核苷二磷酸激酶a氧化還原異構體的製作方法

2023-07-05 08:37:56 4

專利名稱：核苷二磷酸激酶a氧化還原異構體的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因工程領域，具體是涉及一種通過基因工程改造得到的核苷二磷酸激酶A(NDPK-A)氧化還原異構體。
背景技術：
核苷二磷酸激酶(nucleoside diphosphate kinase，NDPK)的研究歷史可以追溯到50年前(Berg P，Joklik WK.Transphosphorylation between nucleoside polyphosphates.Nature，1953)，作為一種管家酶，NDPK的首要功能是通過催化NDP和NTP之間的磷酸基轉移反應來維持細胞內的NTP濃度。近年來的研究發現，NDPK可以調節細胞增殖、分化、發育(Rosengard AM，Krutzsch HC，Shearn A，et al.Reduced Nm23/Awd protein intumour metastasis and aberrant Drosophila development.Nature，1989)和凋亡(Fan Z，Beresford PJ，Oh DY，et al.Tumor suppressor NM23-H1 is a granzyme A-activated DNaseduring CTL-mediated apoptosis，and the nucleosome assembly protein SET is its inhibitor.Cell，2003)。尤其是NDPK-A，1990年發現NDPK-A由抑癌基因Nm23-H1編碼，與多種腫瘤的轉移負相關(Biggs J，Hersperger E，Steeg PS，et al.A Drosophila gene that ishomologous to a mammalian gene associated with tumor metastasis codes for a nucleosidediphosphate kinase.Cell，1990；Wallet V，Mutzel R，Troll H，et al.Dictyostelium nucleosidediphosphate kinase highly homologous to Nm23 and Awd proteins involved in mammaliantumor metastasis and Drosophila development.J Natl Cancer Inst，1990)。自此，NDPK-A倍受關注，研究其多種功能及其調控機制對於揭示細胞增殖、腫瘤轉移等多種生命現象具有重要意義(Narayanan R，Ramaswami M.Regulation of dynamin by nucleosidediphosphate kinase.J Bioenerg Biomembr，2003；Roymans D，Willems R，Van BlockstaeleDR，Slegers H.Nucleoside diphosphate kinase(NDPK/NM23)and the waltz with multiplepartnerspossible consequences in tumor metastasis.Clin Exp Metastasis，2002；Rochdi MD，Laroche G，Dupre E，et al.Nm23-H2 interacts with a G protein-coupled receptor to regulateits endocytosis through an Racl-dependent mechanism.J Biol Chem，2004)。
(一)NDPK-A的腫瘤抑制活性1988年，Stegg首先報導Nm23-H1基因(Steeg PS，Bevilacqua G，Kopper L，et al.Evidence for a novel gene associated with low tumor metastatic potential.J Natl Cancer Inst，1988)，後來證明，這種能夠抑制腫瘤轉移的基因的蛋白產物就是(NDPK-A Biggs J，Hersperger E，Steeg PS，et al.A Drosophila gene that is homologous to a mammalian geneassociated with tumor metastasis codes for a nucleoside diphosphate kinase.Cell，1990)。我們在前期工作中，發現Nm23-H1基因對Hep-2等腫瘤細胞在體內外都表現出抗癌活性(楊瑞儀，等.抑癌基因Nm23-H1誘導癌細胞凋亡及抗氧化作用的研究.癌症，2000；楊瑞儀，等.抑癌基因Nm23-H1在逆轉錄病毒載體中的表達.病毒學報，1999)對LA-795細胞不僅表現出轉移抑制活性，對順鉑、絲裂黴素C等烷化劑還有不同程度的增敏活性(吳予平，等.抑癌基因Nm23-H1對化療藥物增敏作用的體外實驗研究.廣東藥學院學報，2002)。Nm23-H1以及NDPK-A在體外對MCF-7的增殖和移動都有抑制作用(蘇運貞，等.人重組核苷二磷酸激酶A亞基對MCF-7S的影響.生物技術，2003)。
