一種應用超重力技術製備納米脂質體的方法與流程

2023-07-24 13:52:36 2

本發明涉及生物醫藥及化妝品技術領域。更具體地，涉及一種可大規模化應用超重力技術製備納米脂質體的方法。

背景技術：

脂質體是由磷脂雙分子層形成的閉合囊泡狀結構。根據其結構的不同可以分為單層脂質體(suv)、多層脂質體(luv)和多囊脂質體(miv)。脂質體首先由英國人alecd.bangham在1965年發現，此後，人們發現脂質體作為物質載體尤其是藥物載體，有著巨大的應用價值，於是便對脂質體進行了系統而廣泛的研究。

經過了二十多年的探索，科研人員已經提出了許多很有價值的脂質體製備方法。目前脂質體主要通過分散技術(dispersiontechnique)製備，其方法可分為三大類：1)以機械分散技術為基礎。如薄膜分散法(filmdispersion)，專利cn103110931a中，公開了一種製備羅咪酯肽脂質體的方法，以膽固醇為穩定劑，蔗糖為凍幹保護劑，維生素e為抗氧劑，採用薄膜分散法製備羅咪酯肽脂質體，同時採用高壓均質法使脂質體的粒徑小於120nm。該方法雖是最經典、應用最廣的方法，但是卻存在一些缺點：使用的有機溶媒毒性很大；無法實現工業化生產；當用含藥水溶液水化時，形成的多層脂質體層與層之間藥物分布不均一，必須再通過反覆凍融處理等。2)以表面活性劑分散技術為基礎。該法是將脂質與表面活性劑一起在水溶液中攪拌得到膠束，再利用透析法從膠束中將表面活性劑除去。其優點是所製備的脂質體比較均勻，而且由於磷脂是在低於其相變溫度的情況下操作，處理方法溫和。但該法所製得的納米脂質體濃度較低，同時還會有少量表面活性劑殘留，而且由於膠束在水相的平衡需要較長的時間，比較費時，難以大規模生產。3)以溶劑或反溶劑分散技術為基礎。例如逆相蒸發法(rev)，此種製備方法對水溶性藥物的包封率及載藥量相對較高；專利cn101912388a中，公開了一種中鏈脂肪酸-維生素c複方脂質體的製備方法，採用逆向蒸發-高壓微射流法，經溶解、混勻、減壓蒸發以及高壓微射流等處理製備中鏈脂肪酸-維生素c複方脂質體。該複方脂質體的平均粒徑雖然能夠達到90nm-200nm，該方法製得脂質體後仍需經高壓微射流處理減小粒徑，過程繁瑣。此外，還可以採用乳劑法製備多囊脂質體目前可以實現大規模生產，但是僅限於製備微米級具有緩釋功能的多囊脂質體。

因此，針對上述問題，需要提供一種簡便易行的大規模製備納米級脂質體的方法。

技術實現要素：

本發明的一個目的在於提供一種應用超重力技術製備納米脂質體的方法。該方法利用超重力旋轉床技術，可以大大強化傳質、微觀混合，利於放大，生產時間短，易於大規模生產，且製備的納米脂質體粒徑分布窄，很好的解決了納米脂質體難以工業化生產的問題。

本發明的另一個目的在於提供一種採用超重力技術製備得到的納米脂質體。該納米脂質體粒徑小且分布窄，分散性好，應用範圍廣泛。

為達到上述第一個目的，本發明採用下述技術方案：

一種應用超重力技術製備納米脂質體的方法，所述方法包括將含有脂材的有機溶液與含有載體的水溶液採用超重力旋轉床進行混合，隨後進行凍幹處理得到納米脂質體的步驟。

優選地，所述方法包括如下具體步驟：

1)將形成納米脂質體的脂類物質、膜軟化劑溶於有機溶劑中得到有機溶液，將水溶性載體溶於純水中得到水溶液；

2)在20-70℃下，將步驟1)得到的有機溶液與水溶液分別注入超重力旋轉床中進行充分混合，得到混合溶液；

3)向步驟2)製備的混合溶液中加入凍幹保護劑，之後進行凍幹處理，得到凍幹態的納米脂質體。

優選地，步驟1)中，所述形成納米脂質體的脂類物質選自磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲氨酸、磷脂醯肌醇、磷脂醯甘油、二磷脂醯甘油、神經鞘磷脂和氫化卵磷脂中的一種或多種；所述膜軟化劑為膽固醇；所述有機溶劑選自乙醇、丙醇、異丙醇、丙三醇、叔丁醇、丙酮、n，n-二甲基乙醯胺和二甲基亞碸中的一種或多種。做此優選的目的是篩選出綠色安全溶劑，減小溶劑毒性。且篩選出易揮發溶劑，易於凍幹。

