海豹油基脂質乳液及其用途的製作方法

2024-02-29 14:18:15

專利名稱：海豹油基脂質乳液及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及脂質乳液體系領域，並且具體說涉及用於腸胃外施用的海豹油基脂質乳液。
背景技術：
脂質乳液被廣泛地用作總腸胃外營養(TPN)輸注溶液的基礎，用來給那些不能以口服途徑接受營養的患者提供熱量和必要脂肪酸。例如，在20世紀60年代，歐洲便開發出Intralipid靜脈內用脂質乳液，並且到了1975年批准在美國使用。目前可商購獲得的用於腸胃外用途的脂質乳液由植物油(諸如大豆油或紅花油)、乳化劑(諸如蛋磷脂類)、甘油和水組成。這些可商購獲得的乳液包括Liposyn和LiposynII(Abbott Laboratories)；Travemusion(Baxter Healthcare)及Soyacale(Alpha Therapeutics)。
脂質生物化學的進展已經確認了多不飽和Omega-3(ω-3)和Omega-6(ω-6)脂肪酸的生物學必需性。脂肪酸通過它們所具有的C原子和雙鍵的數目並且通過第一個雙鍵相對於分子甲基末端的位置來表徵。由此，命名C182ω-6表示的是具有18C原子和2個雙鍵的脂肪酸，第一個雙鍵位於從甲基末端的第6個C原子處。多不飽和脂肪酸作為建立生物化學過程阻斷和調製劑的膜是重要的。生物學上最重要的ω-6脂肪酸是花生四烯酸(AA；C204)及其前體，亞油酸(C182)。α-亞麻酸是長鏈ω-3脂肪酸二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的母體物質，這些長鏈ω-3脂肪酸是人體中的必需脂肪酸。作為在高度生物學活性eiconaoids的合成中的前體，AA和EPA影響著炎性反應(Burton JL.Lancet，1989，433-5)和免疫學抗性(Endrers S，等，Eur J Clin Invest，1995，25629-38)以及心血管疾病(Burr ML，等，Lancet，1989，2757-61；Hu FB，等，JAMA，2002，287(14)1815-21)，脂質代謝紊亂、血栓形成過程和腫瘤性轉化疾病(Jeeski LI，等，Pro Soc Exp Biol Med 1995，210227-33；Tevar R，等，J Parenter Enteral Nutr，2002，26(5)285-9；BarberMD，等，Nutr Cancer，2001，40(2)118-24；Senzaki H，等，WorldRev Nutr Diet，2001，88117-25)。一些臨床症狀(例如皮膚損害，生長中止，腎退化和代謝速率增加)與ω-6脂肪酸的缺乏有關係(Caldwell M.D.，Human essential fatty acids deficiencyA reviewin fat emulsion in parenteral nutrition.Meng H.C.和Wilmore D.W.(eds.)Chicago，ILAmer.Med.Assoc.P.24，1978)。
流行病學研究(它顯示食物脂肪含量與心血管疾病發生之間的關係)認為多不飽和脂肪酸是預防有效的。在此內容中，在海洋生物油中發現的ω-3脂肪酸據證明是特別有益的。近來，人們認識到，保持ω-3和ω-6脂肪酸消耗之間的平衡，對實現這些脂肪酸的保護性藥理學效果是必要的。ω-3與ω-6脂肪酸之比為1∶2-1∶4是推薦的(Helmut G.等，JPEN，1994，18417-421)。
如上所述，大部分可商購獲得的脂質乳液得自於植物油。與乳液得自於植物油相關的缺陷是雙重的。首先，植物油缺乏ω-3不飽和脂肪酸，其次，植物中含有顯著量的維生素K(例如，在Intralipid和LiposynII的10％乳液中，據發現維生素K1的濃度分別為30.8和13.2微克/dL)。維生素K在血液凝固過程中是關鍵因素之一併且由此可能使得手術過程變得複雜，特別是對接受抗凝血療法的患者來說。
隨著目前的研究顯示用ω-3脂肪酸補充腸胃外營養在某些臨床條件下可引出各種保護性效果10，11，人們開發出魚油基脂質乳液，Omegaven(Fresenius Kabi)，並且已允許在歐洲市場上使用。Omegaven是10％魚油乳液，其含有高百分比含量的ω-3脂肪酸EPA和DHA。許多生物學有益效果據顯示都與使用Omegaven有聯繫，包括LTC5產生增加、血小板聚集降低、免疫學功能提高和水腫形成減慢。將Omegavene與基本脂質乳液如Intralipid同時靜脈內施予也提供最佳的ω-3與ω-6脂肪酸的比例。
然而，魚油中含有非常少量的ω-3脂肪酸DPA。與多不飽和脂肪酸EPA和DHA一樣，DPA是營養學重要的，人體血液中循環的長鏈ω-3脂肪酸的約三分之一都歸屬於DPA。近來的研究證實，EPA在血管壁中可以實際上轉化成DPA，而DPA本身在這些環境下是有效試劑。雖然通常相信EPA在產生前列腺素中是關鍵因素，其中前列腺素使動脈壁柔軟和不含動脈粥樣斑，但這個研究表明，DPA在此方面可以是10-20倍地比EPA更有作用。由此DPA可以起強有效的抗致動脈粥樣化因素的作用(Schiefenneier M. Yavin E.，J Lipid Res，2002，43(1)124-31；Hansen JB，等，J Lipid Res，2000，41(9)1376-83)。
在脂質乳液中使用魚油的另一個潛在的缺陷是提取魚油的方法目前依賴於蒸汽或加熱，其使ω-3脂肪酸氧化。高溫還具有加速ω-3脂肪酸從其天然的順式幾何形狀異構化成反式幾何形狀的可能。氧化和反式脂肪酸都對人體的健康是有害的。
