可可茶提取物用於製備預防及改善糖尿病及其臨床症狀的藥物及食品的應用的製作方法

2023-07-11 05:15:56

專利名稱：可可茶提取物用於製備預防及改善糖尿病及其臨床症狀的藥物及食品的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及天然植物提取及應用領域，尤其是涉及可可茶提取物的應用。
背景技術：
糖尿病是一種因糖代謝異常引起的疾病，以缺乏胰島素(insulin)引起的慢性高血糖為主要特徵，同時伴有各種糖代謝異常引起的的臨床疾患症候群。近年來的研究證明糖尿病不僅起因於遺傳因素，也受環境因素的影響。一般臨床上將糖尿病分為胰島素依賴型糖尿病(I型糖尿病/insulin-dependent diabetesmellitus；IDDM)和胰島素非依賴型糖尿病(II型糖尿病/non-insulin-dependentdiabetes mellitus；NIDDM)。胰島素依賴型糖尿病也稱I型糖尿病，一般認為是由病毒等原因誘發，並通過自身免疫系統作用於胰臟β細胞使之壞死或者功能停止，結果引起胰島素合成及分泌障礙的一種疾病。實際上，臨床上的I型糖尿病患者僅佔糖尿病的少數。胰島素非依賴型糖尿病，也稱II型糖尿病，是一種包括遺傳因素在內的胰島素分泌異常或者作用低下導致的疾病。當然，II型糖尿病的病態也受生活習慣、肥胖、飲食過度以及運動不足等環境因素的影響。臨床上，II型糖尿病在糖尿病患者中佔有多數。根據流行病學調查，糖尿病作為腦卒中、心臟病的危險因素之一為人們所關注。同時由糖尿病引起的神經損傷、視網膜病變及腎臟損害等併發症影響也已成為社會生活中不可忽視的現象。近年來流行病學的調查證明，糖尿病患病人數也在逐年增加。作為生活習慣病的糖尿病，已成為人民生活中受人關注的健康問題之一。
眾所周知，日常生活中的清涼飲料、果汁飲料、點心及澱粉等含有大量多糖類物質。人類在攝取這些多糖類物質後，需在消化酶(digestive enzymes)作用下將其分解成葡萄糖後才能吸收。葡萄糖被吸收後，體內血糖值即會急劇上升，被稱為食後一過性血糖現象。血糖值的上升將刺激胰島素分泌，從而促進末梢組織吸取血中葡萄糖以降低血糖值。如果經常持續出現進食後一過性血糖增高現象，或者長期維持進食後的高血糖狀態，將會導致分泌胰島素的胰臟β細胞疲憊不堪，從而使胰島素分泌功能降低，並誘發耐糖功能的異常，導致糖尿病的進一步惡化。因此，對食後高血糖現象的有效抑制也被認為是可以減輕II型糖尿病的發病和預防其惡化的一種重要手段。對糖尿病患者而言，除接受臨床治療外，注意改變飲食習慣或採取增加運動量等促進糖代謝方法來降低血糖也是非常有效和重要的措施。當然，抑制血糖吸收也可有效減輕或改善高血糖的症狀。通常，採用糖類消化酶抑制劑可以有效地抑制多糖分解為單糖，進而抑制葡萄糖的吸收。近年來，儘管acarbose、voglibose等葡萄糖苷酶(glucosidase)抑制劑已經廣泛用於臨床，並且與改善耐胰島素製劑配伍應用治療II型糖尿病顯示出一定的治療效果，但仍然遠遠不能滿足臨床醫療的需要。眾所周知，為了有效地預防糖尿病及糖尿病引發的生活習慣病，人們不僅要注重對糖尿病病理生理的解析或治療藥物的研製及開發，同時也應注意改變生活方式，從根本上改善體質。從改善身體素質及生活習慣上著想，人們期待出現一種可以長期服用且安全性高，可用於改善或治療糖尿病的健康食品或藥物。當然，從預防觀點考慮，能夠作為日常飲料應用的糖尿病改善、治療劑的研製為人們所期待。同時也是現在社會受人關注和急需解決的課題之一。
