利用反義核酸技術和疾病動物模型篩選相關基因的平臺的製作方法
2023-06-14 14:23:21 2
專利名稱：利用反義核酸技術和疾病動物模型篩選相關基因的平臺的製作方法
技術領域：
本發明涉及動物行為學和藥物篩選領域，更具體地，本發明涉及一種利用反義核酸技術和動物模型篩選疾病相關基因的平臺，以及利用該平臺篩選治療藥物的方法。
背景技術：
精神分裂症是世界上十大致殘或使人喪失勞動能力的疾病之一，也是各種精神疾病中患病率最高的一種(Warner R，Girolamo D，成義仁 王克勤(譯).精神分裂症.世界衛生組織，人民衛生出版社，1997)。精神分裂症的病因未明，具有感知、思維、情感、行為等多方面的障礙和精神活動的不協調以及精神活動與環境不協調的症狀(Diagnostic and Statistical and Manual of MentalDisorders，3rd ed.Washington，DCAmerican Psychiatric Association，1987；Alan AB，Glen BB and Mathew TM.Animal Models in Psychiatry I，Humana Press.1991.)。
遺傳學因素已被確認在精神分裂症的發生中起重要作用。目前的研究方法通常是尋找患精神病的家系，然後對該家系中的各個個體的染色體(尤其是連鎖位點)基因測序，從而尋找出在多個病人中共同存在的基因。已有多個課題組基於不同的家系研究報導了染色體上的多個高度連鎖位點(Brown，J.S.，Jr.(2003).″Genetic linkage in schizophrenia.″Am J Psychiatry 160(3)598；authorreply 598-9；Pittelli，S.J.(2003).″Genetic linkage in schizophrenia.″Am J Psychiatry 160(3)597；author reply 598-9；Seidman，L.J.and H.E.Wencel(2003).″Genetically mediated brain abnormalities inschizophrenia.″Curr Psychiatry Rep 5(2)135-44.)。
然而，這種方法具有重大缺陷(a)樣本數目有限，因此無法有效地確定候選基因。有許多所謂的候選基因是錯誤的。(b)雖然可以確定精神病的某些候選基因，但是由於沒有能說明因果關係的實驗證明而無法確認。而且由於生物多樣性的存在，不同家系的研究結果基本上無法相互驗證。因此，目前尚未得到確認的精神病易感性基因。
綜上所述，對於精神病等多種疾病而言，本領域長期缺乏有效地較準確地確定疾病(如精神病)相關基因的方法。因此，本領域迫切需要開發新的快速簡便地確定疾病相關基因的有效方法，從而解決疾病相關基因研究的重大難題。
發明內容
本發明的目的就是提供一種新的篩選和確定疾病相關基因的方法。
在本發明的第一方面，提供了(？？？？待確定了權利要求後，由徐迅補充即可)
圖1顯示了S基因與MK-801的相互作用。其中A.跨格跑動曲線B.異常刻板性動作曲線。各組別如下組別Aicv反義核酸片段/i.p.生理鹽水；組別Bicv錯義核酸片段/i.p.生理鹽水；組別Cicv生理鹽水/i.p.生理鹽水；組別Dicv反義核酸片段/i.p.MK-801；組別Eicv錯義核酸片段/i.p.MK-801；組別Ficv生理鹽水/i.p.MK-801。
圖2顯示了A基因與MK-801的相互作用。其中A.跨格跑動曲線B.異常刻板性動作曲線。各組別如下組別Aicv反義核酸片段/i.p.生理鹽水；組別Bicv錯義核酸片段/i.p.生理鹽水；組別Cicv生理鹽水/i.p.生理鹽水；組別Dicv反義核酸片段/i.p.MK-801；組別Eicv錯義核酸片段/i.p.MK-801；組別Ficv生理鹽水/i.p.MK-801。
圖3顯示了N基因與MK-801的相互作用。其中A.跨格跑動曲線B.異常重複性動作曲線。各組別如下組別Aicv反義核酸片段/i.p.生理鹽水；組別Bicv錯義核酸片段/i.p.生理鹽水；組別Cicv生理鹽水/i.p.生理鹽水；組別Dicv反義核酸片段/i.p.MK-801；組別Eicv錯義核酸片段/i.p.MK-801；組別Ficv生理鹽水/i.p.MK-801。
圖4.N基因與MK-801的相互作用(20-60分鐘內累積的曠場移動行為)。各組別如下組別A(anti-sal)icv反義核酸片段/i.p.生理鹽水；組別B(sal-sal)icv錯義核酸片段/i.p.生理鹽水；組別C(mis-sal)icv生理鹽水/i.p.生理鹽水；組別D(anti-mk)icv反義核酸片段/i.p.MK-801；組別E(sal-mk)icv錯義核酸片段/i.p.MK-801；組別F(mis-mk)icv生理鹽水/i.p.MK-801。
