花生乙醯輔酶a羧化酶生物素羧化酶亞基基因及其編碼的蛋白質與克隆方法
2023-08-04 04:27:06
專利名稱：花生乙醯輔酶a羧化酶生物素羧化酶亞基基因及其編碼的蛋白質與克隆方法
技術領域：
本發明涉及一種基因工程技術領域，具體涉及花生乙醯輔酶A羧化酶生物素羧化酶亞基 基因及其編碼的蛋白質與克隆方法。
背景技術：
乙醯輔酶A羧化酶(Acetyl-CoA Carboxylase, ACCase)屬於生物素包含酶，它在生物 體內催化乙醯輔酶A羧化形成丙二醯輔酶A，為脂肪酸和許多次生代謝產物的合成提供底物 (Konishi T， Shinohara K, Yamada K. Acetyl-CoA carboxylase in higher plants: most plants other than gramineae have both the prokaryotic and the eukaryotic forms of this enzyme[J]. Plant Cell Physiol, 1996, 37(1): 17-122.)。生物體中ACCase有2種 類型。 一種ACCase稱為同質型(Homomeric)，亦稱多功能或真核型，存在於動物、酵母、藻 類及植物的胞質溶膠中，具有一個相對分子量為22CT260的生物素包含亞基。另一種是異質 型(Heteromeric)，也稱多亞基或原核型ACCase，存在於細菌及雙子葉植物和非未本科單子 葉植物的細胞質中。異質型ACCase包含4個亞基，即生物素羧化酶(Biotin carboxylase, BC)、生物素羧基載體蛋白(Biotin carboxyl Carrier Protein, BCCP)以及羧基轉移酶的 2個亞基a-CT和CT，其中前2個亞基組成BC和BCCP域，後2個亞基構成CT催化域。 BC亞基是由核基因組中的基因編碼的，目前已從擬南芥、菸草、油菜、大豆等多種植物中獲 得BC基因(J Sun, J Ke， J L Johnson, B J Niko]au， and E S Wurtele. Biochemical and molecular biological characterization of CAC2, the Arabidopsis thaliana gene coding for the biotin carboxylase subunit of the plastidic acetyl-coenzyme A carboxylase. Plant Physiol. 1997, 115(4): 1371—1383; Sergei Reverdatto， Vadim Beilinson, and Niels C. Nielsen. A Multisubunit Acetyl Coenzyme A Carboxylase from Soybean. Plant Physiol. 1999， 119(3): 961-978.)。但花生中尚沒有此基因的相關報導。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種花生乙醯輔酶A羧化酶生物素羧化酶亞 基基因及其編碼的蛋白質與克隆方法。使該基因在花生中獲得高表達，以改良花生的品質。
本發明的花生乙醯輔酶A羧化酶生物素羧化酶亞基基因，其序列由SEQIDNO. l中從核 苷酸第115 — 1737位的核苷酸序列構成。所述基因來自花生(^rac力is力j^^aea)，命名為J力5C基因。
本發明第二個目的是提供所述基因編碼的蛋白質，具有序列表中SEQ ID NO. 2所示的氨 基酸序列。所述蛋白質命名為^^C蛋白質
同時，本發明還提供所述基因的克隆方法，包括如下步驟
(1) 提取花生幼苗中的總RNA;
(2) 利用Promega的RT-PCR體系反轉錄獲得cDNA;
(3) 根據cDNA文庫中的EST信息設計引物-
(4) 進行PCR擴增，並將PCR產物回收後篩選陽性克隆；
(5) 對篩選到的陽性克隆進行序列分析，獲得乙醯輔酶A羧化酶生物素羧化酶亞基基因。 乙醯輔酶A羧化酶生物素羧化酶亞基是II類ACCase多肽複合物的一個亞基。該酶活性的
提高可以增強II類ACCase複合物的裝配，有利於提高花生種子的含油量。本發明公開的花生 乙醯輔酶A羧化酶生物素羧化酶亞基"力^:)基因的核苷酸序列及其編碼的蛋白序列以及基 因克隆方法，可廣泛應用於花生品質的改良、花生的栽培和培養，尤其是花生作為油料作物 的開發和利用等領域。
圖1是本發明的蛋白質的結構域示意圖； 圖2是本發明的蛋白質預測的三級結構。
具體實施例方式
下面結合具體實例對本發明作進一步詳細的描述。
實施例l克隆花生乙醯輔酶A羧化酶生物素羧化酶亞基(力力5C)基因
(1) 選用E12花生幼苗作為實驗材料，採用Pbiozol植物組織RNA提取試劑盒提取花生 幼苗中的總RNA。腦A含量及質量可採用瓊脂糖凝膠電泳檢測。
(2) 利用Promega的RT-PCR體系反轉錄獲得cDNA。
(3) 根據cDNA文庫中的EST信息設計花生乙醯輔酶A羧化酶生物素羧化酶亞基基因編碼 區引物其中
正向引物5' — CAGTTTCAGTTACAATTAGGAT _3' 反向引物5， - CAAATGTCATATCATATCCATC -3，