(二)NDPK-A的其它生物學活性早在1989年，Shearn課題組就首先報導NDPK-A與果蠅翅膀的發育有關，並進行了7年跟蹤研究(Rosengard AM，Krutzsch HC，Shearn A，et al.Reduced Nm23/Awd proteinin tumour metastasis and aberrant Drosophila development.Nature，1989；Xu J，Liu LZ，DengXF，et al.The Enzymatic Activity of Drosophila AWD/NDP Kinase Is Necessary but NotSufficient for Its Biological Function.Dev Biol，1996)，由此而揭開了NDPK多能性研究的序幕；Okabe-Kado等1992年報導(Okabe-Kado J，Kasukabe T，Honma Y，et al.Identity ofa differentiation inhibiting factor for mouse myeloid leukemia cells with NM23/nucleosidediphosphate kinase.Biochem Biophys Res Commun，1992)，NDPK-A是M1型白血病細胞的分化抑制因子，由此開始了NDPK-A與白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等血液病的預後之間的相關性研究。在植物中，NDPK參與光敏色素介導的信號轉導(Shen Y，Kim JI，Song PS.NDPK2 as a signal transducer in the phytochrome-mediated light signaling.J Biol Chem，2005)，最近有學者報導，NDPK還可能通過乙烯信號途徑調節植物生長(Novikova GV，Moshkov IE，Smith AR，et al.Nucleoside diphosphate kinase is a possible component of theethylene signal transduction pathway.Biochemistry(Mosc)，2003)。NDPK作為轉錄調控因子的報導主要集中在NDPK與EBNA-3C、Menin等轉錄因子，以及與PDGF-A啟動子、RORα/RZRβ等細胞核受體的相互關係研究上(Subramanian C，Cotter MA，RobertsonES.Epstein-Barr virus nuclear protein EBNA-3C interacts with the human metastaticsuppressor Nm23-H1a molecular link to cancer metastasis.Nat Med，2001)，這方面的研究主要是為了闡述NDPK-A、NDPK-B調控腫瘤轉移的機制，這一領域是NDPK研究的熱點和難點(Salemo M，Ouatas T，Palmieri D，Steeg PS.Inhibition of signal transduction by thenm23 metastasis suppressorpossible mechanisms.Clin Exp Metastasis，2003；Postel EH.Multiple biochemical activities of NM23/NDP kinase in gene regulation.J BioenergBiomembr，2003；Valentijn LJ，Koppen A，van Asperen R，et al.Inhibition of a newdifferentiation pathway in neuroblastoma by copy number defects of N-myc，Cdc42，andnm23 genes.Cancer Res，2005)。
(三)國內外研究現狀NDPK-A的可能應用主要表現在如下幾個方面(1)抗病毒藥物增敏劑。利用NDPK的磷酸轉移酶活性，有可能將其開發為抗病毒藥物的增敏劑。核苷類似物，如d4T、AZT可用於AIDS等病毒性疾病和癌症的治療。在體內，這些化合物需要磷酸化為三磷酸化合物後才能發揮活性，NDPK是目前公認的催化這些前體藥物磷酸化的關鍵酶，也是限速酶(核苷類似物磷酸化的速度慢於核苷)，因此，外源補加NDPK可以作為核苷類似物的增敏劑、增效劑；(2)抗癌藥物增敏劑。我們在前期進行的實驗結果表明，NDPK-A對順鉑等烷化劑在in vitro和in vivo模型中均表現出明顯的增效減毒活性，有可能開發為腫瘤輔助藥物。(3)腫瘤標誌物。NDPK-A是血細胞分化抑制劑，對於白血病患者來說，血漿/血清高濃度NDPK-A意味預後不良。日本Toho大學的學者正在研究NDPK-A作為白血病預後因子的可行性，本課題組開發的血清NDPK-A酶聯免疫檢測試劑盒也已經進入臨床研究(熊盛，等.血清核苷二磷酸激酶A(NDPK-A)含量測定及其臨床意義初探.中國衛生檢驗雜誌，2004)；(4)藥靶。以Nm23-H1/NDPK-A作為藥靶的新藥研究也在積極進行中，已經發現，反式維甲酸可以提高肝癌細胞的Nm23-H1水平，5-氮脫氧胞苷可以增加高轉移性乳腺癌細胞中的Nm23-H1水平，以升高Nm23-H1水平為目的的抗乳腺癌轉移新藥MPA已於2006年進入臨床研究。