優選地，步驟1)中，所述水溶性載體選自磷酸一氫鈉、磷酸一氫鉀、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、磷酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氯化鈉和氯化鉀中的一種或多種；所述水溶性載體溶於純水後調節水溶液的ph值為3-8。做此優選的目的是為了配置緩衝溶液，脂質體中的磷脂易水解，會使溶液ph值降低，改變脂質體的粒徑及形貌，緩衝液會提供一個更穩定的環境，溶液ph值不發生較大變化。

優選地，步驟1)中，所述脂類物質與膜軟化劑的重量比為3-10:1；所述有機溶液中脂類物質的濃度為5-80mg/ml。磷脂與膽固醇形成脂質體，膽固醇加入的目的是調節磷脂的流動性，按照本發明限定的比例範圍加入能使形成的脂質體結構更穩定。

優選地，步驟2)中，所述有機溶液與水溶液分別通過蠕動泵注入超重力旋轉床中。

優選地，步驟2)中，所述有機溶液與水溶液的進料體積比為1:5-30；所述有機溶液向超重力旋轉床中的注入速度為1ml/min-8ml/min；所述水溶液向超重力旋轉床的注入速度為5ml/min-240ml/min。並且，通過改變有機相與水相進料比，可改變最終形成的脂質體的粒徑大小。

優選地，步驟2)中，所述超重力旋轉床的轉速為500rmp-2800rmp。

優選地，步驟3)中，所述凍幹保護劑選自乳糖、甘露醇、木糖醇、蔗糖、海藻糖、右旋糖苷和聚乙烯比咯烷酮中的一種或多種；所述凍幹保護劑的加入量與形成納米脂質體的脂類物質的重量比為2.5-15:1；所述凍幹處理的具體操作是將混合溶液在液氮或低溫裝置中凍結然後在凍幹機中凍幹，或者直接將混合溶液在凍幹機中凍幹。

加入凍幹保護劑是為了改善脂質體凍幹後的狀態，冷凍乾燥是有效的改善脂質體製劑長期穩定性的方法之一，但凍幹所涉及的預凍和乾燥等過程不利於脂質體結構和功能的穩定，而採用本發明中限定的凍幹保護劑種類，並按照本發明限定的量加入凍幹保護劑，可有效降低凍幹過程對脂質體造成的不利影響。

優選地，還包括將步驟3)製備的凍幹態的納米脂質體進行水化處理得到納米脂質體溶液的步驟；所述水化處理是指復溶凍幹態的納米脂質體以形成水化後的納米脂質體溶液，復溶所用的溶劑為純水。水是最廉價環保安全的溶劑，生物相容性好，而且製備的脂質體主要用於藥物載體及化妝品領域，因此優選復溶溶劑為純水。另外，也可採用合適的緩衝液在適宜溫度下完成，為加速水化，也可在機械力作用下完成，如可進行震蕩、攪拌或超聲等。