茶的故鄉在中國南部，其根據之一是中國南部自然分布生長著茶的多種變種及野生種。可可茶(Camellia ptilophylla Chang)是一種野生茶，在植物分類學上是傳統茶葉(Camellia sinensis)的近緣種植物，被人們發現後又稱為新種茶。根據近年的調查結果，野生可可茶主要自然分布在廣東省龍門地區的狹窄範圍，長期以來被當地人們通過殺青、半發酵、發酵等不同方法製成綠茶、烏龍茶及紅茶等茶葉日常飲用。可可茶是一種飲用安全的日常飲料，長期以來被當地人們用作健康茶飲用，迄今為止沒有發現任何副作用及不安全的現象。與傳統茶葉中的甲基黃嘌呤(methyxanthine)類物質代謝途徑不同，可可茶中不含有咖啡因(caffeine)，而含有可可豆鹼(theobromine)(為巧克力的原料-可可豆cacao的主要活性成分)，因此被稱為可可茶(cocoa tea)。與咖啡因的化學結構不同，可可豆鹼在咖啡因化學結構的1位上沒有甲基取代，因而表現出與咖啡因不同的生理作用，不僅不顯示咖啡因特有的中樞興奮作用，相反顯示出鎮靜等功能。因此，可可茶又被稱作睡前可以飲用的休息茶，適用於老年、孕婦、兒童、胃腸功能低下或心臟不健康等人的飲用。
近年來，人們非常關心天然物質生理活性的研究，對茶類所具有生物功能更是特別關注。茶和咖啡、可可被並稱為世界三大嗜好飲料，為世界絕大多數人所喜愛。人類飲茶已有數千年的歷史。茶葉對健康的種種調節功能自古以來早以為人們所知，例如茶葉的抗氧化作用(antioxidant)、抗菌作用、對血中膽固醇的調節作用等更是令人注目。傳統茶葉的提取物及所含主要活性成分多酚類(polyphenols)物質對糖的吸收抑制作用等已有報導。儘管可可茶是傳統茶葉的近緣種植物，但對於可可茶的生物活性及其中主要活性成分對糖的吸收影響以及對葡萄糖苷酶的抑制活性尚無任何應用方面的探討。

發明內容
本發明的發明目的在於提供以可可茶(Camellia ptilophylla Chang)提取物及可可茶有效成分為原料，製備的安全性高、質量穩定、可供長期服用，不存在副作用的、用於減輕、改善和預防I型糖尿病、II型糖尿病或因糖尿病引起的包括高血糖、糖代謝異常及上述疾患引起的各種生活習慣病及臨床症狀的的藥物的用途。所述的藥物包括有效治療劑量的可可茶提取物，以及藥學上可接受的載體。
本發明的另一發明目的在於提供以可可茶提取物及可可茶有效成分為原料，製備的可用於預防或改善高血糖症、糖代謝異常、糖尿病或因糖尿病引起的各種臨床症狀的、無副作用、無毒性的健康食品、食品或食品添加劑的用途。
本發明的原理是基於可可茶在小鼠糖負荷試驗中對升高的血糖值顯示有明顯的抑制作用，並具有統計學意義。本發明以2g/kg葡萄糖或4g/kg蔗糖荷糖小鼠為動物實驗模型，評價可可茶提取物對高血糖值的抑制效果。結果證明可可茶提取物對蔗糖荷糖小鼠表現出在統計學上有意義的糖吸收抑制作用。此外，本發明也確認可可茶提取物及其所含主要活性成分1，3，4，6-GA-glc、GC-3，5-diGA對葡萄糖苷酶(α-glucosidase)的活性具有明顯的抑制效果。
本發明所述的可可茶提取物是採用熱水或水與甲醇、乙醇等低級醇類、丙酮等極性溶劑的一種或二種以上的任意混合溶劑進行提取的。
因為可可茶中的生物鹼(alkaloid)及兒茶酚類(catechins)都屬於小分子化合物，一般用水提取即可，也可用不同濃度的低級醇類、丙酮等極性溶劑或任意混合溶劑來提取。在提取時，隨著醇的添加，可可茶中活性成分的回收率會有所增加。儘管用水提取效果不如用醇添加提取，但隨著水溫增加，以及提取時間的延長，也可以達到與醇提取法相當的結果。因此，對可可茶中活性成分的提取而言，上述提取方法及其任意組合都可得到本發明所述的提取物。