重組藥物方面，法國巴斯德研究所正在進行將NDPK-A開發為抗病毒藥物增敏劑方面的研究。Schneider等(www.pasteur.fr/recherche/RAR/RAR2003/Reac-en.html)對NDPK進行蛋白質改造，發現在NDPK活性中心中2個特定位點處引入突變後，對AZT和d4T的結合能力增強，進一步in vivo工作正在進行中。
基礎研究方面，國內自1999年至今，關於nm23/NDPK的研究報告超過300篇，主要集中於研究不同類型、不用階段腫瘤組織Nm23-H1基因的表達水平與腫瘤惡性表型之間的關係，如肺癌(四川大學華西醫院/四川省肺癌分子重點實驗室)(車國衛，等.Nm23-H1基因缺失人肺癌細胞株的篩選與鑑定.生命科學研究，2004；)，口腔癌(中山大學附屬二醫院口腔科)(陳紹維，黃洪章.Nm23-H1基因抑制口腔癌細胞的侵襲轉移行為機制的實驗研究.中山大學學報醫學科學版，2003)、婦科腫瘤(華中科技大學同濟醫院婦產科)(高慶蕾，等.Nm23-H1基因表達與卵巢癌轉移的相關性.癌症，2004)，還有更多從事病理學分析的研究報導(張紅凱，嚴美申，趙鐵華，等.ER，PR，nm23，P53，mdr，C-erbB-2在子宮內膜癌中的表達及意義.中華實用中西醫雜誌，2005)；國外關於nm23/NDPK的研究報告超過已1000篇，近年來的研究熱點是nm23/NDPK的作用機制及其非酶促活性。
從1988年發現該基因以來，國內外對Nm23-H1基因進行了大量的研究，但Nm23-H1基因調控腫瘤侵襲、轉移的分子機制仍未完全闡明。基因定點突變是在已知基因的預定位點通過替換、插入或缺失一定長度的核苷酸片段，精確地改變基因的特定鹼基序列，從而獲得突變蛋白質、研究蛋白質結構與功能之間關係的新技術。NDPK-A P96S、S44A、S120G、H118F是目前研究較為徹底的4種NDPK異構體。Freije JM等對Nm23-H1基因進行定點突變的研究顯示，120位的絲氨酸突變為甘氨酸(S120G)和96位的脯氨酸突變為絲氨酸(P96S)，保留了NDPK活性，但喪失了組氨酸依賴的蛋白磷酸轉移酶活性，而且喪失Nm23-H1基因抑制腫瘤轉移的功能(Freije JM，Blay P，MacDonald NJ，etal.Site-directed mutation of Nm23-H1.Mutations lacking motility suppressive capacity upontransfection are deficient in histidine-dependent protein phosphortransferase pathways in vitro.J Biol-Chem，1997)；Kim YI等將118位的組氨酸突變為苯丙氨酸(H118F)，雖不影響Nm23-H1基因抑制腫瘤轉移的功能，但喪失了NDPK活性(Kim YI，Park S，Jeoung DI，et al.Point mutations affecting theoligomeric structure of Nm23-H1 abrogates its inhibitoryactivity on colonization and invasion of prostate cancer cells.Biochem Biophys ResCommun，2003)。
目前能檢索到的均是對NDPK-A關鍵活性殘基進行定點突變的報導，這些研究的目的是為了闡明某一位點對NDPK-A某種特定活性的決定作用，所以異構體均或多或少喪失NDPK的某種活性。

發明內容
本發明的目的在於提供一種核苷二磷酸激酶A(NDPK-A)氧化還原異構體，該異構體的穩定性不變而活性更強，尤其是NDPK的磷酸基轉移酶、DNase(抑癌)活性均得到不同程度增強。
本發明所述的一種NDPK-A氧化還原異構體，它是由具有胺基酸序列如SEQ IDNO.1所列的核苷二磷酸激酶A即NDPK-A中製造一個胺基酸突變而產生的，所述的胺基酸突變是第4位半胱氨酸突變為絲氨酸，所述的NDPK-A氧化還原異構體的胺基酸序列如SEQ ID NO.2所列。本發明所述的NDPK-A氧化還原異構體簡稱為NDPK-AC4S。
本發明還提供了一種改善具有如SEQ ID NO.1所列胺基酸序列的核苷二磷酸激酶A的酶學性質的方法，通過在該胺基酸序列的第4位引入胺基酸取代以改變所述核苷二磷酸激酶A的胺基酸序列，所述的第4位的胺基酸取代是用絲氨酸取代半胱氨酸。
本發明還提供了一種DNA分子，其編碼本發明所述的NDPK-A氧化還原異構體。
優選的，所述的DNA分子，其編碼序列為SEQ IDNO.3。
本發明是對NDPK活性的負調控基團進行基因工程突變而得到新的NDPK-A氧化還原異構體，NDPK-A C4S的磷酸基轉移酶、DNase(抑癌)活性均得到不同程度增強，NDPK-A的磷酸基轉移酶活性與AZT、d4T等抗病毒/抗癌藥物的活性發揮至關重要，NDPK-A的DNase活性則可能直接參與腫瘤抑制、抗病毒等生物學過程，因此，本發明所述的NDPK-A氧化還原異構體對於抗腫瘤、抗病毒藥物研究開發具有重要潛在意義。
(1)異構體NDPK-A C4S的磷酸轉移酶活性NPDK-A的首要功能是催化NDP和NTP之間的磷酸基轉移反應，這一活性與細胞內NTP濃度的維持、能量代謝、DNA合成、抗病毒前體藥物和抗癌前體藥物轉化為活性藥物等生命活動過程有重要關係。
