水稻黃單胞菌hrp基因克隆和hrp基因調節基因的製作方法

2024-04-06 18:13:05

專利名稱：：水稻黃單胞菌hrp基因克隆和hrp基因調節基因的製作方法
技術領域：
：本發明水稻黃單胞菌hrp基因克隆和hrp基因調節基因，屬農業生物
技術領域：
，專用於農業生物技術育種和防治植物病蟲害。水稻黃單胞菌(Xanthomonasoryzae)包括兩個致病變種水稻白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae，簡稱Xoo)和水稻細條斑病菌(Xanthomonasoryzaepvoryzicola，簡稱Xooc)。水稻黃單胞菌hrp(hypersensitiveresponseonnonhostplantsandpathogenicityonhostplants)基因決定該種病原細菌在非寄主植物(如菸草)上激發過敏反應(hypersensitiveresponse，HR)和在寄主植物水稻(如汕優63)上的致病性(pathogenicity)。水稻黃單胞菌hrp基因成簇(cluster)排列，hrp基因簇調節基因位於hrp基因簇之外。水稻黃單胞菌hrp基因或其調節基因發生突變，則都會改變兩致病變種激發非寄主產生HR和在寄主水稻上具致病性的能力。水稻黃單胞菌既有其致病性，又有其誘導抗病性。水稻黃單胞菌hrp基因可激發非寄主植物產生HR和決定其對寄主水稻的致病性。HR是一種抗病表型。國外已對Erwiniaamylovora、Pseudomonassyringae、Ralstoriasolanacearum和Xanthomonascaampestris中的hrp基因以及以據其進行的可能上述研究領域和應用開發領域進行了專利保護，國內仍未見水稻黃單胞菌中hrp基因克隆和hrp基因的報導。本發明的目的是提供水稻黃單胞菌hrp基因克隆和hrp基因調節基因，用於克隆水稻黃單胞菌或其它植物病原細菌hrp基因和分析水稻黃單胞菌或其它植物病原細菌hrp基因結構與功能，並為用於農業生物技術育種和防治植物病蟲害而構建遺傳重組體提供基因資源。本發明所提供的水稻黃單胞菌(X.oryzae)hrp基因包括1.水稻白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae，簡稱Xoo)hrp基因克隆pUHRX245及其亞克隆(1)Xoo的hrp基因克隆pUHRX245是以載體pUFR034+36.8-kbhrp基因片段構建而成的。(2)36.8-kbhrp基因片段，經EcoRI酶切後構建於載體pUFR034上形成4個亞克隆pHRE17、pUHRE13.5、pHRE3.3和pHRE3，分別含17.0、13.5、3.3和3.0-kbDNA片段；經KpnI酶切後構建形成4個亞克隆pHRK20、pHRK6、pHRK5.8和pHRK3.8，分別含20、6.0、5.8和3.8-kbDNA片段。(3)13.5-kb片段經BamHI酶切後構建得到pHRB2.3、pHRB5.2和pHRB6三個亞克隆，所含插入DNA片段分別為2.3、5.2和6.0-kb。(4)6.0-kb片段經SacI酶切後構建成2個亞克隆pHRS2.7和pHRS3.3，分別含2.7-kb和3.3-kbDNA片段。(5)3.3-kb片段經SacI和KpnI雙酶切後構建成2個亞克隆pSK1.1和pSK2.2，分別含1.1-kb和2.2-kbDNA片段。2.水稻細條斑病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola，簡稱Xooc)hrp基因克隆pUHRS138及其亞克隆(1)Xoochrp基因克隆pUHR138是以載體pUFR034+39.3-kbhrp基因片段構建而成的。(2)39.3-kbhrp基因片段經EcoRI酶切後構建成3個亞克隆pHRE18.6、pHRE12.3和pHRE8.4，分別含18.6、12.3和8.4-kbDNA片段；經EcoRI部分酶切後獲得pE20.7亞克隆，含20.7-kb(12.3+8.4-kb)DNA片段。(1)20.7-kb片段經KpnI部分酶切後構建成6個亞克隆pPK12.3、pPK8.4、pHRK6.6、pHR5.7、pHRK5.2和pHRK3.2，分別含12.3(5.7+6.6-kb)、8.4(5.2+3.2-kb)、6.6、5.7、5.2和3.2-kb片段。(2)6.6-kb片段經BamHI和KpnI雙酶切後構建成2個亞克隆pBK2.1和pBK4.5，分別含2.1和4.5-kb兩個片段。4.5-kb片段上有3個SacI酶切位點和1個EcoRI酶切位點。本發明所提供的水稻黃單胞菌hrp基因的調節基因包括1.來自Xoohrp基因的調節基因hrpXoo，其核苷酸序列為5′GAGCTCGGCGATTGTTGTCTTTTGCTCCGCCCCCCAAGAGAGAGACCGGCATCCTTTCGACCTACTTTGCAGCGATCTCTGCGTTGTCTTACGCAGAACGTCTTCCTACCTATACGAGCAGGATGCTGGTTGGTGCTTGGCCGCAGGGACTGCAACACCTTCAACAGCGACGCGACGGGCAGGGTGCAGCCGATGGCGCCGACGATGAGGTCAGCCTGTTTGGTGCCAGCGGCGATGCGCTGCTGATCCTGGAATATCAAGAAGAGGCCGAAGACGCGTATCGGCAGGCTTTGAAAGCCATGCGCGGGCAGCAGCGCCAATTGCGTTTGCTGTCGTGCCGGAATACCGCCTGGTTGATGCTGAGCCAGCGACGCCTGAGTGCGGCATTGAACTGCTTTGCGCAGCTGGCGATGGATCGCGAAACGCCCCCCAGCCTGTGCGGCGAGAGCCTGCTGGGCAAGGCACTGACCCACTTTCATCTGGGCCAGAGCACGCTGGCCTTGCAGACCCTGGAGCGCGCCAACGAGGTGCTGGCCGAGCTGGAGAGTGGTGCTTCCGATTGGCTGCGTGTCGCCACCGCGCTGCGGCTGGACATGATCGCGCAGCTGCGCATCCGCCGCTCCGATCGCATGGTCGACCATGTGTTCTGGCAGGCCACGCTGCGCCAGGAAGATGCCGCGCATGCCTTCGAGCCCAGCGATTTACGCGCATGCATCGCCGATCTGGCCGAGAGCATGCCGGTGCTGGCGCAGCGCATGCGGCATGTGCGCAACCTGCTGCGGATCGTCGGCGGCGATACCTTCGGCTTCGATGCGCAGATCGATGCGTTGCCGGCTGCGGCCACCGGCTGCCCGCCGTGTGCGCGTCAGGACGCACAGGTGGAACTGGCGCTTGCCGCATTGGCGGTGGGGCGTGCCGATCTGGCCGAGCGCGCGCTGGCCGGTGCCGGCCGGCATCATGCGCCGCGCTGGAATCTGGAGTTCGAATACTGCCAGGCCAAGATCAGTCAGGCGCTGGGACGCACGGAACAAGCGTTGTTGCTCTACAACCGCTATGCGCTGGACGCGGTGCAATGCCTGCGTAGCGAAGTGCAGGCACCGCGCTTGCTGGAAAGCGGTACCCCAGCGCACGTCTCCGACGATATTTCCGCCCGCTTGCCGGCCAAATATCGGCGTGCGTATAGCTACATGATCACCAACGCGCACCGCTCGGATCTGTCGATGGCCACCGGGCTGTCGCCGACCCAGGTGCTGCGCCGTTACCGCATGCAGAGCATCCGCGACGAACTGCTGGCCGAAGGCGGCTGCGGCAGCGTGTTGCAAGCGGCCAGCCGCTGGGGTGTGGGCAGCCGTCGGCATTGGCCAAGGGCTATCGCCAGCACTTCAACGAAGCACCGATGGAAACCTTGCAACGGTAATCTCTTGGCACGCCACGGCTTGGTAGCGCTACCTGCCGTGGCGGTTTGTTGTCGGCGGATGCAGCGGGCGTTAAGGTGCGCAACGTAGGGCAGGGGCTGAATTGAGACGTGCGTGC-3』其中，GAGCTSacI酶切位點；AGAGAGAG；核糖體結合位點；CCGGC轉錄起始位點；翻譯起始位點；GGTACCKpnI酶切位點；alpha-helix-turn-alpha-helix；終止密碼子。