因此，仍然需要一種脂質乳液，其含有高百分比含量的ω-3脂肪酸EPA、DPA和DHA，低含量維生素K及低比例的氧化和反式脂肪酸。
這個背景信息是為製作已知信息的目的而提供的，申請人相信這些信息與本發明具有可能的關聯性。沒有必要承認也不應當解釋為前述的任何信息構成對本發明的現有技術。
發明概述本發明的一個目的是提供海豹油基脂質乳液及其用途。本發明的一個方面是提供一種脂質乳液，該乳液含有(a)5-40wt％的純化海豹油；(b)0.5-5wt％的乳化劑，和(c)水，其中所述乳液的最終pH為6.0-9.0。
本發明的另一方面提供一種營養組合物，該組合物含有(a)含5-40wt％的純化海豹油、0.5-5wt％的乳化劑和水的脂質乳液，和(b)一種或多種營養化合物，
其中所述組合物的最終pH為6.0-9.0。
本發明的另一方面是提供一種營養組合物，該組合物含有含5-40wt％的純化海豹油、0.5-5wt％的乳化劑和水的脂質乳液，和一種或多種治療劑。
本發明的另一方面是提供一種營養組合物，該組合物含有含5-40wt％的純化海豹油、0.5-5wt％的乳化劑和水的脂質乳液，和一種或多種診斷劑。
本發明的另一方面是提供一種含5-40wt％的純化海豹油、0.5-5wt％的乳化劑和水的脂質乳液在需要的患者的總腸胃外營養中的用途。
本發明的另一方面是提供一種含5-40wt％的純化海豹油、0.5-5wt％的乳化劑和水的脂質乳液作為治療劑或診斷劑用的傳遞載體的用途。
附圖簡介

圖1描繪了卵磷脂與海豹油之比對10％海豹油乳液的液滴粒度的影響。
圖2描繪了pH對10％海豹油乳液的ζ電勢的影響。
圖3描繪了pH對10％海豹油乳液的過氧化的影響。
圖4描繪了EDTA和/或維生素E對10％海豹油乳液的過氧化的影響。
圖5描繪了EDTA濃度對10％海豹油乳液的過氧化的影響。
圖6描繪了含有不同油的乳液的過氧化值。菱形Intralipid，由大豆油製備；正方形Omegaven，由魚油製備；三角形10％海豹油乳液。
圖7描繪了高壓滅菌時間對10％海豹油乳液的過氧化的影響。
圖8描繪了高壓滅菌時間對10％海豹油乳液的pH的影響。
圖9描繪了高壓滅菌時間對10％海豹油乳液的ζ電勢的影響。
圖10描繪了高壓滅菌時間對10％海豹油乳液的顆粒粒度的影響。
發明詳述本發明提供一種脂質乳液，其含有海豹油作為內芯脂類，用於在治療應用中使用，包括在總腸胃外營養中的應用。
定義除非有另外的說明，本文所用的所有技術和科學術語都具有與本發明所屬技術領域的普通技術人員所通常理解的相同的含義。
本文中所用的術語「約」是相對標稱值有+/-5％的變化。應當理解的是這種變化總是包括在本文所提供的任何給定的數值範圍內，無論是否特別指出。
脂質乳液的組分根據本發明，脂質乳液含有海豹油和分散在水中的乳化劑。乳液還可以含有附加組分，諸如抗氧化劑，螯合劑，緩衝劑，助乳化劑，滲透性(osmolality)改進劑，中和劑等等，它們用來提高乳液的穩定性、均勻性和/或其它特性。
相比目前可獲得的魚油基乳液，本發明的海豹油基脂質乳液更穩定和更耐氧化。除此之外，海豹油基乳液中含有必需脂肪酸二十二碳五烯酸(DPA)，其在魚油基乳液中僅以少量存在。
1.海豹油本發明的脂質乳液含有海豹油作為內芯脂質。各種品種的海豹都適合作為所述乳液用油的來源。在本發明的一個實施方案中，油得自格陵蘭海豹(harp seal)。
如上所述，目前可獲得的用於治療用途的脂質乳液中含有得自植物的油或含有魚油作為內芯脂質。海豹油提供了超過魚油或植物油的許多優點。例如，大部分得自植物的油中都具有低含量的有益ω-3脂肪酸和相對高含量的維生素K，而海豹油中含有高含量的ω-3脂肪酸和低含量的維生素K。除此之外，海豹油的ω-3脂肪酸含量高於在魚油中存在的含量，例如，格陵蘭海豹油的ω-3脂肪酸含量一般為約20-35％。此外，海豹油中的大部分ω-3脂肪酸佔據著取代甘油三酯分子的第1和第3位，與在人中的位置相同，而魚油中的ω-3脂肪酸主要佔據第2-位。因此，海豹油的這種取代方式可以讓接受者更好地吸收乳液中的脂質，因為海豹油的脂質更類似於內源脂質。
就ω-3脂肪酸的含量而言，海豹油比魚油含有更高的二十二碳六烯酸(DHA)/二十碳五烯酸(EPA)之比，以及更低含量的不期望的單不飽和及飽和脂肪酸。此外，海豹油中含有顯著量的必需脂肪酸二十二碳五烯酸(DPA)，而其在魚油中存在的含量非常低。加之在製備非常適合治療目的的海豹油中，上述特性賦予海豹油優越的液體性能，使得其不太可能形成能夠阻塞血管的半固體。
根據本發明，用於作為乳液內芯脂質使用的海豹油是高度純化的並且含有高濃度的多不飽和脂肪酸，特別是ω-3脂肪酸。該油中含有的ω-3脂肪酸的比例比ω-6脂肪酸要高。
海豹油中ω-3脂肪酸的濃度一般是總重量的約20-35％，和ω-6脂肪酸的濃度一般是總重量的約2-10％。然而，本領域技術人員能夠領會，油的脂肪酸組成是取決於萃取和精煉的方法而不同的。
根據本發明，在乳液中使用的海豹油含有總重量的大於約20％的ω-3脂肪酸。在一個實施方案中，海豹油含有總重量的大於約25％的ω-3脂肪酸。在另一個實施方案中，海豹油含有總重量的大於約27％的ω-3脂肪酸。
在海豹油中，二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)在油的ω-3脂肪酸含量中佔有較高比例。例如，一般來說，在格陵蘭海豹油中，二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的濃度佔ω-3脂肪酸總重量的約45-70％，而亞麻酸佔ω-3脂肪酸總重量的約0.5-1.5％。
根據本發明，在本發明乳液中使用的海豹油中，DHA與EPA之比為約1∶1至約3.5∶1。
