一種檢測尖孢鐮刀菌的pcr方法及試劑盒的製作方法

2023-06-14 09:57:21 3

專利名稱：一種檢測尖孢鐮刀菌的pcr方法及試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及農作物病害診斷與防治技術，特別是一種檢測尖孢鐮刀菌的PCR方法 及試劑盒。
背景技術：
尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)主要在土壤裡越冬(夏)，且在土壤裡存活時 間較長，一般是通過土壤、肥料、灌溉水等進行傳播，以侵染危害植株地下部位的根莖為主， 且能侵染植物的維管束，病原物在維管束裡繁殖，阻塞其輸送營養物質，在短期內致使整株 植物枯萎而死亡。尖孢鐮刀菌可嚴重危害瓜類、茄科類、豆科蔬菜及草莓等經濟作物，主要引起根 腐、莖腐、果腐等，有的侵染植物維管束組織引起萎蔫症。病原菌以菌絲體、厚垣孢子在土壤 中越冬，且在土壤中可以腐生。厚垣孢子在土壤中能生存5 10年。尤其在保護地農作物種植栽培過程中，尖孢鐮刀菌引致的土傳病害的發生越來越 嚴重。因其發生具有隱蔽性，大多在結果期才達到發病的高峰期，因此損失巨大。嚴重影響 了保護地的發展與人民的經濟收入。傳統鑑定方法通常採用選擇性培養基進行病原菌的分離培養，菌落形態觀察，顯 微鏡下觀察病菌的菌絲體，孢子等特徵，結合田間發病植株症狀的觀察進行分類。傳統鑑定 方法在很多方面存在一定誤差和困難，尤其是對土傳病原菌的準確鑑定具有很大局限性。 僅菌絲體和孢子等的形態特徵也即表型分析來鑑別，有時是不準確的。同一病原菌的菌落 往往在形態上、分布、生理性狀等方面存在一定差異，難以進行準確鑑定。隨著分子生物學 技術的日益成熟和廣泛應用，人們有可能避開傳統的分離培養過程，通過DNA水平上的研 究，對土壤中病原菌進行鑑定。分子生物學方法的簡便、快速、高效、可靠等特點，是傳統的 分離培養方法所達不到的。定量PCR是在PCR定性技術基礎上發展起來的核酸定量技術。實時螢光定量PCR 技術(real-time fluorescent quantitative PCR， FQ-PCR)是一種在 PCR 反應體系中力口 入螢光基團，利用螢光信號的積累實時監測整個PCR進程，通過擴增產物熔解曲線分析可 以特異地檢測和鑑定某種病原真菌，通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。該技 術不僅實現了對DNA模板的定量，而且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強、能實現多重反 應、自動化程度高、無汙染性、具實時性和準確性等特點，目前已廣泛應用於分子生物學研 究和醫學研究等領域，但在農業植物病原真菌的定性定量檢測研究中應用較少，尤其是在 尖孢鐮刀菌的定性定量研究中。

發明內容
本發明根據上述領域的不足，提供一種採用PCR檢測尖孢鐮刀菌的方法和試劑 盒，能夠提高了檢測的準確性，節約了檢測時間，試劑盒可以在植物病害診斷與防治領域大 規模推廣。
一種檢測尖孢鐮刀菌的PCR方法，包括如下步驟(1)預製 PCR 體系，(2)在預製好的PCR體系中加入模板得到PCR反應體系，(3)進行PCR擴增反應；其特徵在於，所述PCR反應體系中的引物的序列信息如下Fol :5，-CGTCATTTCAACCCTCAAGCA-3，Fo2 5 』 -ATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAT-3』。所述PCR 反應體系為10 X PCR buffer 2 μ L, 15mM MgCl2 0. 5μ L,2. 5mM dNTPs 1. 6 μ L，5 μ M引物各0· 5 μ L，Taq酶1U，DNA模板1 μ L，其餘為滅菌雙蒸水，終體積為20 μ L0所述PCR擴增反應的程序為94°C預變性3min ；94°C變性lmin，65°C退火lmin， 72°C延伸lmin，共30個循環；最後72°C延伸IOmin0所述PCR方法為螢光定量PCR方法。