反應體系2. 5 ul 10XPCR緩衝液(含MgCl》，0.5 ul 10 uM的引物，1.0 u 1 20 mM的dNTPs， 1 ul cDNA樣品，0. 5 u 1 Ex-Taq酶(Takara) ， 19 u 1雙蒸水。PCR反應程序為95° C預變性5 min， 95。C變性30s， 5(TC復性30s， 72。C延伸1. 5min， 28個循環 後，72°C延伸10min。
(4) 進行PCR擴增，PCR產物回收後與pMD18-T simple vector (Takara)連接，連接產 物轉化￡ coh'Top IO感受態細胞，採用藍白斑法篩選陽性克隆。
(5) 篩選的陽性克隆經PCR進一步驗證後測序，獲得花生乙醯輔酶A羧化酶生物素羧化 酶亞基基因。
實施例2 z力^:蛋白質的序列信息與特性分析
本發明的J/^C基因長2027bp，其開放閱讀框為1623bp，位於115-1737bp處。BioXM軟 件分析表明力/^C共編碼540個胺基酸。根據PR0SITE資料庫分析花生力力^:基因編碼的540 個胺基酸，發現此序列含一個BC活性位點(Biotin carboxylation domain, PS50979 )， 位於75-520aa，如圖1所示。另外還包含2種其它功能位點，ATP-grasp domain profile (PS50975 ); 氨甲醯磷酸合成酶位點 (Carbamoyl-phosphate synthase subdomain signatures 1， PS00866; Carbamoyl-phosphate synthase subdomain signatures 2， PS00867)。
用Protparam預測編碼蛋白的物理化學性質，推測分子式為C2584H414。N7280774 S28，分子量為 58687.3，等電點為6.72，理論推導半衰期為30h，不穩定參數是39. 30，屬於穩定蛋白。該 蛋白中含量相對較多的胺基酸是Ala (10.4%), Gly (8.3%)， Val (7.8%), Glu (7.0%)， Leu (6.9%);該蛋白中不含Pyl和Sec。總的帶正電荷的殘基為(Arg + Lys) : 63;總的帶負電荷 的殘基為(Asp + Glu) :65。該蛋白親水性平均數為-O. 152，預測該蛋白為疏水性蛋白。採用 iPS0RT進行預測，表明該蛋白含有導肽序列，可能定位於葉綠體。以Tmpred網站為基礎的 跨膜結構預測表明該蛋白含2個跨膜信號區。
採用在線HNN網站預測花生AhBC蛋白的二級結構，表明該蛋白含有36. 85%的a -螺旋， 17. 96%的P -摺疊以及45. 19%的無規則巻曲。利用3D-JIGSAW預測花生AhBC蛋白三級結構， 結果表明該蛋白呈緊密的球狀結構，如圖2所示。
本發明涉及的序列及記號分列如下 (l)SEQ ID NO. 1的信息 (i)序列特徵
(A) 長度:2027bp
(B) 類型核苷酸
(C) 鏈性:單鏈(D)拓撲結構線性
(ii) 分子類型核苷酸
(iii) 序列描述:SEQ ID NO. 1 (2) SEQ ID NO. 2的信息
(i) 序列特徵:
(A) 長度540 aa
(B) 類型胺基酸
(C) 鏈性單鏈
(D) 拓撲結構線性
(ii) 分子類型蛋白質
(iii)序列描述:SEQ ID NO. 2序列表
山東省花生研究所
〈120〉花生乙醯輔酶A羧化酶生物素羧化酶亞基基因及其編碼的蛋白質與克隆方法
〈160〉 2
<170〉 Patentln version 3.3
1
〈211> 2027
<212〉 DNA
〈213〉 花生(Arachis hypogaea)
<220〉
<221〉 CDS
〈222〉 (115).. (1737)
〈400> 1
gaaacagaag aaacatcatc gttttcatcg acaatcgcca ttcggcattc gctaaccctt 60
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1747
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atacattgta aaaaccaaac tttatgtttg gttctattgc taatatcaaa tactggtgct 1927
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atattctaaa tttttgtttt ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2027
2 〈211〉 540 〈212〉 PRT
〈213> 花生(Arachis hypogaea) 〈400〉 2
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Gly Ala Gly Gly Ala Leu Gly Ala Thr Cys Gin Ala Glu Lys lie Leu 65 70 75 80
Val Ala Asn Arg Gly Glu lie Ala Val Arg Val lie Arg Thr Ala His 85 90 95
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Ala Leu His Val Lys Leu Ala Asp Asp Ala Val Cys lie Gly Glu Ala 115 120 125