海豹油的脂肪酸含量還可以是脂肪酸的酯的形式，例如亞油酸(18:2n6)、花生四烯酸(20:4n6)、亞麻酸(18:3n3)、二十碳五烯酸或EPA(20:5n3)及二十二碳六烯酸或DHA(22:6n3)的酯，以及其它飽和脂肪酸的酯，如肉豆蔻酸(14:00)、棕櫚酸(16:00)和硬脂酸(18:00)的酯。就酸值而言(按照United States Pharmacopoeia 1993)，海豹油中一般含有低含量的游離脂肪酸酯(約0.2-0.9ml/g)。本領域技術人員能夠領會，油中的脂肪酸酯的量取決於在油精煉過程中所採用的工藝。
根據本發明，乳液中所用海豹油的游離脂肪酸含量小於約0.5ml/g。在一個實施方案中，游離脂肪酸含量小於約0.4ml/g。在另一個實施方案中，游離脂肪酸含量小於約0.3ml/g(所有數值均按照United States Pharmacopoeia 1993測定)。
油的品質可以通過本領域已知的參數來評價，例如，過氧化值、碘值或脂肪酸組成。這些參數可以通過本領域技術人員已知的許多方法來測定，例如，參數可以通過氣相色譜法來測定(還參見the United StatesPharmacopoeia XXI和XXII及British Pharmacopoeia 1993和1998中描述的分析過程)。
根據本發明，在乳液中使用的海豹油的過氧化值為約3mEq/kg至約35mEq/kg並且平均碘值為大於60mEq/kg。在一個實施方案中，海豹油的碘值為約85mEq/kg至約100mEq/kg。
萃取和精煉油的方法是本領域公知的。例如，國際專利申請PCT/CA00/00028描述了一種使用低熱來精煉動物和植物油的方法。低溫的使用可以最大程度地降低純化油中存在的有害的氧化和反式脂肪酸的量。附加地，海豹油往往比魚油更耐自然氧化過程，初步實驗證明，在海豹油中，ω-3多不飽和脂肪酸的體外氧化程度小於在魚油中所觀察的一半。根據本發明，海豹油具有低含量的氧化和反式脂肪酸。
在本發明的一個實施方案中，通過低溫方法萃取和精煉海豹油，以便最大程度地減少氧化。在另一個實施方案中，將加工溫度保持在或低於22℃。
本發明的脂質乳液一般含有約5％至約40％(w/v)的海豹油。在一個實施方案中，乳液含有約5％至約30％(w/v)的海豹油。在另一個實施方案中，乳液含有約5％至約20％(w/v)的海豹油。在另一個實施方案中，乳液含有約5％至約15％(w/v)的海豹油。在另一個實施方案中，乳液含有約10％(w/v)的海豹油。
2.乳化劑為製備本發明的脂質乳液，將一種或多種乳化劑與海豹油組分混合。用於此目的的乳化劑通常是天然、合成或半合成來源的磷脂類。各種適宜的乳化劑是本領域已知的。適宜乳化劑的實例包括但不限於蛋磷脂醯膽鹼，蛋卵磷脂，L-α-二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)，DL-α-二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺(DPPE)，二油醯磷脂醯膽鹼(DOPC)和大豆卵磷脂。根據本發明，乳化劑中的甘油三酯以及游離脂肪酸的總濃度應當是低的，以便最大程度地降低對乳液總油濃度的影響。在本發明的一個實施方案中，乳化劑中的甘油三酯以及游離脂肪酸的總濃度小於約3.5％。
在本發明的一個實施方案中，使用卵磷脂作為脂質乳液的中的乳化劑。在另一個實施方案中，使用蛋卵磷脂作為乳化劑。在另一個實施方案中，使用含有80-85％磷脂醯膽鹼和小於約3.5％脂肪的蛋卵磷脂作為乳化劑。本領域技術人員能夠領會，在蛋卵磷脂中可以存在不會不利地影響乳化性能的其它組分。例如，蛋卵磷脂中可以含有磷脂醯乙醇胺、溶血磷脂醯膽鹼、溶血磷脂醯乙醇胺、鞘磷脂和其它天然組分中的一種或多種。
本發明的脂質乳液中一般含有約0.5％至約5％(w/v)的乳化劑。在本發明的一個實施方案中，乳液含有約0.6％至約2％(w/v)的乳化劑。在另一個實施方案中，乳液含有約0.8％至約1.8％(w/v)的乳化劑。在另一個實施方案中，乳液含有約1.0％至約1.5％(w/v)的乳化劑。在另一個實施方案中，乳液含有約1.2％(w/v)的乳化劑。
乳液中的卵磷脂與海豹油之比在決定乳液內所形成的油滴的粒度方面是重要的。根據本發明，乳液中的油滴粒度低於1μm。因此，卵磷脂與海豹油之比為約1∶4至約1∶20。在本發明的一個實施方案中，卵磷脂與海豹油之比為約1∶4至約1∶18。在另一個實施方案中，卵磷脂與海豹油之比為約1∶4至約1∶15。在另一個實施方案中，卵磷脂與海豹油之比為約1∶4至約1∶10。
3.其它添加劑本發明的脂質乳液中還可以含有附加組分，諸如抗氧化劑、螯合劑、滲透性改進劑、緩衝劑，中和劑等等，它們用來提高乳液的穩定性、均勻性和/或其它特性。
本發明包括向脂質乳液添加一種或多種抗氧化劑，以便有助於防止形成不期望的氧化脂肪酸。可以向脂質乳液中添加的適宜的抗氧化劑包括但不限於α-生育酚(維生素E)和生育三烯酚(tocotrienols)。正如本領域所知，生育三烯酚是生育三烯酚和維生素E萃取物的天然共混物，由米糠油蒸溜物中濃縮而成，其具有類似於α-生育酚(維生素E)的抗氧化活性。生育三烯酚具有與維生素E相似的結構並且在分子的碳側鏈上含有三個雙鍵。
當使用時，向乳液中添加的抗氧化劑的濃度一般為約0.002至約1.0％(w/v)。在一個實施方案中，在乳液中所用的抗氧化劑的濃度為約0.02％至約0.5％(w/v)。
在本發明的一個實施方案中，將生育三烯酚作為抗氧化劑添加至乳液中。在另一個實施方案中，向乳液中添加約0.5％(w/v)的生育三烯酚。在另一個實施方案中，將維生素E作為抗氧化劑添加至乳液中。在另一個實施方案中，向乳液中添加約0.02％(w/v)的維生素E。
