前膠原IIA缺乏小鼠的製造方法與工藝

2023-07-31 18:57:16

前膠原IIA缺乏小鼠本申請要求2004年7月26日提交的美國臨時申請號60/591,935的優先權，其內容在此通過引用結合於本申請中。在本申請的全文中引用了不同的出版物。對於這些出版物的全部引用可於權利要求書的前面看到。這些出版物的公開內容在此通過引用結合於本申請中，以便更加全面地描述在本文描述和要求的本發明之日前的本領域現狀。發明背景心臟病猝死(SCD)是主要的公共衛生問題，在美國35歲以上人群中因心臟病所致死亡高達63％。1而急性缺血性心臟疾病是此人群中SCD的主要病因，但是青少年和40歲以下的青壯年猝死的最常見病因之一是肥厚型心肌病(HCM)。其它較少發生的病因包括畸形的冠狀動脈、Marfan’s症候群、致心律失常的右心室發育異常、心肌炎、主動脈瓣膜狹窄和冠狀動脈粥樣硬化性疾病。HCM是遺傳性心肌疾病，在沒有繼發病因時，存在具有非擴張的、高動力性腔室(hyperdynamicchamber)的不對稱的或對稱的左心室肥大。它同樣地侵襲男性和女性，以高度可變化的臨床過程、不同的病理學和複雜的遺傳表達為特點。依靠潛在的(underlying)突變，在疾病譜的一個極端方面，HCM可與正常長壽共存，但在另外一個極端方面，它是青年運動員中SCD的最常見的病因。SCD的病因被假定為源於電不穩定性心肌基質的複合的心室心動過速或纖維性顫動，但也提示有心動過緩和嚴重梗塞。對HCM中的SCD的預防仍然是臨床醫師的主要挑戰。在第三期中心(tertiarycenters)，已有報告使用可植入的心復律除顫器(cardioverterdefibrillator)(ICD)是有用的，但患者可仍然罹患伴有血栓栓塞性卒中風險的晚期心力衰竭和心房纖維性顫動。3，4HCM的病理模型對於了解HCM的發展和SCD的病因將是必需的，對於預防和治療將是重要的。當前，已知的疾病基因佔所有家族性肥厚型心肌病病例的約50-70％。5人的大多數原發性心肌病，無論是肥厚型或擴張的，都是由於收縮性蛋白質、細胞骨架蛋白質或間隙連接蛋白質的突變，在大多數病例中是結構性缺損的直接結果。心臟細胞外基質起著多項重要的功能作用，如同基質之於細胞粘附和支撐，如同信號之於細胞生存，如同貯主(reservoir)之於生長因子，並且作為組織機械學(mechanics)的主要決定因素。膠原是哺乳動物心臟中細胞外基質的主要成分並表現為動態(dynamic)表達模式和在發育過程中和在病理條件下同種型(isoform)多樣性。5在成年心肌中，I型膠原佔總膠原的80％，與III型膠原一起形成支持個體心肌細胞和平滑肌細胞的纖維狀膠原網絡，和組織肌肉束、傳導系統和冠狀脈管系統進入粘性的收縮性單位。相反地，III型膠原是新生大鼠心臟中的主要成分，約佔總膠原含量的三分之一，並且因此其粘彈性不同於成年心肌。在右心室肥大的齧齒動物模型中，I型和III型膠原的比率有顯著改變。9，10II型和VIII膠原在心臟發育過程中短暫表達並已涉及心臟形態發生中。儘管II型膠原通常是軟骨特有的，已經顯示在小鼠胚胎發生過程中有非常廣泛的組織分布。小鼠αl(II)膠原基因(Col2a-1)在許多非軟骨組織中短暫表達，諸如脊索、神經視網膜、尾腱、心臟、外胚層表面、顱蓋的間充質、胎腦、內耳的感覺上皮細胞和形成肢芽的頂外胚層脊(apicalectodermalridge)(AER)。對外顯子2的可選的剪接產生或者包括(IIAmRNA)或排除(IIBmRNA)此外顯子的II型前膠原mRNAs。IIA型mRNA在9.5天胚胎的心房和心室的外心膜細胞中均含量豐富，但是在10.5天即迅速減少。12.5天後，IIBmRNA水平迅速升高並最後超過IIAmRNAs。到了16.5天，IIBmRNAs是主要的Col2a-1轉錄物，主要在成熟軟骨細胞中表達。13自一家醫院的屍檢分析顯示，在2例II型膠原疾病的軟骨發育不良(hypochondrogenesis)的嬰兒心臟隔膜(septation)中發現缺損。至今尚未明確，IIA型膠原是如何對心臟形態發生起作用的，但近期的研究提示，它可調節生長因子。眾所周知，包含在IIAmRNA中的II型膠原基因(Col2a-1)的外顯子2，編碼在前-α1(II)膠原鏈的氨基-前肽中的富含半胱氨酸的球形域。在體外試驗中顯示，所述富含半胱氨酸的域結合骨形態發生蛋白(如BMP2)和轉化生長因子(TGF)-β1。TGF-β1和BMP-2屬於調節生長和分化的轉化生長因子-β超家族。