HPLC法測定野生型NDPK-A與異構體NDPK-A C4S的磷酸基轉移酶活性，發現野生型NDPK-A的磷酸基轉移酶活性為3159±39U/mg，NDPK-A C4S的磷酸基轉移酶活性為3394±37U/mg(參見實施例五)。
(2)異構體NDPK-A C4S的DNase酶活性NDPK-A與腫瘤生長、轉移密切相關，是最先發現的腫瘤轉移抑制因子，但其抗腫瘤機制至今還未徹底闡明。最近研究結果表明，NDPK-A是顆粒酶A活化的DNase(Granzyme A activated DNase，GAAD)，是機體非Caspase依賴性細胞凋亡途徑的效應分子，直接參與機體抗腫瘤和抗病毒過程。
超螺旋質粒水解法測定NDPK-A C4S的DNase活性，發現NDPK-A C4S的DNase活性是野生型NDPK-A蛋白的2.55倍(參見實施例六)。
本發明還提供了所述的NDPK-A氧化還原異構體的應用，包括用於製備抗病毒和/或抗腫瘤藥物增敏劑的應用，以及用於製備抗病毒和/或抗腫瘤藥物的應用。
本發明所述的NDPK-A C4S異構體可至少應用於以下幾個方面(1)抗病毒和/或抗腫瘤藥物增敏劑核苷類似物是一大類抗病毒、抗腫瘤藥物，如抗HIV藥物疊氮胸苷AZT、4-脫氧胸苷d4T等。這些藥物必須磷酸化為三磷酸化合物才能摻入到病毒DNA或者腫瘤細胞DNA中，發揮抗病毒、抗腫瘤活性，但三磷酸化的核苷類似物由於帶強電荷很難通過細胞膜，只能以非磷酸化形式的核苷給藥，進入細胞後再磷酸化為有活性的藥物，NDPK是這一藥物轉化過程的限速酶。本發明獲得的一種磷酸基轉移酶活性增高的NDPK-A異構體，比野生型NDPK-A更適宜可作為核苷類似物的增效劑、增敏劑。
(2)直接發揮抗病毒和/或抗腫瘤活性顆粒酶A是一種絲氨酸蛋白酶，位於NK細胞和CTL的細胞毒顆粒中，在穿孔素介導下進入靶細胞後，可以導致caspase非依賴的細胞死亡，這一過程對於機體殺滅高表達bcl-2或者其它對caspase不敏感的靶細胞具有重要意義。在這一過程中，顆粒酶A活化的DNA酶(GzmA-activated DNase，GAAD)位於一種與內質網相連的複合體中，這一複合體中還含有pp32，以及GzmA的底物SET、HMG-2和Ape1等。最近報導，GAAD就是NDPK-A，NDPK-A的特異性活性抑制劑是SET，加入GzmA後或者在CTL攻擊時，SET和NDPK-A轉位到胞核中，SET被降解，活化的NDPK-A可以在染色體DNA上形成缺刻(nick)，誘發細胞凋亡(Fan Z，et al.Tumor suppressor NM23-H1 is agranzyme A-activated DNase during CTL-mediated apoptosis，and the nucleosome assemblyprotein SET is its inhibitor.Cell，2003)。本發明所獲得的DNase活性明顯增高的NDPK-A異構體可以以轉基因或者穿膜型蛋白的形式給藥，以觸發宿主針對病毒寄生性細胞或者腫瘤細胞的CTL反應，從而直接發揮抗病毒/抗腫瘤活性。
NDPK-A是一種多功能蛋白，可以調節細胞生長、運動，腫瘤發生、發展和轉移，細胞分化，器官發生等多種生命活動過程，磷酸基轉移酶和DNase活性是NDPK-A多種生物學功能的基礎，因此本發明所述的酶活性增強的NDPK-A異構體C4S比野生型NDPK-A具有更多潛在的應用。


圖1為NDPK-A突變體構建示意圖；圖中，黑色實線野生型NDPK-A cDNA(即Nm23-H1)；C野生型NDPK-A基因中的Cys殘基；S突變引物中的Ser編碼序列；箭頭突變引物黑點限制酶位點。
圖2為NDPK-A突變體測序結果；圖中，A野生型；B突變體；箭頭指示突變位點。
圖3為SDS-PAGE分析NDPK-A C4S工程菌的蛋白表達；圖3中，1蛋白標準品；2E.coli DH[pBV-Nm23-C4S]誘導前；3E.coli DH[pBV-Nm23-C4S]誘導後。
圖4為SDS-PAGE分析NDPK-A C4S離子交換層析過程；圖中，1蛋白標準品；2野生型NDPK-A標準品；3離子交換層析上樣樣品；4上樣穿透峰；5雜蛋白；6目的蛋白。
圖5為SDS-PAGE分析NDPK-A C4S親和層析過程；圖中，1蛋白標準品；2上樣樣品；3洗脫雜蛋白；4目的蛋白NDPK-A C145S；5野生型NDPK-A標準品。
圖6為野生型NDPK-A及其C4S突變體蛋白的肽指紋圖譜；圖中，A野生型NDPK-A；BNDPK-A C4S突變體。
圖7為NDPK-A及其突變體磷酸基轉移酶活性測定HPLC洗脫曲線；圖中，4.451min、4.421min所在洗脫峰為底物UDP峰，7.921min、7.861min所在洗脫峰為產物UTP峰。
圖8為野生型NDPK-A不同水解時間的DNase活性；圖中，M核酸分子量標準；0，3，6，9，12，18，24反應不同時間後的質粒DNA樣品。
圖9為不同方法評價NDPK-A DNase活性的曲線圖；圖中，曲線(CCCt0-CCCt1)/CCCt0為酶切不同時間後超螺旋質粒的減少量；曲線((L+OC)t1-t0)/CCCt0為酶切不同時間後線性和開環質粒的增加量(相對於起始超螺旋質粒)；曲線((L+OC)t1-t0)/tO為酶切不同時間後線性和開環質粒的增加量(相對於起始線性和開環質粒)。
圖10為NDPK-A及其突變體的DNase酶活性。圖中，1核酸分子量標準；2pcDNA3.1(-)質粒對照；3未加酶陰性對照；4陽性對照DNase I；5野生型NDPK-A；6NDPK-A C4S突變體。