進一步地，本發明還保護採用上述應用超重力技術製備納米脂質體的方法製備得到的納米脂質體，所述納米脂質體的平均粒徑為20-200nm，pdi值為0.1-0.3。

優選地，所述納米脂質體的平均粒徑為20-120nm。

現有技術中，以機械分散技術為基礎製備的納米脂質體，使用的有機溶媒毒性大且無法實現工業化，並且當用含藥水溶液水化時，形成的多層脂質體層與層之間藥物分布不均一，必須再通過反覆凍融處理等；以表面活性劑分散技術為基礎製備的納米脂質體，濃度低且表活劑有殘留難以完全去除；以溶劑或反溶劑分散技術為基礎製備的脂質體，過程繁瑣，且僅限於製備微米級具有緩釋功能的多囊脂質體。針對現有技術中的不足，本發明首次提出將納米脂質體的製備與超重力技術相結合，通過選擇適宜的脂類物質和膜軟化劑，配合相應的水溶性載體，調節好各個原料間的比例關係，通過適宜的注入速度通入超重力旋轉床中進行混合，再配合適宜凍幹保護劑的保護進行冷凍乾燥，可以有效地去除有機溶劑及其他殘留物，保證脂質體的純淨，並且幹態的脂質體利於保存。最後通過簡單的復溶水化來得到粒徑均一，穩定性好的水化後的納米脂質體產品進行應用。本發明通過對製備方法中所有步驟及工藝參數的優化，令其相互協調配合，構成了本發明的技術方案，達到了良好的技術效果，即本發明利用超重力旋轉填充床優異的傳質能力，將其與脂質體的製備相結合，強化溶劑-反溶劑的傳遞與混合，使納米脂質體的製備過程在高度微觀均勻地條件下進行，得到粒徑可控、分布窄、穩定性高的納米脂質體顆粒，並且可以實現大規模生產。

本發明的有益效果如下：

1.本發明利用超重力旋轉填充床優異的傳質能力，強化溶劑-反溶劑的傳遞與混合，使納米脂質體的製備過程在高度微觀均勻地條件下進行，得到粒徑可控、分布窄、穩定性高的納米脂質體顆粒。

2.本發明通過加入凍幹保護劑，在凍幹過程中避免納米脂質體破裂聚集，加快凍乾產物水化形成納米脂質體的過程。

3.本發明採用凍幹處理方法處理有機溶劑，操作簡單且有機溶劑的去除效果好。

4.本發明工藝過程簡單，容易實現，能耗少，效率高，成本低，且非常容易放大，達到工業化生產的發明目標。

附圖說明

下面結合附圖對本發明的具體實施方式作進一步詳細的說明。

圖1示出本發明實施例1製備得到的納米脂質體的掃描電鏡圖。

圖2示出本發明對比例1製備得到的納米脂質體的掃描電鏡圖。

圖3示出本發明實施例5製備得到的納米脂質體的掃描電鏡圖。

圖4示出本發明實施例6製備得到的納米脂質體的掃描電鏡圖。

具體實施方式

為了更清楚地說明本發明，下面結合優選實施例和附圖對本發明做進一步的說明。附圖中相似的部件以相同的附圖標記進行表示。本領域技術人員應當理解，下面所具體描述的內容是說明性的而非限制性的，不應以此限制本發明的保護範圍。

實施例1

將80g磷脂醯膽鹼、10g膽固醇溶於2l乙醇中，將5g磷酸二氫鉀和5g磷酸氫二鉀加入20l水中並調ph為6.5，開啟超重力旋轉床調節轉速為2000rpm，乙醇相以2ml/min、水相以20ml/min進料，控制體系溫度為30℃，待乙醇相進料完畢後，關閉超重力旋轉床，在所得混合溶液中加入300g蔗糖，經冷凍乾燥後除去有機溶劑，得到乾燥的凍乾粉劑。凍乾粉劑可長期保存，使用前採用純水將乾燥的凍乾粉劑復溶水化，即得到納米脂質體溶液。圖1示出本發明實施例1製備得到的納米脂質體的掃描電鏡圖。從圖中可以看出，該納米脂質體的平均粒徑為40nm，對其進行粒徑分布測試，其pdi值為0.18，展現出良好的分散性。圖2示出本發明實施例1製備得到的納米脂質體的粒徑分布圖。從圖中可以看出該納米脂質體溶液平均粒徑為40nm，與電鏡圖結果一致。

對比例1

將80mg磷脂醯膽鹼、10mg膽固醇溶於2ml乙醇中，取實施例1中配製ph為6.5的磷酸氫二鉀緩衝液20ml，磁力攪拌條件下，在30℃將乙醇溶液逐滴加入水溶液中，在所得混合溶液中加入300mg蔗糖，經冷凍乾燥後除去有機溶劑，得到乾燥的納米脂質體凍乾粉劑。凍乾粉劑可長期保存，使用前採用純水將乾燥的凍乾粉劑復溶水化，即得到納米脂質體溶液。圖2示出本發明對比例1製備得到的納米脂質體的掃描電鏡圖。該納米脂質體的平均粒徑為500nm，對其進行粒徑分布測試，其pdi值為0.35，分散性較差。可見，採用普通的機械混合，不僅無法量產，耗時，並且得到的產品在粒徑、均一性方面都有所欠缺。