2.來自Xoochrp基因的調節基因hrpXooc，其核苷酸序列為5』AGGACAGAGTGAGATTTTTTGATTTTTTCGGTCTCTTTCATTGACAAATTCCATTGAATCCGCTGCCTACAATCGTATGCGCCAGCGAGCTCGGCGATTGTTGTCTTTTGCTCCGCCCCCCAAGAGAGAGACCGGCATCCTTTCGACCTACTTTGCAGCGATCTCTGCGTTGTCTTACGCAGAACGTCTTCCTACCTATACGAGCAGGATGCTGGTTGGTGCTTGGCTGCAGGGACTGCAGCACCTTCAACAGCGACGCGACGGGCAGGGTGCAGCCGATGGAGCCGACGATGAGGTCAGCCTGTTTGGTGCCAGCGGCGATGCGCTGCTGATCCTGGAATATCAAGAAGAGGCCGAAGACGCGTATCGGCAGGCTTTGAAAGCGATGCGCGGGCAGCAGCGCCAATTGCGTTTGCTGTCGTGCCGGAATACCGCCTGGTTGATGCTGAGCCAGCGACGCCTGAGTGCGGCATTGAACTGCTTTGCGCAGCTGGCGATGGATCGCGAAACACCCCCCAGCCTGTGCGGCGAGAGCCTGCTGGGCAAGGCACTGAGCCACTTTCATCTGGGCCAGAGCACGCTGGCCTTGCAGACCCTGGAGCGCGCCAACGAGGTGCTGGCCGTGCTGGAGAGTGGTGCTTCCGATTGGCTGCGTATCGCCACCGCGTTGCGGCTGGACATGATCGCGCAGCTGCGCATCCGCCGCTCCGATCGCATGGTCGACCACGTGTTCTGGCAGGCCACGCTGCGCCAGGAAGATGCCGCGCATGACTTCGAGCCCAGCGATTTACGCGCTTGCATCGCCGATCTGGCCGAAAGCATGCCGGTGCTGGCGCAGCGCATGCGGCATGTGCGCAACCTGCTGCGTATCGCCGGCGGCGATACCTTCGGCTTCGATGCGCAGATCGATGCGTTGCCGGCTGCGGCCACCGGCTGCCCGCCGTGCGCGCGTCAGGACGCACAGGTGGAACTGGCGCTTGCCGCATTGGCGGTGGGGCGTGCCGATCTGGCCGAGCGCGCGCTGGCCGGTGCCGGCCGGCATCACGCGCCGCGCTGGAATCTGGAGTTCGAATACTGCCAGGCCAAGATCAGTCAGGCGCTGGGACGCACGGAACAAGCCTTGTTGCTCTACAACCGCTATGCGCTGGACGCGGTGCAATGCCTGCGTAGCGAAGTGCAGGCACCGCGCTTGCTGGAAAGCGGTACCCCAGCGCACGTCTCCGACGATATTTCCGCCCGCTTGCCGGCCAAATATCGGCGTGCGTATAGCTACATGATCACCAACGCGCACCGCTCGGATCTGTCGATGGCCACCGGGCTGTCGCCGACCCAGGTGCTGCGCCGTTACCGCATGCAGAGCATCCGCGACGAACTGCTGGCCGAAGGCGGCTGCGGCAGCGTGTTGCAAGCGGCCAGCCGCTGGGGTGTGGGCAGCCGTCGGCATTGGCCAAGGGCTATCGCCAGCACTTCAACGAAGCACCGATGGAAACCTTGCAACGGTAATCTCTTGGCACGCCACGGCTTGGTAGCGCTACCTGCCGTGGCGGTTTGTTGTCGGCGGATGCAGCGGGCGTTAAGGTGCGCAACGTAGGGCAGGGGCTGAATTGAGACGTGCGTGC-3』其中，GACAGA......ATGCGCC啟動子區域；GAGCTSacI酶切位點；AGAGAGAG核糖體結合位點；CCGGC轉錄起始位點；翻譯起始位點；alpha-helix-turn-alpha-helix；翻譯終止密碼子。3.來自Xoochrp基因的調節基因hrpGXooc，其核苷酸序列為3′CTGCAGCGGTGAACTTGCTCAGCAGGCGGCTGTGCGATGTGCCGGGCTGAGACTTGGGCTGACAGCCTTGCTCATCGTTGTTGCATCTTTGTCTTGCAGCGCGAGCTCCAACTTGTAGCCATGCGAATACACGGCCCTGATGCGCACTGCGCCGTTGTGATTGCCGAGCTGCAGTTTCTTGCGCAGCTTGTAGATATGCTGCTCCATGGTGCGGTCGGTGAATTCGGTGTGGCTGCCCCAGACCGCCTTGGCCAGCTGGCAACGCCGGAAGCACACGCCGGGGCTGGAAAATAGCAGCCAGGCAATCGAAAACTCGCGTGCGGTCAGCACGATCGGCTTGCCGTGCAGATACACGGTATTTTCGTCGCGGAGCAACTGGTATGGACCAACGCTGAGTTGCTGCGTTTCCGGGCAGGCCGCCACCGGCGATAGCGCCAGGGCCGCGCGTACCTGCAATTCGTGCGAATTGAAGGGGAGCGCAAGCACCTCCTGCGCGCCCGCGCGATACCAGTCCAGGATGTCATTGGCGCAGTCGAAACGCCCGAGCACAATCAGCGGCGTGGGATGACCGCTATGGCAGCGCTGCCAGGCCAGCAGCGAGCTTTCGTCGGAGGCGACGCAACTGGCGTCGAAGACCAGTAACTCGCACGGCGAATGCCGCAACGAACGCAGGAGCTCCAGTTCATCGGAAAACACCGAGACATTGCGCGATAGCGGTGCGAGGCTGGCGTTGACCTGCGAGACCAGGCGGGCGTCCTGCGTCAACAGAAACGCCGATCCGTGTGCAAGGGGGCAAGGGATGTTCATCAGGTGGGCGTCCCGTGGCCGCGCGCAAACCACGCGTGGGCCGGATGCCGACGCCTGGCGTCCGACGCCAGGACAAAACCCATAGGGAGAGATCGATGCATCGTCGGACCAGTTGGTTGTCGGGGGGAGCGTCCGGCAGCGCCGGACAGATGCTATGTACCATTGCAACGAGGAAAAGTTTCACGCTTGCGAACGCTTCTTCGGGTTTGTGGGGGTTGGCTTTAACTCGCGCTCATCTTGGCGTAACGGAGCTCTTACATAGCGGGCATGTGGGCGTCGGCACTGCGCACATCCGCCAAGGTCTAGACCAACCTATTGCGATTCGTGCAATCGCGCGCATCTGGAATACATCGGTCAACAATTCGGGTGCGCGCTAGGTCTGCCGCTCATCATCAAGCCAGTGTCAGCGTGTGTGGTCACAAAATTGCAATGGCTGCGGCCAATAACGGTCAATGGCTGTGGAAGCGGCGCGTTCGCAGACGTTGTCCGAA-5′其中，AAGG核糖體結合位點；CGCGCGC轉錄起始位點；翻譯起始位點；翻譯終止密碼子。本發明所提供的水稻黃單胞菌hrp基因克隆、亞克隆及其調節基因的優點和積極效果在於依據水稻黃單胞菌hrp基因克隆、亞克隆及其調節基因，可以對其hrp基因的結構與功能進行分析，以揭示水稻黃單胞菌的致病機制、誘導抗病機制以及與水稻互作的分子機制。其實踐價值表現在對農業生產中重大病害減災手段的革新上，如依據本發明所提供的hrp基因克隆、亞克隆及hrp基因調節基因為基因資源，構建遺傳重組體，如重組防病微生物、轉基因植物、定向表達有機體等。本發明所用水稻黃單胞菌Xoo(JXOIII)和Xooc(RS105)為公知公用菌株。圖1.Xooc基因文庫構建流程示意2.水稻黃單胞菌基因文庫構建所用載體的物理圖譜E.EcoRI，Ss.Sacl，KKpnI，Sm.SmalI，B.BamHI，X.XbaI，S.SalI，P.PstI，Sp.SphI，H.HindIII，Bg.BglII。圖3.