所述PCR反應體系為反應總體積為20 μ L, SYBR Green Supermix 10 μ L，10 μ M/L 的 Fol 1 μ L，10 μ M/ L的Fo21 μ L，模板11 μ L，餘量為無菌雙蒸水。所述PCR擴增反應的程序如下第一步95. OO0C 3分鐘，1個循環；第二步95.O0C 45 秒，65. 0°C 45 秒，55. 0°C 1 分鐘，45 個循環；第三步55. O0C 10分鐘，95. 0°C 1分鐘，1個循環；第四步55.0°C 1分鐘；第五步55. O0C 10秒，80個循環。一種檢測尖孢鐮刀菌的PCR方法的試劑盒，其特徵在於包含有具有如下序列信息 的引物Fol :5，-CGTCATTTCAACCCTCAAGCA-3，Fo2 :5』 -ATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAT-3，。還包括螢光定量PCR所需的螢光染料。本發明根據本研究克隆測序的尖孢鐮刀菌ITS區序列如Seq ID No. 1所示，設計 出特異性引物Fol/Fo2，採用該引物的PCR檢測方法具有極好的特異性和靈敏性，經特異性 試驗證明，如圖1能夠將尖孢鐮刀菌與其它近緣菌區分開。靈敏性實驗結果表明，如圖2，可 檢測尖孢鐮刀菌DNA濃度低至0. Ing/mL。由於PCR方法操作簡便快捷，基於對核苷酸的檢 測，不受培養條件限制。本發明的方法，其特有靈敏度和特異性能夠實現對發病植物組織中 及土壤中的尖孢鐮刀菌的快速檢測定量，實現防治的目的，操作簡便快捷，基於對核苷酸的 檢測，不受培養條件限制。本發明優選採用實時定量PCR方法，定量檢測，能真實反映尖孢鐮刀菌定殖和侵 染的情況；可同時進行高通量的樣本檢測。並且對實時定量PCR方法的體系和PCR程序進 行了優化，使檢測靈敏度和準確性明顯提高，對尖孢鐮刀菌的精確檢測可達到8個孢子，如 圖3、4、5所示。本發明還提供一種檢測尖孢鐮刀菌的試劑盒，可對植物組織及土壤中的尖孢鐮刀 菌進行快速檢測和定量。可對尖孢鐮刀菌進行快速定量檢測，可以替代一直沿用的分離培養的傳統鑑定方法，並適於在植物病害診斷及防治領域廣泛推廣應用，實用性強，可滿足植 物病害診斷及監測的需要。


圖1為特異性檢測引物對Fol/Fo2對尖孢鐮刀菌及其近緣種、屬真菌的PCR擴增結果。1-9號為引物對Fol/Fo2擴增8種病原菌結果1.無 DNA 對照 2.尖孢鐮刀菌(Fusarium oxsporum) 3.串珠鐮刀菌(Fusarium moniforme)4.禾穀鍵刀菌(Fusarium graminearum)5.燕麥鍵刀菌(Fusarium avenaceum) 6.腐皮鍵刀菌(Fusarium solani) 7.大_輪枝菌(Verticillium dahliae) 8. 辣椒疫霄(Phytophthora capsici)9.番灰霄(Botrytis cinerea)M :100bp Marker圖2為尖孢鐮刀菌特異引物Fol/Fo2的靈敏度檢測結果。1-6號為尖孢鐮刀菌DNA模板濃度從高至低系列稀釋(1 μ g/mL-10pg/mL) 7.無 DNA 模板對照 M. DL 2000Markero圖3為標準樣品和未知樣品的尖孢鐮刀菌螢光定量PCR擴增曲線圖(y軸螢光吸收率；χ軸循環數)。圖4為標準樣品和未知樣品的尖孢鐮刀菌螢光定量PCR熔解曲線圖，圖示熔解溫 度為88°Co圖5為標準樣品和未知樣品的尖孢鐮刀菌螢光定量PCR標準曲線圖。未知樣品1.病根(有明顯症狀，2. 16X106個孢子)，2.病根(有明顯症狀， 2. 12 X IO5個孢子)，3.病莖(有症狀，2. 04 X IO3個孢子)，4.莖(無症狀，82個孢子)，5.病 土(5g 土壤，8個孢子)；標準樣品尖孢鐮刀菌孢子數系列稀釋(2. 16X107-2. 16 X IO3個孢子)。