具體實施例方式
本發明的發明人，經過多年廣泛而深入的研究，發現採用藥物誘發的方法，如通過給小鼠腹腔注射N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)非競爭性受體拮抗劑MK801(5-甲基二氫二苯並環庚稀亞氨馬來酸，地卓西平馬來酸鹽)，選擇跨格跑動性(locomotion activity)和異常刻板性動作(stereotypy，也可稱為異常重複性)兩個指標來測量給藥後小鼠類似精神分裂症症狀的表現程度，從而建立類似精神分裂症的小鼠模型，使精神分裂症的症狀得以量化。並且在此基礎上結合反義核酸技術與動物行為學試驗，建立了對功能基因進行篩選的技術平臺，從而用於有效地尋找精神分裂症等疾病的相關基因。
如本文所用，術語「精神病正相關基因」指導致精神病的發病率或症狀上升的基因。在本發明的篩選方法中，當導入精神病正相關基因的反義核酸片段時，會使精神分裂症特徵行為出現頻率和/或幅度的下降。通常，這種變化是與對照相比相差至少20％，較佳地至少30％，更佳地至少50％或更多(如200％)。
如本文所用，術語「精神病負相關基因」指導致精神病的發病率或症狀下降的基因。在本發明的篩選方法中，當導入精神病負相關基因的反義核酸片段時，會使精神分裂症特徵行為出現頻率和/或幅度的上升。通常，這種變化是與對照相比相差至少20％，較佳地至少30％，更佳地至少50％或更多(如200％)。
如本文所用，術語「MK801」是5-甲基二氫二苯並環庚烯亞氨馬來酸(或其鹽，尤其是藥學上可接受的鹽)，它是N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)非競爭性受體拮抗劑，能使小鼠產生類似精神分裂症的症狀。
如本文所用，術語「精神分裂症有效量」指可以引起哺乳動物產生精神分裂症的症狀或行為的劑量。取決於所用的實驗動物，精神分裂症有效量會有所不同。本領域技術人員可以通過實驗確定精神分裂症有效量。對於MK801而言，精神分裂症有效量通常為約0.05-5毫克/千克體重，較佳地約0.1-2.5毫克/千克體重；更佳地約0.15-2毫克/千克體重，最佳地約0.3-1.0毫克/千克體重。
如本文所用，術語「精神分裂症特徵行為」指可以哺乳動物的代表精神分裂症的症狀的行為。代表性的例子包括(但並不限於)跨格跑動性加快，以及刻板性動作(stereotypy)的出現和增加，例如小範圍的原地轉圈、大幅度的搖頭、原地打滾等。
以篩選進一步相關基因為例，在本發明方法中首先是製備精神分裂症模型動物，即將精神分裂症有效量的N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)非競爭性受體拮抗劑如MK801施用於哺乳動物。施用方法沒有特別限制，優選的方法包括(但並不限於)腹腔注射，皮下注射等。
適用於本發明的動物可以是哺乳動物，例如齧齒動物、靈長動物等，較佳的動物是嚙齒類動物，更佳的動物是小鼠、大鼠。
在優選例中，將待研究基因的反義核酸片段注射到疾病模型動物的腦中的特定部位，利用反義核酸與相應基因mRNA的結合作用，抑制相應蛋白的表達。通過觀察疾病模型動物在行為方面的變化，確定所述基因的功能以及是否與該疾病相關。
在本發明方法中，首先是提供感興趣基因的反義核酸序列。所述的感興趣的基因可以是任何已知的可能與該疾病有關的基因，也可以是現在未知功能但將來可能發現的任何基因。
用於本發明的這些反義核酸序列可以用人工合成的方法製備。
在本發明中，對於反義核酸片段的的長度沒有特別的限制，但通常反義核酸片段的長度為10-100bp，較佳地為15-50bp，更佳地為20-25bp。所用的反義核酸片段可以是一種或多種反義核酸片段，如果使用多種反義核酸片段，各反義核酸片段之間可以不存在重迭區域，也可存在重迭區域。
反義核酸片段所對應的區域通常是所選取基因cDNA序列的翻譯起始區或其它區域。
在本發明中，為了更好地進行比較，宜設置了用於比較的對照組動物，包括陽性對照和陰性對照。通常，對照動物的例子包括注射了生理鹽水的動物、注射了MK801的動物、僅注射了候選基因的反義核酸片段的動物、以及同時注射了MK801和候選基因的錯義核酸片段(或已知基因的錯義核酸片段)或生理鹽水的動物。
可用於本發明的動物行為包括任何可以反映動物精神分裂症症狀的行為。應理解，對於不同的實驗動物，所選用的動物行為可有所不同。例如，對於小鼠而言，代表性的動物行為包括(但並不限於)跨格跑動性(locomotion activity)和異常刻板性動作(stereotypy)等。
