建立大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞系的方法

2023-08-08 15:23:46 2

建立大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞系的方法
【專利摘要】本發明涉及一種建立大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞系的方法，屬於動物細胞（組織）工程領域。膠原酶消化成年大鼠胰腺組織，Dextron不連續密度梯度離心，RPMI1640有血清培養，胰腺導管原代上皮樣幹細胞貼壁生長，克隆環篩選，上皮樣幹細胞純化，胰蛋白酶消化液消化傳代，建立細胞系；採用該方法建立的一例大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞系的特徵是細胞貼壁呈多角形上皮樣，克隆性生長，是正常的二倍體細胞，在蛋白水平表達增殖細胞核抗原、八聚體轉錄因子4、幹細胞關鍵蛋白、角蛋白19和神經源性分化因子2，具有多分化潛能，無致瘤性。
【專利說明】建立大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞系的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及建立人類和其它哺乳動物胰腺導管幹細胞系的方法，特別涉及一種建立大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞系的方法，屬於動物細胞(組織)工程領域。
【背景技術】
[0002]糖尿病(Diabetes mellitus, DM)是危害人類健康的重大疾病之一,據統計目前全世界糖尿病患者已達3.46億(Am J Stem Cells.2012，I (3): 196-204.)，而傳統的藥物及胰島素替代療法卻不能從根本上醫治該病。近十年來，隨著移植技術的發展，胰島移植治療糖尿病取得了一定的療效(N Engl J Med.2000, 343(4):230-238.Diabetes.2005, 54(7): 2060-2069.Am J Transplant.2008,8(11):2463-2470.1mmune Netw.2013，13(6):235-239.)。但是，由於供體來源短缺，胰島移植治療糖尿病技術的應用受到制約。胰腺導管幹細胞是存在於胰腺導管組織中的成體幹細胞，能自我更新並具有多分化潛能。體外分離克隆胰腺導管幹細胞，誘導其分化形成功能性胰島，並移植治療糖尿病是有效解決供體短缺的途徑之一。目前，建立胰腺導管幹細胞系，研究胰腺導管幹細胞分化形成功能性胰島移植治療糖尿病已成為焦點。國外，Ramiya等(Nat Med.2000，6 (3): 278-282.J Hepatobiliary Pancreat Surg.2002，9 (6): 704-709.)首先報導膠原酶消化 NOD 小鼠胰腺組織，手工分離胰腺導管，消化獲得單個細胞和細胞團，無糖、高胺基酸培養液擴增培養形成單層；體外誘導，這些細胞產生小而圓的胰島祖細胞(islet progenitor cells,IPCs)，繼續培養，這些小細胞進一步形成胰島(IPC-derived islets) ;RT_PCR擴增表明IPCs和IPC-derived islets轉錄胰島素1、II等因子，也表達與胰島發育和分化有關的因子Pdxl、β -半乳糖苷酶和酪氨酸輕化酶等。葡萄糖刺激，IPC-derived islets釋放insulin ;將300個IPC -derived islets移植在NOD成年小鼠腎囊內，能降低NOD小鼠血糖，抗糖尿病。Bonner-Weir 等(Sci Med.2000, 97 (14):7999- 8004.PediatricDiabetes.2004, 5 (Supppl2): 16-22.)採用Ricordi分離法,成人胰腺導管插管，向胰尾組織內注入I~2g/L V型膠原酶(2mL/g胰腺組織)，並將胰尾放入30°C Hank'緩衝液中，消化20~30min ；0.5mm孔徑濾沙過濾，離心，收集組織碎片和細胞；以Histopaque作不連續密度梯度離心，收集位於1.098~1.119g/mL界面間的細胞，分離出胰腺導管上皮細胞；CMRL1066+10%FBS培養液貼壁培養，部分上皮樣細胞形成單層後，換用無血清DMEM/F12+lg/LITS (5mg/Linsulin+5mg/L 轉鐵蛋白 +5mg/L 硒)+2g/L 牛血清白蛋白 +IOmM 煙醯胺+10ng/mL角質細胞生長因子+100U/mL青黴素+100ug/mL鏈黴素培養液擴增培養；免疫化學反應顯示上皮樣細胞表達CK19，少量散在細胞表達insulin和Pdxl ;體外誘導培養，上皮樣細胞分化形成雙硫腙(dithizone, DTZ)染色陽性,且分泌insulin的胰島細胞團。Rovira 等(Proc Natl Acad Sci USA.2010, 107 (I):75-80.Development.2005,132 (16): 3767-3776.)無菌取成年小鼠完整胰腺，0.2mg/mL膠原酶消化，500 μ m和105 μ m孔徑濾膜過濾，離心，WaymouthsMB752 +10%FBS +50%RTC+0.lmg/mL胰蛋白酶抑制劑+1 μ g/!1^地塞米松+100(^/1^青黴素+10(^8/1^鏈黴素培養液重懸細胞，置於37° C、5%C02培養箱中培養14d ;採用ALDHl螢光標記和幹細胞鑑定試劑盒，並通過流式細胞儀篩選，獲得來源於小鼠胰腺導管末端/泡心部幹細胞；PCR檢測該幹細胞表達Sca-1、Sdf1、c-Met、nestin和Sox9基因；體外定向誘導，幹細胞分化形成腺泡細胞，產生澱粉酶；分化形成胰島細胞，糖刺激，分泌insulin。Huch等(EMBO J.2013，32(20):2708-2721.)結紮成年小鼠部分胰腺導管，製備胰腺導管幹細胞增殖修復模型。