用於治療癌症的嵌合腺病毒的製作方法

2023-08-03 15:29:31

專利名稱：用於治療癌症的嵌合腺病毒的製作方法
技術領域：
本發明通常涉及分子生物學領域，更具體地本發明涉及具有治療應用的溶瘤腺病毒。
背景技術：
在美國和其它地區，癌症是死亡的主要原因。根據癌症的類型，典型地採用外科手術、化療和/或放射進行治療。這些治療通常失敗，顯然需要有新的治療手段進行單獨使用或與傳統技術結合使用。
一種方法是使用腺病毒，單獨使用或作為能夠給腫瘤細胞輸送抗-癌治療蛋白的載體。腺病毒是無包膜二十面體雙鏈DNA病毒，具有大約36千個鹼基對的基因組。該病毒基因組的每一末端具有已知的反向末端重複(ITR)短序列，其實病毒複製所必需的。迄今為止檢測到的所有人類腺病毒基因組具有相同的總體結構；即，編碼特定功能的該基因定位於病毒基因組的相同位置。所述病毒基因組含有5個早期轉錄單位(E1A、E1B、E2、E3和E4)、2個延遲早期單位(IX和Iva2)和1個被加工產生5個家族的晚期mRNAs(L1-L5)的晚期單位(主要晚期)。由早期基因編碼的蛋白質參與複製，而晚期基因編碼病毒結構蛋白質。所述病毒基因組的一部分可以用外源DNA容易地進行取代，且重組腺病毒在結構上是穩定的，這些特性使得這些病毒對基因治療具有潛在用途(參見Jolly，D.(1994)CancerGene Therapy 151-64)。
目前，致力於產生臨床上有用的腺病毒治療的研究已聚焦於腺病毒血清型，Ad5。這一人類腺病毒的遺傳學被很好地表徵，對其進行分子操縱的系統也被充分地描述。大量生產方法已經被開發以支持臨床應用，可獲得一些關於該製劑的臨床經驗，參見，Jolly，D.(1994)Cancer Gene Therapy，151-64。涉及人類腺病毒(Ad)在癌症治療中的應用的研究已聚焦於開發基於Ad5的腺病毒，該腺病毒在特定的腫瘤細胞類型中有更效價或者優先靶向特定的腫瘤細胞類型；且如果要想使得腺病毒治療在臨床上得到實際應用，則存在產生更有效的溶瘤病毒的需求。
Ad5僅僅是51種目前已知的腺病毒血清型中的一種，基於不同的特性包括紅血球凝聚特性其被分類為亞群A至F(參見，Shenk，「AdenoviridaeThe Viruses and Their Replication，」Fields Virology，Vol.2，Fourth Edition，Knipe，ea.，Lippincott，Williams Wilkins，pp.2265-2267(2001))。這些血清型在多個水平上不同，例如在人類和齧齒動物中的病理學、用於附著的細胞受體，但是這些區別在很大程度上被忽略了其可作為開發更有效的溶瘤腺病毒的潛在方法(除纖維蛋白改變(fiber alterations)外，參見Stevenson et al.(1997)J.Virol.714782-4790；Krasnykh et al.(1996)J.Virol.706839-6846；Wickhamet al.(1997)J.Virol.718221-8229；Legrand et al.(2002)Curr.GeneTher.2323-329；Barnett et al.(2002)Biochim.Biophys.Acta 1-31-14；美國專利申請2003/0017138)。
對腺病毒血清型間的差異的利用可以為利用具有增強的選擇性和效價的新的腺病毒的更有效的基於腺病毒的療法提供來源。存在對這種改良的基於腺病毒的治療的需求。
發明概述本發明提供了對基於病毒的治療有用的新的嵌合腺病毒或其變體或衍生物。特別地，本發明提供了具有包含E2B區域的基因組的嵌合腺病毒或其變體或衍生物，其中所述E2B區域包含衍生自第一種腺病毒血清型的核酸序列和衍生自第二種腺病毒血清型的核酸序列；其中所述第一種和第二種腺病毒血清型分別選自腺病毒亞群B、C、D、E或F，且彼此間不相同；以及，其中所述嵌合腺病毒是溶瘤的，並對腫瘤細胞顯示出提高的治療指數。
在一個實施方式中，所述嵌合腺病毒還包含編碼纖維蛋白、五鄰體蛋白和六鄰體蛋白的區域，其中編碼所述蛋白的核酸均來自相同的腺病毒血清型。在另一個實施方式中，本發明的嵌合腺病毒包含經修飾的E3或E4區域。
在另一個實施方式中，所述嵌合腺病毒在結腸腫瘤細胞、乳腺腫瘤細胞、胰腺腫瘤細胞、肺腫瘤細胞、前列腺腫瘤細胞、卵巢腫瘤細胞或造血腫瘤細胞中顯示出提高的治療指數。在一個特別優選的實施方式中，所述嵌合腺病毒在結腸腫瘤細胞中顯示出提高的治療指數。
在一個優選的實施方式中，所述嵌合腺病毒的E2B區域包含SEQ ID NO3。在一個特別優選的實施方式中，所述嵌合腺病毒包含SEQ ID NO1。
本發明提供了具有包含E2B區域的基因組的重組嵌合腺病毒或其變體或衍生物，
其中所述E2B區域包含衍生自第一種腺病毒血清型的核酸序列和衍生自第二種腺病毒血清型的核酸序列；其中所述第一種和第二種腺病毒血清型分別選自腺病毒亞群B、C、D、E或F，且彼此不相同；其中所述嵌合腺病毒是溶瘤的，並對腫瘤細胞顯示出提高的治療指數；以及其中所述嵌合腺病毒已通過缺失選自E1、E2、E3或E4的一或多個編碼參與腺病毒複製的蛋白質的腺病毒區域而成為複製缺陷型。
在一個實施方式中，本發明的嵌合腺病毒還包含一種編碼治療性質蛋白質的異源基因，其中所述異源基因在被所述腺病毒感染的細胞中表達。在一個優選的實施方式中，所述治療性蛋白質選自由細胞因子和趨化因子、抗體、前體藥物轉化酶和免疫調節蛋白質所組成的組。
本發明提供了將本發明的嵌合腺病毒用於治療目的的方法。在一個實施方式中，所述嵌合腺病毒可被用以抑制癌細胞的生長。在一個特定的實施方式中，包含SEQ ID NO1的嵌合腺病毒被用於抑制結腸癌細胞的生長。
在另一個實施方式中，本發明的嵌合腺病毒作為將治療蛋白輸送給細胞的載體是有用的。
本發明提供了用於製備本發明的嵌合腺病毒的方法，其中該方法包括h)集合代表腺病毒亞群B至F的腺病毒血清型，從而產生腺病毒混合物；i)將來自步驟(a)的集合的腺病毒混合物在腫瘤細胞的活躍生長培養物中，以高至足以促進血清型之間發生重組但沒有高至產生過早細胞死亡的顆粒/細胞比率進行傳代；j)從步驟(b)收穫上清；k)用在步驟(c)中收穫的上清感染腫瘤細胞的靜止培養物；l)在出現任何細胞病變(CPE)的跡象之前，從步驟(d)中收穫細胞培養物上清；m)用在步驟(e)中收穫的上清感染腫瘤細胞的靜止培養物；和n)通過空斑純化從在步驟(f)中收穫的上清中分離所述嵌合腺病毒。


圖1Ad在TMAE HPLC柱上的保留時間圖。A)用以產生原始的起始病毒池的各Ad血清型的保留圖。B)分別衍生自HT-29、Panc-1、MDA-231和PC-3細胞系的20代傳代池的保留圖。
圖2各病毒池的細胞溶解活性。用各自的病毒池以VP/細胞比率為100-0.01感染A)HT-29、B)MDA-231、C)Panc-1和D)PC-3細胞。根據不同的細胞系在感染後的不同天數(如圖所標示)進行MTS檢測。圖面中的每一數據點代表一次一式四份的檢測，結果以平均值+/-標準差表示。每一圖面描述了一個代表性的試驗，且至少在3個獨立的時間對全部病毒池的靶腫瘤細胞系進行檢測(圖例—●—Ad5、——初始病毒池、—■—衍生自池的特定細胞，20代)。
圖3ColoAd1和Ad5對人腫瘤細胞系的細胞溶解活性。對A)一大組人腫瘤細胞系，和B)一組人結腸癌細胞系進行MTS檢測以測定其潛在的效價特異性。根據不同的細胞系在不同天數進行所述MTS檢測。每一圖面是重複了至少3次的一個代表性試驗。圖面中的每一數據點代表一次一式四份的檢測，結果以平均值+/-標準差表示(圖例—●—Ad5、——ColoAd1)。
圖4ColoAd1和Ad5對一組指出細胞的細胞溶解活性。用ColoAd1和Ad5以VP/細胞比率為100-0.01感染HS-27、HUVEC和SAEC細胞(分別為原始成纖維細胞、內皮細胞和上皮細胞)。根據不同的細胞在感染後的不同天數進行MTS檢測，每一圖面是重複了至少3次的一個代表性試驗。圖面中的每一數據點代表一次一式四份的檢測，結果以平均值+/-標準差表示(圖例—●—Ad5、——ColoAd1)。
圖5ColoAd1、Ad5和ONYX-015對原始正常內皮細胞(HUVEC)和結腸腫瘤細胞系(HT-29)的細胞溶解活性。每一圖面是重複了至少3次的一個代表性試驗。圖面中的每一數據點代表一次一式四份的檢測，結果以平均值+/-標準差表示(圖例—●—Ad5、——ColoAd1、—■—Onyx-015)。
