一種夫西地酸的發酵生產方法
2023-05-19 22:01:56 1
專利名稱：一種夫西地酸的發酵生產方法
技術領域：
本發明屬於發酵工程技術領域，具體涉及一種高產葡萄球菌抗生素夫西地酸的發酵生產方法。
背景技術：
夫西地酸(Fusidic acid, FA)又名梭鏈孢酸，是一種典型的高效抗生素。它是 由梭鏈孢屬產生的一種窄譜抗生素，主要對革蘭陽性菌特別是葡萄球菌有很前強的抗菌活 性，包括對金葡菌、凝固酶陰性菌、表葡菌、梭狀芽孢桿菌屬、棒狀桿菌等都有很高的敏感性 [Collignon P, Turndge J. International journal of antimicrobial agents,1999,12 45-58]。1962年，丹麥Leo製藥公司首次報導從梭鏈孢屬真菌(Fusidium coccineum)的發 酵液中發現並提取出夫西地酸。夫西地酸在國外被廣泛使用了四十多年，但是仍然對絕大 多數葡萄球菌菌株保持較高的抗菌活性和很低的耐藥率，已經越來越受到人們的關注，成 為抗多重耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)菌株的新選擇。根據多種調查顯示，自上世紀80年代末和90年代初以來，葡萄球菌感染較以前明 顯增多。目前葡萄球菌在常見致病菌治病率佔第四位，且耐藥性日益增高，甲氧西林(或苯 唑西林)耐藥葡萄球菌比例呈增高趨勢，國外報導葡萄球菌自上世紀80年代的5% 60% 或更高，而國內上海地區則自80年代的24%增至近期的50% 70%。在重症醫院內感染 中，葡萄球菌佔重要地位[張晴.河北化工，2008，31 (8) :23-24]。國內應用夫西地酸作為 抗葡萄球菌感染必會成為一種趨勢。儘管夫西地酸在國外被廣泛多年，但是在國內臨床應用較少。在國內，生產夫西地 酸的報導比較少，發酵法生產夫西地酸的研究報導更少。2008年，杜天飛等在中國抗生素雜 志第33卷第3期上發表了題名為「夫西地酸產生菌SIIA06-05-201的鑑定及其次級代謝產 物FA-3的結構分析」的論文。在該論文中，對產生菌進行鑑定並分析了次級代謝產物，證實 產物為夫西地酸。針對國內對於這方面的研究仍然處於初級階段，如能對發酵法生產夫西 地酸的工藝進行深入研究，必會為生物法生產抗生素等次生代謝產物提供良好的平臺，對 提高生物法合成抗生素的產量具有極大的意義。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種高效的夫西地酸發酵生產方法。為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案如下一種夫西地酸的發酵生產方法，它包括如下步驟(1)利用梭鏈孢黴(Fusidium coccineum)製備種子液；(2)將發酵培養基滅菌，滅菌過程中校正溶解氧DO為0% ；(3)將步驟(1)製得的種子液按10% (ν/ν)的接種量接種於滅菌後的發酵培養基 中發酵5 8天生產夫西地酸；其中，接種過程中，發酵培養基的培養溫度為25 28°C，控制PH 6.0 8.0，校正溶氧DO 達 100% ；發酵過程中，72h之前，空氣流量為0. 6 0. 8vvm,攪拌速度為260 340rpm，溶氧DO控制在50 80% ；72h之後，空氣流量為0. 2 0. 4vvm，攪拌速度為340 360rpm，溶 氧DO控制在30 40% ；同時，發酵過程中當殘糖濃度低於5g/L時，開始流加80 IOOg/ L，控制發酵罐內殘糖濃度在4 6g/L範圍內。步驟(1)所述的種子液的製備方法為利用梭鏈孢黴(Fusidium coccineum)製得 孢子懸浮液，按IOfVmL的接種量轉接到種子瓶中，上搖床，25 28°C，48hr，搖床轉速200r/ min ；待到種子瓶中生長旺盛時，以5% (ν/ν)的接種量接到50L—級種子罐，25 28°C， 0. 4 0. 5vvm攪拌通風，培養60hr ；後轉到500L 二級種子罐，25 28°C，0. 4 0. 5vvm攪 拌通風，培養48hr得到發酵種子液。步驟⑵所述的滅菌方法為在121°C、0. 12Mpa條件下高溫滅菌30min。