無菌取胰腺組織，0.3mg/mLXI型膠原酶消化，分離獲得單個細胞；篩選去除上皮細胞粘附分子(Epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)表達陰性細胞和白細胞分化抗原45、31 (cluster of differentiation45、31,CD45、31)表達陽性細胞，篩選去除EpCAM陽性和Zn+螯合物TSQ (6-methoxy-8-/7-toIuenesulfonamido- quilone, TSQ)陽性細胞，再篩選去除insulin啟動子表達陽性細胞後，獲得純度>99.6% 的胰腺導管上皮樣幹細胞(EpCAM+、TSQ_);體外培養，這些幹細胞已擴增10個月；核型分析，細胞染色體數正常；流式細胞術檢測表達成體幹細胞標記物Lgr5 ;移植在裸鼠腎囊內，幹細胞分化形成胰腺導管細胞和胰島內分泌細胞。Lee等(Elife.2013 Nov19;2:e00940.do1:10.7554/eLife.00940.)採用去除胰島後的剩餘人胰腺組織，0.05%胰蛋白酶、lU/mLdispase依次消化，收集細胞，⑶133標記，流式細胞術分選；RT_PCR檢測分選出的細胞共表達CK19，不表達腺泡細胞和胰島細胞標記物，證實分離獲得人胰腺導管細胞；DMEM/F-12+50ng/mLEGF+500ng/mLSpondinI+ 50ng/mLFGF10+100ng/mLNoggin+10mM 尼克酸胺培養液擴增，人胰腺導管細胞呈對數生長，傳7代；構建Neur0g3腺病毒載體，轉染，人胰腺導管細胞轉分化形成胰島細胞，分泌insulin ;將誘導胰島移植在NOD成年小鼠腎囊內，糖刺激，分泌人insulin。國內，效梅等(中國科學C輯:生命科學.2008，38 (8): 699-707.Science in China Series C: Life Science.2008，51 (9):779-788.分子細胞生物學報.2008，41 (6):450-457.分子細胞生物學報.2008，41 (6):457-464.解剖學報.2009，40(2):55-58.中國獸醫學報.2009，29(2): 191-195.)報導IV型膠原酶消化人胎兒胰腺組織20~40min，收集單個細胞和細胞團，低糖DMEM+3.7g/LNaHC03 +10%FBS+0.08g/L青黴素+0.lg/L鏈黴素培養液培養。當原代上皮樣胰腺幹細胞長出後，0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液消化，傳代。在傳代中逐漸消除成纖維樣細胞和其他細胞，純化上皮樣胰腺幹細胞。採用克隆環篩選出典型的單複製人胰腺幹細胞，培養液中添加10ng/mLEGF擴增培養，建立人胎兒胰腺幹細胞系。免疫化學反應和RT-PCR檢測該幹細胞表達Pdxl、glucagon、nestin及CK19，不表達insulin、⑶34、⑶44及⑶45。β -巰基乙醇體外誘導，分化形成神經細胞，表達NF。煙醯胺誘導，分化形成DTZ染色陽性，分泌insulin和C肽的功能性類胰島。將單複製人胰腺幹細胞體外誘導胰島移植在STZ製備的糖尿病大鼠腎囊內，能降低糖尿病大鼠血糖水平，延長壽命。李娟等(現代生物醫學進展.2009,9(11):2024-2026.)膠原酶消化人胰腺組織，Ficoll密度梯度離心，收集細胞，用含10% FBS的CMRL1066培養液培養，7~10d，較純的鵝卵石樣胰腺導管幹細胞擴增至單層，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化傳代。取2~3代細胞，螢光免疫化學反應和RT-PCR檢測分離的人胰腺導管幹細胞表達CK19、Pdxl和nestin,不表達insulin和glucagon。陳海燕等(南京醫科大學學報:自然科學版.2008, 28(3):273-277) V型膠原酶灌注消化成年大鼠胰腺組織，Ficoll密度梯度離心去除胰島，獲得較純的胰腺導管細胞。採用含10%NBS的RPMI1640培養液培養，0.25%胰蛋白酶消化液消化傳代，獲得第2代細胞。螢光免疫化學反應顯示大鼠胰腺導管細胞表達 CK19、Pdxl 和 nestin,不表達 insulin、glucagon。RT-PCR 進一步證實該細胞轉錄 CK19、Pdxl和nestin基因。陳旭春等(中華器官移植雜誌.2012，33(6):371-375.)V型膠原酶消化分離大鼠胰腺組織，不連續密度梯度離心，初步分離胰腺導管細胞與胰島細胞。採用動力性三維培養技術進行培養，獲得胰腺導管來源幹細胞，進行擴增培養、連續傳代和純化，建立細胞系。該細胞是單核細胞，成纖維樣貼壁生長，表達⑶29、⑶73、⑶90和⑶105，不表達⑶14、⑶19、⑶34和⑶45，證實該大鼠胰腺導管來源幹細胞為間充質幹細胞。目前，國內尚無建立大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞系的報導，建立大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞系的方法還不成熟。本發明建立大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞系的方法，將為進一步建立人類和其它哺乳動物胰腺導管幹細胞系及研究其生物學特性提供依據，這對於研究人類和其它哺乳動物胰腺發育、糖尿病的產生以及再造胰島微小器官治療糖尿病具有重要的意義。

【發明內容】

[0003]本發明的目的是提供建立大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞系的方法，為進一步建立人類和其它哺乳動物胰腺導管幹細胞系及研究其生物學特性提供依據，這對於研究人類和哺乳動物胰腺發育、糖尿病的產生以及再造胰島微小器官移植治療糖尿病具有重要的意義。
[0004]為了解決上述問題，本發明所採用的技術方案是:
建立大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞系的方法，包括如下步驟: 1.大鼠胰腺導管原代上皮樣幹細胞分離培養
無菌取大鼠胰腺組織，剪碎至Imm3，0.1% IV型膠原酶37°C消化20min，Dextron不連續密度梯度離心；收集11%和20%濃度Dextron分離液處細胞，接種在鋪有0.1%明膠的培養皿中，RPMI1640+10%NBS培養液培養，大鼠胰腺導管原代上皮樣幹細胞貼壁生長(圖1)；
2.大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞純化