具體實施例方式
實施例一利用PCR方法構建突變型Nm23-H1基因1.目的在前期工作中我們發現(熊盛，錢垂文，王一飛，等.核苷二磷酸激酶A的異構及機制研究.中國生物化學與分子生物學學報.2005)，重組人NDPK-A可因氧化還原而發生異構，異構體的部分理化性質和酶活性差異明顯。這些現象提示，對NDPK-A氧化還原異構相關的關鍵殘基(Cys)進行突變，有可能提高其活性。
2.實驗材料含有野生型NDPK-A基因的表達質粒pBV-Nm23H1由侯宇等構建並保存於本實驗室(候宇，等.Nm23-H1/NDPK-A基因在大腸桿菌中的表達及其產物純化研究.中國生物化學與分子生物學學報，1998)，E.coli DH5α購自Promega公司，克隆載體pUC18購自Invitrogen公司，表達載體pBV220(張智清等 含P_RP_L啟動子德原核高效表達載體德組建及其應用 病毒學報 1990年)。
突變引物委託北京奧科生物技術公司合成，引物序列及編號如下所列□C4Nm55』＞TCTA ATGGCCAACAGCGAGCGTACCTTCATTGCG＜3』□C4Nm35』＞GCGA TCATTCATAGATCCAGTTCTG＜3』(其中斜下劃線部分為引入的EcoR I、BamH I限制酶位點，各引物以無菌水稀釋至25μmol/L，-20℃保存備用。)3.實驗方法3.1突變原理NDPK-A分子中含有3個Cys，分別是C4、C109、C145。通過設計合適的引物對NDPK-A進行定點突變，構建NDPK-A C4S突變體。參照圖1。圖中，黑色實線野生型NDPK-A cDNA(即Nm23-H1)；C野生型NDPK-A基因中的Cys殘基；S突變引物中的Ser編碼序列；箭頭突變引物黑點限制酶位點。
3.2PCR定點突變取3支PCR管，1支作反應管，另2支作對照管，順序加入以下成份(表1)表1NDPK-A C4S定點突變PCR反應體系

擴增程序94℃預變性2分鐘→94℃變性45秒→53℃退火45秒→72℃延伸1分鐘→反應28個循環→72℃延伸5分鐘，擴增完畢，取樣，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果。
3.3構建重組質粒pBV-Nm23H1 C4S將擴增片段用EcoR I、BamH I雙酶切，與同樣酶切過的克隆載體pUC18連接，得重組質粒pUC-Nm23H1 C4S，轉化E.coli DH5α，得工程菌E.coli DH[pUC-Nm23H1C4S]，提取質粒，送上海博亞生物技術公司進行序列測定。
3.4序列測定以通用引物M13F和M13R為引物對，Sanger雙脫氧法測定重組質粒pUC-Nm23H1C4S序列，結果表明，重組質粒pBV-Nm23H1 C4S中目的基因序列與預期完全一致，說明定點突變成功。結果參見圖2。圖中，A野生型；B突變體；箭頭指示突變位點。
實施例二NDPK-A C4S工程菌的構建1.目的構建能高效表達NDPK-A C4S突變蛋白的基因工程菌。
2.實驗材料含有NDPK-A C4S基因的重組質粒pUC-Nm23H1 C4S(由實施例一構建)，E.coliDH5α購自Promega公司，表達載體pBV220(張智清等含P_RP_L啟動子德原核高效表達載體德組建及其應用病毒學報1990年)。
3.實驗方法製備外源基因片段E.coli DH[pUC-Nm23H1 C4S]單菌落接種5mL LB培養液，37℃、220rpm過夜培養，小量提取法提取質粒DNA，EcoR I、BamH I雙酶切，酶切產物瓊脂糖凝膠電泳，膠回收小片段，-20℃保存備用。
製備載體片段類似條件擴增表達載體pBV220，EcoR I、BamH I雙酶切，酶切產物瓊脂糖凝膠電泳，膠回收大片段，-20℃保存備用。
連接在10μL反應體系中，加入特定量的外源基因片段和載體片段，然後加入T4 DNA連接酶，16℃連接4h或者4℃連接過夜。
轉化連接產物轉化E.coli DH5α感受態細胞，含有100μg/mL氨苄青黴素的LB固體瓊脂篩選轉化子。
重組質粒鑑定隨機挑選3個轉化子克隆，小量提取質粒，酶切鑑定，重組質粒進一步測序鑑定。
小量誘導表達隨機挑選工程菌E.coli DH[pBV-Nm23-C4S]單菌落接種LB培養液，30℃劇烈振蕩4h，升高溫度至42℃繼續培養4h，離心收集菌體，SDS-PAGE電泳分析工程菌誘導前後蛋白表達情況。選擇表達量最高的菌落保存，為工程菌E.coliDH[pBV-Nm23-C4S]。
3.實驗結果從圖3中可以看出，誘導後的E.coli DH[pBV-Nm23-C4S]菌體在分子量約18kD處出現明顯增粗的蛋白帶，與目的蛋白預期分子量一致，說明重組蛋白NDPK-A C4S得到正確表達。圖3中，1蛋白標準品；2E.coli DH[pBV-Nm23-C4S]誘導前；3E.coliDH[pBV-Nm23-C4S]誘導後。
實施例三NDPK-A異構體的表達與純化1.目的製備NDPK-A C4S異構體蛋白，為活性測定等後續實驗提供物質材料。