有益效果本發明的多階段發酵生產夫西地酸的工藝實現了生物發酵法生產抗葡 萄球菌抗生素夫西地酸的目的，且操作簡單，通過控制發酵不同階段通氣量、攪拌轉速和溶 氧，使得發酵後夫西地酸效價處在較高水平，為工業化規模生產提供了可能性。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用於說明本發明，而不應當也不會限 制權利要求書中所詳細描述的本發明。以下實施例所用的種子培養基配方如下葡萄糖20g/L，黃豆粉4g/L，(NH4)2SO44g/L,KH2PO4 0.4g/L，NaCl 0. lg/L，pH 7. 0o以下實施例所用的發酵培養基配方如下蔗糖20g/L，甘油 5g/L，棉籽餅粉 20g/L，黃豆粉 lg/L，(NH4) 2S04 lg/L，KH2PO4O. 2g/ L, MgSO4 · 7H20 0. Olg/L, FeCl3 · 6H20 0. Olg/L, pH 7. 0。以下實施例所用的梭鏈孢黴(Fusidium coccineum)為ATCC 14700。實施例1 用生理鹽水從PDA斜面上洗下梭鏈孢黴的孢子，製成孢子懸浮液接種到裝有50mL 種子培養基的250mL搖瓶中，接種量為106/mL。在溫度為26°C，轉速200r/min的搖床中振蕩 培養48小時即為搖瓶種子培養液；再以5% (ν/ν)的接種量接到50L —級種子罐中，26°C， 0. 4 0. 5vvm攪拌通風，培養60hr ；後轉到500L 二級種子罐，26°C，0. 4 0. 5vvm攪拌通 風，培養48hr ；得到發酵種子液。洗淨髮酵罐，組裝好溫度、pH探測儀，將發酵培養基溶於水中，倒入發酵罐中，高溫 滅菌，滅菌過程中校正溶解氧DO為0%。接好空氣過濾器，冷卻後接好其他附屬設備。夫西地酸發酵過程分為菌絲生長和夫西地酸積累兩個階段。菌絲生長階段為發酵 過程的前72h，這一階段需要大量的氧，初始空氣流通量為0. 6vvm,攪拌速度為260rpm，溶 氧水平DO控制在60%。夫西地酸累積階段位於發酵的後期，當發酵罐中菌體量比較大時， 轉入低耗氧階段。由於發酵液黏度高，傳氧傳質速率會降低，而且高攪拌速度會造成菌體機 械損傷。此階段調節空氣流量為0. 2vvm，攪拌速度為340rpm，溶解氧水平控制在30%左右。菌體經過一段適應期後進入對數生長期。當營養物質消耗殆盡，殘糖濃度低於5g/L，開始流加100g/L葡萄糖，並以發酵液中殘糖的濃度指導底物流加速度，使得發酵罐內殘 糖濃度控制在4 6g/L範圍內發酵6天。最終測得夫西地酸效價為2783U/mL。實施例2 用生理鹽水從PDA斜面上洗下梭鏈孢黴的孢子，製成孢子懸浮液接種到裝有50mL 種子培養基的250mL搖瓶中，接種量為106/mL。在溫度為26°C，轉速200r/min的搖床中振蕩 培養48小時即為搖瓶種子培養液；再以5% (v/v)的接種量接到50L —級種子罐中，26°C， 0. 4 0. 5vvm攪拌通風，培養60hr,後轉到500L 二級種子罐，26°C，0. 4 0. 5vvm攪拌通 風，培養48hr ；得到發酵種子液。洗淨髮酵罐，組裝好溫度、pH探測儀，將發酵培養基溶於水中，倒入發酵罐中，通入 通入冷卻水，滅菌，滅菌過程中校正溶解氧DO為0%。接好空氣過濾器，冷卻後接好其他附 屬設備。夫西地酸發酵過程分為菌絲生長和夫西地酸積累兩個階段。菌絲生長階段為發酵 過程的前72h，這一階段需要大量的氧，初始空氣流通量為0. 7vvm,攪拌速度為300rpm，溶 氧水平DO控制在60%。夫西地酸累積階段位於發酵的後期，當發酵罐中菌體量比較大時， 轉入低耗氧階段。由於發酵液黏度高，傳氧傳質速率會降低，而且高攪拌速度會造成菌體機 械損傷。此階段調節空氣流量為0. 3vvm，攪拌速度為350rpm，溶解氧水平控制在40%左右。菌體經過一段適應期後進入對數生長期。當營養物質消耗殆盡，殘糖濃度低於5g/ L，開始流加90g/L葡萄糖，並以發酵液中殘糖的濃度指導底物流加速度，使得發酵罐內殘 糖濃度控制在4 6g/L範圍內發酵6天。最終測得夫西地酸效價為3114U/mL。實施例3 用生理鹽水從PDA斜面上洗下梭鏈孢黴的孢子，製成孢子懸浮液接種到裝有50mL 種子培養基的250mL搖瓶中，接種量為106/mL。