打開培養皿，將底部沾有凡士林的克隆環置於胰腺導管上皮樣幹細胞區域內，在克隆環孔中加入0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液，室溫消化3min ;收集克隆環中的細胞，接種在鋪有0.1%明膠的培養皿中，RPMI1640+10%NBS培養液培養，純化的大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞克隆性生長(圖2);生長至80%融合時，呈「鋪路石」樣(圖3)；
3.大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞傳代培養
當純化的大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞生長至80%融合，0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液消化，收集的細胞接種在鋪有0.1%明膠的培養皿中，RPMI1640+10%NBS+10ng/mLEGF細胞培養液擴增培養；1例大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞已傳80代；
4.大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞冷凍保存
冷凍:80%DMEM+10%DMS0+10%NBS細胞冷凍液稀釋大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞至IX IO6個/mL，分裝於冷凍管，4°C平衡30min，液氮面上懸浮2h，投入液氮長期冷凍保存；
解凍:從液氮罐中取出大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞冷凍管，迅速投入37°C水域中解凍，RPMI 1640+10%NBS+10ng/mLEGF培養液貼壁培養；臺盼藍染色檢測，大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞解凍成活率為92% ；
5.大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞形態特徵
H.E染色，大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞完全貼壁後，呈多角形上皮樣(圖4) ；Giemsa染色，細胞有一個圓形或橢圓形細胞核，細胞核內有I~3個核仁(圖5)；
6.大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞生長特性大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞克隆性生長；生長曲線表明細胞接種第I~2d生長緩慢，第3~6d呈對數生長，第7d增殖能力下降(圖6);
7.大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞染色體數目
染色體標本顯示大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞是正常的二倍體細胞，染色體數目2n=42(圖 7)；
8.大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞表達特徵
流式細胞術檢測和螢光免疫化學反應顯示大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞在蛋白水平表達增殖細胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA,圖8)、八聚體轉錄因子 4 (Octamer-binding transcription factor 4, 0ct4,圖 9)、幹細胞關鍵蛋白(Nanog,圖10)、角蛋白19 (Cytokeratin 19, CK19，圖11)和神經源性分化因子2 (Neurogenicdifferentiation factor 2,NeuroD2,圖 12),不表達 Pdxl、Pax4、Pax6、MafA、Ptfla、Ngn3、nestin、Sox2、CD117、CD15、CD34、CD45、insulin、glucagon、ghrelin、somatostatin 和secretin ;圖13是螢光免疫化學反應陰性對照；
9.大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞分化潛能
大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞具有多分化潛能，體外定向誘導，分化形成神經細胞、脂肪細胞和成骨細胞；
9.1分化形成神經細胞:採用DMEM+10%NBS+5mg/mL大鼠腦組織提取液體外定向誘導，誘導6d，約有30%大鼠胰腺導管多角形上皮樣幹細胞分化形成有突觸的神經細胞(圖14)，突光免疫化學反應表達神經元特異性烯醇化酶(Neuron specific enolase, NSE)(圖15);
9.2分化形成脂肪細胞:採用DMEM+10%NBS+1 umo I /L地塞米松+lug/Linsulin+
0.5mmol/LIBMX誘導液體外定向誘導,誘導14d,大鼠胰腺導管多角形上皮樣幹細胞內出現脂滴，脂滴小而分散；21d，約40%多角形上皮樣幹細胞變為圓形細胞，細胞內脂滴增大、增多；27d，圓形細胞內脂滴明顯，油紅O染色陽性(圖16)；
9.3分化形成成骨細胞:採用RPMI1640+10%NBS+0.lumol/L地塞米松+10mmol/L β -磷酸甘油+50ug/mL抗壞血酸鹽誘導液體外定向誘導，誘導5d，大鼠胰腺導管多角形上皮樣幹細胞出現皺縮；10d，皺縮細胞數量增多，細胞分泌增多，並形成基質樣結節；15d，形成明顯的島狀礦化結節；20d,島狀礦化結節菌素紅染色陽性(圖17), Vonkossa染色礦化結節呈現黑色(圖18)；
10.大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞致瘤性