乳液中還可以含有螯合劑，用來提高乳液的穩定性和降低氧化脂肪酸的形成。適宜的螯合劑是本領域所已知的並且是通認為安全的(GRAS)化合物，其實例包括但不限於EDTA。在本發明的一個實施方案中，乳液中含有EDTA。在另一個實施方案中，乳液中含有約1×10-6M至5×10-5M濃度的EDTA。
還可以將滲透性改進劑摻入乳液中，以便將乳液的滲透性調節至適宜於腸胃外給予的數值。在腸胃外乳液中使用的滲透性改進劑的量和類型是本領域公知的。適宜的滲透性改進劑的一個實例是甘油。滲透性改進劑的濃度一般為約2％至約5％(w/v)。在本發明的一個實施方案中，向乳液中添加的滲透性改進劑的量為約2％至約4％。在另一個實施方案中，向乳液中添加的滲透性改進劑的量為約2％至約3％。在另一個實施方案中，將約2.25％(w/v)的甘油作為滲透性改進劑添加至乳液中。
本領域技術人員能夠理解，乳液的pH可以通過使用緩衝劑或中和劑來調整。據顯示，pH值接近生理學pH或之上的乳液較少有脂肪酸過氧化的傾向。本領域技術人員能夠領會，可以通過使用適當的鹼(中和脂肪酸上的負電荷)、通過使用適當的緩衝劑或者其組合，來調節乳液的pH。各種類型的鹼和緩衝劑適用於本發明的乳液。本領域技術人員能夠領會，向乳液添加緩衝劑不僅能夠影響最終pH，而且還影響乳液的離子強度。高離子強度可以負面地影響乳液的ζ電勢(即油滴的表面電荷)並且因此是不期望的。選擇適當的緩衝劑強度來提供適宜的pH和ζ電勢(如本文所定義)被認為屬於本領域技術人員的普通知識。
在本發明的一個實施方案中，使用氫氧化鈉來調節乳液的pH。在另一個實施方案中，用緩衝劑調節pH。在另一個實施方案中，緩衝劑是磷酸鹽緩衝劑。在另一個實施方案中，將氫氧化鈉和磷酸鹽緩衝劑同時添加至乳液中。
乳液的最終pH一般為約6.0至約9.0。在本發明的一個實施方案中，乳液的pH為約7.0至約8.5。在另一個實施方案中，乳液的pH為約7.0至約8.0。
脂質乳液中還可以含有用於調整乳液穩定性的組分，例如胺基酸或碳水化合物，例如果糖或葡萄糖。還可以將脂質乳液配製成含有諸如葡萄糖、胺基酸、維生素或其它腸胃外營養補劑的營養素。將脂質乳液配製成摻加治療劑也被認為屬於本發明的範圍。本文中所用的「治療劑」是指生理學或藥理學活性的物質，其可在動物中產生局部或全身效果或多種效果，並且通常指藥物、營養補劑、維生素、礦物質、酶、激素、蛋白質、多肽、抗原和其它治療或診斷有用的化合物。
脂質乳液的製備本發明的脂質乳液可以通過許多本領域技術人員已知的常規技術來製備。總的來說，首先將內芯脂質與乳化劑和抗氧化劑(如果使用其的話)混合。然後，通過將此油相緩慢添加至水中同時進行恆定攪拌，來製備乳液。如果使用滲透性改進劑的話，將其添加至水中，然後與油相混合。如果需要的話，可以在此階段調節pH，並且如果需要的話可以用水調整最終體積。
乳液的油滴粒度(即顆粒粒度)對於乳液的治療效果和品質而言是重要的參數。由於脂質顆粒會以類似於乳糜微粒的方式從體循環中除去，因而乳液中的脂質顆粒的粒度需要保持在天然存在的乳糜微粒的粒度範圍(即0.4-1.0μm)之內或之下。如果顆粒粒度大於此範圍，脂質顆粒會沉積在肝、脾和肺中，導致在輸注後產生顯著的脂肪負荷(RahuiC.M.，等，Am.J Hosp.Pharm.1992，492749-2755)。具有小顆粒粒度的脂質較好地分散在乳液中，並且往往產生較安全和較穩定的乳液。本發明的脂質乳液一般具有比可商購獲得的脂質乳液更小和更均勻的顆粒粒度。適當的顆粒粒度是具有平均直徑低於1μm，一般是約0.05μm至約0.5μm。在本發明的一個實施方案中，平均顆粒粒度為約100nm至約500nm。在另一個實施方案中，平均顆粒粒度為約200nm至約400nm。在其它實施方案中，平均顆粒粒度為約250nm至約350nm和約300nm至約350nm。本領域技術人員能夠理解，可獲得的顆粒粒度取決於製劑的組成以及製備過程。
具有適當平均顆粒粒度(即直徑小於1μm)的脂質乳液可以通過本領域已知的許多技術來製備。例如，可以對通過如上所述向水中添加油相而製得的分散液進行均質處理、聲處理或微流化處理。可以商購獲得各種各樣的適宜的機械設備，來實現乳液的製備。在本發明的一個實施方案中，使分散液通過均質器一次或多次。在另一個實施方案中，通過使用均質器，使用20,000-27,000Psi的壓力來產生乳液。在另一個實施方案中，通過使用均質器，使用180,000kPa的壓力來產生乳液。本領域技術人員能夠領會，按此方式製備的乳液的顆粒粒度與油含量、乳化劑濃度以及均質器的壓力和通過其的次數有關。適合於製備本發明乳液的條件的選擇被認為屬於本領域技術人員的普通技術範疇。
如果需要的話，在此階段，可以將所得的乳液通過適當的濾器例如0.45μm膜過濾。或者，可以通過高壓滅菌處理，將乳液滅菌。據發現，本發明的含海豹油的乳液對在121℃下高壓滅菌處理最多60分鐘是穩定的。
通常，將最終的乳液保持在無菌條件中並且可以包裝在密閉容器中進行短期或長期保藏。
在惰性氣氛下製備脂質乳液以便最大程度地降低在加工過程中發生脂質氧化也屬於本發明的範圍。
在本發明的一個實施方案中，脂質乳液含有5-20％的海豹油、0.5-5％的含80-85％磷脂、0.002-0.5％生育三烯酚或α-生育酚的蛋卵磷脂、2-5％甘油和水。在另一個實施方案中，海豹油中含有20-35％的ω-3脂肪酸。在另一個實施方案中，使用將溫度保持在22℃或低於22℃的工藝，將海豹油進行精煉。在另一個實施方案中，乳液的平均顆粒粒度為約250nm至約350nm。在另一個實施方案中，乳液的最終pH為約7至約8。