圖6ColoAd1、Ad11p和Ad5對正常上皮細胞系(SAEC)和人結腸癌細胞系(HT-29)的細胞溶解活性。每一圖面是重複了至少3次的一個代表性試驗。圖面中的每一數據點代表一次一式四份的檢測，結果以平均值+/-標準差表示(圖例—●—Ad5、——Ad11p、—■—ColoAd1)。
圖7重組病毒的細胞溶解活性。按照實施例6的記載構建代表4個病毒群體(Adp11、ColoAd1、左端Ad11p/右端ColoAd1(ColoAd1.1)和左端ColoAd1/右端Ad11p(ColoAd1.2))的重組病毒。每一群體在HT29細胞中的溶解活性按照先前的描述進行測定。(圖例—●—Ad5、——Ad11p、—■—ColoAd1、—υ—ColoAd1.1、—▲—ColoAd1.2)。
發明詳述說明書中所提及的所有出版物，包括專利和專利申請，在此通過引用完整地合併入本發明，相當於每一份單獨的出版物被特別地和單獨地指出通過引用以其整體合併入本發明。
定義除非特別說明，本申請所使用的全部技術和科學術語的含義與本發明所屬技術領域的普通技術人員通常理解的含義相同。一般地，本申請所使用的術語和下面描述的試驗方法是在本領域中廣泛已知和普遍應用的。
本申請所用術語「腺病毒」、「血清型」或「腺病毒血清型」指目前已知的51種人類腺病毒血清型或將來分離的人類腺病毒血清型中的任何一種。參見，例如Strauss，「Adenovirus infections inhumans」，The Adenoviruses，Ginsberg，ea.，Plenum Press，New York，NY，pp.451-596(1984)。這些血清型被分類於A至F亞群中(參見，Shenk，「AdenoviridaeThe Viruses and Their Replication」，FieldsVirology，Vol.2，Fourth Edition，Knipe，ea.，Lippincott Williams Wilkins，pp.2265-2267，2001)，如表1中所示。
表1

本申請所用術語「嵌合腺病毒」指一種其核酸序列由至少兩種上述的腺病毒血清型所組成的腺病毒。
本申請所用術語「親本腺病毒血清型」指嵌合腺病毒的大部分基因組是從其衍生的腺病毒血清型。
本申請所用術語「同源重組」指具有同源序列的兩個核酸分子在同源的區域發生交換或進行重組。
本申請所用術語「效價」指病毒的裂解潛力，代表了其複製、細胞溶解和擴散的能力。對本發明的目的而言，效價是本發明給定的腺病毒的細胞溶解活性與Ad5在相同的細胞系中的溶解活性的比值，即效價＝AdX的IC50/Ad5的IC50，其中X是被檢測的特定腺病毒血清型，且其中Ad5的效價被指定為值為1。
本申請所用術語「溶瘤病毒」指相對於正常細胞，其優先殺死癌細胞的病毒。
本申請所用術語「質量指數」或「治療窗」指表明給定的腺病毒的溶瘤潛力的數值，並通過所述腺病毒在癌細胞系中的效價除以相同腺病毒在正常(即，非癌症)細胞系中的效價進行測定。
本申請所用術語「經修飾的」指具有與天然發生的核苷酸或胺基酸序列所不同的核苷酸或胺基酸序列的分子，即野生型核苷酸或胺基酸序列。經修飾的分子能夠保留野生型分子的功能或活性，即經修飾的腺病毒可以保留其溶瘤活性。修飾包括下面所描述的核苷酸的突變。
本申請所用的與多核苷酸或多肽相關的術語「突變」是指分別與參比多核苷酸或多肽相比(例如，與野生型多核苷酸或多肽相比)，多核苷酸或多肽的一級、二級或三級結構的天然發生的、合成的、重組的、或化學的改變或差異。突變包括如缺失、插入或取代這樣的改變。
本申請所用術語「缺失」被定義為在多核苷酸或胺基酸序列中的改變，其中分別缺少一或多個多核苷酸或胺基酸殘基。
本申請所用術語「插入」或「添加」是指與天然發生的多核苷酸或胺基酸序列相比，在多核苷酸或胺基酸序列中發生的分別導致一或多個多核苷酸或胺基酸殘基的添加的改變。
本申請所用術語「取代」由一或多個多核苷酸或胺基酸分別被不同的多核苷酸或胺基酸代替產生。
本申請所用術語「腺病毒衍生物」指經修飾的本發明的腺病毒，對該病毒基因組或在該病毒基因組中進行了添加、缺失或取代，所得的腺病毒衍生物展示出較親本腺病毒更高的效價和/或治療指數，或在其它方面在治療上更有用(即較低的免疫原性、提高的清除率)。例如，本發明的腺病毒的衍生物可以在該病毒基因組的其中一個早期基因(包括但不限於該病毒基因組的E1A或E2B區域)中具有缺失。
本申請所用的與多核苷酸或多肽相關的術語「變體」是指分別與參比多核苷酸或多肽相比(例如，與野生型多核苷酸或多肽相比)，可能在一級、二級或三級結構中發生變化的多核苷酸或多肽。例如，所述胺基酸或核酸序列可以含有與參比胺基酸或核酸序列不同的突變或修飾。在一些實施方式中，腺病毒變體可以是不同的同種型或多態。變體可以是應用本領域中已知的方法分離或產生的天然發生的、合成的、重組的或化學修飾的多核苷酸或多肽。在所述變體的多核苷酸序列中的改變可以是沉默型的。也就是說，它們可以不改變該多核苷酸所編碼的胺基酸。如果改變被限於這一類型的沉默改變，則變體將編碼與參比序列具有相同的胺基酸序列的多肽。或者，在所述變體的多核苷酸序列中的這種改變可以改變參比多核苷酸所編碼的多肽的胺基酸序列，這導致產生下面描述的保守性或非保守性胺基酸改變。這種多核苷酸改變可以在由參比序列編碼的多肽中產生胺基酸取代、添加、缺失、融合和截短。可以引入各種密碼子取代(例如產生多種限制性位點的沉默改變)以優化其克隆到質粒或病毒中，或在特定的原核或真核系統中的表達。
本申請所用術語「腺病毒變體」指其多核苷酸序列與如上面所描述的參比多核苷酸(例如野生型腺病毒)不同的腺病毒。這種差異是有限的，使得親本和變體的多核苷酸序列在總體上是相似的，且在絕大多數區域是相同的。在本申請中，當進行比較時，第一種核苷酸或胺基酸序列被假定為與第二種序列「相似」，這表示它們具有很小的序列差異(即第一種與第二種序列幾乎是相同的)。在本申請中，腺病毒變體與參比腺病毒間存在的多核苷酸序列差異不產生效價和/或治療指數的差異。
本申請所用術語「保守性」指胺基酸殘基被具有相似的化學特性的不同的胺基酸殘基取代。保守性胺基酸取代包括用異亮氨酸或纈氨酸替換亮氨酸、用穀氨酸取代天冬氨酸、或用絲氨酸取代蘇氨酸。典型地，插入或缺失是在約1-5個胺基酸的範圍。
本申請所用術語「非保守性」指用具有不同的化學特性的不同的胺基酸殘基取代胺基酸殘基。非保守性取代包括但不限於用甘氨酸(G)取代天冬氨酸(D)、用賴氨酸(K)取代天冬醯胺(N)、或用精氨酸(R)取代丙氨酸(A)。
胺基酸的單字母代碼包括以下A＝丙氨酸、R＝精氨酸、N＝天冬醯胺、D＝天冬氨酸、C＝半胱氨酸、Q＝穀氨醯胺、E＝穀氨酸、G＝甘氨酸、H＝組氨酸、I＝異亮氨酸、L＝亮氨酸、K＝賴氨酸、M＝甲硫氨酸、F＝苯丙氨酸、P＝脯氨酸、S＝絲氨酸、T＝蘇氨酸、W＝色氨酸、Y＝酪氨酸、V＝纈氨酸。
將認識到多肽常含有除這20種胺基酸(通常被稱作20種天然存在的胺基酸)以外的胺基酸，許多胺基酸(包括終止胺基酸)可以通過天然加工(例如糖基化和其它翻譯後修飾)或通過本領域中已知的化學修飾技術修飾到給定的多肽中。即使在多肽中天然發生的常見修飾也是眾多的，不可能在此窮舉；但它們在基礎課本和更為詳細的專著中、以及在長篇研究文獻中有成分的描述，且為本領域技術人員所熟知。在可能存在於本發明的多肽中的已知修飾中，示例性的有乙醯化、醯基化、ADP-核糖基化、氨基化、黃素的共價附著、血紅素部分的共價附著、多核苷酸或多肽衍生物的共價附著、脂質或脂質衍生物的共價附著、磷脂醯肌醇的共價附著、交聯、環化、二硫鍵形成、去甲基化、共價交聯的形成、胱氨酸的形成、焦穀氨酸的形成、甲醯化、γ-羧化、糖化、糖基化、GPI錨形成、羥基化、碘化、甲基化、豆蔻醯化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、異戊二烯化、外消旋化、硒化(selenoylation)、硫酸化、轉移RNA介導的胺基酸到蛋白質的添加例如精氨醯化和遍在蛋白化。
這種修飾是本領域技術人員已知的，且在科學文獻中已有很詳細的描述。例如，幾種特別的常見修飾(糖基化、脂質附著、硫酸化、穀氨酸殘基的γ-羧化、羥基化和ADP-核糖基化)在絕大多數基礎課本中有描述，例如I.E.Creighton，Proteins-Structure andMolecular Properties，2nd Ed.，W.H.Freeman and Company，New York，1993。關於這一主題有很多詳細的綜述，例如由Wold，F.，Posttranslational Covalent Modification of Proteins，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，pp 1-12，1983；Seifter et al.，Meth.Enzymol.182626-646，1990和Rattan et al.，Protein SynthesisPosttranslationalModifications and Aging，Ann.N.Y.Acad.Sci.66348-62，1992中提供的綜述。