大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞無致瘤性；大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞接種在裸鼠背部皮下30d，解剖，眼觀未見瘤狀物。
[0005]上述的建立大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞系的方法建立的大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞系的保藏號為C201457，保藏日期2014年4月2日，保藏單位:中國典型培養物保藏中心，地址:武漢大學中國典型培養物保藏中心。
[0006]本發明的有益效果是:建立大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞系的方法，將為進一步建立人類和其它哺乳動物胰腺導管幹細胞系及研究其生物學特性提供依據，這對於研究人類和其它哺乳動物胰腺發育、糖尿病的產生以及再造胰島微小器官治療糖尿病具有重要的意義。【專利附圖】

【附圖說明】
[0007]本說明書共有18幅附圖，其中:
圖1大鼠胰腺導管原代上皮樣幹細胞貼壁生長(X200);
圖2純化的大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞克隆性生長(X100)；
圖3大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞生長至80%融合，呈「鋪路石」樣(X200)；
圖4大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞H.E染色形態特徵(X 200)；
圖5大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞Giemsa染色形態特徵(X 400)；
圖6大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞生長曲線；
圖7大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞染色體數目2n=42 ；
圖8流式細胞術檢測，大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞表達PCNA ；
圖9流式細胞術檢測，大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞表達0ct4 ；
圖10突光免疫化學反應，大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞表達Nanog ( X 200)；
圖11螢光免疫化學反應，大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞表達CK19 (X200)； 圖12螢光免疫化學反應，大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞表達NeuroD2 (X200)；
圖13螢光免疫化學反應陰性對照(X 200)；
圖14體外定向誘導，大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞分化形成有突觸的神經細胞(X200)；
圖15螢光免疫化學反應，大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞分化形成的神經細胞表達NSE(X200)；
圖16體外定向誘導，大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞分化形成脂肪細胞，油紅O染色陽性(X200)；
圖17體外定向誘導，大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞分化形成成骨細胞，茜素紅染色陽性(X100)；
圖18大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞分化形成成骨細胞，Vonkossa染色礦化結節呈現黑色(X100)。
【具體實施方式】
[0008]下面通過實施例對本發明做進一步詳細說明，這些實施例僅用來說明本發明，並不限制本發明的範圍。
[0009]實施例1
1.大鼠胰腺導管原代上皮樣幹細胞分離培養
無菌取SD成年大鼠胰腺組織，剪碎至Imm3，0.1% IV型膠原酶37 V消化20min，RPMI1640+10%NBS培養液終止消化。100目孔徑濾紗過濾，離心(lOOOrpm，5min)，PBS (-)洗漆2次。25%濃度Dextron分離液重懸細胞,依次加入23%、20%、11%濃度Dextron分離液以及PBS (-),不連續密度梯度離心(1500rpm, 5min),收集11%和20%濃度Dextron分離液處細胞，離心(lOOOrpm, 5min),洗滌。RPMI1640+10%NBS稀釋細胞至I X IO6個/mL，接種在鋪有0.1%明膠的培養皿中，置於37°C、5%C02、飽和溼度培養箱中培養。3~5d，大鼠胰腺導管原代上皮樣幹細胞貼壁生長(圖1)。
[0010]2.大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞純化打開培養皿，將底部沾有凡士林的克隆環置於胰腺導管上皮樣幹細胞區域內。在克隆環孔中加入0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液，室溫消化3min，RPMI1640+10%NBS培養液終止消化，收集克隆環中的細胞懸液，離心(lOOOrpm，5min)。RPMI1640+10%NBS培養液重懸細胞，接種在鋪有0.1%明膠的培養皿中，繼續培養。3~5d，純化的大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞克隆性生長(圖2)。生長至80%融合時，呈「鋪路石」樣(圖3)。
[0011]3.大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞傳代培養