脂質乳液的穩定性最大程度減少脂質的氧化對脂質乳液來說是特別重要的，因為氧化會導致發展成酸敗和產生具有潛在毒性的分子。正如本領域所已知的，油滴的粒度、油的濃度、乳化劑的性質和抗氧化劑的存在對乳液中所發生的脂質氧化的量來說是重要的決定因素。
脂質乳液的穩定性可以通過許多本領域已知的並且在本文和在別處所描述的試驗來測定，包括但不限於視覺檢測乳液的乳液分層和/或分離、加速老化測試、高速離心、測量顆粒粒度及ζ-電勢的分布和變化。通過測定過氧化值可以預先評價海豹油的氧化狀態，並且由此確定乳液的品質。測定油的過氧化物含量的方法是本領域已知的(例如，參見the United States Pharmacopoeia XXI或the British Pharmacopoeia1993中描述的分析過程)。海豹油一般具有約4mEq/kg至約32mEq/kg的低過氧化值，取決於製造的方法。由此，在本發明的一個實施方案中，海豹油的過氧化值為小於35mEq/kg。在另一個實施方案中，海豹油的過氧化值為約5mEq/kg至約30mEq/kg。
脂質乳液的氧化水平還可以通過測定過氧化值、通過監測氧的消耗或通過檢測脂類過氧化物來測定。
毒性測試使用本領域已知的標準方法，可以體外和體內測試脂質乳液的毒性(參見，例如，Current Protocols in Toxicology，Maines，M.，等編)，J.Wiley Sons，Inc.，New York，NY)。例如，可以使用LimulusAmebocyte Lysate(LAL)血凝塊試驗(Marilyn J.Gould，NephrologyNews Issues，November 1988，pp26)，來體外測試乳液中的內毒素存在。或者，或除此之外，可以使用標準急性毒性試驗，其中將乳液施用給適宜的試驗動物(一般來說是小鼠或大鼠)，來體內測試乳液。在施用適當的時間後，將動物殺死，收集主器官中的組織並且進行分析。將結果與對照組動物比較，其中給對照組使用安慰劑或標準產品。
測試脂質乳液可以採用許多本領域技術人員已知的臨床試驗，來測定本發明脂質乳液在總腸胃外營養方面或者用於治療應用的功效。例如，通過標準生物等效研究(參見，例如，Current Protocols in Toxicology，Maines，M.，等(編)，J.Wiley Sons，Inc.，New York，NY)，可以測定脂質乳液被動物體吸收的能力。在這些研究中，監測適當動物模型在輸注本發明脂質乳液或對照乳液(一般是可商購獲得的植物油或魚油基乳液)之後，脂肪酸從血流中的消失情況。還可以通過標準過程來測定肝脂質的脂肪酸分布並且通過檢測例如肝、腎、心、肺、脾或胸腺的病理組織學來測定脂肪酸的分布。
本發明脂質乳液的治療效果可以在適當的動物疾病模型中得到測定。例如，經常使用灼傷小鼠模型來測試脂質乳液的治療有益性[參見，Hayashi，Nutrition，17211(2001)]。在此情形中，將脂質乳液施用給小鼠並且監測各種生理學參數，例如，血液和尿液的氮含量或者某些蛋白質如血液白蛋白的再生。
在短期或長期安排後，也可以進行本領域已知的其它生物利用性研究和毒性試驗。
脂質乳液的用途本發明的脂質乳液可以被用作富含順式-ω-3脂肪酸的總腸胃外營養(TPN)產品。為此目的，如果需要，可以將脂質乳液與富含ω-6的脂質乳液例如植物油基乳液合併，以便提供最佳ω-3∶ω-6脂肪酸比。除此之外，可以通過標準技術將本發明的脂質乳液配製成營養組合物的形式，以便其含有一種或多種其它營養素，諸如葡萄糖、胺基酸、維生素和/或其它腸胃外營養性補劑。
如前所述，已知ω-3脂肪酸可影響炎性反應和免疫學抗性，以及心血管疾病，脂肪代謝紊亂，血栓形成過程和腫瘤性轉化疾病。因此，本發明的脂質乳液還可以用於有益於術後和創傷後患者(特別是經過用抗凝血劑治療的患者)、經歷早期膿毒/全身性炎性響應症候群(SIRS)的患者、處於高炎性過程危險的患者、其免疫功能需要支持的患者、患有炎性腸疾病(Crohn′s病，潰瘍性結腸炎)的患者、患有炎性皮膚疾病(牛皮癬，特異反應性溼疹)的患者，關節炎患者，心血管疾病患者、癌症患者、肺病患者(如哮喘)和糖尿病患者。
使用脂質乳液來配製摻加有一種或多種治療性或診斷性化合物的組合物也屬於本發明的範疇。在此實施方案中，脂質乳液起治療性或診斷性化合物的傳遞載體的作用，以及提供如上所述的有益效果。配製脂質乳液，使其含有一種或多種治療性或診斷性化合物，是本領域技術人員使用標準技術容易實現的。
給患者施用脂質乳液以便進行TPN應用或治療有益效果的方法是本領域已知的。一般，通過在適宜的時間期限內輸注來施予乳液。適當的劑量和施予制度是臨床領域的技術人員容易確定的。
試劑盒本發明還附加提供含有脂質乳液的試劑盒子，用於給患者施用。該試劑盒能夠提供在規定期限內的合適的劑量。
本發明的試劑盒包含一個或多個含有脂質乳液的包裝或容器以及一套指導說明，其中所述指導通常是書面的指導，涉及脂質乳液的使用和劑量。試劑盒可還含有附加的含有一種或多種營養素或者治療性或診斷性化合物的容器，這些營養素或化合物可以在施用前添加至乳液中。含有脂質乳液的包裝可以是單位劑量的形式或者呈大批量包裝的形式(例如，多劑量包裝)。劑量的包裝形式可以是使每劑量與例如一周內的每日劑量有關。也可以將試劑盒與注意事項聯繫起來，其中所述注意事項是由調整製造、使用或銷售生物製品的政府機構來規定的，這種注意事項反映了政府機構對用於人或動物施用的製造、使用或銷售的許可。
為取得對本發明更好的理解，可以參考以下實施例。應當理解的是這些實施例僅僅是為舉例說明的目的而列舉的。因此，它們應當不以任何方式限制本發明的範圍。