2.實驗材料工程菌E.coli DH[pBV-Nm23-C4S]由發明人所在實驗室保存，構建方法如實施例二所列；層析基質DEAE-sepharose Fast Flow購自Amersham Bioscience公司；Cibacron Blue3GA Sepharose CL-4B購自Millipore公司；純化緩衝液及其配方Buffer A20mmol/L Tris-HCl、1mmol/L EDTA、2mmol/LMgCl2、1mmol/L DTT，pH7.5；Buffer B含0.05mol/L NaCl的Buffer A；Buffer C含0.1mol/LNaCl的BufferA；Buffer D含1.5mmol/LATP的Buffer C。
3.實驗方法3.1搖瓶發酵和樣品前處理工程菌DH[pBV-Nm23-C4S]接種5mL LB培養基，30℃，220rpm過夜搖菌培養一級種子，按10％比例接種於裝有50ml發酵培養基的三角瓶中培養，振蕩培養至0.8OD600U/mL，轉入8個裝有250ml發酵培養基的三角瓶中繼續培養至0.8OD600U/mL，升高溫度至42℃誘導表達6小時後，4℃、8000rpm離心15min收集菌體，TE緩衝液按1∶8(m/v)比例重懸，超聲破碎菌體(功率600W，時間15min)，4℃、15000rpm離心30min去除細胞碎片，取上清保存備用。
3.2離子交換層析參考錢垂文等和熊盛等的方法進行(錢垂文，等.rNM23-H1/NDPK-A中試純化工藝研究，生物技術，2002；熊盛，等.50L規模中試發酵重組核苷二磷酸激酶A工程菌，生物工程學報，2005)。裝置DEAE Sephadex Fast Flow層析柱(25×30cm)，0.2mol/LNaOH+0.1mol/L HCl+1mol/LNaCl洗柱→BufferA平衡，流速2ml/min→蛋白樣品上樣→Buffer A洗回基線→Buffer B洗脫雜蛋白→Buffer C洗脫目標蛋白→BufferA+1mol/LNaCl洗脫剩餘雜蛋白→0.2mol/L NaOH柱再生，純水平衡至中性→20％乙醇保存層析柱。
3.3親和層析裝置親和層析柱Cibacron blue 3-GA(規格XK50×30cm)，0.2mol/L NaOH再生→Buffer C平衡，流速1ml/min→取離子交換層析洗脫樣品上樣→Buffer C洗回基線→Buffer D洗脫收集目的蛋白→0.2mol/L NaOH清洗再生層析柱，純水平衡至中性→20％乙醇保存層析柱。
3.4樣品後處理及檢測親和層析收集樣品經超濾或者凝膠過濾除鹽後，SDS-PAGE電泳結合凝膠光密度掃描分析純度，超過95％以上為合格樣品，Bradford法蛋白定量並調整至合適濃度，-20℃或-80℃保存樣品。
4.實驗結果SDS-PAGE分析離子交換層析和親和層析純化NDPK-A C4S樣品，結果分別如圖4、圖5所示，經凝膠光密度掃描，2步純化後的NDPK-A C4S純度超過99％。圖4中，1蛋白標準品；2野生型NDPK-A標準品；3離子交換層析上樣樣品；4上樣穿透峰；5雜蛋白；6目的蛋白。圖5中，1蛋白標準品；2上樣樣品；3洗脫雜蛋白；4目的蛋白NDPK-A C145S；5野生型NDPK-A標準品。
實施例四肽質量指紋圖譜分析突變蛋白關鍵肽段分子量1.目的高精度質譜測定突變後Ser所在肽段的分子量，進一步確認定點突變的準確無誤。
2.實驗材料和儀器NDPK-A C4S如實施例一、二、三作製備；胰蛋白酶購自Promega公司；基質輔助雷射解吸附離子飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)為ABI 4700 Proteomics System。
3.實驗方法SDS-PAGE分離NDPK-A C4S蛋白，染色後，切割目的條帶，保存於0.5mL離心管中→加入脫色液脫色，3D H2O洗2～3次→每管加入200μL 100％ACN脫水2～3次→加入胰蛋白酶0.01μg/μL至膠吸脹，37℃過夜酶解→每管加入100μL 50％ACN+0.1％TFA置於37℃萃取30min→超聲5～10min後，離心取上清，重複此步驟一次，合併二次萃取上清→凍幹保存→加基質CCA→ABI 4700proteomics系統分析。
4.實驗結果經胰蛋白酶徹底水解後，野生型NDPK-A中C4所在肽段序列為(ANCER)，理論分子量為592.2508(單電子峰，下同)，經C→S突變後序列為ANSER，分子量為576.2742。圖6A和圖6B分別是野生型NDPK-A及C4S突變體在分子量566-602Dal區間的PMF圖譜，可見野生型蛋白中出現質荷比為592.2287的肽段(誤差＜0.03dal)，在576.2附近無信號；而NDPK-A C4S突變體的PMF圖譜中出現576.2689肽段，在592.2附近無信號。這從蛋白質水平證明NDPK-A C4S突變成功。
實施例五HPLC法測定NDPK-A C4S的磷酸轉移酶活性研究1.目的測定NDPK-A C4S突變體的磷酸基轉移酶活性，評價其未來應用前景。
2.實驗材料和儀器NDPK-A C4S蛋白純品，如實施例一、二、三所得；Agilent C18柱(4.6×150mm 5m)購自Agilent公司；高效液相色譜儀為Agilent 1100型；NDPK-A野生型蛋白由熊盛等參照論文方法製備(熊盛，等.50L規模中試發酵重組核苷二磷酸激酶A工程菌，生物工程學報，2005)；酶反應底物UDP、ATP購自Sigma公司，甲酸、乙酸、乙腈、MgCl2等試劑為色譜純或分析純。
3.實驗方法3.1酶促反應野生型NDPK-A及其突變體稀釋至150ng/mL，在1.5mL eppendorg管中按表2所示加入UDP、ATP、緩衝液(33mmol/L Na-Hepes，5mmol/L MgCl2，1.6μmol/L寡酶素，pH 7.4)後，加入NDPK-A蛋白，置於氣體恆溫器上加熱至37℃，反應8min；加入甲酸終止反應，振蕩混勻，使用0.45微孔濾膜過濾樣品。
