低電壓瞬時電脈衝構建小球藻生物反應器的方法

2023-06-21 22:12:11 1

專利名稱：低電壓瞬時電脈衝構建小球藻生物反應器的方法
技術領域：
本發明涉及一種低電壓瞬時電脈衝構建小球藻生物反應器的方法。它是一種條件溫和，低成本，便捷的使外源基因安全地進入小球藻細胞的新方法。在生物技術領域可以建立小球藻生物反應器，對於生產高附加值產品，特別是來源緊俏的基因工程產品具有廣泛應用前景。
背景技術：
橢圓小球藻(Chlorella ellipsoidea)為綠藻門小球藻屬單細胞真核藻類，是一種重要的綠色微藻資源。在具有體積小，繁殖迅速，易於培養等特點的同時還含有葉綠素 a、葉綠素b、葉黃素和胡蘿蔔素，能夠利用光能進行光合作用，培養成本低廉。小球藻是一種優質的蛋白質資源，被聯合國糧食及農業組織(FAO)列為二十一世紀人類的綠色營養源健康食品。小球藻具有真正的細胞核，對於一些需要大量生產而又對原核表達生物有害的物質或表達需要翻譯修飾的複雜蛋白，可利用小球藻生物反應器來生產。小球藻不含內毒素，利用轉基因技術將小球藻改造成新型高效的生物反應器，對於生產高價值產品，特別是來源緊俏的醫藥產品具有廣泛應用前景。Maruyama認為在高場強及長時間的電脈衝持續期，小球藻細胞可得到高的通透性，吸納外源DNA的能力較強。Maruyama等以小球藻(C. saccharophila)為受體，採用高壓電擊法，在600-900V電場強度，400ms脈衝持續時間的條件下，將質粒pBI221導入藻細胞 (Maruyama M et al.，1994)。王逸雲等在5000V脈衝電壓，50ms脈衝持續時間，脈衝次數為 211次，循環次數為90次的高強度電場力條件下，將質粒pBI121/phyA II轉入藻細胞(王逸雲，200 。張小宇等在6000-9000V脈衝電壓，20-50ms脈衝持續時間，脈衝次數為21°條件下，將兔防禦素基因NP-I轉入藻細胞，獲得了穩定表達外源蛋白質的小球藻生物反應器 (張小宇，2006)。雖然以上報導成功地將外源基因轉入小球藻，但是他們的方法均存在著缺點與不足。首先，高強度或長時間持續電脈衝損傷小球藻細胞；其次，實現上述高電壓及長時間脈衝刺激等實驗條件，必需具有高性能的電轉化儀和基因槍等價格昂貴的設備，增加了實驗成本。因此，尋找一種比較溫和、低成本、便捷的使外源基因安全地轉入小球藻細胞的新方
法非常有必要。

發明內容
本發明的目的在於提供了一種低電壓瞬時電脈衝構建小球藻生物反應器的方法。 本發明首先獲得了具有高通透性細胞壁的活體小球藻，利用低電壓及瞬時電脈衝的條件， 將基因載體及外源基因導入活體小球藻，避免了轉化藻體時高強度電壓或長時間電脈衝對小球藻的損傷，從而使外源基因平穩地進入小球藻細胞，建立小球藻生物反應器。本發明利用較溫和的低電壓瞬時電脈衝電擊轉化法成功地構建了小球藻生物反應器。本發明提供的小球藻生物反應器的構建方法包括的步驟如下
1)取處於對數生長期的小球藻，以5%的接種量接種於Knop液體培養基中，25°C 下靜置培養，光照條件3000 40001χ，每4h搖動一次，連續照明，培養2d ；Knop 液體培養基(pH 7. 0)葡萄糖 3g ；酵母粉 3g ；KH2PO4O. 025g ；Ca (NO3)2O. Ig ； MgSO4O. 025g ；KCl 0. 012g ；FeCl3O. OOlg ；dH20 1 L。取上述培養液1ml，離心收集小球藻細胞，重懸於Iml MBBM培養基中，置於光照培養箱中培養，3000 40001x，25°C下靜置培養Mh ；MBBM 培養基(pH 7.0) 0. 5g NH4Cl，0.075g MgSO4,0. 17g KH2PO4,0. 075g K2HPO4, 0. 025g CaCl2,0. 025g NaCl，0. 05g 酵母粉，ImL A6 混合液，7. 5g 2-脫氧-D-葡萄糖，3. 75g 葡萄糖，用 dH20定容到 1L。A6混合液0. 28g H3BO3,0. 25g MnSO4 ·7Η20，0· 0222gZnS04 ·7Η20， 0. 0079g CuSO4 · 5Η20，0· 0021g Na2MoO4 · 2H20, IOOmL dH20。離心收集藻細胞，加入含有4% (ff/V)纖維素酶的高滲PBS緩衝液Iml {pH 6. 0， 0. 025mol/L 磷酸緩衝液(由 0. 2mo VLNaH2PO4 ·2Η20 和 0. 2mo 1/LNa2HPO4 · 2Η20 配置而成)， 含有0. 3mol/L山梨醇/甘露醇}重懸細胞，30°C下，80r/min搖床，黑暗酶解4h，進行處理。分別取實驗處理前後的小球藻液，離心收集小球藻細胞，重懸於相同體積的低滲溶液(ddH20)中，放置30min，分別計數。結果為處理前細胞數量為3. 