鑑於可可茶提取物是以藥劑或飲料作為最終產品開發，故從安全性角度考慮提取溶劑儘量選擇乙醇為宜。提取時可可茶與溶劑的比率沒有特定限制，但一般可可茶與溶劑的比例以5∶1～50範圍為宜。本發明對提取溫度沒有特定限制，從室溫到溶劑沸點範圍都可適用。當然室溫、常壓及在溶劑沸點範圍內提取最為理想。提取時間從10秒到24小時範圍都可以。在提取可可茶提取物時，根據需要也可以在溶劑中添加碳酸氫鈉、抗壞血酸鈉鹽(sodium ascorbate)等物質。這些提取方法不會影響可可茶本來具有的生物活性。
本發明提供的可可茶提取物固形劑使用量一般在0.1％至40％(W/W)，因為通常飲料添加濃度一般在0.1％至40％(W/W)範圍較為適宜。在這個濃度範圍內，可可茶提取物適於直接服用，容易被消費者接受。當然，作為添加物的可可茶提取物隨著加入量的增大，可能會出現苦澀感覺。其解決辦法可以根據市場需要及消費者的心理要求改換劑型，例如使用片劑、顆粒劑、膠囊劑等劑型。低濃度可可茶提取物溶液可以作為日常飲料提供給消費者。
本發明提供的可可茶及可可茶活性成分，可以用於各種口服劑型投放市場，提供預防、改善或減輕糖尿病、高血糖症、糖代謝異常及因上述疾患引起的各種臨床症狀為目的的醫藥品、健康食品、食品或食品添加劑。當然，可可茶提取物也可以與常用的賦形劑等醫藥用載體結合做成製劑。必要時，還可以添加一些防腐劑、抗氧化劑、色素、甜味劑等添加物用於各種製劑。
比較適宜的可可茶賦形劑，一般考慮有乳糖、白糖、D-甘露醇、澱粉、結晶纖維素等。潤滑劑一般應採用硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、滑石粉等。溶劑通常使用精製水、乙醇、丙二醇等。防腐劑一般採用氯丁醇、苄醇、二羥基乙酸等。抗氧化劑通常以亞硫酸鹽、抗壞血酸等比較適宜。
本發明提供的可可茶提取物，可以其原型、提取物或粉末添加到製品中用於口服。可可茶提取物也可與其它飲料原料結合製成一定的飲料製品，如可可茶飲料、碳酸飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料、運動飲料、豆乳等。可可茶提取物食品還可以考慮製成餅乾、巧克力類、糖果類、口香糖類、快餐點心類、果凍點心類、麵包、豆腐、酸奶酪等日常食品。
本發明提供的可可茶及可可茶活性成分可以用作預防、改善或治療糖尿病、高血糖症、糖代謝異常及因上述疾患引起的各種臨床症狀為目的醫藥品、健康食品、食品或食品添加劑。其在日常生活中的應用通過下述試驗得到證明。預防和改善糖尿病的作用包括降低空腹時的血糖值，對進食後血糖值急劇上升的抑制作用及耐糖能力的改善作用。其血糖值改善效果可以通過禁食一夜後的血糖值測定得以確認，也可以通過對進食後血糖值的測定及耐糖試驗得以確認。本發明提供的可可茶提取物用量可以根據使用者的健康狀態、年齡、性別及體重等條件進行適當調節。成年人平均體重如以60公斤計算，一般一天口服可可茶提取物可以考慮在3克至10克範圍內，分次服用。當然10克以上也不存在副作用等問題。
本發明所述的可可茶提取物含有以下活性成分gallogatechin-gallate(GCG)、1，3，4，6-tetragalloyl-glucose(1，3，4，6-GA-glc)及gallogatechin-3，5-digallate(GC-3，5-diGA)。
每克可可茶提取物中，上述活性成分GCG、1，3，4，6-GA-glc及GC-3，5-diGA的含量至少為40mg、25mg及100mg。