如同已知的及上述提及的那樣，本領域技術人員能夠認識到多肽不總是完全線性的。例如，多肽可以由於遍在蛋白化而分支；通常由於翻譯後事件，它們可以是環形的，具有或不具有分支，所述翻譯後事件包括天然加工事件和由非天然發生的人工操縱致使的事件。可以通過非翻譯天然加工以及通過完全的合成方法合成環形多肽、支鏈多肽和支鏈環形多肽。
修飾可以發生在多肽中的任何地方，包括肽骨架、胺基酸側鏈和氨基或羧基末端。實際上，通過共價修飾封閉多肽的氨基或羧基基團在天然存在的多肽和合成多肽中很普遍，這種修飾也可以存在於本發明的多肽中。例如，在大腸桿菌(E.coli)中製備的多肽的氨基末端殘基在進行蛋白水解加工之前幾乎總將是N-甲醯甲硫氨酸。
發生在多肽中的修飾通常與該多肽是如何產生的有關。例如，對於通過在宿主中表達克隆基因所製備的多肽，大部分修飾的特性和程度將取決於宿主細胞翻譯後修飾能力和存在於該多肽胺基酸序列中的修飾信號。例如，如眾所周知的那樣，糖基化通常不發生在細菌宿主如大腸桿菌中。因此，當需要糖基化時，應當在糖基化宿主(glycosylating host)，通常為真核細胞中表達多肽。昆蟲細胞通常發生與哺乳動物細胞相同的翻譯後糖基化，由此，昆蟲細胞表達系統已被發展用以有效表達天然的糖基化等模式的哺乳動物蛋白質。
本領域技術人員將認識到，相同類型的修飾可以相同或不同的程度存在於給定多肽中的幾個位點。同樣，給定的多肽可以含有多種類型的修飾。
在本申請中，採用了以下術語對兩條或多條多核苷酸或胺基酸序列之間的序列關係進行描述「參比序列」，「比較窗」，「序列相同性」，「序列相同性百分比」，「實質上的相同性」，「相似性」以及「同源性」。「參比序列」是用作進行序列比較基礎的規定序列，參比序列可以是較大序列的子集，例如，作為序列表中給定的全長cDNA或基因序列的片段或可包含完整的cDNA或基因序列。一般地，參比序列的長度為至少18個核苷酸或6個胺基酸，常為至少24個核苷酸或8個胺基酸長，且通常為至少48個核苷酸或16個胺基酸長。因為兩條多核苷酸或胺基酸序列各自可以(1)包含在兩個分子之間類似的序列(即，完整的多核苷酸或胺基酸序列的一部分)，以及(2)可進一步包含與兩條多核苷酸或胺基酸序列相去甚遠的序列，典型地通過在「比較窗」上比較兩個分子的序列進行兩個(或多個)分子間的序列比較以鑑定和比較具有序列相似性的局部區域。在本申請中，「比較窗」是指概念上至少18個連續核苷酸位置或6個胺基酸的片段，其中多核苷酸序列或胺基酸序列可以與至少18個連續核苷酸或6個胺基酸序列的參比序列進行比較，且其中在所述比較窗中的所述多核苷酸序列部分與參比序列(其不含有添加或缺失)相比可以包含20％或更少的添加、缺失、取代等(即，缺口)，從而對所述兩條序列進行最佳比對。比較窗例如通過採用Smithand Waterman，Adv.Appl. Math.2482(1981)的局部同源性算法，，通過採用Needleman and Wunsch，J.Mol.Biol.48443(1970)的同源性比對算法，，通過採用Pearson and Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.) 852444(1988)對相似性方法的研究，通過這些算法(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0(Genetics ComputerGroup，575 Science Dr.，Madison，Wis.)中的GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA、Informatix公司的VectorNTI、Geneworks或MacVector軟體包)的計算機處理，或通過檢查可以進行為了對比較窗進行比對的序列最佳比對，並選擇通過各種方法產生的最佳比對(即，獲得比較窗上的最高同源性百分比)。
在本申請中，術語「序列相同性」是指在所述比較窗上，兩條多核苷酸或胺基酸序列是一致的(即，在核苷酸-核苷酸或殘基-殘基基礎上)。術語「序列相同性百分比」是通過比較在所述比較窗上的兩條最佳比對序列，確定在兩條序列上出現相同核酸鹼基(例如，A、T、C，G，U或I)或殘基位置的數目，從而獲得匹配位置的數目，用匹配位置的數目除以在所述比較窗口(即，窗口大小)中的總位置數目，並將所述結果乘以100從而得到序列相同性百分比。在本申請中使用的術語「實質上的相同性」表明多核苷酸或胺基酸序列的特徵，當在至少18個核苷酸(6個胺基酸)位置的比較窗口上與參比序列相比較時，更常見的是在至少24-48個核苷酸(8-16個胺基酸)位置的比較窗口上進行比較時，其中所述多核苷酸或胺基酸包含與參比序列具有至少85％的序列相同性的序列，優選至少90-95％的序列相同性，更常見為至少99％的序列相同性，比較窗口其中序列相同性百分比是通過在比較窗口上比較所述參比序列和可以包括總共20％或更少的參比序列的缺失或添加的序列進行計算得到的。參比序列可以是較大序列的一個子集。術語「相似性」，當用於對描述多肽時，可通過比較一條多肽與另一條多肽的胺基酸序列和保守胺基酸取代進行確定。術語「同源性」，當用於描述多核苷酸時，是指兩條多核苷酸或其指定的序列，當進行最佳比對和比較時，是一致的，同時，在所述核苷酸的至少70％中(通常為約75％-99％，以及更優選地至少為約98-99％)具有適當的核苷酸插入或缺失。
在本申請中，「同源性」，當用於描述多核苷酸時，是指兩條多核苷酸或其指定的序列，當進行最佳比對和比較時，是一致的，同時，在所述核苷酸的至少70％中(通常為約75％-99％，以及更優選地至少為約98-99％)具有適當的核苷酸插入或缺失。
在本申請中，「聚合酶鏈反應」或「PCR」是指這樣的程序，其中特異性的DNA片段根據US 4,683,195中的描述進行擴增。一般地，來自於感興趣多肽片段的末端的序列信息或超越需求的信息都是可獲得的，從而可以設計寡核苷酸引物；這些引物是相互相對的，並且與待擴增模板的相對鏈的序列一致或類似。所述兩條引物的5』末端核苷酸與擴增材料的末端相一致。PCR可用以從總基因組DNA、從總細胞RNA轉錄得到的cDNA、質粒序列等中擴增特異性的DNA序列(通常參見Mullis et al.，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，51263，1987；Erlich，ed.，PCR Technology，Stockton Press，NY，1989)。
在本申請中，「嚴格性」通常發生在約Tm(熔化溫度)-5℃(比探針的Tm低5℃)至約低於Tm20℃-25℃的範圍。如本領域所屬技術人員所理解的那樣，嚴格雜交可用來鑑定或檢測相同的多核苷酸序列或者用來鑑定或檢測相似或相關的多核苷酸序列。在本申請中，術語「嚴格條件」是指僅在序列問相同性至少為95％和優選至少97％的情況下發生的雜交。
在本申請中，「雜交」應該包括「通過鹼基配對將多核苷酸鏈與互補鏈結合到一起的任何方法」(Coombs，J.，Dictionary ofBiotechnology，Stockton Press，New York，N.Y.，1994)。
在本申請中，術語「治療有效劑量」或「有效量」是指能夠改善疾病症狀或狀況的腺病毒的量。當腫瘤或轉移生長減慢或停止，或者發現腫瘤或轉移在尺寸上有所減小時的劑量被認為是治療癌症或其轉移的治療有效劑量，從而導致了患者壽命的延長。
本發明的腺病毒本發明提供了嵌合腺病毒或其變體或衍生物，其基因組中所述嵌合腺病毒的E2B區域的核苷酸序列包含衍生自至少兩種腺病毒血清型的核酸序列，每種血清型分別選自腺病毒亞群B、C、D、E和F，且彼此不相同。本發明的嵌合腺病毒是溶瘤的，並對腫瘤細胞顯示出提高的治療指數。
嵌合腺病毒的分離可以對稱為「生物選擇」的技術進行修飾來生產本發明的嵌合腺病毒或其變體或衍生物，其中通過在受控條件性利用遺傳選擇產生具有所需特性例如增強的致瘤性或細胞類型特異性的腺病毒(Yanet al.(2003)J.Virol.772640-2650)。