水稻白葉枯病菌(Xoo)hrp基因克隆pUHRX245所含36.8-kbhrp基因片段的限制性酶切圖譜圖4.Xoohrp基因克隆pUHRX245的亞克隆及其功能互補作用圖5.Xoo基因文庫構建流程示意6.水稻細條斑病菌(Xooc)hrp基因克隆pUHRS138所含39.3-kbhrp基因片段的限制性酶切圖譜圖7.Xoochrp基因克隆pUHRS138的亞克隆及其功能互補作用實施例1水稻白葉枯病菌hrp基因克隆、亞克隆和調節基因hrpXoo1.水稻白葉枯病菌基因文庫的構建構建流程圖如圖1。提取Xoo基因組總DNA，經EcoRI部分酶切後回收23-48-kb片段，以pUHR034質粒(物理圖譜如圖2)為載體，提取pUFR034質粒DNA，經EcoRI完全酶切後並去磷酸化。用T4DNA連接酶對去磷酸化的載體pUFR034與經EcoRI部分酶切而回收得到的Xoo基因組總DNA23-48kb片段進行連接，得到多聯體DNA。提取溶源菌BHB2688、BHB2690中λ噬菌體蛋白，也稱包裝蛋白。用包裝蛋白包裝多聯體DNA形成成熟的噬菌體顆粒。噬菌體可容納的最大、最小DNA片段分別為52-kb和38-kb。pUFR034的大小為8.7-kb。因此，以pURF034為載體構建的Xoo文庫的外源片段，最大為52-8.7＝43.3(-kb)，最小為38-8.7＝29.3(-kb)。用成熟的噬菌體感染宿主菌S17-1，得到感染子。單菌落感染子(也稱克隆)，其形式為S17-1/pUFR034∷Xoo基因組DNA片段。為便於書寫，以後將根據含有某種性狀的DNA片段的感染子重新命名，如本實驗例中所得hrp基因表型的克隆，則命名為pUHRX245。提取20個克隆中的質粒DNA，經EcoRI完全每切後計算外源插入片段的平均大小。本實施例中外源DNA片段大小平均為33-kb。根據公式N＝ln(1-p)/ln(1-f)，其中N為Xoo基因文庫所需的克隆數，p為某個基因期望出現的概率，f為外源DNA片段平均長度與該物種染色體總長度的比例。以E.coli的染色體長度4×106bp估算Xoo的染色體長度為例。插入片段平均長度為33-kb，若期望其中某個基因出現的概率為99％，則Xoo基因文庫的理論克隆數應為417個。本實施例中提出Xoo基因文庫的克隆數為2000個，足以滿足文庫的容量要求。因hrp基因簇一般大小為23-25-kb，在載體pURF034上插入的平均大小為33-kb的DNA片段足以包含Xoohrp基因簇。基因組DNA和質粒DNA提取、純化、酶切、回收、重組、連接、轉化、電泳和包裝蛋白的提取、包裝、轉染等技術均為公知，見文獻(LarrySnyderandWendyChampness.(1997)MolecularGeneticsofBacteria.ASM.Press，Washington，D.C)。S17-1、BHB2688和BHB2690以及質粒pUFR034均為已知和公用。S17-1見文獻(DeFeyter，R.，C.I.KadoandD.W.Simon，R.，U.PrieferandA.Puhler.1983.Abroadhostrangemobilizationsystemforgeneticengineeringtransposonmutagenesisingramnegativebacteria.Biotechnology.1784-791)。BHB2688和BHB2690見文獻(Priefer，U.etal.1984.CloningwithcosmidsInAdvancedMoleculargenetics.A.PuhlerandK.N.Timmis(eds)SpringerVerlag，pp.160-170.)。質粒pUFR034見文獻Gabriel.1990.Small，stableshuttlevectorsforuseinXanthomonas.Gene8865-72.。2.DES誘變水稻黃單胞菌獲得hrp-基因突變體2.1DES誘變Xoo獲得hrp-基因突變體Xoo野生菌株JXOIII(在寄主水稻汕優63上具致病性、在非寄主菸草NC89上可激發HR)在NA培養基上標記Rifampicin抗性(≥100ug/mL)，經水稻和菸草上檢驗後獲得出發菌。出發菌在20mLNA+Rif(100ug/mL)中28℃、100rpm條件下振蕩培養36h，4,000rpm離心10min收集菌體，0.2mol/L磷酸鈉緩衝液(PBS，pH7.0)洗二次，後用1/5體積0.2mol/LPBS懸浮，加入16mLPBS，再加入200ul硫酸二乙酯(DES)，於28℃、100rpm條件下孵育30min，取其中200uL塗於NA+Rif100ug/mL的平板上。28℃下培養3-4d後挑選突變體。突變體在NA+Rif(100ug/mL)中於28℃、100rpm條件下培養至對數生長期(＞108cfu/mL)。用去針頭的注射器將突變體注射於菸草葉片背面的葉肉組織中，12-72h內觀察接種部位有無HR。將無HR的突變體培養至對數生長期(＞108cfu/mL)，剪葉法接種孕穗期水稻。每突變體接種5株水稻，每株只接種旗葉，12d後測量病斑長度。將無激發菸草產生HR和在水稻汕優63無致病性的突變體在100mLNA中擴大生長至對數期，4,000rpm離心10min收集菌體。按下列方法製備細胞各組分①細胞破碎液將收集的菌體用25ml去離子水懸浮，超聲波(20kHz，Pulseonfor3.30sec.，Pulseofffor3sec.)冰浴避光破碎菌體7min；②細胞破碎上清液細胞破碎液於4℃、10,000rpm離心10min，取上清液；③菌殘體沉澱用5mL去離子水懸浮待測；④細胞破碎液上清液熱處理將細胞破碎上清液熱(100℃)處理10min冷卻後待測；⑤細胞破碎液上清液蛋白酶K水解物將細胞破碎上清液用蛋白酶K處理(終濃度40ug/mL，37℃溫浴15min)待測。將上述5種組分注射接種菸草，12-72h內觀察HR反應。Xoo經DES誘變和HR及致病性測定後發現，Xoohrp-突變體JCM0066、JCM2211、JCM2322和JCM2482在菸草上失去激發HR的能力，並在寄主水稻上失去致病性(表1)。根據激發菸草產生HR的物質是否在胞內，把上述突變體分為兩類。一類是JCM0066、JCM2322和JCM2482，其激發菸草產生HR的物質既不在胞內存在也不在胞外存在，這類突變體為harpin類蛋白缺乏突變體。另一類是JCM2211，其激發菸草產生HR的物質存在於細胞內，但不能泌出胞外。這類突變體為III型泌出通道突變體(表1)。2.2DES誘變Xooc獲得hrp-突變體Xooc野生菌株RS105(在汕優63上具致病性、在菸草NC89上激發HR)在NA培養基上標記Rif抗性(≥100ug/mL)，經水稻和菸草檢驗後獲得出發菌。出發菌在20mLNB+Rif(100ug/mL)中28℃、100rpm條件下振蕩培養36h，4,000rpm離心10min收集菌體，0.2mol/L磷酸鈉緩衝液PBS(pH7.0)洗二次，後用1/5體積0.2mol/LPBS懸浮，加入16mLPBS中，再加入200ul硫酸二乙酯(DES)，於28℃、100rpm條件下誘變30min，取其中200uL塗於PSA+Rif100ug/mL的平板上。28℃下3-4d後挑選突變體。將突變菌株在NB+Rif(100ug/mL)中於28℃、100rpm條件下培養至對數生長期(＞108cfu/mL)。用無針頭的注射器將突變菌株注射於菸草葉片背面的葉肉組織中，12-72h內觀察接種部位有無過敏反應(HR)。將無HR的突變菌株按上述條件再培養至對數生長期(＞108cfu/mL)，針刺法接種於成株期的水稻葉片。每株突變體接種5株水稻，每株2葉，12d後測量病斑長度。在菸草上無HR和在水稻汕優63上無致病性的hrp-突變株分別為M51、M55和M1005(表2)。將此3株hrp-突變體於100mLNB中培養至對數期(≥108cfu/mL)，4,000rpm離心10min收集菌體。按下列方法製備細胞各組分①細胞破碎液將收集的菌體用25ml去離子水懸浮，超聲波(20kHz，Pulseon3.30secfor3min，Pulseofffor3sec)冰浴避光破碎菌體7min；②離心上清液細胞破碎液於4℃、10,000rpm離心10min，取上清液；③菌殘體沉澱用5mL去離子水懸浮；④離心上清液熱處理離心上清液熱(100℃)處理10min；⑤離心上清液蛋白酶K水解物離心上清液用蛋白酶K處理(終濃度40ug/mL，37℃溫浴15min)。將上述5種組分注射接種菸草葉片，12-72h內觀察HR反應。