0750X IO7個/ml，處理後為2. 0913X IO7個/ml，細胞的崩解數量為9. 8370X IO6個/ml，崩解率達到34. 3%，說明本發明的小球藻細胞具有高通透性。2)取步驟1)處理後的小球藻液30 μ l,8000rpm離心5min，用30 μ 1 Hepes Buffer (lmol/L NaCl,0. Olmol/L KC1,0. Olmol/L CaCl2,0. 02mol/L H印es，0. 2mol/L 甘露醇，0. 2mol/L山梨醇)重懸細胞沉澱，加入2 μ 1(76. 5ng/y 1)攜帶ble基因的質粒pSPlMS DNA。電擊轉化小球藻，脈衝電壓為500V，脈衝持續時間1. 2ms ；同時做的陰性對照不加質粒 PSP124S DNA。3)電擊之後，將藻體於冰上預冷6min，加入Iml高滲Knop培養基(含0. 5mol/L 蔗糖的Knop液體培養基)，25°C下，光照條件3000 40001x溫和培養Mh，加至ImL Knop 半固體培養基(額外加入0. 5mol/L蔗糖，Zeocin)中，混合均勻，塗布於Knop固體培養基(額外加入0.5mol/L蔗糖，10yg/mL Zeocin)上，置於25°C培養箱中，光照條件 3000 40001x靜置培養。挑取單藻落接種於含有4 μ g/mL Zeocin的Knop液體培養基中，置於25°C培養箱中，光照條件3000 40001x，靜置培養。培養物為小球藻生物反應器。對照組沒有藻落出現。同時接種於不含kocin的Knop固體培養基上的對照組有藻落出現。本發明克服了已有技術的缺點與不足，利用較溫和的低電壓瞬時電脈衝電擊轉化法成功地構建了小球藻生物反應器。首先獲得了具有高通透性細胞壁的活體小球藻，利用低電壓及瞬時電脈衝的條件，將基因載體及外源基因導入活體小球藻，避免了轉化藻體時高強度電壓或長時間電脈衝對小球藻的損傷，從而使外源基因平穩地進入小球藻細胞，建立小球藻生物反應器。


圖1第3至第10次轉接培養的轉基因小球藻生長狀況。圖2質粒pSP124S所載的ble基因。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步的說明，實施例僅為解釋性的，決不意味著它以任何方式限制本發明的範圍。1)藻種小球藻(Chlorella ellipsoidea)藻種由天津師範大學微生物實驗室篩選並保存並可公開出售。2)ble基因載體pSP124S質粒的構建設計引物ρ 1 為 GTATCGATGGCCAAGcTGACCAGcGCCG ；設計引物p2 為 TTGGTCGaCGTCGGTtAGTCC ；以質粒pUT430 (Drocourt et. al.，1990) DNA為模板，以PCR (聚合酶鏈式反應)的方法擴增 ble 基因，PCR 的條件是95°C變性 5min ；95°C, 40sec, 56°C, 40sec, 72°C, 40sec, 30個循環；72°C延伸lOmin。獲得395bp的PCR產物。用內切酶Msc I和Ml I分別酶切處理 PCR 產物和 pSP105 Gtevens et. al.，1996) DNA，以 DNA 連接酶將 ble 基因重組到 pSPlOOTNA 上。並利用內切酶BamH I和Nco I在_173 (相對於轉錄起始)的位置到翻譯起始，插入一個 RBCS2啟動子。以內切酶Mel和KpnI雙酶切處理以上構建產物獲得含有ble基因的1. 2kb 大小的DNA片段；同時以內切酶&icl和KpnI雙酶切處理pBluescript SK(Stratagene)質粒DNA。利用DNA連接酶將ble基因重組到質粒pBluescript SK(Stratagene)上。重組質粒命名為？3 1對5，含kocin抗性基因ble，見圖2。3)步驟(1)提高小球藻細胞壁通透性取處於對數生長期的小球藻，以5%的接種量接於Knop液體培養基中，25°C下靜置培養，光照條件3000 40001x，每4h搖動一次，連續照明，培養2d ；分別取Iml藻液至 1. 5ml離心管中，SOOOrpm離心5min，棄上清液收集藻細胞，設置3組實驗①1組實驗，於細胞沉澱中加入 Iml MBBM 液體培養基(0. 5g NH4CIjO. 075g MgSO4,0. 17gKH2P04,0 . 0 7 5g K2HPO4,0. 025g CaCl2,0. 025g NaCl，0. 05g 酵母粉，ImL A6 混合液，7. 5g2DG，3. 75g 葡萄糖， 用 dH20定容到 lL，pH 7. 0。A6 混合液0. 28g H3BO3,0. 25gMnS04 ·7Η20，0· 0222g ZnSO4 ·7Η20， 0. 