實施例實施例1製備含有格陵蘭海豹油的脂質乳液將磷脂類、海豹油、甘油、生育三烯酚或α-生育酚和膽固醇通過在室溫下攪拌約30分鐘徹底混合。將無菌水添加至混合物中並且將其攪拌另外2-3分鐘。然後，將整個混合物傾入均質器(EmulsiFelex-C5，Avestin Inc.，Ottawa，加拿大)的腔內並且在高壓條件(20,000-27,000psi)下經過該均質器數次。
在一種組合中，海豹油10％，蛋卵磷脂2.4％，生育三烯酚0.5％，甘油2.25％和膽固醇5％，使乳液在20,000Psi壓力下經過均質器4次後，脂滴的平均粒度為452nm。在27,000Psi增加壓力下經過均質器一次後，顆粒粒度降低至340nm。然而，當將膽固醇從組合中省去時，在20,000Psi的壓力下可以獲得280nm的顆粒粒度。
實施例2乳液組成的優化由於脂質乳液是熱力學不穩定體系，因而為製備穩定的且有效的藥物產品就必需考慮許多因素。這些因素包括油和乳化劑的性質、各組分的濃度和配製方法。然而，對在各種含量下的所有因素進行測試是不切實際的，因此，常使用析因或部分析因設計。析因或部分析因設計為篩選各種因素和優化乳液的配製提供了一條有效途徑，參見Phan-Tan-Luu，R.和Didier，M.Experimental design in emulsion andsuspension formulationstheoretical aspects.P.465-535；及Neilloud，F.，Marti-Mestres，G.，Maillols，H.Application ofexperimental methodology to emulsion and suspensions. P.535-557，Pharmaceutical emulsion and Suspensions.Neilloud，F.和Marti-Mestres編，G.，Marcel Dekker Inc.，2000)。
下面描述的是全析因設計的一個樣品，用於評價改變脂質乳液中某些因素對10％海豹油乳液穩定性影響的結果。
三個因素的變化範圍示於下表1。
表1.

在該樣品中，考慮的響應是乳液的顆粒粒度。
通過該方法也評價脂質氧化的其它參數以及生物穩定性數據。
全析因設計(23)和響應示於下表2。
表2.

此樣品中基體效應的計算表明，膽固醇的存在和濃度對決定此類型乳液的顆粒粒度而言是重要的因素。
實施例3調節脂質乳液的顆粒粒度如上所述，乳液的顆粒粒度與許多因素有關。控制顆粒粒度和將此粒度保持在某範圍內對乳液的穩定性具有很大影響，並且還決定著乳液的有效性和毒性。由以下組合組成的乳液海豹油10％，蛋卵磷脂2.4％，生育三烯酚0.5％，甘油2.25％和膽固醇5％，使乳液在20,000Psi。壓力條件下經過均質器4次後，其平均脂質滴粒度為452nm。當將壓力增加至27,000Psi時，僅僅經過一次，此脂質滴的粒度下降至340nm。然而，如果從此組合中省去膽固醇，則在20,000Psi壓力條件下，乳液的顆粒粒度便可以達到280nm。
實施例4製備10％海豹油乳液將卵磷脂(12g，Lipoid E80，Lipoid GmbH，Ludwigshafen，德國)、甘油(22.5g，Sigma-Aldrich，Burlington，Ontario，加拿大)、海豹油(100g，或者得自Caboto Seafood Ltd.，Baie Verte，Newfoundland and Labrador，加拿大，或者得自Seafreez Seafood Ltd，Catalina，Newfoundland and Labrador，加拿大)、維生素E(0.2g，Sigma-Aldrich，Burlington，Ontario，加拿大)、0.1M NaOH溶液(2.0g，Sigma-Aldrich，Burlington，Ontario，加拿大)、K2HPO4(0.38g，Sigma-Aldrich，Burlington，Ontario，加拿大)、EDTA(0.75mg，Sigma-Aldrich，Burlington，Ontario，加拿大)和注射用水，USP(Baxter加拿大Ltd.，Mississauga，Ontario，加拿大)至1000g，攪拌30min。通過使此混合物經過高壓均質器4-8次(EmulsiFlex-C5，Avestin，Ottawa，Ontario，加拿大)，製備乳液。將壓力保持在180,000kPa。將產品通過高壓滅菌器在121℃下滅菌20min並且在無菌條件下包裝在瓶或塑膠袋中。
實施例510％海豹油乳液的組成分析使用氣相色譜法(GC)和紅外分光光度測定法，分析三種不同格陵蘭海豹油製品的脂肪酸組成，其中所述三種不同格陵蘭海豹油獲自不同供應商。簡言之，使用NaOH將海豹油水解成游離脂肪酸，然後進行甲基轉移化。將酯化的脂肪酸甲基酯在HP-5964毛細管氣相色譜儀上進行分析。採用相同的過程，將從Sigma購買的脂肪酸標準樣酯化。定量分析海豹油的脂肪酸組成(參見Fidler N，等，J Lipid Res，2000，41(9)1376-83)。結果匯總於下表3。
表3海豹油乳液的組成

從表3中可以看出，魚油和海豹油中的長鏈ω-3多不飽和脂肪酸的組成是非常不同的。雖然魚油中含有EPA和DHA，但它的DPA數量非常少。魚油中EPA的含量比DHA高。
實施例6.海豹油的酸值按照US藥典來測定酸值並且以中和10.0g格陵蘭海豹油中的游離脂肪酸所需要的0.1N鹼的mL數量來表示。
來自供應商#1的油2.356來自供應商#2的年老格陵蘭海豹油2.262來自供應商#2的Beater(年老)油1.695來自供應商#2的Beater(幼小)油0.986來自供應商#2的Bedlamer油2.300Beater處在其生命中第一年的幼小格陵蘭或灰色海豹，在三至四周的年齡完成了其第一次蛻皮，形成柔軟的帶有斑點灰色外皮。