當純化的大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞生長至80%融合，0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液消化3min，RPMI1640+10%NBS培養液終止消化，離心(lOOOrpm，5min)。收集的細胞按1 X IO6個/mL細胞密度接種在鋪有0.1%明膠的培養皿中，RPMI 1640+10%NBS+10ng/mL EGF細胞培養液擴增培養。
[0012]4.大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞冷凍保存
冷凍:大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞生長至80%融合時，PBS (-)清洗，0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液消化，RPMI1640+10%NBS培養液終止消化，離心(lOOOrpm，5min)。80%RPMI1640+10%DMS0+10%NBS冷凍液稀釋細胞至1 X IO6個/mL，分裝於冷凍管。4°C平衡30min，液氮面上懸浮2h，投入液氮長期冷凍保存。
[0013]解凍:從液氮罐中取出大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞冷凍管，迅速投入37°C水域中解凍，RPMI1640+10%NBS 培養液清洗解凍細胞 2 ~3 遍，RPMI 1640+10%NBS+10ng/mLEGF 培養液貼壁培養。取少量細胞，臺盼藍染色檢測，細胞解凍成活率為92%。
[0014]採用以上分離、純化、傳代培養及冷凍保存技術，已獲得大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞。其中，1例大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞系已穩定擴增1年以上，傳80代，冷凍保存100管細胞，約1XlO8個細胞。
[0015]5.大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞形態特徵
H.Ε染色:大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞完全貼壁後，呈多角形上皮樣(圖4)。染色方法參照司徒鎮強，吳軍正.細胞培養[Μ].世界圖書出版公司.2007.略；
Giemsa染色:大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞有一個圓形或橢圓形細胞核，核內有1~3個核仁(圖5)。染色方法參照R.1.弗雷謝尼.動物細胞培養-基本技術指南[Μ].科學出版社.2008.略。
6.大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞生長特性
大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞克隆性生長。生長曲線表明細胞接種第I~2d生長緩慢，第3~6d呈對數生長，第7d增殖能力下降(圖6)。
[0016]生長曲線測定方法:解凍復活第20、40、60代大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞，RPMI1640+ 10%NBS+10ng/mLEGF培養液分別稀釋細胞至1X 1O4個/mL。取96孔板7個，每個板上分別接種3種不同代數的細胞，每代設6個孔，每孔加100 μ L細胞懸液，並設陰性對照(基礎培養液，無細胞)，置於37°C、5%C02、飽和溼度培養箱中培養。此時記為0d。每24h取出一塊培養板，採用CCK-8法測定細胞吸光度值(0D值)，共測7d。測定時，每孔加10μ LCCK-8後，置於37°C、5%C02、飽和溼度培養箱中作用2h，在酶標儀上測定450nm處OD值。以時間Cd)為橫坐標，吸光度值(OD)為縱坐標，繪製大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞生長曲線圖。
[0017]7.大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞染色體數目
染色體標本顯示大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞是正常的二倍體細胞，染色體數目2n=42(圖 7)。
[0018]大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞按IX IO5個/ mL細胞密度接種於鋪有0.1%明膠的培養皿中，貼壁培養。擴增至80%融合時，加入終濃度為0.1 μ g/mL秋水仙素，繼續培養5h，使多數細胞染色體停於中期分裂相。0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液室溫消化3min，RPMI1640+10%NBS培養液終止消化，離心。棄上清，加入0.4%KC1，並置於37°C水域中，低滲30min，離心。棄上清，加甲醇-冰醋酸固定液(甲醇:冰醋酸=3: 1，現用現配)，混勻，靜置固定20min，離心。如此反覆固定2~3次。棄上清，加0.5mL固定液，混勻，製成染色體懸液。取冰凍載玻片，於約80cm高度滴片,火焰乾燥。滴加Giemsa染色液,染色lOmin。普通生物學顯微鏡下觀察染色體標本，照相。
[0019]8.大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞表達特徵
流式細胞術檢測和螢光免疫化學反應顯示大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞在蛋白水平表達增殖細胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA,圖8)、八聚體轉錄因子 4 (Octamer-binding transcription factor 4, 0ct4,圖 9)、幹細胞關鍵蛋白(Nanog,圖10)、角蛋白19 (Cytokeratin 19, CK19,圖11)和神經源性分化因子2 (Neurogenicdifferentiation factor 2,NeuroD2,圖 12),不表達 Pdxl、Pax4、Pax6、MafA、Ptfla、Ngn3、nestin、Sox2、CD117、CD15、CD34、CD45、insulin、glucagon、ghrelin、somatostatin 和secretin。圖13是螢光免疫化學反應陰性對照。