在本發明中，在腫瘤細胞的分會合培養物上，以高至充以促進在血清型之間發生重組，而不高至導致過早細胞死亡的顆粒/細胞比率集合不同血清型的腺病毒混合物並進行傳代，優選為至少兩代。優選顆粒/細胞比率為約500顆粒/細胞，並可由本領域所屬技術人員容易地測定。在本申請中，細胞的「分會合培養物」是指單層或懸浮培養物，其中所述細胞生長活躍。對於以單層進行生長的細胞而言，其實例可以是可供細胞生長的區域的約50-80％都被細胞所覆蓋的培養物。優選生長區域的約75％被細胞所覆蓋。
在一個優選實施方式中，所述腺病毒混合物包括腺病毒亞群B、C、D、E和F代表的腺病毒血清型。組A腺病毒未包括在所述混合物中，因為它們與嚙齒類中的腫瘤形成相關。優選地，可用於所述生物選擇方法中的腫瘤細胞系包括但不限於那些衍生自乳腺、結腸、胰腺、肺和前列腺的細胞系。一些可用於對腺病毒混合物的「生物選擇性」傳代的實體腫瘤細胞系包括但不限於MDA231、HT29、PAN-1和PC-3細胞。造血細胞系包括但不限於Raji和DaudiB-淋巴細胞、K562紅系原始細胞(erythroblastoid cells)、U937髓性細胞和HSB2 T-淋巴細胞。
在這些初始代次產生的腺病毒可用於以允許僅由一種腺病毒感染細胞的足夠低的顆粒/細胞比率感染靜止期腫瘤細胞。在這樣的條件下傳代直至20代之後，在可見的細胞病理效應(CPE，參見FieldsVirology，Vol.2，Fourth Edition，Knipe，ea.，Lippincott Williams Wilkins，pp.135-136)之前，從最後一代收穫上清從而增加高效價病毒的選擇。可採用本領域所屬技術人員公知的技術對所收穫的上清進行濃縮。一種優選的用於在單層培養物中獲得靜止期細胞(即，其中活躍細胞生長停止)的方法允許所述培養物在會合之後再生長3天，其中會合意味著可供細胞生長的整個可用區域都被佔據了(被細胞所覆蓋)。類似地，懸浮培養物可以生長至以沒有活躍細胞生長為特徵的密度。
可以通過在陰離子交換柱上測定所收穫病毒池的保留時間來進行檢測含有生物選擇的腺病毒池的濃縮上清的血清型分布情況，其中不同的腺病毒血清型已知具有特徵性的保留時間(Blanche et al.(2000)Gene Therapy 71055-1062)；參見實施例3，圖1A和圖1B。可以通過稀釋和空斑純化或本領域公知的其它技術從濃縮的上清中分離到本發明的腺病毒，並進行生長以用於進一步表徵。本領域公知的技術還可以用以測定分離到嵌合腺病毒的序列(參見實施例5)。
本發明嵌合腺病毒的一個例子是嵌合腺病毒ColoAd1，其是使用HT29結腸細胞在生物選擇過程中分離出來的。ColoAd1具有SEQID NO1的核酸序列。ColoAd1核苷酸序列的大部分都與Ad11血清型的核酸序列(SEQ ID NO2)相一致(Stone et al.(2003)Virology309152-165；Mei et al.(2003)J.Gen.Virology 842061-2071)。與Ad11相比，ColoAd1核苷酸序列中有兩處缺失，一處是在基因組的E3轉錄單位區域內2444個鹼基對長度的缺失(SEQ ID NO2的27979-30423鹼基對)，另一處缺失要小一些，是在E4orf4基因內的25個鹼基對長度的缺失(SEQ ID NO2的33164-33189鹼基對)。ColoAd1的E2B轉錄單位區域(SEQ ID NO3)，其編碼腺病毒蛋白DNA聚合酶和末端蛋白，位於SEQ ID NO1的5067和10354鹼基對之間，是Ad11和Ad3血清型之間的同源重組區域。在ColoAd1的這一區域內，與Ad11的序列(SEQ ID NO1)相比，有198個鹼基對發生了改變。這些改變導致了與Ad3的E2B區域(SEQ ID NO8)部分的序列同源的ColoAd1的E2B區域的核苷酸範圍更加伸展，並具有ColoAd1和Ad3之間414bp長度的同源性的最長伸展範圍。與未修飾的Ad11腺病毒相比，ColoAd1的E2B區域(SEQ ID NO3)具有比ColoAd1腺病毒更強的效價(參見實施例6、圖7)。在其它實施方式中，本發明的嵌合腺病毒可包含來自超過兩種腺病毒血清型的核酸序列。
可以通過從與初始傳代的腺病毒池相同組織得到的腫瘤細胞中細胞溶解能力的測定，對本發明的嵌合腺病毒或其變體或衍生物在特定的腫瘤類型中的選擇性進行評估。例如，在HT-29細胞和從包括DLD-1、LS174T、LS1034、SW403、HCT116、SW48和Colo320DM的其它結腸衍生腫瘤細胞系中對最初從HT-29結腸腫瘤細胞系傳代的腺病毒池得到的嵌合腺病毒ColoAd1(SEQ ID NO1)進行重新檢測(參見圖3B)。任何可獲得結腸腫瘤細胞系對這樣的評估都具有相等的作用。可以在包括但不限於前列腺細胞系(例如，DU145和PC-3細胞系)、胰腺細胞系(例如，Panc-1細胞系)、乳腺腫瘤細胞系(例如，MDA231細胞系)和卵巢細胞系(例如，OVCAR-3細胞系)的適當腫瘤細胞中，對從來自在其它腫瘤細胞類型上選擇的腺病毒池的分離的腺病毒克隆進行類似的檢測。其它可獲得的腫瘤細胞系對本發明腺病毒的分離和鑑定具有相同的作用。
與從中得到了本發明嵌合腺病毒的腺病毒血清型相比，本發明的嵌合腺病毒具有提高的治療指數(參見圖6，其比較了嵌合腺病毒ColoAd1和Ad11p的細胞溶解活性)。
本發明還包括使用本領域所屬技術人員公知的重組技術構建的嵌合腺病毒。這樣的嵌合腺病毒包含一核苷酸序列區域，該區域衍生自通過重組技術整合入另一腺病毒血清型的基因組中的腺病毒血清型。所整合的序列賦予這樣的性質，例如，對親本腺病毒血清型的腫瘤特異性或增強的效價。例如，可以將ColoAd1的E2B區域(SEQ ID NO3)整合到Ad35或Ad9的基因組中。
腺病毒衍生物本發明還包括本發明的嵌合腺病毒，其被修飾以提供其它治療上有用的嵌合腺病毒。所述修飾包括但不限於以下描述的情況。
一種修飾是作為在編碼E1B-55K蛋白的腺病毒基因中發生突變的結果，產生了實質上缺乏結合p53能力的本發明的嵌合腺病毒的衍生物。這些病毒通常包括E1B-55K區域的部分或全部缺失(參見US 5,677,178)。US 6,080,578中描述了在負責結合p53的E1B-55K蛋白的區域具有缺失的Ad5突變體。本發明的嵌合腺病毒的其它優選修飾是在E1A區域的突變，如US 5,801,029和US 5,972,706中所述。這些類型的修飾提供了對腫瘤細胞具有更高選擇性的本發明嵌合腺病毒。
本發明包括的其它修飾實例是由於組織特異性啟動子的控制下的病毒複製排列而表現出更高程度組織特異性的嵌合腺病毒，如US5,998,205中所述。也可將本發明嵌合腺病毒的複製置於如美國專利申請09/714,409中所述的E2F應答元件的控制之下。這樣的修飾提供了基於存在E2F的病毒複製控制機制，導致了增強的腫瘤組織特異性，並且與通過組織特異性啟動子實現的控制不同。在這兩種實施方式中，所述組織特異性啟動子和E2F應答元件可操縱地連接於對所述腺病毒複製至關重要的腺病毒基因。
本發明的其它修飾有本發明嵌合腺病毒(例如ColoAd1)作為生產新的複製-缺陷型腺病毒載體的骨架的利用。如Lai et al.((2002)DNA Cell Bio.21895-913)中所述，複製缺陷型腺病毒載體可用以輸送和表達治療基因。本申請提供了第一代(其中E1和E3區域缺失)和第二代(其中還缺失了E4區域)衍生自本發明嵌合腺病毒的腺病毒載體。可以使用本領域技術人員熟知的技術容易地製備這些載體(參見Imperiale and Kochanek(2004)Curr.Top.Microbiol.Immunol.273335-357；Vogels et al.(2003)J.Virol.778263-8271)。
本發明包括的另一修飾是插入用作追蹤病毒感染的效力的異源基因標記物或報導物。這類修飾的一種實施方式是胸苷激酶(TK)基因的插入。使用放射性標記的TK反應的底物，在感染細胞內TK的表達可用來追蹤在病毒感染後細胞內殘留病毒的水平(Sangro et al.(2002)Mol.Imaging Biol.427-33)。
