絮凝菌f2的絮凝基因的製作方法

2023-04-23 22:04:36 2

專利名稱：絮凝菌f2的絮凝基因的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種絮凝菌的絮凝基因。
背景技術：
絮凝菌F2的絮凝率＞80％，屬於芽孢桿菌屬，是從大慶煉油廠含油廢水處理單元曝氣池活性汙泥中分離出的高效絮凝菌菌株(複合型生物絮凝劑產生菌篩選及絮凝機理研究，哈爾濱工業大學學報2004.6第36卷第6期759～762頁)。具有絮凝作用的多功能工程菌株在水處理中有顯著的優越性和經濟價值，因此得到絮凝菌F2的絮凝基因有著重要的意義。

發明內容
鑑於絮凝菌F2的絮凝基因在構建具有絮凝作用的多功能工程菌株方面具有重要的意義，本發明旨在獲得絮凝菌F2基因組中的絮凝基因。本發明絮凝菌F2的絮凝基因序列全長1071bp，其中T、C、G、A分別為307bp(29％)、191bp(18％)、266bp(25％)、307bp(29％)。
本發明得到了絮凝菌F2基因組中的絮凝基因，為將來構建具有絮凝作用的多種功能的工程菌株，節約水處理費用和科學研究奠定了物質基礎。


圖1是絮凝基因PCR擴增凝膠電泳圖，其中1號泳道條帶是Marker，圖中黑色箭頭所指條帶為1000bp，2號和4號泳道條帶是PCR擴增基因片段；圖2是BamH I酶切載體PUC19的凝膠電泳圖，其中1號泳道條帶是Marker，2號泳道中的條帶是經BamH I酶切的載體PUC19的DNA片段。
具體實施例方式
具體實施方式
一本實施方式通過以下步驟獲得絮凝菌F2的絮凝基因。其具體方法如下1、提取絮凝菌F2基因組DNA取絮凝菌F2菌液50mL，用上海華舜生物工程有限公司生產的華舜小量細菌基因組DNA抽提試劑盒(W6511)提取絮凝菌F2的絮凝基因DNA，提取步驟參見小量細菌基因組DNA抽提試劑盒(W6511)使用操作手冊。
2、PCR擴增絮凝基因絮凝菌F2的絮凝基因的PCR擴增引物P1和P2的序列見表1，擴增程序見表2，PCR擴增體系如下(20μL)Buffer2μLdNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP各3.2mol/L)2μLP1(10pmol/L) 1μLP2(10pmol/L) 1μLEx Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.25μL絮凝菌F2基因組DNA 0.5μL蒸餾水13.25μL表1