發明人首次從可可茶提取物中分離得到三個成分，經核磁共振(NMR)等波譜學方法測定化學結構，確認為以下三種已知化合物1)gallogatechin-gallate(GCG)2)1，3，4，6-tetragalloyl-glucose(1，3，4，6-GA-glc)3)gallogatechin-3，5-digallate(GC-35diGA)上述三種成分在傳統茶葉品種中尚無報導，可能是含量很少或很難檢測出的。
通過葡萄糖苷酶(Glucosidase)抑制活性的測定實驗，結果表明可可茶活性成分GCG、1，3，4，6-GA-glc和C-3，5-diGA顯示出非常強的葡萄糖苷酶抑制活性。因此，本發明確認GCG、1，3，4，6-GA-glc和C-3，5-diGA是可可茶中抑制糖的吸收、降血糖及抗糖尿病的活性成分。
實驗證明，本發明所提供的可可茶提取物及其活性成分GCG、1，3，4，6-GA-glc和C-3，5-diGA，通過抑制葡萄糖苷酶的活性以減少糖的分解，通過抑制攝食後引起的高血糖可以用於預防、改善及治療I型糖尿病、II型糖尿病、高血糖症、糖代謝異常以及因上述疾患引起的各種臨床不良症狀。當然，可可茶提取物及其活性成分GCG、1，3，4，6-GA-glc和C-3，5-diGA也可以單獨作為改善高血糖症、糖尿病及上述疾患引起的併發症，還可與其他糖尿病治療藥物配合用於預防或改善糖尿病惡化。
由於可可茶是天然來源的物質，民間具有長期飲用的經驗，且不含有咖啡因，故不僅適用於一般成年人飲用，作為一種作用緩和的健康茶也適用於老年人、兒童及體力低下者。因此，可可茶提取物及其活性成分1，3，4，6-GA-glc和C-3，5-diGA可以作為健康食品、食品添加劑、健康茶用於減肥、抗高脂質症等的應用提供給消費者。


圖1為可可茶提取物的HPLC分析圖譜。
圖2為小鼠耐糖實驗的結果分析圖，本圖所示實驗的給藥量為2g/kg葡萄糖；圖中1為對照組，2為給藥可可茶提取物250mg/kg，3為給藥可可茶提取物125mg/kg。
圖3為小鼠耐糖實驗的結果分析圖，本圖所示實驗的給藥量為4g/kg蔗糖；圖中1為對照組，2為給藥可可茶提取物250mg/kg，3為給藥可可茶提取物125mg/kg。
具體實施例方式
本發明可以通過以下實施例進行詳細說明，但並不僅僅局限於以下實施例。
實施例一可可茶提取物的製備取可可茶乾燥葉100g，加入90℃熱水2000ml浸提4分鐘。提取液經紗布濾過後，將濾液在1000rpm、5分鐘離心分離，回收上清液冷凍乾燥即成。可可茶葉的上述冷凍乾燥提取物用於本發明的下列實施例。
實施例二可可茶提取物的HPLC分析將上述可可茶提取物配製成1％水溶液後，經Sep-PaktC18 Cartridge(5ml，Waters制)吸附過濾，水洗淨後，用乙腈洗脫分離。隨後，將250mg所得分離組分在Develosil C30-UG-5(20mm×250mm，野村化學制)柱上，在0.05％三氟乙酸(TFA)存在條件下，用5-30％乙腈按線性梯度洗脫方式(5ml/mim，180分鐘，220nm紫外檢測)洗脫分離。回收得到的分離組分，再用YMC-Pak ODS(20×250mm、YMC制)柱，在0.1％TFA存在下，用20-25％乙腈按線性梯度洗脫方式(6ml/mim、60分鐘，280nm紫外檢測)洗脫精製。結果如圖1所示，從中分離得到與傳統茶葉不同的三個組分。
可可茶提取物的HPLC分析條件。層析柱資生堂capcell pak C18(φ4.6mm×150mm)，流動相A＝0.05％TFA/水；B＝90％CH3CN/0.05％TFA/水。B5→B35％(13分鐘)，B35％→B70％(7分鐘)，B70％(5分鐘)。檢測A280nm峰面積定量。PDA 220～500nm檢測。