[0020]8.1流式細胞術檢測
根據所購特異性抗體是否帶螢光標記，採用直接免疫螢光標記法或間接免疫螢光標記法檢測。 [0021]8.1.1直接免疫螢光標記法
直接免疫螢光標記法檢測大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞表達增殖細胞核抗原(PCNA)，不表達 MafA、CD117、CD15、CD34 和 CD45。
[0022]PBS(-)洗滌大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞2次，稀釋細胞至I X IO6個/mL。取EP管7個，分別加入ImL細胞懸液，離心(lOOOrpm, 5min)。棄上清，分別加入200uL含1%BSA的PBS(-)稀釋的螢光素標記抗體(5uL/1OOuL稀釋的小鼠抗人PCNA螢光抗體、0.25ug/1OOuL稀釋的金黃地鼠抗小鼠MafA螢光抗體、5uL/100uL稀釋的小鼠抗人CD117螢光抗體、5uL/100uL稀釋的小鼠抗人CD 15螢光抗體、5uL/1 OOuL稀釋的小鼠抗人CD34螢光抗體或5uL/100uL稀釋的小鼠抗人⑶45突光抗體,均購自eBioscience公司)，陰性對照加PBS(-),混勻，4°C孵育 30min,離心(lOOOrpm, 5min)。棄上清,PBS (-)洗漆細胞 2 次,離心(lOOOrpm, 5min),以除去未結合的多餘抗體。每管分別加0.5mLPBS(_)重懸細胞，流式細胞儀(FACS Canto II,BD，美國)檢測陽性細胞比例。實驗重複3次。
[0023]8.1.2間接免疫螢光標記法
間接免疫螢光標記法檢測大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞表達八聚體轉錄因子4 (0ct4)不表達Pax4和Pax6。
[0024]PBS(-)洗滌大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞2次，稀釋細胞至I X IO6個/mL。取EP管4個,分別加入ImL細胞懸液,離心(lOOOrpm, 5min)。棄上清，分別加入200uL含1%BSA的PBS (_)稀釋的無螢光素標記的一抗(1:100稀釋的兔抗人0ct4和1:500稀釋的兔抗大鼠Pax6,購自Epitomics公司；1:50兔抗人Pax4,購自Abgent公司)，陰性對照加PBS (-),混勻，4°C孵育30min，離心(lOOOrpm，5min)。棄上清，PBS (-)洗滌細胞2次，離心(lOOOrpm，5min)，以除去未結合的多餘抗體。棄上清，加入200uL含I %BSA的PBS (_)稀釋的螢光素標記二抗(1: 100稀釋的羊抗兔突光二抗,購自Epitomics公司)，陰性對照加PBS (-),混勻，4°C孵育30min，離心(lOOOrpm，5min)。棄上清，PBS (-)洗滌細胞2次，離心(lOOOrpm，5min)，以除去未結合的多餘抗體。每管分別加0.5mLPBS (_)重懸細胞，流式細胞儀(FACSCanto II，BD，美國)檢測陽性細胞比例。實驗重複3次。
[0025]8.2突光免疫化學反應
對於購買不到流式細胞術檢測的抗體，則購買螢光免疫化學反應抗體檢測。
[0026]螢光免疫化學反應顯示大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞表達幹細胞關鍵蛋白(Nanog)、細胞角蛋白19 (CK19)和神經源性分化因子2 (NeuroD2)，不表達Pdxl、Ptfla、Ngn3、nestin、Sox2、insulin、glucagon、ghrelin、somatostatin 及 secretin。
[0027]在鋪有0.1 %明膠的培養皿中放入蓋玻片，大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞按IX IO5個/ HiL細胞密度接種在放有蓋玻片的培養皿中。當細胞生長至80%融合，4%多聚甲醛室溫固定細胞爬片15min。PBS (-)洗滌細胞爬片2次，l%Triton_X100穿孔30min, 1%BSA封閉45min。洗掉多餘封閉液，加含1%BSA的PBS (_)稀釋的一抗(1:100稀釋的兔抗人NanogU:300稀釋的兔抗大鼠NeuroD2、1:100稀釋的兔抗人Sox2或1:100稀釋的兔抗人somatostatin,均購自Epitomics公司；20 μ g/mL稀釋的小鼠抗人CK19或20 μ g/mL稀釋的小鼠抗人Pdxl,購自eBioscie nce公司；3 μ g/mL稀釋的小鼠抗人Ptf la、1:100稀釋的小鼠抗人Ngn3、5 μ g/mL稀釋的小鼠抗人ghrelin或1:100稀釋的兔抗人secretin,均購自Abcam公司；1:500稀釋的小鼠抗大鼠insulin或1:500稀釋的兔抗大鼠glucagon,購自Boster公司；1:300稀釋的小鼠抗大鼠nestin,購自Novus公司)，陰性對照加PBS(-),4°C過夜。PBS (_)洗滌3次，每次3min。加含1%BSA的PBS (_)稀釋的螢光二抗(1: 1000稀釋的羊抗小鼠突光二抗，購自Novu公司或1:100稀釋的羊抗兔突光二抗,購自Epitomics公司)，陰性對照加PBS(-)，37°C孵育lh。PBS (_)漂洗3次，每次3min，甘油封片。螢光顯微鏡下觀察，照相。
[0028]9.大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞分化潛能
大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞具有多分化潛能，體外定向誘導，分化形成神經細胞、脂肪細胞和成骨細胞。
[0029]9.1分化形成神經細胞
