域的位置以預定的速度移動。
21.根據權利要求17至20中的任一項所述的電腦程式，其特徵在於，在使所述光學系統的光檢測區域的位置移動的進程中，使所述光檢測區域的位置以比所述發光粒子的擴散移動速度快的速度移動。
22.根據權利要求17至21中的任一項所述的電腦程式，其特徵在於，在單個地檢測來自每個發光粒子的光信號的進程中，基於經過平滑處理的所述時間序列光強度數據中的光信號的形狀來檢測是否有一個發光粒子進入所述光檢測區域。
23.根據權利要求17至22中的任一項所述的電腦程式，其特徵在於，在單個地檢測來自每個所述發光粒子的光信號的進程中，當檢測到強度比預定閾值大的光信號時，檢測到一個發光粒子進入所述光檢測區域。
24.根據權利要求17至23中的任一項所述的電腦程式，其特徵在於，還包括如下進程基於檢測到的所述發光粒子的數量確定所述樣品溶液中的發光粒子的數密度或濃度。
全文摘要
提供一種光學分析技術，其能夠對以低的濃度或數密度包含於樣品溶液中的被觀測粒子的狀態或特性進行檢測。本發明的光學分析技術使用諸如共聚焦顯微鏡的或多光子顯微鏡的光學系統等能夠對來自溶液中的微小區域的光進行檢測的光學系統，以在使微小區域的位置在樣品溶液中移動的同時(在利用微小區域掃描樣品溶液的內部的同時)對來自被觀測發光粒子的光進行檢測；產生時間序列光強度數據，並且隨後對所述時間序列光強度數據進行平滑處理；在經過平滑處理的時間序列光強度數據中對橫穿微小區域的內部的發光粒子單個地進行檢測，由此使得能夠對發光粒子計數或能夠獲取關於發光粒子的濃度或數密度的信息。
文檔編號G01N21/64GK102782479SQ201180011640
公開日2012年11月14日 申請日期2011年2月18日 優先權日2010年3月1日
發明者堀邦夫, 山口光城, 田邊哲也, 近藤聖二 申請人:奧林巴斯株式會社