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Glu Asn Ala Val Phe Val Glu Met Cys Arg Glu His Gly lie Asn Phe 165 170 175
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Ala Arg Asp Thr Met Lys Lys Ala Gly Val Pro Thr Val Pro Gly Ser
11195
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205
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Leu Glu Lys Tyr Val Gin Asn Pro Arg His lie Glu Phe Gin Val Leu 275 280 285
Ala Asp Lys Tyr Gly Asn Val Val His Phe Gly Gly Arg Asp Cys Ser 290 295 300
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Leu Thr Pro Glu Leu Arg Lys Ala Met Gly Asp Ala Ala Val Ala Ala 325 330 335
Ala Ala Ser lie Gly Tyr lie Gly Val Gly Thr Val Glu Phe Leu Leu 340 345 350
Asp Glu Arg Gly Ser Phe Tyr Phe Met Glu Met Asn Thr Arg lie Gin 355 360 365
Val Glu His Pro Val Thr Glu Met lie Ser Ser Val Asp Leu lie Glu 370 375 380
12Glu Gin lie Arg Val Ala Met Gly Glu Lys Leu Arg Tyr Lys Gin Glu 385 390 395 400
Asp lie Val Leu Arg Gly His Ser lie Glu Cys Arg lie Asn Ala Glu 405 410 415
Asp Ala Phe Lys Gly Phe Arg Pro Gly Pro Gly Arg lie Thr Ala Tyr 420 425 430
Ser Pro Ser Gly Gly Pro Phe Val Arg Met Asp Ser His Val Tyr Pro 435 440 445
Asp Tyr Val Val Pro Pro Ser Tyr Asp Ser Leu Leu Gly Lys Leu lie 450 455 460
Val Trp Ala Pro Thr Arg Glu Lys Ala lie Glu Arg Met Lys Arg Ala 465 470 475 480
Leu Asp Asp Thr lie lie Thr Gly Val Pro Thr Thr lie Asp Tyr His 485 490 495
Lys Leu lie Leu Asp lie Glu Asp Phe Lys Asn Gly Lys Val Asp Thr 500 505 510
Ala Phe lie Pro Lys His Glu Glu Glu Leu Ala Met Pro Pro Val Lys 515 520 525
Met Val Leu Ala Lys Glu Phe Ala Gly Val Asn Ala 530 535 540
權利要求
1.一種花生乙醯輔酶A羧化酶生物素羧化酶亞基基因，其特徵在於所述基因序列由SEQ IDNO.1中從核苷酸第115-1737位的核苷酸序列構成。
2. 根據權利要求1所述的花生乙醯輔酶A羧化酶生物素羧化酶亞基基因，其特徵在於所述 基因編碼的蛋白質具有序列表中SEQ ID NO. 2所示的胺基酸序列。
3. —種花生同質型乙醯輔酶A羧化酶基因的克隆方法，包括如下步驟(1) 提取花生幼苗中的總RNA;(2) 利用Promega的RT-PCR體系反轉錄獲得cDNA;(3) 根據cDNA文庫中的EST信息設計引物(4) 進行PCR擴增，並將PCR產物回收後篩選陽性克隆；(5) 對篩選到的陽性克隆進行序列分析，獲得乙醯輔酶A羧化酶生物素羧化酶亞基基因。
全文摘要
本發明公開了一種花生乙醯輔酶A羧化酶生物素羧化酶亞基基因及其編碼的蛋白質與克隆方法。所述基因序列由SEQ ID No.1中從核苷酸第115-1737位的核苷酸序列構成；所述基因編碼的蛋白質具有序列表中SEQ ID No.2所示的胺基酸序列。本發明公開的花生乙醯輔酶A羧化酶生物素羧化酶亞基(AhBC)基因的核苷酸序列及其編碼的蛋白序列以及基因克隆方法，可廣泛應用於花生品質的改良、花生的栽培和培養，尤其是花生作為油料作物的開發和利用等領域。
文檔編號C12P19/34GK101550423SQ20091011955
公開日2009年10月7日 申請日期2009年3月13日 優先權日2009年3月13日
發明者和亞男, 曹玉良, 楊慶利, 潘麗娟, 禹山林, 遲曉元 申請人:山東省花生研究所