表2磷酸基轉移酶活性測定反應體系(體積μl)

3.2HPLC測定活性色譜條件以緩衝液(100mmol/L磷酸二氫鉀、20mmol/L乙酸、5mmol/L四丁基溴化銨，pH 5.0)作為流動相A液，90％A液+10％乙腈作為洗脫液B液，Agilent C18柱(4.6×150mm 5m)，柱溫25℃，流速1.0mL/min，檢測波長254nm。分別進樣10μL反應產物，HPLC測定酶活性，以保留時間定性，峰面積定量，每樣品重複測定2次，取均值。
酶活性單位的定義為在上述測定條件下，每分鐘生成1μmol UTP的酶量為1個活性單位。
4.實驗結果酶反應產物洗脫曲線如圖7所示，酶活性計算結果如表3所示。圖7中，4.451min、4.421min所在洗脫峰為底物UDP峰，7.921min、7.861min所在洗脫峰為產物UTP峰。
表3NDPK-A及其突變體磷酸基轉移酶活性測定結果

實施例六NDPK-A及其異構體DNase酶活性研究1.目的最新研究成果表明，NDPK-A是顆粒酶A活化的DNA酶(granzyme A activatedDNase，GAAD)，是CTL介導的Caspase非依賴性細胞凋亡途徑的重要效應分子，與機體抗病毒和抗腫瘤過程直接相關，為此，我們比較了野生型NDPK-A及其異構體的DNA酶(DNase)活性。
2.實驗材料NDPK-A C4S蛋白如實施例一、二、三所製備；質粒pcDNA3.1由發明人所在實驗室保存；Tris-HCl、EGTA等化學試劑為分析純，BSA為生化試劑，購自Invitrogen公司。
3.實驗方法參照表2所列，在PCR反應管中分別加入20μL緩衝液，0.5μg pcDNA3.1質粒及0.5mg NDPK-A蛋白，混勻。37℃水浴3，6，9，12，18，24h後，加入2μL 10倍核酸電泳緩衝液終止反應，瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠圖像分析確定酶反應條件，然後根據確定的酶反應條件，參照表4所列反應體系測定NDPK-A C4S突變體的DNase活性。
表4NDPK-A C4S DNase酶活性測定體系

4.實驗結果從圖8中可以看出，隨著反應時間的增加，質粒DNA在NDPK-A的DNase酶活性作用下，超螺旋構型的DNA量不斷減少，而線型和開環型DNA不斷增加，在18-24小時後出現降解現象，說明超螺旋構型DNA被逐漸切割為線型或開環型DNA，並逐步降解為小片段DNA。圖8中，M核酸分子量標準；0，3，6，9，12，18，24反應不同時間後的質粒DNA樣品。
對圖8進行灰度掃描，將0h時線性質粒的量標定為1，掃描不同時間不同構型DNA的灰度值。酶活性可以以3種方式描述(1)相對於起始超螺旋質粒，酶切不同時間後超螺旋質粒的減少量；(2)相對於起始線性和開環質粒，酶切不同時間後線性和開環質粒的增加量；(3)相對於起始超螺旋質粒，酶切不同時間後線性和開環質粒的增加量。數據分析結果表明，以超螺旋質粒的減少量作為酶活性比較參數更為合適(圖9中(CCCt0-CCCt1)/CCCt0曲線，數據標記為實心四方形)。理論分析也應該如此，因為在酶切後期，部分線性質粒被分解為小片段而難以電泳檢出，以線性和開環質粒的改變量作為酶活性評價指標可能存在較大負誤差。
以建立的方法評價NDPK-A及其突變體的DNase活性，重複2次，結果如圖10所示，發現C4S突變蛋白的DNase活性明顯高於野生型NDPK-A。圖10中，1核酸分子量標準；2pcDNA3.1(-)質粒對照；3未加酶陰性對照；4陽性對照DNase I；5野生型NDPK-A；6NDPK-A C4S突變體。
經灰度掃描分析，發現野生型NDPK-A可以水解29.88％的超螺旋DNA，而C4S突變體可以水解76.07％的超螺旋DNA，是野生型活性的2.55倍(表5)。
表5NDPK-A及其突變體DNase酶活性測定結果

序列表(SEQUENCE LISTING)110廣州暨南生物醫藥研究開發基地有限公司120核苷二磷酸激酶A氧化還原異構體130
1412007-04-301603170PatentIn version 3.42101211152212PRT213人核苷二磷酸激酶A(swissprotlocus NDKA_HUMAN，accession P15531)4001Met Ala Asn Cys Glu Arg Thr Phe Ile Ala Ile Lys Pro Asp Gly Val1 5 10 15Gln Ala Gly Val Val Gly Glu Ile Ile Lys Arg Phe Glu Gln Lys Glu20 25 30Phe Arg Leu Val Gly Leu Arg Phe Met Gln Ala Ser Glu Asp Val Leu35 40 45