具體實施例方式本發明所採用的微生物均在現有文獻中記載過，本實驗室也有保存，可向公眾發 放用於驗證試驗。實施例1尖孢鐮刀菌ITS區的克隆、測序1)尖孢鐮刀菌DNA製備採用平板培養尖孢鐮刀菌(Fusarium oxsporum)，置於30°C的培養箱內，生長一周 左右，用滅菌的解剖針刮取菌絲體，收集於EP管內，-20°C保存備用。採用液氮研磨菌絲體， 常規CTAB法提取各菌株DNA。2)尖孢鐮刀菌ITS區的擴增採用真菌rDNA ITS 擴增的通用引物 ITS1/ITS4 (White，T.J.，Bruns, Τ.，Lee, S. ， et al. ， Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenies. Innis MA, Glefand D H, Sninsky JJ, et al. a Guide to Methods and Applications. San Diego =AcademicPress, New York, 1990,315 322.)擴增尖孢鐮刀菌 的ITS區。PCR反應體系見表1。
表IPCR反應體系
權利要求
一種檢測尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)的PCR方法，包括如下步驟(1)配製PCR反應體系，(2)在配製好的PCR反應體系中加入待測模板，(3)進行PCR擴增反應；其特徵在於，所述PCR反應體系中的引物的序列信息如下Fo15』 CGTCATTTCAACCCTCAAGCA 3』Fo25』 ATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAT 3』。
2.根據權利要求1所述的PCR方法，所述PCR反應體系為10XPCR buffer 2yL,15mM MgCl2O. 5 μ L, 2. 5mM dNTPs 1· 6 μ L，5 μ M 弓丨物各 0. 5 μ L，Taq 酶 IU，DNA 模板 1 μ L，其餘為 滅菌雙蒸水，終體積為20 μ L。
3.根據權利要求2所述的PCR方法，所述PCR擴增反應的程序為94°C預變性3min; 94°C變性lmin，65°C退火lmin，72°C延伸lmin，共30個循環；最後72°C延伸lOmin。
4.根據權利要求1所述的PCR方法，所述PCR為螢光定量PCR。
5.根據權利要求4所述的PCR方法，所述PCR反應體系為反應總體積為 20 μ L, SYBR Green Supermix 10 μ L，10 μ M/L 的 Foil μ L，10 μ M/L 的 Fo21yL，模板11 μ L，餘量為無菌雙蒸水。
6.根據權利要求5所述的螢光定量PCR方法，所述PCR擴增反應的程序如下 第一步95. OO0C 3分鐘，1個循環；第二步95. O0C 45 秒，65. 0°C 45 秒，55. 0°C 1 分鐘，45 個循環；第三步55. O0C 10分鐘，95. O0C 1分鐘，1個循環第四步55. O0C 1分鐘第五步55. O0C 10秒，80個循環。
7.—種檢測尖孢鐮刀菌的PCR試劑盒，其特徵在於包含有具有如下序列信息的引物 Fol :5』 -CGTCATTTCAACCCTCAAGCA-3』Fo2 :5』 -ATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAT-3，。
8.根據權利要求7所述的PCR試劑盒，還包括螢光定量PCR所需的螢光染料。
全文摘要
本發明「一種檢測尖孢鐮刀菌的PCR方法及試劑盒」，屬於農作物病害診斷與防治技術。包括如下步驟(1)配製PCR反應體系，(2)在配製好的PCR反應體系中加入待測模板，(3)進行PCR擴增反應；其特徵在於，所述PCR反應體系中的引物的序列信息如下Fo15』-CGTCATTTCAACCCTCAAGCA-3』；Fo25』-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAT-3』。能夠提高了檢測的準確性，節約了檢測時間，試劑盒可以在植物病害診斷與防治領域大規模推廣。
文檔編號C12Q1/06GK101974650SQ20101056780
公開日2011年2月16日 申請日期2010年11月30日 優先權日2010年11月30日
發明者吳篆芳, 崔瑞, 曹坳程, 李園, 趙海濱, 郭美霞 申請人:中國農業科學院植物保護研究所