構建修飾嵌合腺病毒的方法是本領域內所公知的。參見Mittal，S.K.(1993)Virus Res.2867-90以及Hermiston，T.et al.(1999)Methodsin Molecular MedicineAdenovirus Methods and Protocols，W.S.M.Wold，ed，Humana Press。將標準技術用於重組核酸方法、多核苷酸合成、以及微生物培養和轉化(例如，電穿孔、脂質體轉化)。一般地，根據製造商的說明書進行酶促反應和純化步驟。一般地，根據本說明書全文所提及的本領域的常規方法和各種常規參考文獻來實施這些技術和程序(通常可參見，Sambrook et al.，Molecular CloningALaboratory Manual，2nd.edition(1989)Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.)。本申請所用術語和以下描述的分析化學、有機合成化學以及藥物配製的實驗室程序是本領域技術人員所公知和常規使用的。
治療潛力的確定可以通過檢測其在從作為治療靶的的感興趣組織得到的腫瘤細胞中的細胞溶解潛力來評估本發明嵌合腺病毒或其變體或衍生物的治療效用。可用於檢測這些腺病毒的腫瘤細胞系包括但不限於結腸細胞系(包括但不限於DLD-1、HCT116、HT29、LS1034和SW48細胞系)、前列腺細胞系(包括但不限於DU145和PC-3細胞系)、胰腺細胞系(包括但不限於Panc-1細胞系)、乳腺腫瘤細胞系(包括但不限於MDA231細胞系)以及卵巢細胞系(包括但不限於OVCAR-3細胞系)。造血細胞系包括Raji和Daudi B-淋巴細胞、K562紅系原始細胞、U937髓性細胞和HSB2 T-淋巴細胞。其它可獲得的任何腫瘤細胞系都可以用來對本發明腺病毒治療瘤形成的使用進行評估和鑑定。
可以在代表性的腫瘤細胞系中對本發明腺病毒的細胞溶解活性進行測定，並將所得數據轉化成對效價的度量，由於腺病毒屬於亞群C，優選Ad5，可將其用作標準(即，假定效價為1)。測定細胞溶解活性的優選方法是MTS檢測(參見實施例4，圖2)。
可通過比較給定腺病毒在腫瘤細胞系中的效價和相同腺病毒在非癌細胞系中的效價計算出本發明腺病毒在特定的腫瘤細胞系中的治療指數。優選的非癌細胞系是來源於上皮的SAEC細胞，以及來源於內皮的HUVEC細胞(參見圖4)。這兩種細胞類型分別代表了來自器官和脈管系統的正常細胞，根據對腺病毒進行輸送的方式，可以得到這兩種細胞類型，並且是在腺病毒治療中具有代表性的可能的毒性位點。然而，本發明的實施並不僅局限於這些細胞的使用，也可以使用其它非癌細胞系(例如，B細胞、T細胞、巨噬細胞、單核細胞、成纖維細胞)。
還可以將本發明嵌合腺病毒在擁有腫瘤細胞移植物的裸鼠中降低腫瘤發生或腫瘤細胞負擔的能力，與在擁有相同腫瘤細胞負擔的未處理小鼠中的對應能力進行比較，從而評估出本發明嵌合腺病毒影響靶腫瘤細胞生長(即，癌症)的能力(參見實施例7)。
還可以使用原代人類腫瘤外植體對本發明腺病毒進行評估(Lamet al.(2003)Cancer Gene Therapy；Grill et al.(2003)Mol.Therapy6609-614)，其提供了使用腫瘤異種移植物研究不能正常提供的存在於腫瘤中的檢測環境。
治療應用本發明提供了將本發明的嵌合腺病毒用於抑制腫瘤細胞生長的應用，以及將衍生自這些嵌合腺病毒的腺病毒載體用於輸送在腫瘤或其它疾病狀態的治療中有用的治療性蛋白質的應用。
藥物組合物及施用本發明還涉及被配製成用於治療性施用給患者的包含本發明的嵌合腺病毒(包括其變體和衍生物)的藥物組合物。對於治療性用途，將含有藥理學有效劑量的腺病毒的滅菌組合物施用給人類患者或非人患病動物用於治療例如腫瘤病症。通常，所述組合物將包含於水性懸浮液中的約1011個或更多的腺病毒顆粒。常常將藥學上可接受的載體或賦形劑用於這種滅菌組合物中。可以使用多種水性溶液，例如水、緩衝液、0.4％鹽水、0.3％-甘氨酸等。這些溶液是無菌的，並通常除所需要的腺病毒載體外不含有其它微粒物質。根據需要，該組合物可以含有藥學上可接受的輔助物質以接近生理條件，例如pH調節和緩衝劑、毒性調節劑等(例如乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等)。可以包括增強腺病毒感染細胞賦形劑(參見US 6,392,069)。
本發明的腺病毒也可以通過脂質體或免疫脂質體運輸而被輸送到腫瘤細胞，這種運輸可以基於腫瘤細胞群呈遞的細胞表面特性(例如結合免疫脂質體中的免疫球蛋白的細胞表明蛋白的存在)而選擇性地靶向腫瘤細胞。典型地，含有病毒體的水性懸浮液被包膜在脂質體或免疫脂質體中。例如，可以提供常規方法(US 5,043,164、US4,957,735、US 4,925,661、Connor and Huang，(1985)J.Cell Biol.101581、Lasic D.D.(1992)Nature 355279、Novel Drug Delivery(eds.Prescott and Nimmo，Wiley，New York-，1989)、Reddy et al.(1992)J.Immunol.1481585)將腺病毒病毒體的懸浮液包膜在膠囊中形成免疫脂質體。可以將包含特異性結合呈遞於個體的癌細胞上癌細胞抗原(例如CALLA、CEA)的免疫脂質體用於靶向那些細胞的病毒體(Fisher(2001)Gene Therapy 8341-348)。
為進一步提高本發明的腺病毒的功效，可以對它們進行修飾以呈現對特定的癌細胞類型嗜性增強。例如，如PCT/US98/04964中所示，可以將腺病毒的外包膜上的蛋白質進行修飾以具有化學製劑，優選多肽，其與腫瘤細胞上存在的受體的結合程度高於正常細胞(也參見，US 5,770,442和US 5,712,136)。所述多肽可以是抗體，優選單鏈抗體。
腺病毒治療本發明的腺病毒或其藥物組合物可以被施用用於治療腫瘤疾病或癌症。在治療應用中，將組合物以足以治癒或至少部分阻斷病症及其併發症的量施用給已被特定的腫瘤疾病侵襲的患者。足以達到這一目的的量被定義為「治療有效劑量」或「有效劑量」。有效地用於這一用途的量取決於病症的嚴重性、患者的總體狀況和施用途徑。
例如，但不作為限制，患有實體瘤或血液系統腫瘤疾病(例如胰腺癌、結腸癌、卵巢癌、肺癌或乳腺癌、白血病或多發性骨髓瘤)的人類患者或非人哺乳動物可以通過施用治療有效劑量的本發明的適當的腺病毒(即對某一組織類型顯示出提高的治療指數的那種腺病毒)。例如，優選的用於治療結腸癌的嵌合腺病毒將是腺病毒ColoAd1(SEQ ID NO1)。可以通過各種途徑將感染性腺病毒顆粒的懸浮液運輸到腫瘤組織，包括靜脈內、腹膜內、肌內、皮下和局部。可以通過灌注(例如灌注到腹膜腔中用於治療卵巢癌，灌注到門靜脈中用於治療肝癌或從其它非肝初級瘤到肝臟的轉移)或其它適當的途徑施用含有約103-1012個或更多的病毒顆粒的腺病毒懸浮液，所述其它適當的途徑包括直接注射到腫瘤塊中(例如乳腺腫瘤)、灌腸(例如結腸癌)或導管(例如膀胱癌)。其它施用途徑也可以適用於其它來源的癌症，即以噴霧吸入(例如，用於肺部輸送以治療於支氣管癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌或喉癌)或直接施用於腫瘤位點(例如，支氣管癌、鼻咽癌、喉癌、宮頸癌)。
利用本發明的腺病毒的腺病毒治療可以與其它抗腫瘤方案(例如傳統的用於治療特定癌症的化學療法或x-射線治療)聯合使用。治療可以是同時的或相繼的。一種優選的化療劑是順鉑，優選的劑量可以由實踐者基於待治療的癌症的特性和其它在施用順鉑時常規考慮的因素進行選擇。優選地，可以以50-120mg/m2的劑量在3-6小時的期間靜脈內施用順鉑。更優選地，以80mg/m2的劑量在4小時的期間靜脈內施用順鉑。另一種優選的化療劑是5-氟尿嘧啶，其通常是與順鉑聯合施用。5-氟尿嘧啶的優選劑量為每天800-1200mg/m2，連續5天。
利用本發明的腺病毒作為腺病毒載體的腺病毒治療也可以與其它已知在基於病毒的治療中有用的基因聯合使用，參見US5,648,478。在這種情況下，所述嵌合腺病毒進一步包含摻入所述病毒的基因組中的編碼治療性蛋白質的異源基因，使得該異源基因在被感染的細胞內表達。本申請所使用得治療性蛋白質指一種當其在給定的細胞中表達時被預期將提供一定的治療效果的蛋白質。
在一個實施方式中，所述異源基因是前體藥物激活基因，例如胞嘧啶脫氨酶(CD)(參見，US 5,631,236、US 5,358,866和US5,677,178)。在另一個實施方式中，所述異源基因是一種已知的細胞死亡的誘導物，例如凋亡素(apoptin)或腺病毒死亡蛋白(ADP)、或一種融合蛋白例如基因融合膜糖蛋白(fusogenic membraneglycoprotein)(Danen-Van Oorschot et al.(1997)Proc.Nat.Acad.Sci.945843-5847；Tollefson et al.(1996)J.Virol.702296-2306；Fu et al.(2003)Mol.Therapy 748-754，2003；Ahmed et al.(2003)Gene Therapy101663-1671；Galanis et al.(2001)Human Gene Therapy 12(7)811-821)。