分化形成神經細胞:採用DMEM+10%NBS+5mg/mL大鼠腦組織提取液體外定向誘導，誘導6d，約有30%大鼠胰腺導管多角形上皮樣幹細胞分化形成有突觸的神經細胞(圖14)，螢光免疫化學反應表達神經元特異性烯醇化酶(Neuron specific enolase, NSE)(圖15)。
[0030]大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞按I X IO5個/ mL細胞密度接種，RPMI1640+10%NBS+10ng/mLEGF培養液擴增培養。當細胞生長至80%融合時，換DMEM+10%NBS+5mg/mL大鼠腦組織提取液定向誘導培養，隔天換液。誘導6d，約有30%大鼠胰腺導管多角形上皮樣幹細胞分化形成有突觸的神經細胞，螢光免疫化學反應表達NSE。
[0031]9.2分化形成脂肪細胞
分化形成脂肪細胞:採用 DMEM+10%NBS+lumol/L 地塞米松 +lug/Linsulin+0.5mmol/LIBMX誘導液體外定向誘導，誘導14d，大鼠胰腺導管多角形上皮樣幹細胞內出現脂滴，脂滴小而分散；21d，約40%多角形上皮樣幹細胞變為圓形細胞，細胞內脂滴增大、增多；27d，圓形細胞內脂滴明顯，油紅O染色陽性(圖16)。
[0032]大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞按IX IO5個/ mL細胞密度接種，RPMI1640+10%NBS+10ng/mLEGF培養液擴增培養。當細胞生長至80%融合時，換DMEM+10%NBS+lumol/L地塞米松+lug/Linsulin+0.5mmol/LIBMX誘導液定向誘導培養，隔天換液。誘導14d,大鼠胰腺導管多角形上皮樣幹細胞內出現脂滴，脂滴小而分散；21d，約40%多角形上皮樣幹細胞變為圓形細胞，細胞內脂滴增大、增多；27d，圓形細胞內脂滴明顯，油紅O染色陽性。
[0033]9.3分化形成成骨細胞
分化形成成骨細胞:採用RPMI1640+10%NBS+0.lumol/L地塞米松+lOmmol/L0 -磷酸甘油+50ug/mL抗壞血酸鹽誘導液體外定向誘導，誘導5d，大鼠胰腺導管多角形上皮樣幹細胞出現皺縮；10d，皺縮細胞數量增多，細胞分泌增多，並形成基質樣結節；15d，形成明顯的島狀礦化結節；20d，島狀礦化結節茜素紅染色陽性(圖17)，Vonkossa染色礦化結節呈現黑色(圖 18)。
[0034]大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞按I X IO5個/ mL細胞密度接種，RPMI1640+10%NBS+10ng/mLEGF培養液擴增培養；當細胞生長至80%融合時，換RPMI1640+10%NBS+0.lumol/L地塞米松+lOmmol/L0 -磷酸甘油+50ug/mL抗壞血酸鹽誘導液定向誘導培養,隔天換液。誘導5d，大鼠胰腺導管多角形上皮樣幹細胞出現皺縮；10d，皺縮細胞數量增多，細胞分泌增多，並形成基質樣結節；15d,形成明顯的島狀礦化結節；20d,島狀礦化結節菌素紅染色陽性，Vonkossa染色礦化結節呈現黑色。
[0035]10.大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞致瘤性
大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞無致瘤性。大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞接種在裸鼠背部皮下30d，解剖，眼觀未見瘤狀物。
[0036]在6隻裸鼠背部皮下分別注射大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞，劑量為I X IO6個/0.2mL/site, 3隻裸鼠背部皮下注射0.2mL細胞培養液RPMI1640作為對照，正常飼養管理30d。結果，6隻實驗裸鼠和3隻對照裸鼠均存活至實驗結束，解剖觀察，均未見瘤狀物。
【權利要求】
1.建立大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞系的方法，其特徵在於:包括如下步驟: (1)大鼠胰腺導管原代上皮樣幹細胞分離培養 無菌取大鼠胰腺組織，剪碎至1mm3，膠原酶消化，Dextron不連續密度梯度離心，收集Dextron分離液處細胞，接種在鋪有0.1%明膠的培養皿中，RPMI1640+10%NBS培養液培養，大鼠胰腺導管原代上皮樣幹細胞貼壁生長； (2)大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞純化 打開培養皿，將底部沾有凡士林的克隆環置於胰腺導管上皮樣幹細胞區域內，在克隆環孔中消化，收集克隆環中的細胞，接種在鋪有0.1%明膠的培養皿中，RPMI1640+10%NBS培養液培養，純化的大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞克隆性生長；當細胞生長至80%融合時，呈「鋪路石」樣； (3)大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞傳代培養 當純化的大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞生長至80%融合，加入胰蛋白酶消化液消化，收集的細胞接種在鋪有0.1%明膠的培養皿中，細胞培養液擴增培養；1例大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞已傳80代； (4)大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞冷凍保存 冷凍:用細胞冷凍液稀釋大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞，分裝於冷凍管，平衡，投入液氮長期冷凍保存； 解凍:從液氮罐中取出大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞冷凍管，迅速投入37°C水域中解凍，RPMI 1640+10%NBS+10ng/mLEGF培養液貼壁培養；臺盼藍染色檢測，大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞解凍成活率為92%。