Xooc野生菌株RS105經DES誘變後獲得的hrp-突變體M51、M55和M1005在菸草上失去激發HR的能力，並在寄主水稻上失去致病性(表2)。根據激發菸草產生HR的物質是否在胞內，把上述突變體分為兩類。一類是M55和M1005，其激發菸草產生HR的物質既不在胞內存在也不在胞外存在，這類突變體為harpin類蛋白缺乏突變體。另一類是M51，其激發菸草產生HR的物質存在於細胞內，但不能泌出胞外。3.交叉互補法釣取Xoo基因文庫中hrp基因克隆以Xoochrp-突變體M55為受體菌，以Xoo基因文庫克隆為供體菌，採用交叉互補法，將Xoo基因文庫400個克隆分別逐一與hrp-突變體M55進行兩親交配。將無菌硝酸纖維濾膜(2cm2)置NA平板上，用無菌牙籤挑取少許在LB+Km20ug/mL+Sp25ug/mL平板上生長的基因文庫克降於濾膜上。受體菌在NB+Rif100ug/mL中於28℃下培養至對數生長前期(107cfu/mL)，離心(4,000rpm，10min，RT)收集菌體，1/20體積LB懸浮菌體，40uL點於塗有供體菌的濾膜上。結合濾膜於NA上在28℃下培養36-48h。塗布濾膜上菌體於NB+Rif(75μg/mL)+Km(10～11μg/mL)的平板上，28℃下培養4-7d後，挑取接合子單菌落。將所得的接合子接種在NB+Rif(75ug/mL)+Km(12ug/mL)中於28℃、100rpm條件下培養至對數生長期(≥108cfu/mL)，無針頭注射器法注射於菸草葉片的葉肉組織中，24h內觀察測試菸草上的HR。將獲得的能在菸草上激發HR的接合子，針刺法接種水稻葉片測定致病性。HR和致病性的測定結果表明，pUHRX245為Xoohrp基因的陽性克隆(表2)。交叉互補法為公知技術，見文獻(王金生.(1999)分子植物病理學.中國農業出版社.北京)4.Xoohrp基因克隆pUHRX245的亞克隆載體質粒pUFR034多克隆位點上的單一酶切位點為EcoRI、KpnI、SacI和BamHI(圖2)提取hrp基因克隆pUHRX245中DNA，經EcoRI完全酶切後除載體外產生17.0、13.5、3.3和3.0-kb四個片段(圖3、圖4)，說明pUHRX245中插入到pUFR034多克隆為點上的hrp基因片段大小為36.8-kb。對pUFR034進行EcoRI酶切並去磷酸化，在T4DNA連接酶的作用下，分別與回收的pUHRX245經EcoRI完全酶切的4個DNA片段相連接，轉化宿主菌DH5α。根據lacZ是否失活選擇白色菌落提取質粒DNA，再進行EcoRI完全酶切，確定所需DNA片段是否插入到載體pUFR034的多克隆位點。以據插入片段大小將所得亞克隆分別命名為pHRE3、pHRE3.3、pHRE13.5和pHRE17，分別含3.0、3.3、13.5和17.0-kbDNA片段。同理，36.8-kbhrp基因片段經KpnI酶切後回收經KpnI酶切後產生的20.0、6.0、5.8和3.8-kbDNA片段，與經KpnI酶切並去磷酸化的pUFR034相連接，轉化宿主菌DH5α。將所得克隆分別命名為pHRK3.8、pHRK5.8、pHRK6和pHRK20，分別含3.8、5.8、6.0和20.0-kbDNA片段。對亞克隆pHRE13.5所含13.5-kb片段進行BamHI酶切，純化後與經BamHI酶切並去磷酸化的載體pUFR034相連接，轉化DH5α後得到pHRB2.3、pHRB5.2和pHRB6三個亞克隆，所含插入DNA片段分別為2.3、5.2和6.0-kb。對亞克隆pHRB6所含6.0-kb片段進行SacI酶切，純化後與經SacI酶切並去磷酸化的載體pUFR034相連接，轉化DH5a後得到pHRS2.7和pHRS3.3兩個亞克隆，所含DNA片段大小分別為2.7-kb和3.3-kb。對亞克隆pHRS3.3所含3.3-kb片段進行SacI和KpnI雙酶切，純化後經與SacI和KpcI雙酶切的pUFR034載體相連接，轉化DH5α後得到2個亞克隆pSK1.1和pSK2.2，所含插入DNA片段分別為1.1-kb和2.2-kb。5.36.8-kbhrp基因片段的酶切圖譜構建依據以上36.8-kb各亞克隆和對pHRE17.0進行KpnI酶切，構建了如圖3所示的限制性酶切圖譜。6.功能互補法檢測pUHRX245各亞克隆所含片段的功能性提取以上各亞克隆中重組質粒，轉化宿主菌S17-1後作為供體菌，以Xoohrp-突變體JCM0066、JCM2211、JCM2322和JCM2482以及Xoochrp-突變體M51、M55和M1005分別為受體菌，在硝酸纖維濾膜上進行兩親交配。供體菌在LB+km20ug/mL+Sp25ug/mL培養基上劃線，於37℃中培養36h後用滅菌牙籤挑取少許於NA培養基的硝酸纖維濾膜(2cm2)上。受體菌在NB+Rif100ug/mL中於28℃下培養至對數生長前期(107cfu/mL)，離心(4,000rpm，10min，RT)收集菌體，1/20體積LB懸浮菌體，40uL點於塗有供體菌的濾膜上。結合濾膜於NA上在28℃下培養36-48hr。塗布濾膜上菌體於NB+Rif(75(g/mL)+Km(10～11ug/mL)的平板上，28℃培養4-7d後，挑取接合子單菌落。將所得的接合子接種在NB+Rif(75ug/mL)+Km(12ug/mL)中於28℃、100rpm條件下培養至對數生長期(108cfu/mL)，無針頭注射器法注射於菸草葉片的葉肉組織中，測試菸草上的HR。將獲得的能在菸草上激發HR的接合子，針刺法接種水稻葉片測定致病性。互補子的HR和致病性測定後發現，pUHRX245的亞克隆pHRE13.5、pHRE13.5的亞克隆pHRB6和pHRB6的亞克隆pHRS3.3能夠交叉互補hrp-突變體M1005的在非寄主菸草上的HR和在感病寄主水稻上的致病性，並表現出水稻細條斑病的症狀(表2、表3，圖3)。這說明亞克隆pHRE13.5、pHRB6、和pHR3.3含有功能性片段，其大小分別為13.5、6.0和3.3-kb。將pHRS3.3的亞克隆pSK1.1和pSK2.2按兩親交配法與hrp-突變體JCM0066、JCM2482、M51、M55和M1005進行功能互補，經HR和致病性測定後發現，該兩亞克隆不能功能互補hrp-突變體M51、M55和M1005的HR和致病性，但亞克隆pSK1.1能夠功能互補JCM0066和JCM2482兩hrp-突變體的激發非寄主菸草產生HR的能力，說明亞克隆pSK1.1含有功能性片段(表3)。將亞克隆pHRS3.3按兩親交配法功能互補Xoohrp-突變體JCM0066和JCM2482，發現pHRS3.3能使hrp-突變體JCM0066和JCM2482恢復在非寄主菸草上激發HR的能力，說明pHRS3.3所含的3.3-kb為功能性片段(表3)。7.序列測定和目標基因分析將pHRS3.3中所含3.3-kbDNA片段送寶生物技術(大連)有限公司進行序列測定。測定號為NJS057。將3.3-kbDNA序列在Internet上輸入GenBank，查新或與已知基因序列進行相似性或相同性比較。結果顯示，3.3-kb中68-1581的序列與來自Xanthomonascampestrispv.vesicatoria中的hrpXv的相同性達90％，與來自X.citri中的hrpXct的序列相同性達90％(表4)。這表明，3.3-kb片段中含有目標基因，將此基因命名為hrpXoo。