表2

3、凝膠電泳檢測圖1中2號和4號泳道在1000bp附近的DNA條帶為目的基因片段。
4、回收目的基因用上海華舜生物工程有限公司生產的柱式華舜小量膠回收試劑盒(W5211)回收，回收步驟參見試劑盒操作手冊。
5、BamH I酶切載體PUC19酶切體系如下(20μL)BamH I1～5μL10×Buffr 2μLPUC191μL加無菌水至總體積為20μL
在37±0.5℃條件下反應1h。
6、凝膠電泳圖2中2號泳道中的條帶是經BamH I酶切的載體PUC19的DNA片段。
7、回收BamH I酶切載體PUC19的DNA片段用上海華舜生物工程有限公司生產的柱式華舜小量膠回收試劑盒(W5211)回收，回收步驟參見試劑盒操作手冊。
8、載體PUC19的DNA片段進行鹼性磷酸化鹼性磷酸化反應體系如下(50μL)PUC 19DNA Fragments in TE Buffer1～20pmol10×Alkaline Phosphataes Buffer 5μL鹼性磷酸化酶(10～30U/μL) 1～2μL加蒸餾水至總體積為50μL在65±0.5℃條件下反應30±2min。
9、絮凝菌F2基因組DNA片段與載體PUC19片段連接連接反應體系如下(20μL)10×T4DNA Ligase Buffer 1～1.5μLDNA酶切片段 15μL載體PUC19 3μLT4DNA Ligase0.5～1μL在16±0.5℃條件下反應24±0.5h。
10、連接產物轉化感受態細胞JM109①在1mL無菌離心管中加入5μL連接產物和20μL(北京博大泰克生物基因技術有限責任公司，高效感受態JM109細菌細胞試劑盒)試劑A，並加入無菌水稀釋至100μL混合均勻(放於冰上備用)；②向80～100μL感受態細胞JM109的細胞液中加入100μL 10-①混合液，混合均勻後冰浴20min，然後再置於無菌室溫環境中放置10min；③向上一步驟(10-②)混合液中加入400μL液體LB培養基，在37℃、200r/min的環境中振蕩培養10～40min；④用10-③的培養液塗鋪LB固體培養基平皿，再將平皿放入37℃的培養箱中培養12～16h，長出單克隆菌菌落。
11、絮凝基因測序連接產物轉化感受態細胞JM109形成的單克隆菌由大連寶生物公司進行序列測定。絮凝菌F2的絮凝基因序列全長1071bp，其中T、C、G、A分別為307bp(29％)、191bp(18％)、266bp(25％)、307bp(29％)。
12、絮凝測定目測法將連接產物轉化感受態細胞JM109形成的單克隆菌單菌落接種於3mL液體LB培養基試管中，在37℃條件下靜置培養48h，之後劇烈振蕩1min，再靜置觀察有絮凝沉澱產生。
序列表110哈爾濱工業大學120絮凝菌F2的絮凝基因160321012111071212DNA213芽孢桿菌屬(Bacillus.sp)4001gccagtgcca agcttggtta ggcttattaa tgagtctact tgctgttttg tttttagtgg 60cgtgtggagg taagtctgaa aagacagcta catcttcatc atctacgact tcttcttcat 120cagaagaagc tgtttcaggt gcatctgaga aagtttatac agatccatct gagttgaaag 180atagctacga tgttatcgtt gttggttcag gtggtgcagg tatgtcagca gctatctcag 240ctaaagacgc tggtgctagt gttgctctct tggagaaaat gcctgttatc ggtggtaata 300cggctaaatc atcagctggt atgaatgctt cacagactaa attccaagaa gcggaaggta 360ttgctgatac aaatgataaa ttctacgaag aaacgcttaa aggtggtaaa gggacaaacg 420atcctgaatt gcttcgttat cttgtagata actctgctag tgcaattgac tggttggatg 480gaatggggat cactcttagc aacctaacta caactggtgg tatgagcgag aaacgtaccc 540accgtccagc agatggttca gctgtcggtg gctacttggt aaatggtctt taccacaatc 600ttgttgaacg tgaagtacca atttttgtca atgcagatgt tacaaaactc caagacaagg 660atggagctgt gacaggtgtt gaagtgaaga ttgctggtga aactaagaaa atctcagcta 720aagcagttgt attggcgact ggtggtttcg gtgctgattt ggaaatggtt gctaaattaa 780acccagcatt gaaaggttat gttacaacta accaagaagg atcaacaggt gacggtattg 840cgcttgctga atcagaaggt gcagcaactg ttgatatgga acaaatccaa attcacccaa 900gtgttgagca agaaacttct tacttgatta cagaagcagt tcgtggcgaa ggtgctatcc 960ttgtcaactc aaaaggtgag cgttttgtta acgaattgga aactcgtgat aaagtttctg 1020
cggctatcaa tagtttggat ccccgggtac cgagctcgaa ttcgtaatca t 1071210221125212DNA213人工序列220
223絮凝菌F2的絮凝基因的PCR擴增引物P14002agtctagatg taagctctct tccgg 25210321124212DNA213人工序列220
223絮凝菌F2的絮凝基因的PCR擴增引物P24003ctctcgagca ataaggacgc aatg 2權利要求
1.絮凝菌F2的絮凝基因，其特徵是絮凝菌F2的絮凝基因序列如下所示GCCAGTGCCAAGCTTGGTTAGGCTTATTAATGAGTCTACTTGCTGTTTTGTTTTTAGTGGCGTGTGGAGGTAAGTCTGAAAAGACAGCTACATCTTCATCATCTACGACTTCTTCTTCATCAGAAGAAGCTGTTTCAGGTGCATCTGAGAAAGTTTATACAGATCCATCTGAGTTGAAAGATAGCTACGATGTTATCGTTGTTGGTTCAGGTGGTGCAGGTATGTCAGCAGCTATCTCAGCTAAAGACGCTGGTGCTAGTGTTGCTCTCTTGGAGAAAATGCCTGTTATCGGTGGTAATACGGCTAAATCATCAGCTGGTATGAATGCTTCACAGACTAAATTCCAAGAAGCGGAAGGTATTGCTGATACAAATGATAAATTCTACGAAGAAACGCTTAAAGGTGGTAAAGGGACAAACGATCCTGAATTGCTTCGTTATCTTGTAGATAACTCTGCTAGTGCAATTGACTGGTTGGATGGAATGGGGATCACTCTTAGCAACCTAACTACAACTGGTGGTATGAGCGAGAAACGTACCCACCGTCCAGCAGATGGTTCAGCTGTCGGTGGCTACTTGGTAAATGGTCTTTACCACAATCTTGTTGAACGTGAAGTACCAATTTTTGTCAATGCAGATGTTACAAAACTCCAAGACAAGGATGGAGCTGTGACAGGTGTTGAAGTGAAGATTGCTGGTGAAACTAAGAAAATCTCAGCTAAAGCAGTTGTATTGGCGACTGGTGGTTTCGGTGCTGATTTGGAAATGGTTGCTAAATTAAACCCAGCATTGAAAGGTTATGTTACAACTAACCAAGAAGGATCAACAGGTGACGGTATTGCGCTTGCTGAATCAGAAGGTGCAGCAACTGTTGATATGGAACAAATCCAAATTCACCCAAGTGTTGAGCAAGAAACTTCTTACTTGATTACAGAAGCAGTTCGTGGCGAAGGTGCTATCCTTGTCAACTCAAAAGGTGAGCGTTTTGTTAACGAATTGGAAACTCGTGATAAAGTTTCTGCGGCTATCAATAGTTTGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCAT。
全文摘要
絮凝菌F2的絮凝基因，它涉及一種絮凝菌的絮凝基因。鑑於絮凝菌F2的絮凝基因在構建具有絮凝作用的多功能工程菌株方面具有重要的意義，本發明旨在獲得絮凝菌F2基因組中的絮凝基因。本發明絮凝菌F2的絮凝基因序列全長1071bp，其中T、C、G、A分別為307bp(29％)、191bp(18％)、266bp(25％)、307bp(29％)。本發明得到了絮凝菌F2基因組中的絮凝基因，為將來構建具有絮凝作用的多種功能的工程菌株，節約水處理費用和科學研究奠定了物質基礎。
文檔編號C12N1/20GK1834247SQ20061000989
公開日2006年9月20日 申請日期2006年4月3日 優先權日2006年4月3日
發明者馬放, 常玉廣 申請人:哈爾濱工業大學