異源基因或其片段的其它例子包括編碼免疫調節蛋白(例如細胞因子或趨化因子)的那些基因。例子包括白介素2(US 4,738,927或US 5,641,665)、白介素7(US 4,965,195或US 5,328,988)和白介素12(US 5,457,038)、腫瘤壞死因子α(US 4,677,063或US5,773,582)、幹擾素γ(US 4,727,138或US 4,762,791)或GM CSF(US5,393,870或US 5,391,485，Mackensen et al.(1997)Cytokine GrowthFactor Rev.8119-128)。其它免疫調節蛋白還包括巨噬細胞炎性蛋白包括MIP-3。也可以使用單核細胞趨化蛋白(MCP-3α)，一種優選的異源基因的實例是一種嵌合基因，其由編碼跨細胞膜的蛋白質(例如VP22或TAT)的基因與編碼優先對癌細胞而非正常細胞具有毒性的蛋白質的基因相融合而成。
本發明的嵌合腺病毒也可以被用作載體輸送編碼治療上有用的RNA分子，即siRNA的基因(Dorsett and Tuschl(2004)Nature RevDrug Disc 3318-329)。
在一些情況下，可以將基因(儘管這些基因對腫瘤本身不具有直接的影響)摻入本發明的嵌合腺病毒中以進一步增強該溶瘤病毒根除腫瘤的能力，所述基因包括編碼破壞MHC I型抗原呈遞分子(Hewittet al.(2003)Immunology 110163-169)，阻斷補體，抑制IFN和IFN-誘導機制、趨化因子和細胞因子、基於NK細胞的殺傷(Orange et al.，(2002)Nature Immunol.31006-1012；Mireille et al.(2002)Immunogenetics 54527-542；Alcami(2003)Nature Rev.Immunol.336-50)，下調免疫應答(e.g.IL-10，TGF-Beta，Khong and Restifo(2002)Nature Immunol.3999-1005；2002)和能夠破壞細胞外基質並加強病毒在腫瘤中的擴散的金屬蛋白酶(Bosman and Stamenkovic(2003)J.Pathol.2000423-428；Visse and Nagase(2003)CirculationRes.92827-839)的基因。
試劑盒本發明還涉及包含一或多個容器的藥物包裝和試劑盒，所述容器中裝有上述本發明的組合物的的一或多種成分。這種容器可伴有管理藥品或生物製品的製造、使用和銷售的政府機構規定格式的告示，其反映獲得了管理這種產品的製造、使用和銷售的機構的正式批准可將其用於人。
本發明通過以下實施例被進一步描述，這些實施例示例性地說明了本發明的特定實施方式，及其各種用途。這些舉例說明本發明的某些特定方面的實例不應當被描述成對本發明所公開的範圍的限制。
除非特別指出，本發明的實施是利用細胞培養、分子生物學、微生物學、重組DNA操縱、免疫學科學的常規技術進行，這些技術是本領域技術人員所熟知的。這樣的技術在文獻中有詳細的解釋，參見，例如Cell Biologya Laboratory HandbookJ.Celis(Ed).Academic Press.N.Y.(1996)；Graham，F.L.and Prevec，L.Adenovirus-based expression vectors and recombinant vaccines.InVaccinesNew Approaches to Immunological Problems.R.W.Ellis(ed)Butterworth.Pp 363-390；Grahan and Prevec Manipulation of adenovirusvectors.InMethods in Molecular Biology，Vol.7Gene Transfer andExpression Techniques.E.J.Murray and J.M.Walker(eds)HumanaPress Inc.，Clifton，N.J.pp 109-128，1991；Sambrook et al.(1989)，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press；Sambrook et al.(1989)和Ausubel et al.(1995)，ShortProtocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons。
實施例方法將標準技術用於重組核酸方法、多核苷酸合成、以及微生物培養和轉化(例如電穿孔、脂轉染)。一般地，根據廠商說明書進行酶促反應和純化步驟。一般地，根據本說明書全文所提及的本領域的常規方法和各種綜合參考書(通常，參見Sambrook et al.，MolecularCloningA Laboratory Manual，2nd.edition(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)進行各項技術和方法。本申請中所使用的術語和實驗室方法分析化學、有機合成化學、藥物配製和輸送、和患者的治療。用於構建腺病毒突變體的方法在本領域中是廣泛已知的(參見Mittal，S.K.，Virus Res.，1993，vol28，pages67-90和Hermiston，T.et al.，Methods in Molecular MedicineAdenovirus Methods and Protocols，W.S.M.Wold，ed，Humana Press，1999)。此外，腺病毒5基因組被登記為Genbank 10登錄號#M73260，且該病毒可獲自美國典型微生物菌種保藏中心，羅克維爾，馬裡蘭，美國，保藏號VR-5。
病毒和細胞系除HUVEC(Vec Technologies，Rensselaer，NY)和SAEC(Clonetics，Walkersville，MD)外，Ad血清型Ad3(GB毒株)、Ad4(RI-67毒株)、Ad5(Adenoid 75毒株)、Ad9(Hicks毒株)、Ad11p(Slobitski毒株)、Ad16(Ch.79毒株)和全部細胞系均購自ATCCMDA231-mt1(Deb Zajchowski博士自快速生長的MDA231細胞皮下異種移植物分離的衍生物)和Panc1-sct(由Sandra Biroc博士從自快速生長的Panc1細胞皮下異種移植物衍生)。Ad40由St.LouisUniversity的William S.M.Wold博士惠贈。
實施例1病毒純化和定量將病毒母液在293細胞上進行增殖，在CsCl梯度上進行純化(Hawkins et al.，2001)。用於定量病毒顆粒的方法是基於Shabram et al.(1997)Human Gene Therapy 8453-465，除用陰粒子交換劑TMAEFractogel代替Resource Q外。簡言之，用Fractogel EMD TMAE-650(S)(目錄號#116887-7 EM Science，Gibbstown，NJ 08027)裝滿1.25ml的柱。在Agilent HP 1100 HPLC上，利用以下條件進行HPLC分離緩衝液A＝50mM HEPES、pH 7.5；緩衝液B＝於緩衝液A中的1.0 M NaCl；流速＝1ml/分。在緩衝液A中進行柱平衡不少於30分鐘後，約109-1011個樣品病毒顆粒負載到柱上10-100μl體積中，繼以4柱體積的緩衝液A。然後應用超過16柱體積的線性梯度，並在100％緩衝液B中結束。
在A260和A280nm處監測柱洗脫物，計算峰區域，測定260nm與280nm的比率。病毒峰被鑑定為A260/A280比率接近1.33的那些峰。每一樣品系列包括一個標準病毒。標準的每毫升的病毒顆粒數已利用Lehmberg et al.(1999)J.Chrom.B，732411-423的方法進行確定。在使用的病毒濃度範圍內，每一樣品的A260nm峰區域直接對應於所述樣品中的病毒顆粒數。每一測試樣品中的每毫升病毒顆粒數通過已知的標準中的每毫升病毒顆粒數乘以該樣品與標準的A260nm病毒峰區域的比率進行計算。