hrpXoo基因的核苷酸序列特徵如下5′GAGCTCGGCGATTGTTGTCTTTTGCTCCGCCCCCCAAGAGAGAGACCGGCATCCTTTCGACCTACTTTGCAGCGATCTCTGCGTTGTCTTACGCAGAACGTCTTCCTACCTATACGAGCAGGATGCTGGTTGGTGCTTGGCCGCAGGGACTGCAACACCTTCAACAGCGACGCGACGGGCAGGGTGCAGCCGATGGCGCCGACGATGAGGTCAGCCTGTTTGGTGCCAGCGGCGATGCGCTGCTGATCCTGGAATATCAAGAAGAGGCCGAAGACGCGTATCGGCAGGCTTTGAAAGCCATGCGCGGGCAGCAGCGCCAATTGCGTTTGCTGTCGTGCCGGAATACCGCCTGGTTGATGCTGAGCCAGCGACGCCTGAGTGCGGCATTGAACTGCTTTGCGCAGCTGGCGATGGATCGCGAAACGCCCCCCAGCCTGTGCGGCGAGAGCCTGCTGGGCAAGGCACTGACCCACTTTCATCTGGGCCAGAGCACGCTGGCCTTGCAGACCCTGGAGCGCGCCAACGAGGTGCTGGCCGAGCTGGAGAGTGGTGCTTCCGATTGGCTGCGTGTCGCCACCGCGCTGCGGCTGGACATGATCGCGCAGCTGCGCATCCGCCGCTCCGATCGCATGGTCGACCATGTGTTCTGGCAGGCCACGCTGCGCCAGGAAGATGCCGCGCATGCCTTCGAGCCCAGCGATTTACGCGCATGCATCGCCGATCTGGCCGAGAGCATGCCGGTGCTGGCGCAGCGCATGCGGCATGTGCGCAACCTGCTGCGGATCGTCGGCGGCGATACCTTCGGCTTCGATGCGCAGATCGATGCGTTGCCGGCTGCGGCCACCGGCTGCCCGCCGTGTGCGCGTCAGGACGCACAGGTGGAACTGGCGCTTGCCGCATTGGCGGTGGGGCGTGCCGATCTGGCCGAGCGCGCGCTGGCCGGTGCCGGCCGGCATCATGCGCCGCGCTGGAATCTGGAGTTCGAATACTGCCAGGCCAAGATCAGTCAGGCGCTGGGACGCACGGAACAAGCGTTGTTGCTCTACAACCGCTATGCGCTGGACGCGGTGCAATGCCTGCGTAGCGAAGTGCAGGCACCGCGCTTGCTGGAAAGCGGTACCCCAGCGCACGTCTCCGACGATATTTCCGCCCGCTTGCCGGCCAAATATCGGCGTGCGTATAGCTACATGATCACCAACGCGCACCGCTCGGATCTGTCGATGGCCACCGGGCTGTCGCCGACCCAGGTGCTGCGCCGTTACCGCATGCAGAGCATCCGCGACGAACTGCTGGCCGAAGGCGGCTGCGGCAGCGTGTTGCAAGCGGCCAGCCGCTGGGGTGTGGGCAGCCGTCGGCATTGGCCAAGGGCTATCGCCAGCACTTCAACGAAGCACCGATGGAAACCTTGCAACGGTAATCTCTTGGCACGCCACGGCTTGGTAGCGCTACCTGCCGTGGCGGTTTGTTGTCGGCGGATGCAGCGGGCGTTAAGGTGCGCAACGTAGGGCAGGGGCTGAATTGAGACGTGCGTGC-3′其中，GAGCTSacI酶切位點；AGAGAGAG核糖體結合位點；CCGGC轉錄起始位點；翻譯起始位點；GGTACCKpnI酶切位點；alpha-helix-turn-alpha-helix；終止密碼子。3.3-kb片段經SacI和KpnI酶切酶切位點分析發現，pSK1.1中所含1.1-kb片段缺少hrpXoo基因序列中的α-螺旋-轉-α-螺旋序列。α-螺旋-轉-α-螺旋序列是hrpXoo的特徵。表1.Xoohrp-突變體和其細胞組分在菸草上的反應菌株菌懸液破碎離心上熱處理的蛋白酶K處菌殘體菸草水稻液清液離心上清理的離心上JCM0066-------JCM2211--+++--JCM2322-------JCM2482----NDND-JXOIII+15.52cm*+++--CK-------注+示激發菸草產生HR；-示菸草上無HR；ND，未測定；*示病斑長度；ND，未測定。表2.Xoochrp-變體和功能互補子及其細胞組分在菸草上的反應菌株和活菌體細胞離心上菌殘體離心上清液離心上清液蛋接合子菸草水稻破碎液清液熱處理白酶K處理M51--++-+-M55-------M1005-------M51/pUHRX245+-++-+-M51/pUHRS138+-++-+-M55/pUHRX245+-++-+-M55/pUHRS138+-++-+-M1005/pUHRX245+4.07a++-+-M1005/pUHRS138+3.56a++-+-RS105+3.85a++-+-CK-------+示在菸草上激發HR，-示在菸草上無HR。*-示無反應；*數字後無相同字母示差異達顯著水平。表3.Xoohrp基因片段及其亞克隆對對水稻黃單胞菌hrp-突變體的互補作用hrp基因片段及hrp-突變體亞克隆Xoohrp-突變體Xoochrp-突變體JCM0066JCM2482M51M55M1005pUHRX245NTNT+++pHRE3NTNT---pHRE3.3NTNT---pHRE13.5NTNT+++pHRE17NTNT---pHRK3.8NTNT---pHRK5.8NTNT---pHRK6NTNT---pHRK20NTNT---pHRB2.3NTNT---pHRB5.2NTNT---pHRB6NT++++pHRS2.7-----pHRS3.3+++++pSK1.1++---pSK2.2-----*NT，未測；**-無HR；+HR表43.3kb片段中hrpXoo基因序列與其它黃單胞菌中相關序列的相同性比較相關序列(基因)長度(-kb)同源序列起止位點相同性SequencesLength(-kb)StartandstopsitesIdentitySubject/ObjectX.c.pv.vesicatoriahrpXv180668-1581/188-170190％X.citrichrpXct185381-1581/153-165390％X.c.pv.zinniae60(alpha-helix-turn-alpha-helix)1292-1351/1-6093％表5.Xoochrp基因克隆及其亞克隆對對水稻黃單胞菌hr-p突變體的互補作用hrp基因片段hrp-突變體及亞克隆Xoohrp-突變體Xoochrp-突變體JCM0066JCM2482M51M55M1005pUHRS138NTNT+++pHRE8.4NTNT---pHRE12.3NTNT---pHRE18.6NTNTpE20.7NTNT+++pPK12.3NTNT+++pPK8.4NTNT---pHRK6.6NTNT+++pHRK5.7NTNT---pHRK5.2NTNT---pHRK3.2NTNT---pBK4.5+++++pBK2.1-----*NT，未測；**-無HR；+HR表6.pBK4.5中所攜4.5-kb片段與其它黃單胞菌中相關序列的相同性比較同源基因長度(kb)同源序列起始位點同一性X.c.pv.vesicatoriahrpXv18063346-4883/148-168690％X.citrihrpXct18533346-4883/100-163890％X.c.pv.vesicatoriahrpG15591866-3168/1406-3587％實施例2水稻細條斑病菌hrp基因克隆、亞克隆和調節基因hrpXooc和hrpGXooc1.水稻細條斑病菌基因文庫的構建構建流程圖如圖5，方法參見實施例1。2.DES誘變水稻黃單胞菌Xoo、Xooc獲得hrp-基因突變體，方法同實施例1。3.功能互補法釣取Xooc基因文庫中hrp基因克隆以Xoochrp-突變體M55為受體菌，以Xooc基因文庫克隆為供體菌，採用功能互補法，將Xoo基因文庫1000個克隆分別逐一與hrp-突變體M55進行兩親交配。將無菌硝酸纖維濾膜(2cm2)置NA平板上，用無菌牙籤挑取少許在LB+Km20ug/mL+Sp25ug/mL平板上生長的基因文庫克隆於濾膜上。受體菌在NB+Rif100ug/mL中於28℃下培養至對數生長前期(107cfu/mL)，離心(4,000rpm，10min，RT)收集菌體，1/20體積LB懸浮菌體，40uL點於塗有供體菌的濾膜上。結合濾膜於NA上在28℃下培養36-48h。塗布濾膜上菌體於NB+Rif(75μg/mL)+Km(10～11μg/mL)的平板上，28℃下培養4-7d後，挑取接合子單菌落。將所得的接合子接種在NB+Rif75ug/mL+Km12ug/mL中於28℃、100rpm條件下培養至對數生長期(≥108cfu/mL)，無針頭注射器法注射於菸草葉片的葉肉組織中，24hr內觀察測試菸草上的HR。將獲得的能在菸草上激發HR的接合子，針刺法接種水稻葉片測定致病性。HR和致病性的測定結果表明，pUHRS138為Xoochrp基因的陽性克隆(表2)。4.Xoochrp基因克隆pUHRS138的亞克隆載體質粒pUFR034多克隆位點上的單一酶切位點為EcoRI、KpnI、SacI和BamHI(圖2)提取hrp基因克隆pUHRS138中DNA，經EcoRI完全酶切後除載體外產生8.4、12.3和18.6-kb三個片段(圖6、圖7)，說明pUHRS138中插入到pUFR034多克隆位點上的hrp基因片段大小為39.3-kb。