在溫度為26°C，轉速200r/min的搖床中振蕩 培養48小時即為搖瓶種子培養液；再以5% (v/v)的接種量接到50L —級種子罐中，26°C， 0. 4 0. 5vvm攪拌通風，培養60hr,後轉到500L 二級種子罐，26°C，0. 4 0. 5vvm攪拌通 風，培養48hr ；得到發酵種子液。洗淨髮酵罐，組裝好溫度、pH探測儀，將發酵培養基溶於水中，倒入發酵罐中，通入 通入冷卻水，滅菌，滅菌過程中校正溶解氧DO為0%。接好空氣過濾器，冷卻後接好其他附 屬設備。夫西地酸發酵過程分為菌絲生長和夫西地酸積累兩個階段。菌絲生長階段為發酵 過程的前72h，這一階段需要大量的氧，初始空氣流通量為0. 8vvm,攪拌速度為340rpm，溶 氧水平D0控制在60%。夫西地酸累積階段位於發酵的後期，當發酵罐中菌體量比較大時， 轉入低耗氧階段。由於發酵液黏度高，傳氧傳質速率會降低，而且高攪拌速度會造成菌體機 械損傷。此階段調節空氣流量為0. 4vvm，攪拌速度為360rpm，溶解氧水平控制在30%左右。菌體經過一段適應期後進入對數生長期。當營養物質消耗殆盡，殘糖濃度低於5g/ L，開始流加80g/L葡萄糖，並以發酵液中殘糖的濃度指導底物流加速度，使得發酵罐內殘 糖濃度控制在4 6g/L範圍內發酵6天。最終測得夫西地酸效價為3027U/mL。
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對比例1 同實施例2的方法，所不同的是在夫西地酸發酵過程不分階段調整參數，始終保 持空氣流量為0. 7vvm,攪拌速度為300rpm，溶氧DO控制在60 %，發酵6天，最終測得夫西地 酸效價為2649U/mL。對比例2:同實施例2的方法，所不同的是在夫西地酸發酵過程不分階段調整參數，始終保 持空氣流量為0. 3vvm,攪拌速度為350rpm，溶氧DO控制在40 %，發酵6天，最終測得夫西地 酸效價為2117U/mL。
權利要求
一種夫西地酸的發酵生產方法，其特徵在於它包括如下步驟(1)利用梭鏈孢黴(Fusidium coccineum)製備種子液；(2)將發酵培養基滅菌，滅菌過程中校正溶解氧DO為0％；(3)將步驟(1)製得的種子液按10％(v/v)的接種量接種於滅菌後的發酵培養基中發酵5～8天生產夫西地酸；其中，接種過程中，發酵培養基的培養溫度為25～28℃，控制pH 6.0～8.0，校正溶氧DO達100％；發酵過程中，72h之前，空氣流量為0.6～0.8vvm，攪拌速度為260～340rpm，溶氧DO控制在50～80％；72h之後，空氣流量為0.2～0.4vvm，攪拌速度為340～360rpm，溶氧DO控制在30～40％；同時，發酵過程中當殘糖濃度低於5g/L時，開始流加80～100g/L葡萄糖，控制發酵罐內殘糖濃度在4～6g/L範圍內。
2.根據權利要求1所述的夫西地酸的發酵生產方法，其特徵在於步驟(1)所述的種子 液的製備方法為利用梭鏈孢黴(Fusidium coccineum)製得孢子懸浮液，按106/mL的接種 量轉接到種子瓶中，上搖床，25 28°C，48hr，搖床轉速200r/min ；待到種子瓶中生長旺盛 時，以5% (ν/ν)的接種量接到50L—級種子罐，25 28°C，0.4 0. 5vvm攪拌通風，培養 60hr ；後轉到500L 二級種子罐，25 28°C，0. 4 0. 5vvm攪拌通風，培養48hr得到發酵種 子液。
3.根據權利要求1所述的夫西地酸的發酵生產方法，其特徵在於步驟(2)所述的滅菌 方法為在121°C、0. 12Mpa條件下高溫滅菌30min。
全文摘要
本發明屬於發酵工程技術領域，公開了一種夫西地酸的發酵生產方法。該方法包括種子的培養、接種前準備以及接種、多階段溶氧控制、分批補料發酵階段。以多階段發酵生產梭鏈孢黴，使得該菌株的次級代謝產物夫西地酸效價有很大提高。本發明操作簡單，成本低廉，實現了生物法生產抗生素夫西地酸，而且發酵所得目標產物夫西地酸效價較高，有利於工業化生產。
文檔編號C12R1/645GK101812498SQ20101015082
公開日2010年8月25日 申請日期2010年4月20日 優先權日2010年4月20日
發明者叢蕾蕾, 李軍, 紀曉俊, 胡燚, 蘇永明 申請人:江蘇九陽生物科技有限公司