實施例2

將70g磷脂醯膽鹼、10g膽固醇2l異丙醇溶液中，將4g磷酸二氫鉀和6g磷酸氫二鈉溶於20l水中並調緩衝液ph為7.4，開啟超重力旋轉床調節轉速為2000rpm，異丙醇相以3ml/min、水相以30ml/min進料，控制體系溫度為30℃，待異丙醇相進料完畢後，關閉超重力旋轉床，在所得混合溶液中加入300g蔗糖，經冷凍乾燥後除去溶媒，得到乾燥的納米脂質體凍乾粉劑。凍乾粉劑可長期保存，使用前採用純水將乾燥的凍乾粉劑復溶水化，即得到納米脂質體溶液。該納米脂質體的平均粒徑為80nm，對其進行粒徑分布測試，其pdi值為0.16，展現出良好的分散性。

實施例3

將70g磷脂醯膽鹼、15g膽固醇溶於2l叔丁醇溶液中，將3g磷酸氫二鈉和2g磷酸溶於10l水中並調緩衝液ph為5，開啟超重力旋轉床調節轉速為1000rpm，叔丁醇相以3ml/min、水相以30ml/min進料，控制體系溫度為30℃，待有機溶液進料完畢後，關閉超重力旋轉床，在所得混合溶液中加入300g海藻糖，經冷凍乾燥後除去溶媒，得到乾燥的納米脂質體凍乾粉劑。凍乾粉劑可長期保存，使用前採用純水將乾燥的凍乾粉劑復溶水化，即得到納米脂質體溶液。該納米脂質體的平均粒徑為65nm，對其進行粒徑分布測試，其pdi值為0.2，展現出良好的分散穩定性。

實施例4

將70g磷脂醯膽鹼、10g膽固醇溶於3ln，n二甲基乙醯胺中，2g氯化鈉和2g磷酸溶於20l水中並調緩衝液ph為7，開啟超重力旋轉床調節轉速為1000rpm，n，n二甲基乙醯胺相以2ml/min、水相以15ml/min進料，控制體系溫度為40℃，待n，n二甲基乙醯胺相進料完畢後，關閉超重力旋轉床，在所得混合溶液中加入300g海藻糖，經冷凍乾燥後除去溶媒，得到乾燥的納米脂質體凍乾粉劑。凍乾粉劑可長期保存，使用前採用純水將乾燥的凍乾粉劑復溶水化，即得到納米脂質體溶液。該納米脂質體的平均粒徑為75nm，對其進行粒徑分布測試，其pdi值為0.19，展現出良好的分散穩定性。

實施例5

將100g神經鞘磷脂、15g膽固醇溶於2l乙醇溶液中，將2g磷酸二氫鉀和2g氯化鈉溶於20l水中並調緩衝液ph為6，開啟超重力旋轉床調節轉速為1500rpm，乙醇相以3ml/min、水相以20ml/min進料，控制體系溫度為50℃，待乙醇相進料完畢後，關閉超重力旋轉床，在所得混合溶液中加入300g海藻糖，經冷凍乾燥後除去溶媒，得到乾燥的納米脂質體凍乾粉劑。凍乾粉劑可長期保存，使用前採用純水將乾燥的凍乾粉劑復溶水化，即得到納米脂質體溶液。圖3示出本發明實施例5製備得到的納米脂質體的掃描電鏡圖。該納米脂質體的平均粒徑為80nm，對其進行粒徑分布測試，其pdi值為0.12，展現出良好的分散穩定性。