對pUFR034進行EcoRI酶切並去磷酸化，在T4DNA連接酶的作用下，分別與回收的pUHRS138經EcoRI完全酶切的3個DNA片段相連接，轉化宿主菌DH5α。根據lacZ是否失活選擇白色菌落提取質粒DNA，再進行EcoRI完全酶切，確定所需DNA片段是否插入到載體pUFR034的多克隆位點。以據插入片段大小將所得亞克隆分別命名為pHRE8.4、pHRE12.3和pHRE18.6，分別含8.4、12.3和18.6-kbDNA片段(圖7)。對pUHRS138進行EcoRI部分酶切，回收後與經EcoRI完全酶切並去磷酸化的載體pUFR034相連接，轉化宿主菌DH5α。根據lacZ是否失活選擇白色菌落提取質粒DNA，再進行EcoRI完全酶切，確定所需DNA片段是否插入到載體pUFR034的多克隆位點。以據插入片段大小將所得亞克隆命名為pE20.7，所含片段大小為8.4kb+12.3kb＝20.7-kb。20.7-kb片段經Kpnl部分酶切和純化後與經KpnI酶切並去磷酸化的pUFR034載體相連接，轉化宿主菌DH5α。將所得克隆分別命名為pPK12.3、pPK8.4、pHRK6.6、pHR5.7、pHRK5.2和pHRK3.2，分別含12.3(5.7+6.6)、8.4(5.2+3.2)、6.6、5.7、5.2、3.2-kb片段。對亞克隆pHRK6.6所含6.6-kb片段進行BamHI和KpnI雙酶切，純化後與經BamHI和KpnI雙酶切的載體pUFR034相連接，轉化DH5α後得到pHRB4.5和pHRB2.1兩個亞克隆，所含插入DNA片段分別為4.5和2.1-kb片段(圖7)。5.39.3-kbhrp基因片段的酶切圖譜構建依據以上39.3-kb片段各亞克隆和對pHRE18.6進行BamHI和KpnI酶切，構建了其限制性酶切圖譜(圖6)。6.功能互補法檢測pUHRS138各亞克隆所含片段的功能性提取以上各亞克隆中重組質粒，轉化宿主菌S17-1後作為供體菌，以Xoohrp-突變體JCM0066、JCM2211、JCM2322和JCM2482以及Xoochrp-突變體M51、M55和M1005分別為受體菌，在硝酸纖維濾膜上進行兩親交配。交配方法、HR和致病性測定參見實施例1。互補子的HR和致病性測定後發現，pUHRS138的亞克隆pE20.7、pPK12.3、pHRK6.6和pBK4.5能夠交叉互補hrp-突變體M1005的在非寄主菸草上的HR和在感病寄主水稻上的致病性，並表現出水稻細條斑病的症狀(表2、表5、圖7)，這說明亞克隆pE20.7、pPK12.3、pHRK6.6和pBK4.5含有功能性片段，其大小分別為20.7、12.3、6.6和4.5-kb。7.序列測定和目標基因分析將pBK4.5中所含4.5-kbDNA片段送寶生物技術(大連)有限公司進行序列測定。測定號為NJS100。將4.5-kbDNA序列在Intemet上輸入GenBank，查新並和與已知相關序列進行相似性或相同性比較。結果顯示，4.5-kb中的同列片段與來自Xanthomonascampestrispvvesicatoria中的hrpXv和hrpG的同一性分別達90％和87％，與來自X.citri的hrpXct的同一性達90％(表6)。功能互補(表5、圖7)和序列分析顯示(表6)，4.5-kb片段中含有目標基因hrpX和hrpG。因此，將來自Xooc的hrp基因的調節基因分別命名為hrpXooc和hrpGXooc。hrpXooc基因的序列特徵如下5』AGGACAGAGTGAGATTTTTTGATTTTTTCGGTCTCTTTCATTGACAAATTCCATTGAATCCGCTGCCTACAATCGTATGCGCCAGCGAGCTCGGCGATTGTTGTCTTTTGCTCCGCCCCCCAAGAGAGAGACCGGCATCCTTTCGACCTACTTTGCAGCGATCTCTGCGTTGTCTTACGCAGAACGTCTTCCTACCTATACGAGCAGGATGCTGGTTGGTGCTTGGCTGCAGGGACTGCAGCACCTTCAACAGCGACGCGACGGGCAGGGTGCAGCCGATGGAGCCGACGATGAGGTCAGCCTGTTTGGTGCCAGCGGCGATGCGCTGCTGATCCTGGAATATCAAGAAGAGGCCGAAGACGCGTATCGGCAGGCTTTGAAAGCGATGCGCGGGCAGCAGCGCCAATTGCGTTTGCTGTCGTGCCGGAATACCGCCTGGTTGATGCTGAGCCAGCGACGCCTGAGTGCGGCATTGAACTGCTTTGCGCAGCTGGCGATGGATCGCGAAACACCCCCCAGCCTGTGCGGCGAGAGCCTGCTGGGCAAGGCACTGAGCCACTTTCATCTGGGCCAGAGCACGCTGGCCTTGCAGACCCTGGAGCGCGCCAACGAGGTGCTGGCCGTGCTGGAGAGTGGTGCTTCCGATTGGCTGCGTATCGCCACCGCGTTGCGGCTGGACATGATCGCGCAGCTGCGCATCCGCCGCTCCGATCGCATGGTCGACCACGTGTTCTGGCAGGCCACGCTGCGCCAGGAAGATGCCGCGCATGACTTCGAGCCCAGCGATTTACGCGCTTGCATCGCCGATCTGGCCGAAAGCATGCCGGTGCTGGCGCAGCGCATGCGGCATGTGCGCAACCTGCTGCGTATCGCCGGCGGCGATACCTTCGGCTTCGATGCGCAGATCGATGCGTTGCCGGCTGCGGCCACCGGCTGCCCGCCGTGCGCGCGTCAGGACGCACAGGTGGAACTGGCGCTTGCCGCATTGGCGGTGGGGCGTGCCGATCTGGCCGAGCGCGCGCTGGCCGGTGCCGGCCGGCATCACGCGCCGCGCTGGAATCTGGAGTTCGAATACTGCCAGGCCAAGATCAGTCAGGCGCTGGGACGCACGGAACAAGCCTTGTTGCTCTACAACCGCTATGCGCTGGACGCGGTGCAATGCCTGCGTAGCGAAGTGCAGGCACCGCGCTTGCTGGAAAGCGGTACCCCAGCGCACGTCTCCGACGATATTTCCGCCCGCTTGCCGGCCAAATATCGGCGTGCGTATAGCTACATGATCACCAACGCGCACCGCTCGGATCTGTCGATGGCCACCGGGCTGTCGCCGACCCAGGTGCTGCGCCGTTACCGCATGCAGAGCATCCGCGACGAACTGCTGGCCGAAGGCGGCTGCGGCAGCGTGTTGCAAGCGGCCAGCCGCTGGGGTGTGGGCAGCCGTCGGCATTGGCCAAGGGCTATCGCCAGCACTTCAACGAAGCACCGATGGAAACCTTGCAACGGTAATCTCTTGGCACGCCACGGCTTGGTAGCGCTACCTGCCGTGGCGGTTTGTTGTCGGCGGATGCAGCGGGCGTTAAGGTGCGCAACGTAGGGCAGGGGCTGAATTGAGACGTGCGTGC-3』其中，GACAGA......ATGCGCChrpXooc基因啟動子區域；GAGCTSacI酶切位點；AGAGAGAG核糖體結合位點；CCGGC轉錄起始位點；翻譯起始位點；alpha-helix-turn-alpha-helix；翻譯終止密碼子。