Bedlamer約一至五歲的幼年格陵蘭或灰色海豹，其具有帶斑點的外皮。格陵蘭海豹在性成熟的早期逐漸發育區別性的鞍形(saddle)或豎琴(harp)形印記。
實施例7重金屬含量和PCBs分析通過PSC Analytical Services(Bedford，NS，加拿大)進行痕量金屬(USEPA方法#3050B)、汞(USEPA方法#245.5)和多氯聯苯(PCBs)的ICP-質譜分析。
對由海豹油、魚油(Omegaven)和大豆油(Intralipid)製備的五種油樣品和三種脂質乳液樣品進行測試。所有樣品均沒有發現可檢測含量的重金屬和PCBs。
實施例8影響海豹油乳液品質的各種因素通過監測乳液中油滴的粒度來評價物理穩定性。試驗在加速條件、高速離心或在高溫條件下進行。在15℃下對乳液樣品(10mL)進行在41,600g下的高速離心處理一周。每天收集乳液的等分試樣(50μL)，進行顆粒粒度分析。在獨立的一組實驗中，將乳液樣品(10mL)保持在37、45和60℃的水浴中5天。每24小時間隔，取出樣品的等分試樣(50μL)，進行顆粒粒度分析。
通過過氧化值來定義化學穩定性。將乳液樣品保持在37℃的試管中。第0、1、2、3和4天收集樣品並且分析過氧化值。
將乳液0.2mL添加至1.5mL異辛烷/異丙醇(3∶2，v/v)中。將混合物渦旋約30秒並且在2000xg下離心2min。收集頂層(20μL)，並且與2.8mL甲醇/1-丁醇(2∶1，v/v)和15μL硫氰酸鹽/Fe2+溶液*混合。然後將混合物渦旋。在室溫下保溫20min之後，測定510nm下的吸光度。根據由一系列已知濃度的氫過氧化枯烯獲得的標準曲線，測定過氧化物的濃度。
*硫氰酸鹽/Fe2+溶液通過將3.94M硫氰酸鹽溶液與0.072M Fe2+溶液以1∶1的比混合來製備。
8.1.卵磷脂與海豹油之比對油滴粒度的影響如前所述，油滴粒度是乳液的特徵之一。我們發現使用的表面活性劑(卵磷脂)對所形成的油滴的粒度有影響。如圖1所示，隨著卵磷脂與油的比例降低，油滴粒度增加。
8.2.pH對表面電荷的影響已知油滴表面上的電荷對乳液的穩定性具有影響。高電荷使油滴彼此相互排斥。結果，油滴能夠在乳液中停留較長時間。使用ζ電勢來定義油滴表面上的電荷。測定海豹油乳液在不同pH條件下的ζ電勢並且結果示於圖2。該結果證實隨著乳液的pH增加，ζ電勢增加。
8.3.pH對過氧化的影響海豹油中含有多不飽和脂肪酸，它們易於過氧化。氧化脂肪酸與癌症、心血管疾病和炎性過程有關。對於含不飽和脂肪酸的油而言，首要關心的是脂肪酸的過氧化問題。已知過氧化反應的程度和/或速率受許多因素的影響，包括pH。評價pH對海豹油乳液的過氧化物的影響並且結果示於圖3。結果顯示當乳液的pH為～7或pH＜3時，過氧化反應緩慢。當pH在4-6之間時發生更多的過氧化反應。
基於上述結果，選擇磷酸鹽緩衝劑來控制乳液pH為7。所用的K2HPO4的濃度為2.5mM。在此pH下，發現ζ電勢在35-42mV範圍。雖然較高濃度的磷酸鹽緩衝劑可以增加緩衝能力，但它還會增加溶液的離子強度，從而可以導致ζ電勢的快速降低，這是不期望的。
8.4抗氧化劑和螯合劑對過氧化物的影響圖4顯示了在維生素E(作為抗氧化劑)、EDTA及維生素E/EDTA一起不存在或存在時，海豹油乳液的過氧化結果。結果顯示，EDTA和維生素E都可顯著地降低過氧化反應。EDTA和維生素E的結合非常有效。據報導，卵磷脂(來自蛋或大豆)中存在痕量的過渡金屬離子如Cu2+和Fe3+。已知這些金屬離子對氧化反應是優越的催化劑。據信，諸如EDTA的螯合劑能夠與金屬離子形成絡合物。結果，離子所催化的反應受到抑制。然而，在待輸注至患者血漿中的產品中存在大量的EDTA是不期望的。為找出EDTA在海豹油脂質乳液中的最低有效濃度，測試不同量的EDTA。據發現，當EDTA的濃度高於2×10-6M時，過氧化反應被消除(圖5)。因此，所有海豹油乳液製品選擇這個濃度。維生素E的濃度為0.02％，其與魚油乳液(Omegaven)的數值是相同的。
實施例910％海豹油乳液的表徵9.1.顆粒粒度和ζ電勢均勻的顆粒粒度是乳液的理想特性。已知ζ電勢影響乳液的穩定性。因此，評價採用不同組分和在不同條件下製備的海豹油乳液的顆粒粒度和ζ電勢。
通過顆粒分析儀Delsa 440SX(Beckman Coulter製造，Fullerton，California，USA)，分析按照實施例4製備的10％海豹油乳液的顆粒粒度和ζ電勢，發現結果分別為320±40nm和44.7±15.3mV。乳液的pH通過pH計測定發現是7.5±0.5。
9.2.無菌性試驗通過Health Care Corporation的醫藥微生物實驗室(St.John′s，Newfoundland and Labrador，加拿大)來檢查無菌性。無菌性試驗證明，產品不含任何細菌汙染。表4匯總了不同批次的海豹油和使用這些海豹油產品按照實施例4製備的10％海豹油乳液的無菌性檢查結果。
表4無菌性試驗

9.3.內毒素試驗鱟變形細胞溶解物試驗從Associates of Cape Cod Incorporated(Cape Cod，Massachusetts，USA)購買內毒素標準樣(0.2ng/mL)和LAL試劑盒。將注射用無菌水USP(10mL/vial，Baxter加拿大，Mississauga，Ontario，加拿大)作為負對照。將內毒素標準樣(0.2ng/mL)稀釋至0.1、0.05、0.025和0.0125ng/mL。將實施例4的10％海豹油乳液也稀釋至2、4、8、16和32倍。為進行試驗，將0.1mL的負對照、內毒素標準樣(0.2，0.1，0.05，0.025和0.0125ng/mL)或海豹油乳液及其稀釋樣品添加至0.1mL的LAL試劑盒中。將樣品搖動完全混合。將樣品在37±1℃下保溫1小時並且檢測。通過凝膠的形成來指示內毒素的存在。