如同TGF-β超家族的其它成員(TGF-β/活化素/結節和BMP/GDF/MIS亞家族)，它們不同的生物學作用是通過形成I型和II型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體的異聚複合物，II型受體將I型受體磷酸化和隨後活化Smad蛋白而介導的。受體激活的Smads(R-Smads，Smads1-3、5、8)由I型受體激酶磷酸化，與共同的介體Smads(co-Smads，Smad4)形成異聚複合物，並易位核中，在那裡它們與特定的轉錄因子和輔調節因子(co-regulators)相互作用以調節基因表達。R-Smads2和3應答於TGF-β亞家族，而R-Smads1、5和8主要應答於BMP亞家族。兩種抑制性Smads(1-Smad)，Smad6和Smad7，通過與Smad4競爭結合活化的R-Smads負性調節TGF-β/BMP信號傳導，抑制R-Smads的磷酸化，或靶向所述受體使其降解。16，17TGF-β1和BMP-2在心臟發育的多個不同方面，特別是在心肌細胞分化、瓣膜發生和流出道和隔膜的發育方面，均起重要的作用。18-21TGF-β1在出生後的心臟中發揮不同的生物學活性。它控制主要組織相容性複合物的表達，減少由心臟成纖維細胞產生的細胞外基質蛋白質，調節血管平滑肌細胞表型，導致心臟肥大和增強β-腎上腺素能的信號傳導。關於在出生後哺乳動物心臟中的BMP-2作用的信息有限。在新生大鼠心肌細胞培養中，BMP-2通過激活Smadi途徑發揮抗細胞凋亡作用和通過激活磷脂醯肌醇3激酶途徑增強收縮性。22，23臨床上，原發性肺動脈高壓，一種肺動脈中內皮和平滑肌細胞的增生加強的疾病，與作用BMP(BMPR-II)的II型受體的突變相關聯。24，25近期在Marfan症候群鼠科動物模型的研究也顯示，細胞外基質，在本例中，微纖維蛋白，在調節TGF-β信號傳導的活性作用。26，27在人擴張的心肌病中，增強的肌束膜的纖維化與I型，III型和VI型膠原含量的增加有關，V型膠原在心肌的細胞內基質中增加。II型膠原在正常心臟或擴張的心肌病中不表達。28II型膠原在肥厚型心肌病人中是否異常表達還有待研究。多種心肌病和改變收縮性的小鼠模型集中在導致前述的蛋白質、細胞周期調節蛋白、涉及鈣代謝的調節蛋白的突變上，和集中在腎上腺素能受體亞單位的信號傳導級聯上。雖然基質缺損通常不被認為是心肌病可能的病因，細胞外基質調節組織模型和心肌細胞分化的概念並不新穎。甚至在伴有III型膠原的定向去除的小鼠中，沒有心臟異常，且猝死是由於主動脈破裂。29因此，在本申請所述的成年191-IIA突變小鼠是用於研究可突然發生的心肌病誘的導死亡的非常重要的模型。Taussig-Bing畸形(TBA)是罕見的但複雜的先天性心臟病，其包括伴肺動脈下心室隔膜缺損(VSD)的右心室雙出口(DORV)。主動脈和肺動脈幹移位。TBA是僅次於法樂氏四聯症(TetralogyofFallot)的DORV的最常見的變型。患TBA的嬰兒常常表現充血性心力衰竭和肺動脈高壓。其診斷是合併相關聯的血管缺損諸如冠狀動脈畸形、主動脈下狹窄、主動脈弓縮窄或中斷。目前推薦的治療是在單次手術中完全糾正，特別是包括動脈調轉手術，VSD修補，主動脈梗阻的矯正性修補和畸形的冠狀動脈的移位。因此，對於這些血管缺損的詳細繪圖對矯正性手術的成功至關重要。TOGA是最常診斷的新生兒紫紺性心臟缺損複合症(ref)和包含心室大動脈不協調(ventriculoarterialdiscordance)。人TBA或TOGA的遺傳學集中在有關左-右不對稱或內臟異位症候群的候選基因上。三個人類基因的突變與TOGA相關：鋅指轉錄因子ZIC3{DigiIio，M.C.等.Completetranspositionofthegreatarteries：patternsofcongenitalheartdiseaseinfamilialprecurrence.Circulation104，2809-14(2001).}{Belmont，J.W.，Mohapatra，B.，Towbin，J.A.&Ware，S.M.Moleculargeneticsofheterotaxysyndromes.CurrOpinCardiol19，216-20(2004).}、CFC1(humanCRYPTICgene){Goldmuntz，E.等.CFC1mutationsinpatientswithtranspositionofthegreatarteriesanddouble-outletrightventricle.AmJHumGenet70，776-80(2002).}和PROSIT240{Muncke，N.