每一樣品梯度後，用2柱體積的0.5 N NaOH繼以2柱體積的100％緩衝液A、3柱體積的100％緩衝液B，和隨後4柱體積的100％緩衝液A洗滌柱使柱再生。
實施例2生物選擇集合代表腺病毒B至F亞群的病毒血清型，並在靶腫瘤細胞系的分會合培養物上以高顆粒/細胞比率進行2輪傳代，使得血清型之間發生重組。然後，將來自第2輪高病毒顆粒/細胞感染、分會合培養物的上清(1.0、0.1、0.01、0.001ml)用於感染一組靶腫瘤細胞系PC-3、HT-29、Panc-1和MDA-231的過會合(over-confluent)T-75組織培養皿。為了獲得過會合，以允許細胞系在接種後24-40小時之間達到會合的接種率接種每一細胞系，允許所述細胞在接種之後感染之前生長總共72小時。進行該步驟以使所述細胞的會合率最大化，以模擬在人實體瘤中的生長條件。
以10倍連續稀釋液自第一皿中收穫細胞培養物上清，這些稀釋液在感染後第3或4天沒有顯示出任何CPE的跡象(對於HT-29和PC-3，以此修飾10-20代以收穫第二皿，即收穫100倍的稀釋液，其中在感染3天可以檢測到CPE)。將每一收穫物用作起始材料用於病毒的選擇性傳代。重複這一過程直至病毒池達到20代生物選擇帶。
應用標準方法(Tollefson，A.，Hermiston，T.W.，and Wold，W.S.M.；「Preparation and Titration of CsCl-banded Adenovirus Stock」inAdenovirus Methods and Protocols，Humana Press，1999，pp 1-10，W.S.M.Wold，Ed)在A549細胞上通過2輪空斑純化從各生物選擇池分離各種病毒。簡言之，在標準空斑檢測中，將收穫自各靶腫瘤系上的第20代的上清的稀釋液用以感染A549細胞。收穫分隔良好的空斑，將相同的空斑檢測方法用於從這些收穫物產生第2輪的獨立空斑。來自第2輪空斑純化的分隔良好的空斑被認為是純的，利用這些純化的空斑製備感染培養物，通過如上述的MTS檢測對這些培養物上清的溶瘤效價進行測定。
實施例3血清型表徵採用與Shabram et al.(1997)Human Gene Therapy 8453465中的描述相類似的方法對包含所述病毒池或分離的ColoAd1腺病毒的親本腺病毒血清型進行鑑定，除如實施例1中所描述的那樣用陰粒子交換劑TMAE Fractogel(EM Industries，Gibbstown，NJ)代替ResourceQ外(參見，圖1)。
在梯度過程中，腺病毒類型5在大約60％緩衝液B時洗脫。其它血清型(3、4、9、11p、16、35和40)分別在與Blanche et al.(2000)Gene Therapy 71055-1062所公開的在Q Sepharose XL上的保留時間相一致的特徵性保留時間被洗脫。
實施例4細胞溶解檢測利用修飾的MTT檢測(Shen et al.，2001)對病毒的裂解能力進行測定。簡言之，由於MTS被細胞轉化為水性的、可溶的甲月替縮短了時間並避免了使用與MTT檢測有關的揮發性有機溶劑，因此用MTS檢測(Promega，CellTiter 96Aqueous Non-Radioactive CellProliferation Assay)取代了MTT檢測。
為了進行所述檢測，以每種腫瘤細胞系能在24小時內產生會合單層的規定密度接種細胞。在暴露給測試病毒前，允許這些密度接種的細胞再生長2天。採用病毒的3倍連續稀釋一式四份地進行腫瘤和原代正常細胞的感染，自顆粒/細胞的比率為100始，顆粒/細胞的比率為0.005止。於37℃溫育被感染的細胞，在為各原代細胞或腫瘤細胞係指定的時間點進行MTS檢測。將未感染細胞用作陰性對照，並在給定的檢測中將其設定為100％的存活率。
實施例5DNA測序Ad11p(SEQ ID NO2)和ColoAd1(SEQ ID NO1)基因組DNA的DNA測序按照如下進行。簡言之，用限制性核酸內切酶Sau3A1部分消化來自ColoAd1和Ad11p的純化的腺病毒DNA，然後鳥槍法克隆到質粒載體pBluescript II(Stratagene，La Jolla，CA)中。增殖陽性克隆，並利用引物M13R和KS(Stratagene，La Jolla，CA)進行測序。利用Sequenchertm(Gene Codes Corp.，Ann Arbor，Michigan)對各序列反應進行修飾、編輯和組裝。用傳統的寡核苷酸引物對覆蓋的缺口進行擴增，並測序。脫離腺病毒DNA對病毒基因組的末端進行直接測序。總之，以3X+coverage對每一基因組測序，以2Xcoverage對431個鹼基測序。
為了測定ColoAd1 E2B區域的起點，設計了兩個引物對，一對針對E2B pTP基因(9115bp，5』GGGAGTTTCGCGCGGACACGG3』(SEQ ID NO4)和(9350bp，5』GCGCCGCCGCCGCGGAGAGGT3』(SEQ ID NO5)，一對針對DNA聚合酶基因(7520bp，5』CGAGAGCCCATTCGTGCAGGTGAG3』(SEQ ID NO6)和7982bp，5』GCTGCGACTACTGCGGCCGTCTGT3』(SEQ ID NO7))，並用於來自各血清型(Ad3、4、5、9、11p、16和40)的PCR分離物DNA片段，所述片段利用Advantage 2 PCR試劑盒(Clonetics，Walkersville，MD；Cat#K1910-Y)並在來自MJ Research(Watertown，MA)的PTC-200 thermocycler上進行電泳獲得。隨後，利用染色終止測序在ABI 3100遺傳分析儀上，將這些片段與Ad3的DNA序列一起測序。
用分離的Ad3 DNA和重疊引物對Ad3的E2B區域進行測序。
用Vector NTI程序(Informatix)對序列信息進行分析。
實施例6重組病毒的構建Ad11p(SEQ ID NO2)和ColoAd1(SEQ ID NO1)的基因組DNA純化自CsCl梯度結合的病毒顆粒。用PacI消化基因組DNA，在病毒基因組中PacI僅切割兩種基因組各一次。在ColoAd1核苷酸序列(SEQ ID NO1)上，Pac1切割發生在第18141個鹼基；在Ad11核苷酸序列(SEQ ID NO2)上，Pac1切割發生在第18140個鹼基。等量混合消化的DNA，並於16℃在T4 DNA連接酶的存在下進行連接過夜。用Invitrogen，Carlsbad，CA(Cat#K2780-01)的CaPO4轉染試劑盒將這一連接混合物轉染到A549細胞中。挑選分離的空斑，通過限制性酶消化和PCR分析進行篩選以區分4個病毒群體(Ad11p、ColoAd1、左端Ad11p/右端ColoAd1(ColoAd1.1)和左端ColoAd1/右端Ad11p(ColoAd1.2))。
如實施例3中所述，在幾個細胞系中(包括HT29和HUVEC細胞系)測定每一群體的病毒裂解能力。結果表明效價從最低到最高為Ad11p、ColoAd1.2、ColoAd1.1、ColoAd1(參見圖7所示的在HT29細胞中的結果)。
同樣構建的還有嵌合腺病毒pCJ144和pCJ146，其含有全長的ColoAd1基因組，該基因組中已經分別重建了野生型Ad11p E3和E4區域。通過同源重組將這些修飾導入BJ5 183 E.Coli(Chartier et al.(1996)J.Virol.704805-4810)。與ColoAd1或ColoAd1.2相比較，這兩種嵌合腺病毒在HT29和HUVEC細胞中都顯示出降低的裂解能力。
實施例7腺病毒的體內效能在經典的人癌移植物裸鼠試驗中，用5×106個細胞皮下注射鼠的後側。當腫瘤的大小達到100-200μl時，用介質(PBS)或用2×1010個顆粒的病毒連續注射5天(總共1×1011個顆粒)。相對於PBS對照組合其它的對照病毒(Ad5、ONYX-015)，將觀察到腫瘤大小的縮小。
實施例8ColoAd1在原代人組織移植物上的選擇性將來自結腸腫瘤的組織樣品以及在手術過程中摘除的鄰近的正常組織放置於培養基中，並用相同數目的ColoAd1或Ad5感染。感染後24小時收集培養物上清，並測定產生的病毒顆粒的數目。與Ad5相比，ColoAd1在腫瘤組織上產生更多的病毒顆粒/每一輸入顆粒，但其在正常組織上產生較少的病毒顆粒/每一輸入顆粒。