Lys Glu His Tyr Val Asp Leu Lys Asp Arg Pro Phe Phe Ala Gly Leu50 55 60Val Lys Tyr Met His Ser Gly Pro Val Val Ala Met Val Trp Glu Gly65 70 75 80Leu Asn Val Val Lys Thr Gly Arg Val Met Leu Gly Glu Thr Thr Pro85 90 95Ala Asp Ser Lys Pro Gly Thr Ile Arg Gly Asp Phe Cys Ile Gln Val100 105 110Gly Arg Asn Ile Ile His Gly Ser Asp Ser Val Glu Ser Ala Glu Lys115 120 125Glu Ile Gly Leu Trp Phe His Pro Val Glu Leu Val Asp Tyr Thr Ser130 135 140Cys Ala Gln Asn Tyr Ile Tyr Glu145 1502102211152212PRT213基因工程突變產物4002
Met Ala Asn Ser Glu Arg Thr Phe Ile Ala Ile Lys Pro Asp Gly Val1 5 10 15Gln Ala Gly Val Val Gly Glu Ile Ile Lys Arg Phe Glu Gln Lys Glu20 25 30Phe Arg Leu Val Gly Leu Arg Phe Met Gln Ala Ser Glu Asp Val Leu35 40 45Lys Glu His Tyr Val Asp Leu Lys Asp Arg Pro Phe Phe Ala Gly Leu50 55 60Val Lys Tyr Met His Ser Gly Pro Val Val Ala Met Val Trp Glu Gly65 70 75 80Leu Asn Val Val Lys Thr Gly Arg Val Met Leu Gly Glu Thr Thr Pro85 90 95Ala Asp Ser Lys Pro Gly Thr Ile Arg Gly Asp Phe Cys Ile Gln Val100 105 110Gly Arg Asn Ile Ile His Gly Ser Asp Ser Val Glu Ser Ala Glu Lys115 120 125Glu Ile Gly Leu Trp Phe His Pro Val Glu Leu Val Asp Tyr Thr Ser130 135 140
Cys Ala Gln Asn Tyr Ile Tyr Glu145 1502103211459212DNA213基因工程突變產物4003atggccaaca gcgagcgtac cttcattgcg atcaaaccag atggggtcca gcggggtctt60gtgggagaga ttatcaagcg ttttgagcag aaaggattcc gccttgttgg tctgaaattc120atgcaagctt ccgaagatct tctcaaggaa cactacgttg acctgaagga ccgtccattc180tttgccggcc tggtgaaata catgcactca gggccggtag ttgccatggt ctgggagggg240ctgaatgtgg tgaagacggg ccgagtcatg ctcggggaga ccaaccctgc agactccaag300cctgggacca tccgtggaga cttctgcata caagttggca ggaacattat acatggcagt360gattctgtgg agagtgcaga gaaggagatc ggcttgtggt ttcaccctga ggaactggta420gattacacga gctgtgctca gaactggatc tatgaatga 459
權利要求
1.一種核苷二磷酸激酶A氧化還原異構體，其特徵在於它是由具有胺基酸序列如SEQ ID NO.1所列的核苷二磷酸激酶A即NDPK-A中製造一個胺基酸突變而產生的，所述的胺基酸突變是第4位半胱氨酸突變為絲氨酸，所述的核苷二磷酸激酶A氧化還原異構體的胺基酸序列如SEQ ID NO.2所列。
2.一種改善具有如SEQ ID NO.1所列胺基酸序列的核苷二磷酸激酶A的酶學性質的方法，其特徵在於通過在該胺基酸序列的第4位引入胺基酸取代以改變所述核苷二磷酸激酶A的胺基酸序列，所述的第4位的胺基酸取代是用絲氨酸取代半胱氨酸。
3.一種DNA分子，其特徵在於其編碼權利要求1所述的核苷二磷酸激酶A氧化還原異構體。
4.根據權利要求3所述的DNA分子，其特徵在於所述的編碼序列為SEQ ID NO.3。
5.如權利要求1所述的核苷二磷酸激酶A氧化還原異構體用於製備抗病毒和/或抗腫瘤藥物增敏劑的應用。
6.如權利要求1所述的核苷二磷酸激酶A氧化還原異構體用於製備抗病毒和/或抗腫瘤藥物的應用。
全文摘要
本發明屬於基因工程領域，具體是涉及一種通過基因工程改造得到的核苷二磷酸激酶A(NDPK－A)氧化還原異構體。本發明所述的NDPK－A氧化還原異構體，是由具有胺基酸序列如SEQ ID NO.1所列的核苷二磷酸激酶A即NDPK－A中製造一個胺基酸突變而產生的，所述的胺基酸突變是第4位半胱氨酸突變為絲氨酸，所述的NDPK－A氧化還原異構體的胺基酸序列如SEQ ID NO.2所列。該異構體的穩定性不變而活性更強，尤其是NDPK的磷酸基轉移酶、DNase(抑癌)活性均得到不同程度增強。
文檔編號A61K38/45GK101063112SQ200710027829
公開日2007年10月31日 申請日期2007年4月30日 優先權日2007年4月30日
發明者熊盛, 王一飛, 郭朝萬 申請人:廣州暨南生物醫藥研究開發基地有限公司