hrpGXooc基因的序列特徵如下3′CTGCAGCGGTGAACTTGCTCAGCAGGCGGCTGTGCGATGTGCCGGGCTGAGACTTGGGCTGACAGCCTTGCTCATCGTTGTTGCATCTTTGTCTTGCAGCGCGAGCTCCAACTTGTAGCCATGCGAATACACGGCCCTGATGCGCACTGCGCCGTTGTGATTGCCGAGCTGCAGTTTCTTGCGCAGCTTGTAGATATGCTGCTCCATGGTGCGGTCGGTGAATTCGGTGTGGCTGCCCCAGACCGCCTTGGCCAGCTGGCAACGCCGGAAGCACACGCCGGGGCTGGAAAATAGCAGCCAGGCAATCGAAAACTCGCGTGCGGTCAGCACGATCGGCTTGCCGTGCAGATACACGGTATTTTCGTCGCGGAGCAACTGGTATGGACCAACGCTGAGTTGCTGCGTTTCCGGGCAGGCCGCCACCGGCGATAGCGCCAGGGCCGCGCGTACCTGCAATTCGTGCGAATTGAAGGGGAGCGCAAGCACCTCCTGCGCGCCCGCGCGATACCAGTCCAGGATGTCATTGGCGCAGTCGAAACGCCCGAGCACAATCAGCGGCGTGGGATGACCGCTATGGCAGCGCTGCCAGGCCAGCAGCGAGCTTTCGTCGGAGGCGACGCAACTGGCGTCGAAGACCAGTAACTCGCACGGCGAATGCCGCAACGAACGCAGGAGCTCCAGTTCATCGGAAAACACCGAGACATTGCGCGATAGCGGTGCGAGGCTGGCGTTGACCTGCGAGACCAGGCGGGCGTCCTGCGTCAACAGAAACGCCGATCCGTGTGCAAGGGGGCAAGGGATGTTCATCAGGTGGGCGTCCCGTGGCCGCGCGCAAACCACGCGTGGGCCGGATGCCGACGCCTGGCGTCCGACGCCAGGACAAAACCCATAGGGAGAGATCGATGCATCGTCGGACCAGTTGGTTGTCGGGGGGAGCGTCCGGCAGCGCCGGACAGATGCTATGTACCATTGCAACGAGGAAAAGTTTCACGCTTGCGAACGCTTCTTCGGGTTTGTGGGGGTTGGCTTTAACTCGCGCTCATCTTGGCGTAACGGAGCTCTTACATAGCGGGCATGTGGGCGTCGGCACTGCGCACATCCGCCAAGGTCTAGACCAACCTATTGCGATTCGTGCAATCGCGCGCATCTGGAATACATCGGTCAACAATTCGGGTGCGCGCTAGGTCTGCCGCTCATCATCAAGCCAGTGTCAGCGTGTGTGGTCACAAAATTGCAATGGCTGCGGCCAATAACGGTCAATGGCTGTGGAAGCGGCGCGTTCGCAGACGTTGTCCGAA-5′其中，AAGG核糖體結合位點；CGCGCGC轉錄起始位點；翻譯起始位點；翻譯終止密碼子。權利要求1.水稻黃單胞菌hrp基因克隆，包括來自水稻白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae，簡稱Xoo)、以載體pUFR034+36.8-kbhrp基因片段構建而成的hrp基因克隆pUHRX245，和來自水稻細條斑病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola，簡稱Xooc)、以載體pUFR034+39.3-kbhrp基因片段構建而成的hrp基因克隆pUHRS138。2.根據權利要求1所述水稻黃單胞菌hrp基因克隆，其中Xoohrp基因克隆pUHRX245還包括36.8-kb片段的亞克隆2.1)36.8-kbhrp基因片段，經EcoRI酶切後構建於載體pUFR034上形成4個亞克隆pHRE17、pUHRE13.5、pHRE3.3和pHRE3，分別含17.0、13.5、3.3和3.0-kbDNA片段；經KpnI酶切後構建形成4個亞克隆pHRK20、pHRK6、pHRK5.8和pHRK3.8，分別含20、6.0、5.8和3.8-kbDNA片段；2.2)13.5-kb片段經BamHI酶切後構建得到pHRB2.3、pHRB5.2和pHRB6.0三個亞克隆，所含插入DNA片段分別為2.3、5.2和6.0-kb片段；2.3)6.0-kb片段經SacI酶切後構建成2個亞克隆pHRS2.7和pHRS3.3，分別含2.7-kb和3.3-kb片段；2.4)3.3-kb片段經SacI和KpnI雙酶切後構建成2個亞克隆pSK1.1和pSK2.2，分別含1.1-kb和2.2-kb片段。3.根據權利要求1所述水稻黃單胞菌hrp基因，其特徵在於，Xoochrp基因克隆pUHRS138還包括39.3-kb片段的亞克隆3.1)39.3-kbhrp基因片段經EcoRI酶切後構建成3個亞克隆pHRE18.6、pHRE12.3和pHRE8.4，分別含18.6、12.3和8.4-kbDNA片段；經EcoRI部分酶切後獲得pE20.7亞克隆，含20.7-kb(12.3+8.4-kb)DNA片段；3.2)20.7-kb片段經KpnI部分酶切後構建成6個亞克隆pPK12.3、pPK8.4、pHRK6.6、pHR5.7、pHRK5.2和pHRK3.2，分別含12.3、8.4、6.6、5.7、5.2和3.2-kb片段；3.3)6.6-kb片段經BamHI和KpnI雙酶切後構建成2個亞克隆pBK2.1和pBK4.5，分別含2.1和4.5-kb兩個片段。4.5-kb片段上有3個SacI酶切位點和1個EcoRI酶切位點。4.水稻黃單胞菌hrp基因的調節基因包括4.1來自Xoo的hrp基因調節基因hrpXoo，其核苷酸序列為5′GAGCTCGGCGATTGTTGTCTTTTGCTCCGCCCCCCAAGAGAGAGACCGGCATCCTTTCGACCTACTTTGCAGCGATCTCTGCGTTGTCTTACGCAGAACGTCTTCCTACCTATACGAGCAGGATGCTGGTTGGTGCTTGGCCGCAGGGACTGCAACACCTTCAACAGCGACGCGACGGGCAGGGTGCAGCCGATGGCGCCGACGATGAGGTCAGCCTGTTTGGTGCCAGCGGCGATGCGCTGCTGATCCTGGAATATCAAGAAGAGGCCGAAGACGCGTATCGGCAGGCTTTGAAAGCCATGCGCGGGCAGCAGCGCCAATTGCGTTTGCTGTCGTGCCGGAATACCGCCTGGTTGATGCTGAGCCAGCGACGCCTGAGTGCGGCATTGAACTGCTTTGCGCAGCTGGCGATGGATCGCGAAACGCCCCCCAGCCTGTGCGGCGAGAGCCTGCTGGGCAAGGCACTGACCCACTTTCATCTGGGCCAGAGCACGCTGGCCTTGCAGACCCTGGAGCGCGCCAACGAGGTGCTGGCCGAGCTGGAGAGTGGTGCTTCCGATTGGCTGCGTGTCGCCACCGCGCTGCGGCTGGACATGATCGCGCAGCTGCGCATCCGCCGCTCCGATCGCATGGTCGACCATGTGTTCTGGCAGGCCACGCTGCGCCAGGAAGATGCCGCGCATGCCTTCGAGCCCAGCGATTTACGCGCATGCATCGCCGATCTGGCCGAGAGCATGCCGGTGCTGGCGCAGCGCATGCGGCATGTGCGCAACCTGCTGCGGATCGTCGGCGGCGATACCTTCGGCTTCGATGCGCAGATCGATGCGTTGCCGGCTGCGGCCACCGGCTGCCCGCCGTGTGCGCGTCAGGACGCACAGGTGGAACTGGCGCTTGCCGCATTGGCGGTGGGGCGTGCCGATCTGGCCGAGCGCGCGCTGGCCGGTGCCGGCCGGCATCATGCGCCGCGCTGGAATCTGGAGTTCGAATACTGCCAGGCCAAGATCAGTCAGGCGCTGGGACGCACGGAACAAGCGTTGTTGCTCTACAACCGCTATGCGCTGGACGCGGTGCAATGCCTGCGTAGCGAAGTGCAGGCACCGCGCTTGCTGGAAAGCGGTACCCCAGCGCACGTCTCCGACGATATTTCCGCCCGCTTGCCGGCCAAATATCGGCGTGCGTATAGCTACATGATCACCAACGCGCACCGCTCGGATCTGTCGATGGCCACCGGGCTGTCGCCGACCCAGGTGCTGCGCCGTTACCGCATGCAGAGCATCCGCGACGAACTGCTGGCCGAAGGCGGCTGCGGCAGCGTGTTGCAAGCGGCCAGCCGCTGGGGTGTGGGCAGCCGTCGGCATTGGCCAAGGGCTATCGCCAGCACTTCAACGAAGCACCGATGGAAACCTTGCAACGGTAATCTCTTGGCACGCCACGGCTTGGTAGCGCTACCTGCCGTGGCGGTTTGTTGTCGGCGGATGATGCAGCGGGCGTTAAGGTGCGCAACGGGCAGGGGCTGAATTGAGACGTGCGTGC-3′其中，GAGCTCSacI酶切位點；AGAGAGAG核糖體結合位點；CCGGC轉錄起始位點；翻譯起始位點；GGTACCKpnI酶切位點；alpha-helix-turn-alpha-helix終止密碼子。