結果如圖1所示，從可可茶提取物中分離得到三個成分，經核磁共振(NMR)等波譜學方法測定化學結構，確認為以下三種在傳統茶葉品種中含量很少或很難檢測出的已知化合物gallogatechin-gallate(GCG)、1，3，4，6-tetragalloyl-glucose(1，3，4，6-GA-glc)及gallogatechin-3，5-digallate(GC-35diGA)。
左側為EGCG的結構式 右側為gallogatechin-gallate(GCG)的結構式傳統茶主要含有EGCG。
1，3，4，6-tetragalloyl-glucose(1，3，4，6-GA-glc)的結構式 gallogatechin-3，5-digallate(GC-3，5-diGA)的結構式實施例一所得到的可可茶提取物中各成分的含量如下Theobromine 278.75EGC 43.25(+)C62.75EC 14.50EGCG37.25GCG 199.001，3，4，6-GA-glc 54.75GC-3，5-diGA32.50
由於用水提取、用醇提取、用其他極性溶劑提取，或者混合法提取，每克可可茶提取物中，上述活性成分GCG、1，3，4，6-GA-glc及GC-3，5-diGA的含量有或多或少的差別，但發明人的不同實驗多次表明，活性成分GCG、1，3，4，6-GA-glc及GC-3，5-diGA的含量至少為40mg、25mg及100mg。
實施例三小鼠耐糖實驗使用動物為7周齡雄性ICR小鼠，由日本CLEA公司購入。飼養溫度23±1～2℃，溼度55±5％，換氣次數12～15次/時，照明時間12小時/日(上午7點開燈，下午7點關燈)，5隻/飼養籠(235×325×170H mm)，飼養條件固形飼料CE-2(CLEA公司)，自由飲水。經1周飼養後進行試驗。小鼠每組10隻，禁食一夜後，按250mg/kg或125mg/kg劑量，經口給藥給與可可茶提取物水溶液(10ml/10g)。對照組給與等容量蒸餾水。30分鐘後再經口給藥以2g/kg葡萄糖及4g/kg蔗糖水溶液。隨後，每隔30分鐘從尾靜脈採一次血，測定血糖濃度。實驗結果以student t-test做統計學處理，結果如圖2和圖3所示。對於給以葡萄糖的小鼠，可可茶末能顯示吸收抑制作用；但對於給以蔗糖的小鼠來說，與蒸餾水對照組相比，可可茶提取物給藥組對高血糖值顯示出有意義的抑制效果，並呈劑量依存性關係。
實施例四葡萄糖苷酶(Glucosidase)抑制活性的測定。
將從酵母中得到的葡萄糖苷酶(glucosidase)(14units/mg protein/ml，Sigma)溶解於含有0.2％牛白蛋白血清(bovine serum albumin)及0.02％NaN3的0.1M磷酸鹽緩衝溶液(pH7.0)中作為酶液。另將5mM p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside溶解於0.1M磷酸鹽緩衝溶液(pH7.0)作為前體溶液(substrate solution)。將可可茶提取物用20％EtOH水溶液稀釋成不同濃度後，分別吸取10μl先加入50μl酶液中，在405nm處測定。隨後，再加入50μl前體溶液，在室溫下作用5分鐘後在405nm處再次測定。將測得的結果與20％EtOH/H2O在405nm、5分鐘測得的數值比較，其上升差值即為樣品對葡萄糖苷酶的抑制活性。
結果如表一所示