等.MissensemutationsandgeneinterruptioninPROSIT240，anovelTRAP240-likegene，inpatientswithcongenitalheartdefect(transpositionofthegreatarteries).Circulation108，2843-50(2003).}。這些臨床發現已經在用基因技術去除(geneticablation)Zic3的小鼠模型{Purandare，S.M.等.Acomplexsyndromeofleft-rightaxis，centralnervoussystemandaxialskeletondefectsinZic3mutantmice.Development129，2293-302(2002).}、潛在的(EGF-CFC){Gaio，U.等.Aroleofthecrypticgeneinthecorrectestablishmentoftheleft-rightaxis.CurrBiol9，1339-42(1999).}和TRAP220{Ito，M.，Yuan，C.X.，Okano，H.J.，Darnell，R.B.&Roeder，R.G.InvolvementoftheTRAP220componentoftheTRAP/SMCCcoactivatorcomplexinembryonicdevelopmentandthyroidhormoneaction.MolCell5，683-93(2000).}中得到驗證。在此，發明人描述在C57/BL6遺傳背景上帶有IIA突變的小鼠，是TBA和TOGA的新的小鼠模型。在人COL2A1基因中的突變是顯性的，導致具有從出生前致死到輕微畸形的嚴重的疾病譜的軟骨發育異常。在外顯子2中的顯性的突變已在施蒂克勒症候群(SticklerSyndrome)和還伴有眼睛缺損的華格納氏症候群(Wagner′sSyndromes)中被發現{Richards，A.J.等.COL2A1exon2mutations：relevancetotheSticklerandWagnersyndromes。BrJOphthalmol84，364-71(2000).}{VanDerHout，A.H.等.OccurrenceofdeletionofaCOL2A1alleleasthemutationinSticklerSyndromeshowsthatacollagentypeIIdosageeffectunderliesthissyndrome.HumMutat20，236(2002).}{Donoso，L.A.等.Identificationofastopcodonmutationinexon2ofthecollagen2A1geneinalargesticklersyndromefamily.AmJOphthalmol134，720-7(2002).}{Donoso，L.A.等.ClinicalvariabilityofSticklersyndrome：roleofexon2ofthecollagenCOL2A1gene.SurvOphthalmol48，191-203(2003).}{Gupta，S.K.，Leonard，B.C.，Damji，K.F.&Bulman，D.E.Aframeshiftmutationinatissue-specificalternativelysplicedexonofcollagen2A1inWagner′svitreoretinalvitreoretinaldegeneration.AmJOphthalmol133，203-10(2002).}。然而，沒有紫紺性先天性心臟缺損的報告或與Col2a1基因突變系統性相關。僅有一例來自一家醫院的屍檢研究報告，2個患II型膠原疾病的軟骨發育不良的嬰兒的心臟隔膜缺損{Potocki，L，Abuelo，D.N.&Oyer，CE.Cardiacmalformationintwoinfantswithhypochondrogenesis.AmJMedGenet59，295-9(1995).}。鑑於未治療的紫紺性先天性心臟病的發病率和死亡率臨床意義重大，IIA前膠原可作為新的標記用於先天性心臟病複合症的出生前篩查。作為在心臟形態發生中BMP依賴的Nkx2.5表達的關鍵調節因子，IIA前膠原可作為用於心肌再生療法的生長因子的新的傳遞系統。了解這些心血管缺損在IIA無效突變體中的細胞機制，對闡明治療或預防紫紺性心臟疾病複合症的新策略將是極為重要的。