4.2來自Xooc的hrp基因調節基因hrpXooc，其核苷酸序列為5』AGGACAGAGTGAGATTTTTTGATTTTTTCGGTCTCTTTCATTGACAAATTCCATTGAATCCGCTGCCTACAATCGTATGCGCCAGCGAGCTCGGCGATTGTTGTCTTTTGCTCCGCCCCCCAAGAGAGAGACCGGCATCCTTTCGACCTACTTTGCAGCGATCTCTGCGTTGTCTTACGCAGAACGTCTTCCTACCTATACGAGCAGGATGCTGGTTGGTGCTTGGCTGCAGGGACTGCAGCACCTTCAACAGCGACGCGACGGGCAGGGTGCAGCCGATGGAGCCGACGATGAGGTCAGCCTGTTTGGTGCCAGCGGCGATGCGCTGCTGATCCTGGAATATCAAGAAGAGGCCGAAGACGCGTATCGGCAGGCTTTGAAAGCGATGCGCGGGCAGCAGCGCCAATTGCGTTTGCTGTCGTGCCGGAATACCGCCTGGTTGATGCTGAGCCAGCGACGCCTGAGTGCGGCATTGAACTGCTTTGCGCAGCTGGCGATGGATCGCGAAACACCCCCCAGCCTGTGCGGCGAGAGCCTGCTGGGCAAGGCACTGAGCCACTTTCATCTGGGCCAGAGCACGCTGGCCTTGCAGACCCTGGAGCGCGCCAACGAGGTGCTGGCCGTGCTGGAGAGTGGTGCTTCCGATTGGCTGCGTATCGCCACCGCGTTGCGGCTGGACATGATCGCGCAGCTGCGCATCCGCCGCTCCGATCGCATGGTCGACCACGTGTTCTGGCAGGCCACGCTGCGCCAGGAAGATGCCGCGCATGACTTCGAGCCCAGCGATTTACGCGCTTGCATCGCCGATCTGGCCGAAAGCATGCCGGTGCTGGCGCAGCGCATGCGGCATGTGCGCAACCTGCTGCGTATCGCCGGCGGCGATACCTTCGGCTTCGATGCGCAGATCGATGCGTTGCCGGCTGCGGCCACCGGCTGCCCGCCGTGCGCGCGTCAGGACGCACAGGTGGAACTGGCGCTTGCCGCATTGGCGGTGGGGCGTGCCGATCTGGCCGAGCGCGCGCTGGCCGGTGCCGGCCGGCATCACGCGCCGCGCTGGAATCTGGAGTTCGAATACTGCCAGGCCAAGATCAGTCAGGCGCTGGGACGCACGGAACAAGCCTTGTTGCTCTACAACCGCTATGCGCTGGACGCGGTGCAATGCCTGCGTAGCGAAGTGCAGGCACCGCGCTTGCTGGAAAGCGGTACCCCAGCGCACGTCTCCGACGATATTTCCGCCCGCTTGCCGGCCAAATATCGGCGTGCGTATAGCTACATGATCACCAACGCGCACCGCTCGGATCTGTCGATGGCCACCGGGCTGTCGCCGACCCAGGTGCTGCGCCGTTACCGCATGCAGAGCATCCGCGACGAACTGCTGGCCGAAGGCGGCTGCGGCAGCGTGTTGCAAGCGGCCAGCCGCTGGGGTGTGGGCAGCCGTCGGCATTGGCCAAGGGCTATCGCCAGCACTTCAACGAAGCACCGATGGAAACCTTGCAACGGTAATCTCTTGGCACGCCACGGCTTGGTAGCGCTACCTGCCGTGGCGGTTTGTTGTCGGCGGATGATGCAGCGGGCGTTAAGGTGCGCAACGGGCAGGGGCTGAATTGAGACGTGCGTGC-3』其中，GACAGA......ATGCGCC啟動子區域；GAGCTSacI酶切位點；AGAGAGAG核糖體結合位點；CCGGC轉錄起始位點；翻譯起始位點；alpha-helix-turn-alpha-helix翻譯終止密碼子。4.3來自Xooc的hrp基因調節基因hrpGXooc，核苷酸序列為3′CTGCAGCGGTGAACTTGCTCAGCAGGCGGCTGTGCGATGTGCCGGGCTGAGACTTGGGCTGACAGCCTTGCTCATCGTTGTTGCATCTTTGTCTTGCAGCGCGAGCTCCAACTTGTAGCCATGCGAATACACGGCCCTGATGCGCACTGCGCCGTTGTGATTGCCGAGCTGCAGTTTCTTGCGCAGCTTGTAGATATGCTGCTCCATGGTGCGGTCGGTGAATTCGGTGTGGCTGCCCCAGACCGCCTTGGCCAGCTGGCAACGCCGGAAGCACACGCCGGGGCTGGAAAATAGCAGCCAGGCAATCGAAAACTCGCGTGCGGTCAGCACGATCGGCTTGCCGTGCAGATACACGGTATTTTCGTCGCGGAGCAACTGGTATGGACCAACGCTGAGTTGCTGCGTTTCCGGGCAGGCCGCCACCGGCGATAGCGCCAGGGCCGCGCGTACCTGCAATTCGTGCGAATTGAAGGGGAGCGCAAGCACCTCCTGCGCGCCCGCGCGATACCAGTCCAGGATGTCATTGGCGCAGTCGAAACGCCCGAGCACAATCAGCGGCGTGGGATGACCGCTATGGCAGCGCTGCCAGGCCAGCAGCGAGCTTTCGTCGGAGGCGACGCAACTGGCGTCGAAGACCAGTAACTCGCACGGCGAATGCCGCAACGAACGCAGGAGCTCCAGTTCATCGGAAAACACCGAGACATTGCGCGATAGCGGTGCGAGGCTGGCGTTGACCTGCGAGACCAGGCGGGCGTCCTGCGTCAACAGAAACGCCGATCCGTGTGCAAGGGGGCAAGGGATGTTCATCAGGTGGGCGTCCCGTGGCCGCGCGCAAACCACGCGTGGGCCGGATGCCGACGCCTGGCGTCCGACGCCAGGACAAAACCCATAGGGAGAGATCGATGCATCGTCGGACCAGTTGGTTGTCGGGGGGAGCGTCCGGCAGCGCCGGACAGATGCTATGTACCATTGCAACGAGGAAAAGTTTCACGCTTGCGAACGCTTCTTCGGGTTTGTGGGGGTTGGCTTTAACTCGCGCTCATCTTGGCGTAACGGAGCTCTTACATAGCGGGCATGTGGGCGTCGGCACTGCGCACATCCGCCAAGGTCTAGACCAACCTATTGCGATTCGTGCAATCGCGCGCATCTGGAATACATCGGTCAACAATTCGGGTGCGCGCTAGGTCTGCCGCTCATCATCAAGCCAGTGTCAGCGTGTGTGGTCACAAAATTGCAATGGCTGCGGCCAATAACGGTCAATGGCTGTGGAAGCGGCGCGTTCGCAGACGTTGTCCGAA-5′其中，AAGG核糖體結合位點；CGCGCGC轉錄起始位點；翻譯起始位點；翻譯終止密碼子；CTCGAGSacI酶切位點；CTTAAGEcoRI酶切位點。全文摘要本發明水稻黃單胞菌hrp基因克隆和hrp基因調節基因,屬農業生物
技術領域：
。本發明提供的Xoochrp基因陽性克隆及其亞克隆、Xoochrp基因陽性克隆及其亞克隆以及水稻黃單胞菌hrp基因調節基因hrpXoo、hrpXooc和hrpG文檔編號C12N15/63GK1276429SQ0011221公開日2000年12月13日申請日期2000年4月17日優先權日2000年4月17日發明者王金生,陳功友申請人:南京農業大學