2.根據權利要求1所述的建立大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞系的方法，其特徵在於: 步驟(1)所述的膠原酶消化是指加入0.1% IV型膠原酶，在37°C條件下，消化20min。
3.根據權利要求1所述的建立大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞系的方法，其特徵在於:步驟(I)所述的收集Dextron分離液處細胞是指收集11%和20%濃度Dextron分離液處細胞。
4.根據權利要求1所述的建立大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞系的方法，其特徵在於:步驟(2)所述的消化是指加入0.25%胰蛋白酶和0.04%EDTA消化液，室溫消化3min。
5.根據權利要求1所述的建立大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞系的方法，其特徵在於:步驟(3)所述的細胞培養液是指RPMI1640+10%NBS+10ng/mLEGF。
6.根據權利要求1所述的建立大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞系的方法，其特徵在於: 步驟(4)所述的細胞冷凍液是指80%DMEM+10%DMS0+10%NBS。
7.根據權利要求1所述的建立大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞系的方法，其特徵在於: 步驟(4)所述的平衡是指4°C平衡30min，液氮面上懸浮2h。
8.根據權利要求1所述的方法建立的大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞系，其特徵在於:所述的大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞系的保藏號為C201457，保藏日期2014年4月2日，保藏單位:中國典型培養物保減中心。
9.根據權利要求8所述的大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞系，其特徵在於:所述的大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞系形態特徵為:大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞貼壁呈多角形上皮樣，細胞核為圓形或橢圓形，細胞核 內有I~3個核仁。
10.根據權利要求8所述的大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞系，其特徵在於:所述的大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞生長特性為:大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞克隆性生長；細胞接種第I~2d生長緩慢，第3~6d呈對數生長，第7d增殖能力開始下降。
11.根據權利要求8所述的大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞系，其特徵在於:所述的大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞染色體數目為:大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞是正常的二倍體細胞，染色體數目2n=42。
12.根據權利要求8所述的大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞系，其特徵在於:所述的大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞表達特徵為:大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞在蛋白水平表達增殖細胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、八聚體轉錄因子 4(0ctamer_bindingtranscription factor 4, 0ct4)、幹細胞關鍵蛋白(Nanog)、角蛋白 19 (Cytokeratin 19,CK19)和神經源性分化因子 2 (Neurogenic differentiation factor 2, NeuroD2),不表達 Pdxl、Pax4、Pax6、MafA、Ptfla、Ngn3、nestin、Sox2、CD117、CD15、CD34、CD45、insulin、glucagon、ghrelin、somatostatin 和 secretin。
13.根據權利要求8所述的大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞系，其特徵在於:所述的大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞分化潛能為:大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞具有多分化潛能，體外定向誘導，大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞分化形成有突觸的神經細胞，表達NSE;分化形成含有脂滴的脂肪細胞，油紅O染色陽性；分化形成成骨細胞，產生礦化結節，茜素紅染色陽性，Vonkossa染色礦化結節呈現黑色。
14.根據權利要求8所述的大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞系，其特徵在於:所述的大鼠胰腺導管上皮樣幹細胞致瘤性為:大 鼠胰腺導管上皮樣幹細胞無致瘤性。
【文檔編號】C12N5/071GK103881962SQ201410138851
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年4月9日 優先權日:2014年4月9日
【發明者】效梅, 安立龍 申請人:廣東海洋大學