發明概述本發明提供兩個系的經遺傳工程改造的小鼠，其中前膠原IIA基因的外顯子2與loxP序列側翼鄰接(flanked)，並且該外顯子2通過與表達Cre-重組酶的雜交小鼠而缺失。外顯子2的缺失導致IIA轉錄物的缺失。這進而導致心血管缺損的雙重表現，其中一個主要是C57/BL6遺傳背景的譜系死於嚴重的先天性心臟病(IIA-/-)，而在遠系繁殖的遺傳背景(C57BL6/ICR/129)下的另一個譜系發展為以心肌細胞肥大、雜亂排列(disarray)和瓣膜纖維化(191-IIA)為特徵的肥厚型心肌病。本發明提供篩選用於減少肥大、雜亂排列和纖維化的藥物的方法，以及通過將所述藥物給予或者191-IIA成年小鼠或者IIA-/-突變的胚胎減少心血管形成模式結構的缺損。這樣的藥物可以是合成的或天然發現的激素、生長因子、肽類或由適合用於基因轉移的載體攜帶的基因。本發明還提供從心臟或主動脈的原代細胞培養物和衍生於敲除小鼠的永久的細胞系。來自由191-IIA小鼠的永久的或原代細胞培養物的細胞，被用於篩選改善或消除肥大、增殖或纖維化過程的藥物。圖的簡述圖1191-IIA小鼠的系譜pedigree上欄的框圖概述了191-IIA小鼠中的猝死的自然史。下欄的框圖顯示在這些不同齡的小鼠中發現的四例心臟肥大的實例。圖2191.1心臟的H&E染色ACE-來自野生型小鼠。BDF-來自191.1雄性鼠，於2個月齡死亡的ColIIA的純合子無效突變體。AB-來自野生型(A)和突變體(B)的心臟的兩室的短軸面圖像。突變體的左心室壁較不緻密，因此比野生型的左心室壁厚。CD-右心室(RV)，100x總放大率。在突變體的RV壁厚度增加。EF-側LV壁，400x總放大率。在野生型中心肌細胞為大小均勻，而在心肌中顯示平行方向排列(E)，突變體心肌以心肌細胞肥大和雜亂排列為特徵(F)。圖3191.3心臟的H&E染色AC-分別為野生型小鼠的主動脈瓣(AV)和二尖瓣(MV)。BD-於3個月齡死亡的191.3雄性鼠的AV和MV。在突變體中，兩種瓣膜均出現纖維變性。所有的框圖用400x總放大率。比例，一格-20μm。圖4大齡191-IIA小鼠的H&E染色AB-來自於8個月齡死亡的254.66雄性小鼠的LV側壁。注意到多細胞結構(hypercellularity)。C-254.66的RV。注意到多細胞結構和心肌細胞肥大。D-來自於15個月齡死亡的191.29雄性小鼠的LV側壁。比較圖2F、4A和4B，此小鼠的心肌細胞並不紊亂無序。所有框圖用400x總放大率。比例，一格-20μm。圖5IIAmRNA的正常表達模式和IIA-/-小鼠的繁殖A-正常發育的心臟中IIAmRNA的不對稱分布。用IIA-特異性探針製作原位雜交的野生型胚胎的整體標本(Wholemount)(WISH)。在2-體節配對階段(E8.0)，IIAmRNA在心半月瓣(cardiaccrescent)中有很強的表達。在10-體節配對階段(E8.5)，IIAmRNA在初始心臟管道迴路(loopingprimitivehearttube)中仍有很強的表達。在27-體節配對階段(E9.5)，IIAmRNA在心球(bulbouscordis)和流出道中，接著是在左心室中表達最高，在流入道(心房)中發現最低水平。B-Col2a1定位和目標載體的示意圖，其中外顯子2被插入由loxP位點側翼連接的Neo基因中斷(disrupted)。所述Neo基因隨後被Cre-介導的重組切除。C，D，E-靶向性缺失分別由DNA印跡法、RT-PCR和WISH證實。圖6新生鼠IIA-/-突變體中的血管缺損從左至右，顯示從胸的頭端至尾端的橫斷面。框圖(A-C)來自WT新生小鼠。框圖(D-L)來自IIA-/-突變體。A，B-在WT，肺動脈(p)起自右心室(rv)和位於主動脈(a)的前面和頭端。主動脈彎向氣管(t)的左側和產生右鎖骨下動脈(rs)和右頸動脈(rc)、左頸動脈(c)和左鎖骨下動脈(Is)。C-心房間隔膜將右和左心房(箭頭處)分隔開，而心室間隔膜(ivs)將左心室(Iv)與右心室(rv)分隔開。注意右心室壁比左心室壁薄。D-F-伴DORV的不完全TOGA的實例，和肺動脈下的VSD。D-在IIA-/-突變體中，產生頭部血管的主動脈(a)，在肺動脈(p)的前面。畸形的冠狀動脈(星號*)起自升主動脈。E-冠狀動脈離開(箭頭)之處的主動脈(a)，完全起自RV。大動脈導管未閉(pda)連接左降主動脈(da)。F-肺動脈(p)在主動脈的尾端並且均起自LV和RV。肺瓣膜(pv)正覆蓋瓣膜下心室隔膜缺損(箭頭處)。G-完全TOGA的實例，此處主動脈(a)起自RV。肺動脈(p)向尾端和後面易位(transposed)並且完全起自LV。H-...