序列表110舍林股份公司120用於治療癌症的嵌合腺病毒13053183AUSM1150US 60/574,8511512004-05-261608170PatentIn version 3.2210121132325212DNA213Adenovirus4001ctatctatat aatatacctt atagatggaa tggtgccaat atgtaaatga ggtgatttta 60aaaagtgtgg atcgtgtggt gattggctgt ggggttaacg gctaaaaggg gcggtgcgac 120cgtgggaaaa tgacgttttg tgggggtgga gtttttttgc aagttgtcgc gggaaatgtg 180acgcataaaa aggctttttt ctcacggaac tacttagttt tcccacggta tttaacagga 240aatgaggtag ttttgaccgg atgcaagtga aaattgttga ttttcgcgcg aaaactgaat 300gaggaagtgt ttttctgaat aatgtggtat ttatggcagg gtggagtatt tgttcagggc 360caggtagact ttgacccatt acgtggaggt ttcgattacc gtgtttttta cctgaatttc 420cgcgtaccgt gtcaaagtct tctgttttta cgtaggtgtc agctgatcgc tagggtattt 480atacctcagg gtttgtgtca agaggccact cttgagtgcc agcgagaaga gttttctcct 540ctgcgccggc agtttaataa taaaaaaatg agagatttgc gatttctgcc tcaggaaata 600atctctgctg agactggaaa tgaaatattg gagcttgtgg tgcacgccct gatgggagac 660gatccggagc cacctgtgca gctttttgag cctcctacgc ttcaggaact gtatgattta 720gaggtagagg gatcggagga ttctaatgag gaagctgtaa atggcttttt taccgattct 780atgcttttag ctgctaatga agggttagaa ttagatccgc ctttggacac ttttgatact 840ccaggggtaa ttgtggaaag cggtacaggt gtaagaaaat tacctgattt gagttccgtg 900gactgtgatt tgcactgcta tgaagacggg tttcctccga gtgatgagga ggaccatgaa 960aaggagcagt ccatgcagac tgcagcgggt gagggagtga aggctgccaa tgttggtttt1020cagttggatt gcccggagct tcctggacat ggctgtaagt cttgtgaatt tcacaggaaa1080aatactggag taaaggaact gttatgttcg ctttgttata tgagaacgca ctgccacttt1140
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1.一種具有包含E2B區域的基因組的重組嵌合腺病毒或其變體或衍生物，其中所述E2B區域包含衍生自第一種腺病毒血清型的核酸序列和衍生自第二種腺病毒血清型的核酸序列；所述第一種和第二種腺病毒血清型分別選自腺病毒亞群B、C、D、E或F，且彼此不相同；以及，所述嵌合腺病毒是溶瘤的，並對腫瘤細胞顯示出提高的治療指數。
2.權利要求1的腺病毒，其還包含編碼纖維蛋白、五鄰體蛋白和六鄰體蛋白的區域，其中編碼所述腺病毒的纖維蛋白、五鄰體蛋白和六鄰體蛋白的核酸來自相同的腺病毒血清型。
3.權利要求1的腺病毒，其還包含經修飾的E3區域。
4.權利要求1的腺病毒，其還包含經修飾的E4區域。
5.權利要求1的腺病毒，其中所述腫瘤細胞是結腸腫瘤細胞、乳腺腫瘤細胞、胰腺腫瘤細胞、肺腫瘤細胞、前列腺腫瘤細胞、卵巢腫瘤細胞或造血腫瘤細胞。
6.權利要求5的腺病毒，其中所述腫瘤細胞是結腸腫瘤細胞。
7.權利要求1的腺病毒，其中所述腺病毒的E2B區域的核苷酸序列包含SEQ ID NO3或其一部分。
8.權利要求1的腺病毒，其中所述腺病毒的核苷酸序列包含SEQ ID NO1。
9.一種具有包含E2B區域的基因組的重組嵌合腺病毒或其變體或衍生物，其中所述E2B區域包含衍生自第一種腺病毒血清型的核酸序列和衍生自第二種腺病毒血清型的核酸序列；所述第一種和第二種腺病毒血清型分別選自腺病毒亞群B、C、D、E或F，且彼此不相同；所述嵌合腺病毒是溶瘤的，並對腫瘤細胞顯示出提高的治療指數；以及所述嵌合腺病毒已通過缺失選自E1、E2、E3或E4的一或多個編碼參與腺病毒複製的蛋白質的腺病毒區域而成為複製缺陷型。
10.權利要求9的複製缺陷型腺病毒，其中E1和E3區域被缺失。
11.權利要求10的複製缺陷型腺病毒，進一步包含E4區域的缺失。
12.權利要求1或9的腺病毒，進一步包含異源基因，其中所述異源基因在由所述腺病毒感染的細胞內表達。
13.權利要求12的腺病毒，其中所述異源基因是胸苷激酶。
14.權利要求12的腺病毒，其中所述異源基因編碼選自以下一組的治療性蛋白質細胞因子和趨化因子、抗體、前體藥物轉化酶和免疫調節蛋白。
15.一種抑制癌細胞生長的方法，包括用權利要求1的腺病毒感染所述癌細胞。
16.權利要求15的方法，其中所述癌細胞是結腸癌細胞。
17.權利要求16的方法，其中所述腺病毒的核苷酸序列包含SEQ ID NO1。
18.一種將治療性蛋白質輸送給細胞的方法，包括用權利要求14的腺病毒感染所述細胞。
19.一種用於分離權利要求1的腺病毒的方法，其中所述方法包括a)集合代表腺病毒亞群B至F的腺病毒血清型，從而產生腺病毒混合物；b)將來自步驟(a)的集合的腺病毒混合物在腫瘤細胞的活躍生長培養物中，以高至足以促進血清型之間發生重組但沒有高至產生過早細胞死亡的顆粒/細胞比率進行傳代；c)從步驟(b)收穫上清；d)用在步驟(c)中收穫的上清感染腫瘤細胞的靜止培養物；e)在出現任何CPE的跡象之前，從步驟(d)中收穫細胞培養物上清；f)用步驟(e)中收穫的上清感染腫瘤細胞的靜止培養物；和g)通過空斑純化從在步驟(f)中收穫的上清中分離權利要求1的病毒。
20.權利要求19的方法，其中在收穫步驟(c)中的上清之前進行步驟(b)兩遍。
21.權利要求19的方法，其中在步驟(g)之前重複步驟(e)和(f)20遍。
22.權利要求19的方法，其中在步驟(g)之後進行第二輪空斑純化。
23.權利要求19的方法，其中所述腫瘤細胞是結腸腫瘤細胞、乳腺腫瘤細胞、胰腺腫瘤細胞、肺腫瘤細胞、前列腺腫瘤細胞、卵巢腫瘤細胞或造血腫瘤細胞。
24.一種具有包含E2B區域的基因組的重組嵌合腺病毒或其變體或衍生物，其中所述E2B區域包含衍生自第一種腺病毒血清型的核酸序列和衍生自第二種腺病毒血清型的核酸序列；所述第一種和第二種腺病毒血清型分別選自腺病毒亞群B、C、D、E或F，且彼此不相同；以及所述嵌合腺病毒是溶瘤的，並對腫瘤細胞顯示出提高的治療指數；該重組嵌合腺病毒通過以下方法產生a)集合代表腺病毒亞群B至F的腺病毒血清型，從而產生腺病毒混合物；b)將來自步驟(a)的集合的腺病毒混合物在腫瘤細胞的活躍生長培養物中，以高至足以促進血清型之間發生重組但沒有高至產生過早細胞死亡的顆粒/細胞比率進行傳代；c)從步驟(b)收穫上清；d)用在步驟(c)中收穫的上清感染腫瘤細胞的靜止培養物；e)在出現任何CPE的跡象之前，從步驟(d)中收穫細胞培養物上清；f)用步驟(e)中收穫的上清感染腫瘤細胞的靜止培養物；和g)通過空斑純化從在步驟(f)中收穫的上清中分離所述嵌合腺病毒。
25.權利要求24的方法，其中在收穫步驟(c)中的上清之前進行步驟(b)兩遍。
26.權利要求24的方法，其中在步驟(g)之前重複步驟(e)和(f)20遍。
27.權利要求24的方法，其中在步驟(g)之後進行第二輪空斑純化。
全文摘要
本發明涉及具有治療用途的溶瘤腺病毒。本發明提供了重組嵌合腺病毒以及生產它們的方法。本發明的嵌合腺病毒包含衍生自B至F亞群分類的腺病毒血清型的核酸序列，並顯示出提高的治療指數。
文檔編號C12N7/02GK1997746SQ200580016509
公開日2007年7月11日 申請日期2005年5月24日 優先權日2004年5月26日
發明者保羅·哈登, 特麗·赫米斯頓, 艾琳·庫恩 申請人:舍林股份公司