體外內毒素試驗(LAL化驗)表明，海豹油乳液是非致熱性的(＜0.006ng/mL或10EU/ng)。
實施例10海豹油、植物油和魚油乳液的化學穩定性比較按照實施例8描述的過程測試10％海豹油乳液(按實施例4所述製備)、可商購獲得的植物油乳液(Intralipi)和可商購獲得的魚油乳液(Omegaven)的化學穩定性(定義為過氧化程度)並且進行比較。結果示於圖6，結果證明海豹油乳液比植物油或魚油乳液都更穩定。Intralipid和Omegaven都是Fresenius-Kabi的商品名稱。
實施例11高壓滅菌處理對海豹油乳液的物理和化學穩定性的影響由於海豹油乳液製劑欲用於靜脈內輸注，因此需要進行高壓滅菌處理，以便滅活細菌和其它病原體。因為海豹油的多不飽和脂肪酸對高溫和壓力不穩定，因而對乳液的高壓滅菌後樣品進行化學和物理穩定性的再檢查是必要的。將五種海豹油乳液製品(各自20mL，海豹油得自不同年齡的海豹並且通過不同技術加工，並且按實施例4所述製備乳液)在121℃的高壓滅菌條件下處理0、10、20、30、60分鐘。檢測樣品的顆粒粒度、ζ電勢和過氧化反應的速率(圖7、8、9和10)。結果說明，在所有樣品中測定的參數沒有顯著變化。根據US藥典，高壓滅菌體積為500mL的可注射製品需要30分鐘。這些實驗中所用的高壓滅菌條件清楚地證明了海豹油乳液製劑的穩定性。
實施例12海豹油和魚油乳液的比較比較按實施例4所述製備的10％海豹油乳液和可商購獲得的魚油乳液(Omegaven)的性能。
表5製劑比較

表6Omegaven和10％海豹油乳液的特徵比較

實施例13急性毒性測試使用SD大鼠並且將大鼠分成兩組，每組三隻動物。在10天的期限內，通過尾部靜脈給動物輸注海豹油或者魚油乳液每天1小時。海豹油或魚油乳液的劑量比Omegaven每日推薦劑量(0.1g/kg/天)高10倍(1g/kg體重/天)。對照組用鹽水溶液處理。10天的輸注之後，將每隻動物殺死並且收集包括腎、心和肝的組織、將這些組織固定並且通過Health Care Corporation的Pathology Lab(St.John′s)進行病理學檢查。腎、肝、GI道和心中的所有組織(對照、飼餵Omegaven和海豹油乳液)都類似，沒有肝沉積脂質。在大鼠模型中沒有觀察到急性毒性。
對本發明進行了描述，顯然同樣的問題可以通過很多方式改變。這些改變不認為是脫離了本發明的實質和範圍，並且所用這些對本領域技術人員而言顯而易見的改進被包括在以下權利要求的範圍內。
權利要求
1.一種脂質乳液，該乳液含有(d)5-40wt％的純化海豹油；(e)0.5-5wt％的乳化劑，和(f)水，其中所述乳液的最終pH為6.0-9.0。
2.根據權利要求1的脂質乳液，還含有2-5wt％的滲透性改進劑。
3.根據權利要求2的脂質乳液，其中所述滲透性改進劑是甘油。
4.根據權利要求1、2或3任一項的脂質乳液，還含有0.002-1.0％的抗氧化劑。
5.根據權利要求1、2、3或4任一項的脂質乳液，還含有1×10-6M至5×10-5M的EDTA。
6.根據權利要求1、2、3、4或5任一項的脂質乳液，其中所述乳化劑是卵磷脂。
7.一種營養組合物，該組合物含有(c)含5-40wt％的純化海豹油、0.5-5wt％的乳化劑和水的脂質乳液，和(d)一種或多種營養化合物，其中所述組合物的最終pH為6.0-9.0。
8.根據權利要求7的營養組合物，還含有2-5wt％的滲透性改進劑。
9.根據權利要求8的營養組合物，其中所述滲透性改進劑是甘油。
10.權利要求7、8或9任一項的營養組合物，還含有0.002-1.0％的抗氧化劑。
11.根據權利要求7、8、9或10任一項的營養組合物，還含有1×10-6M至5×10-5M的EDTA。
12.根據權利要求7、8、9、10或11的營養組合物，其中所述乳化劑是卵磷脂。
13.一種含有權利要求1、2、3、4、5或6任一項的脂質乳液和一種或多種治療性化合物的組合物。
14.一種含有權利要求1、2、3、4、5或6任一項的脂質乳液和一種或多種診斷性化合物的組合物。
15.權利要求1、2、3、4、5或6任一項的脂質乳液用於製備營養組合物的用途。
16.權利要求1、2、3、4、5或6任一項的脂質乳液用於製備治療性組合物的用途，其中所述治療性組合物用於將一種或多種治療性化合物傳遞給需要的患者。
17.權利要求1、2、3、4、5或6任一項的脂質乳液用於製備診斷性組合物的用途，其中所述診斷性組合物用於將一種或多種診斷性化合物傳遞給需要的患者。
18.權利要求1、2、3、4、5或6任一項的脂質乳液在需要的患者的總腸胃外營養中的用途。
19.根據權利要求18的用途，其中配製所述乳液，以與含有植物油的第二種乳液組合施用。
20.權利要求7、8、9、10、11或12任一項的營養組合物在需要的患者的總腸胃外營養中的用途。
21.根據權利要求20的用途，其中配製所述組合物，以與含有植物油的第二種乳液組合施用。
22.權利要求13的組合物用於將一種或多種治療性化合物腸胃外傳遞給需要的患者的用途。
23.權利要求14的組合物用於將一種或多種診斷性化合物腸胃外傳遞給需要的患者的用途。
全文摘要
本發明提供海豹油基脂質乳液，其富含長鏈ω－3脂肪酸。本發明還提供製備乳液的方法和該乳液在臨床各種應用中的用途，包括在總腸胃外營養中的應用。
文檔編號A61K9/00GK1620253SQ02828069
公開日2005年5月25日 申請日期2002年12月23日 優先權日2001年12月27日
發明者劉虎, 王力力, M·卡拉 申請人:創世紀集團公司