表一可可茶提取物中活性成分的葡萄糖苷酶(glucosidase)抑制活性

從表1可以看出，可可茶活性成分GCG、1，3，4，6-GA-glc和C-3，5-diGA顯示出非常強的葡萄糖苷酶抑制活性。因此，本發明確認GCG、1，3，4，6-GA-glc和C-3，5-diGA是可可茶中抑制糖的吸收、降血糖及抗糖尿病的活性成分。
上述實驗證明，本發明提供可可茶及其活性成分1，3，4，6-GA-glc和C-3，5-diGA，通過抑制葡萄糖苷酶的活性以減少糖的分解，通過抑制攝食後引起的高血糖可以用於預防、改善及治療I型糖尿病、II型糖尿病、高血糖症、糖代謝異常以及因上述疾患引起的各種臨床不良症狀。當然，可可茶及其活性成分1，3，4，6-GA-glc和C-3，5-diGA也可以單獨作為改善高血糖症、糖尿病及上述疾患引起的併發症，還可與其他糖尿病治療藥物配合用於預防或改善糖尿病惡化。由於可可茶是天然來源的物質，民間具有長期飲用的經驗，且不含有咖啡因，故不僅適用於一般成年人飲用，作為一種作用緩和的健康茶也適用於老年人、兒童及體力低下者。因此，可可茶及其活性成分1，3，4，6-GA-glc和C-3，5-diGA可以作為健康食品、食品添加劑、健康茶用於減肥、抗高脂質症等的應用提供給消費者。
權利要求
1.可可茶提取物用於製備預防及改善糖尿病及其臨床症狀的藥物的用途。
2.可可茶提取物用於製備預防及改善糖尿病及其臨床症狀的食品的用途。
3.根據權利要求1或2所述的用途，其特徵在於所述的可可茶提取物含有活性成分gallogatechin-gallate，即GCG，每克可可茶提取物中GCG的含量至少為40毫克。
4.根據權利要求1或2所述的用途，其特徵在於所述的可可茶提取物含有活性成分1，3，4，6-tetragalloyl-glucose，即1，3，4，6-GA-glc，每克可可茶提取物中1，3，4，6-GA-glc的含量至少為25毫克。
5.根據權利要求1或2所述的用途，其特徵在於所述的可可茶提取物含有活性成分gallogatechin-3，5-digallate，即GC-3，5-diGA，每克可可茶提取物中GC-3，5-diGA的含量至少為100毫克。
6.根據權利要求1或2所述的用途，其特徵在於所述的可可茶提取物是採用熱水或水與低級醇類、極性溶劑的一種或二種以上的任意混合溶劑進行提取的。
7.根據權利要求6所述的用途，其特徵在於所述的可可茶提取物在提取時，在溶劑中添加重碳酸鈉和/或抗壞血酸鈉鹽。
8.根據權利要求1所述的用途，其特徵在於所述的藥物包括有效治療劑量的可可茶提取物，以及藥學上可接受的載體。
9.根據權利要求2所述的用途，其特徵在於所述的可可茶提取物的固形劑使用量為0.1％至40％重量比。
全文摘要
本發明公開了可可茶提取物及其活性成分GCG、1，3，4，6－GA－glc、GC－3，5－diGA用於製備預防及改善糖尿病及其臨床症狀的藥物及食品的應用。本發明是基於可可茶在小鼠糖負荷試驗中對升高的血糖值顯示有明顯的抑制作用，並具有統計學意義；另外，可可茶及其所含有效成分GCG、1，3，4，6－GA－glc、GC－3，5－diGA1，3，4，6－GA－glc、GC－3，5－diGA對α－葡萄糖苷酶(α－glucosidase)的抑制活性也得到了確切的證明。
文檔編號C07H1/08GK1562279SQ20041002672
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月1日 優先權日2004年4月1日
發明者慄原博, 姚新生, 葉創興 申請人:暨南大學