本發明人在構建了上述精神分裂症相關基因篩選平臺的基礎上，對已知基因或未知基因進行了驗證或篩選，結果極其快速(從現有技術中的數年縮短為數周甚至數天)、簡便、有效地獲得了令人滿意的結果。本發明方法為從整體動物水平進行疾病相關基因的篩選研究提供了一個新的技術平臺，可適用於較大規模的精神分裂症相關基因及藥物的篩選工作，並為進一步進行細胞及分子水平的研究提供依據和佐證。
與現有技術相比，本發明方法的主要優點在於可非常快速、簡便、有效、準確地確定疾病相關基因。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照製造廠商所建議的條件進行。
實施例材料與方法1材料1.1試劑和溶液的配製地卓西平馬來酸鹽(即MK801)，溶解於含0.9％NaCl的生理鹽水中，用逐步稀釋法配製各個劑量的溶液。反義核酸(Antisense)及錯義核酸(missense)均由上海生工公司合成，具體序列如下
1.2實驗動物 近交系BALB/c小鼠，均為雄性，體重(20±2g)，SPF級，購自中國科學院上海生命科學研究院實驗動物中心。實驗動物生產許可證號SCXK(滬)2002-0010。
1.3儀器 曠場行為紅外線檢測系統(Flex Field System)，美國San DiegoInstruments公司產品；松下攝像系統；Hamilton微量注射器(250μl)等。
1.4統計學分析 將實驗組的行為學數據與對照組比較，並以t檢驗法進行生物學統計分析(Pittelli，S.J.(2003).″Genetic linkage inschizophrenia.″Am J Psychiatry 160(3)597；598-9.)。
2方法在本實驗室以前工作的基礎上挑選出5個與跨格跑動(locomotion)相關的神經系統表達的基因，針對每個基因，設立3個實驗組，分別為側腦室注射反義核酸片段，錯義核酸片段及生理鹽水組，每組內又分為腹腔注射生理鹽水及腹腔注射MK-801 0.6mg/kg實驗小組，每小組10隻BALB/c小鼠。具體步驟如下2.1連續三天在固定的同一時間進行側腦室內微量注射(按金玫蕾，莫蘊等篩選神經系統基因功能的行為學檢測平臺的探索。生理學報，Aug，2001，53(4)247-251中所述的方法)。
2.2第四天開始行為學檢測前，進行MK-801或生理鹽水的腹腔注射(按以下文獻中所述的方法吳金華，鄒洪等用不同品系建立精神分裂症動物模型的研究。生理學報，August 25，2003，55(4)381-387)。
2.3將小鼠放入曠場行為紅外線檢測系統進行觀察(按以下文獻中所述的方法吳金華，鄒洪等用不同品系建立精神分裂症動物模型的研究。生理學報，August 25，2003，55(4)381-387)。
2.4觀看記錄小鼠給藥後2小時效應的錄象帶，人工統計小鼠的異常刻板性動作行為，每10分鐘觀看前2分鐘的異常刻板性動作數據，用秒表記錄異常刻板性動作的時間。
2.5對實驗結果進行分析，評定小鼠異常刻板性動作(也稱為異常重複性動作)按以下文獻中所述的方法吳金華，鄒洪等用不同品系建立精神分裂症動物模型的研究。生理學報，August 25，2003，55(4)381-387)，得出跨格跑動性和異常刻板性動作的曲線圖。
3結果從研究組以往篩選的功能基因中挑選5個可能與運動相關的功能基因進行篩選實驗，圖1至圖3分別為其中3個基因的反義核酸片段與MK-801相互作用的結果，代表著三種不同的情況。
由圖1.A可見，對於S基因，雖然在腹腔注射生理鹽水實驗中反義核酸片段組與兩對照組之間具有顯著差異，令小鼠的跨格跑動性顯著下降，但在腹腔注射MK-801實驗中差異卻並不顯著。而圖1.B顯示在腹腔注射MK-801實驗中，反義核酸片段實驗組小鼠的異常刻板性動作(stereotypy)高於兩對照組。
圖2的A基因的反義核酸片段對小鼠的跨格跑動性及異常刻板性動作兩方面均無顯著影響。
圖3中的N基因的反義核酸片段組在腹腔注射生理鹽水實驗中與兩對照組無顯著差異，但在腹腔注射MK-801實驗中卻差異顯著，可使小鼠的跨格跑動性顯著下降(圖4)，使小鼠的異常刻板性動作顯著增高。
4.討論a)N基因的反義核酸片段對正常小鼠無顯著的影響，卻能造成模型小鼠原本的移動加快(hyperlocomotion)下降，且實驗組與對照組之間表現出顯著性差異，表明該基因與MK-801的作用有所關聯。尤其在藥物作用後的20-60min間(圖4)，T-test結果顯示反義核酸片段組的跨格跑動性數據顯著低於錯義核酸片段對照組和生理鹽水對照組。而統計的異常刻板性動作數據表明反義核酸片段組的異常刻板性動作行為均高於兩對照組，說明N基因的反義核酸片段還能影響模型小鼠的異常刻板性動作現象。這些結果提示N基因可能與精神分裂症相關，其間的確切關係尚需進一步探究。