實施例6

將100g磷脂醯膽鹼、10g膽固醇溶於2l丙醇溶液中，將2g磷酸二氫鉀和2g磷酸二氫鉀溶於20l水中並調緩衝液ph為5.5，開啟超重力旋轉床調節轉速為1000rpm，丙醇相以3ml/min、水相以250ml/min進料，控制體系溫度為40℃，待丙醇相進料完畢後，關閉超重力旋轉床，在所得混合溶液中加入300g海藻糖，經冷凍乾燥後除去溶媒，得到乾燥的納米脂質體凍乾粉劑。凍乾粉劑可長期保存，使用前採用純水將乾燥的凍乾粉劑復溶水化，即得到納米脂質體溶液。圖4示出本發明實施例6製備得到的納米脂質體的掃描電鏡圖。該納米脂質體的平均粒徑為90nm，對其進行粒徑分布測試，其pdi值為0.22，展現出良好的分散穩定性。

實施例7

將100g磷脂醯膽鹼、20g膽固醇和0.02μmol/mlα-生育酚溶於2l異丙醇/乙醇溶液(1:1)中，將1g氯化鈉和2g磷酸二氫鈉溶於20l水中並調緩衝液ph為5，開啟超重力旋轉床調節轉速為2500rpm，有機溶液以3ml/min、水溶液以30ml/min進料，控制體系溫度為30℃，待有機相進料完畢後，關閉超重力旋轉床，在所得混合溶液中加入300g海藻糖，經冷凍乾燥後除去溶媒，得到乾燥的納米脂質體凍乾粉劑。凍乾粉劑可長期保存，使用前採用純水將乾燥的凍乾粉劑復溶水化，即得到納米脂質體溶液。該納米脂質體的平均粒徑為95nm，對其進行粒徑分布測試，其pdi值為0.25，展現出良好的分散穩定性。

實施例8

將80g磷脂醯膽鹼、15g膽固醇溶於2l丙三醇溶液中，將6g氫氧化鈉和2g磷酸溶於20l水中並調ph為4.5，開啟超重力旋轉床調節轉速為2000rpm，丙三醇相以2ml/min、水相以25ml/min進料，控制體系溫度為60℃，待丙三醇相進料完畢後，關閉超重力旋轉床，在所得混合溶液中加入300g海藻糖，經冷凍乾燥後除去溶媒，得到乾燥的納米脂質體凍乾粉劑。凍乾粉劑可長期保存，使用前採用純水將乾燥的凍乾粉劑復溶水化，即得到納米脂質體溶液。該納米脂質體的平均粒徑為70nm，對其進行粒徑分布測試，其pdi值為0.23，展現出良好的分散穩定性。

實施例9

將80g磷脂醯乙醇胺、10g膽固醇溶於2l乙醇/叔丁醇(1:1)溶液中，將4g磷酸氫二鈉和3g磷酸二氫鈉溶於15l水中並調ph為4，開啟超重力旋轉床調節轉速為1000rpm，有機溶液以3ml/min、水溶液以30ml/min進料，控制體系溫度為30℃，待有機溶液進料完畢後，關閉超重力旋轉床，在所得混合溶液中加入300g海藻糖，經冷凍乾燥後除去溶媒，得到乾燥的納米脂質體凍乾粉劑。凍乾粉劑可長期保存，使用前採用純水將乾燥的凍乾粉劑復溶水化，即得到納米脂質體溶液。該納米脂質體的平均粒徑為103nm，對其進行粒徑分布測試，其pdi值為0.212，展現出良好的分散穩定性。

實施例10

將80g氫化磷脂、10g膽固醇溶於2l丙酮溶液中，將2g磷酸氫二鉀和3g磷酸二氫鈉溶於20l水中並調ph為3.5，開啟超重力旋轉床調節轉速為1500rpm，丙酮相以3ml/min、水相以30ml/min進料，控制體系溫度為70℃，待丙酮相進料完畢後，關閉超重力旋轉床，在所得混合溶液中加入300g海藻糖，經冷凍乾燥後除去溶媒，得到乾燥的納米脂質體凍乾粉劑。凍乾粉劑可長期保存，使用前採用純水將乾燥的凍乾粉劑復溶水化，即得到納米脂質體溶液。該納米脂質體的平均粒徑為68nm，對其進行粒徑分布測試，其pdi值為0.155，展現出良好的分散穩定性。

顯然，本發明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發明所作的舉例，而並非是對本發明的實施方式的限定，對於所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動，這裡無法對所有的實施方式予以窮舉，凡是屬於本發明的技術方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處於本發明的保護範圍之列。