b)S基因的反義核酸片段能使正常小鼠的跨格跑動性顯著下降，但對模型小鼠的跨格跑動性影響不大；然而它能造成模型小鼠的異常刻板性動作增多，且實驗組與對照組之間表現出顯著性差異，表明該基因也可能與MK-801的作用有部分關聯。
c)上述結果提示將側腦室注射反義核酸的技術與MK801誘導的精神分裂症小鼠模型相結合，可以作為一個新的技術平臺用於篩選與精神分裂症相關的基因。儘管最後的結論還需進一步用神經生物學的很多研究手段加以證明，但這一新技術平臺無疑為從浩如煙海的大量功能基因中初步找出相關的疾病基因提供了高通量、高效率篩選的可能。這種方法即將反義核酸技術應用於疾病動物模型，也可擴展應用於篩選其他人類疾病相關基因的研究之中，成為從整體動物學水平尋找疾病相關基因以及功能基因的一種新技術。
d)上述結果中對模型小鼠影響不顯著的基因可能與MK-801的作用無關聯，但隨著這一疾病模型檢測指標的進一步完善，也可能會在其他方面如痛覺，學習記憶等有所表現，有待於今後的實驗來證明。然而，用反義核酸來幹擾和暫時阻斷特定基因的表達，始終不失為一種有用的篩選功能基因和疾病相關基因的方法。
e)模型小鼠的跨格跑動性和異常刻板性動作之間往往呈一定的負相關關係，只有選取更典型的MK-801濃度區段，這兩種現象才能分別表現得更充分。這一點在今後的研究中應加以充分的考慮。
本發明的精神分裂症相關基因篩選平臺，可用於篩選其他疾病的相關基因，相關新藥以及開發其他治療方法。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表110上海中科伍佰豪生物工程有限公司120利用反義核酸技術和疾病動物模型篩選相關基因的平臺1300421961606170PatentIn version 3.1210121120212DNA213人工序列220
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權利要求
1.一種篩選候選基因是否是精神病相關基因的方法，其特徵在於，包括步驟(a)將候選基因的反義核酸片段與5-甲基二氫二苯並環庚烯亞氨馬來酸或其鹽一起施用於哺乳動物；(b)觀察哺乳動物的精神分裂症特徵行為，其中，精神分裂症特徵行為出現頻率和/或幅度的下降就表示該候選基因是精神病正相關基因；精神分裂症特徵行為出現頻率和/或幅度的上升就表示該候選基因是精神病負相關基因。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的精神分裂症特徵行為包括跨格跑動性和異常刻板性動作。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(a)中，包括先將5-甲基二氫二苯並環庚烯亞氨馬來酸或其鹽施用於哺乳動物，然後將候選基因的反義核酸片段施用於哺乳動物。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(a)中，5-甲基二氫二苯並環庚烯亞氨馬來酸或其鹽的施用量為0.05-5毫克/千克體重。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述動物是小鼠或大鼠。
6.如權利要求1所述方法，其特徵在於，所述的5-甲基二氫二苯並環庚烯亞氨馬來酸或其鹽以精神分裂症有效量施用。
7.如權利要求6所述方法，其特徵在於，所述的精神分裂症有效量為0.05-5毫克/千克體重。
8.如權利要求6所述方法，其特徵在於，所述的精神分裂症有效量為0.1-2.5毫克/千克體重。
9.如權利要求6所述方法，其特徵在於，所述的精神分裂症有效量為0.15-2毫克/千克體重。
10.一種基因的反義核酸片段的用途，其特徵在於，用於施用於精神分裂症動物模型，從而確定所述基因是否與精神分裂症有關。
全文摘要
本發明提供了一種將精神分裂症症狀的小鼠模型結合反義核酸技術與動物行為學試驗，從而對精神分裂症相關基因進行篩選的技術平臺，以及利用該平臺研究精神病等疾病相關基因功能和治療藥物的方法。與現有技術相比，本發明方法可在整體動物水平上非常快速、簡便、有效、準確地確定疾病相關基因。
文檔編號A61K49/00GK1680590SQ20041001750
公開日2005年10月12日 申請日期2004年4月7日 優先權日2004年4月7日
發明者金玫蕾, 丁澄, 鄒洪, 周雪東, 謝青蓮, 趙國屏, 於雷 申請人:上海中科伍佰豪生物工程有限公司