0079g CuSO4 · 5Η20，0· 0021g Na2MoO4 · 2H20, IOOmLdH2O)；② 2 組實驗，於細胞沉澱中加入 Iml Knop液體培養基；③3組實驗，於細胞沉澱中加入Iml MBBM液體培養基(0. 5g NH4Cl, 0. 075g MgSO4,0. 17g KH2PO4,0. 075gK2HP04,0 . 0 2 5g CaCl2,0. 025g NaCl，0. 05g 酵母粉，ImL A6 混合液，7. 5g 2DG，3. 75g 葡萄糖，用 dH20 定容到 1L，pH 7. 0。A6 混合液0. 28g H3BO3, 0. 25g MnSO4 · 7Η20，0· 0222gZnS04 · 7Η20，0· 0079g CuSO4 · 5H20，0. 0021g Na2MoO4 『 2H20, IOOmL dH20.)。置於光照培養箱中培養，3000 40001x，25°C下靜置培養Mh ；8000rpm離心5min，收集藻細胞，①1組實驗，加入Iml含有4% (W/V)纖維素酶的高滲 PBS 緩衝液{pH 6. 0,0. 025mol/L 磷酸緩衝液(由 0. 2mol/L NaH2PO4 ·2Η20 和 0. 2mol/ LNa2HPO4 ·2Η20配置而成)，含有0. 3mol/L山梨醇/甘露醇}；②2組實驗，加入Iml含有4% (W/V)纖維素酶的 PBS 緩衝液{pH 6. 0,0. 025mol/L 磷酸緩衝液(由 0. 2moVLNaH2PO4 ·2Η20 和0. 2mol/L Na2HPO4 ·2Η20配置而成)，含有0. 3mol/L山梨醇和0. 3mol/L甘露醇}；③3組實驗，加入Iml不含纖維素酶的PBS緩衝液{pH 6. 0,0. 025mol/L磷酸緩衝液(由0. 2mol/ L NaH2PO4 · 2H20 和 0. 2mol/L Na2HPO4 · 2H20 配置而成)，含有 0. 3mol/L 山梨醇 / 甘露醇}。 分別混合均勻。置於30°C的恆溫振蕩器中，轉速80r/min，黑暗酶解4h。
分別取上述實驗處理前後的小球藻液，離心，8000rpm，5min，收集小球藻細胞，分別重懸於相同體積的高滲溶液(0. 2mol/L甘露醇，0. 2mol/L山梨醇)和低滲溶液(ddH20) 中，靜置30min後，分別用血球計數板計數小球藻細胞數量，並以Spss軟體統計分析計數結果。見表1、2、3。表11組實驗中不同緩衝溶液中酶解前後小球藻細胞數量(X IO7個/ml)
權利要求
1.一種低電壓瞬時電脈衝構建小球藻生物反應器的方法，其特徵在於包括以下步驟1)取處於對數生長期的小球藻，以5%的接種量接種於Knop液體培養基中，25°C下靜置培養，光照條件3000 40001χ，每4h搖動一次，連續照明，培養2d ；取上述培養液，離心收集小球藻細胞，重懸於MBBM培養基中，置於光照培養箱中培養， 3000 40001x，25°C下靜置培養Mh ；將培養後的小球藻細胞，加入含有4% (W/V)纖維素酶的PH 6. 0的並含有0. 3mol/L山梨醇/甘露醇高滲PBS緩衝液中重懸細胞，30°C下，80r/ min搖床，黑暗酶解4h，進行處理；2)取步驟1)處理後的小球藻液，8000rpm離心5min，用H印esBuffer重懸細胞沉澱， 加入攜帶ble基因的質粒pSPlMS DNA，濃度為76. 5ng/ μ 1 ；電擊轉化小球藻，脈衝電壓為 500V，脈衝持續時間1. 2ms ；3)將藻體於冰上預冷6min，加入到含0.5mol/L蔗糖的Knop液體培養基中，25°C下， 光照條件3000 40001x溫和培養24h,然後加至含有0. 5mol/L蔗糖，4 μ g/mL Zeocin的 Knop半固體培養基中，混合均勻，塗布於含有0. 5mol/L蔗糖，10 μ g/mL Zeocin的Knop固體培養基上，置於25°C培養箱中，光照條件3000 40001x靜置培養10d。
2.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的MBBM培養基組成0.5g NH4Cl, 0. 075g MgSO4,0. 17g KH2PO4,0. 075g K2HPO4,0. 025g CaCl2,0. 025g NaCl，0. 05g 酵母粉， lmLA6 混合液，7. 5g 2DG，3. 75g 葡萄糖，用 dH20 定容到 1L，pH 7. 0 ；A6 混合液0. 28gH3B03, 0. 25g MnSO4 · 7Η20，0· 0222g ZnSO4 · 7H20，0. 0079g CuSO4 · 5H20，0. 002IgNii2MoO4 · 2H20， 100ml ClH2O。
3.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的Knop液體培養基組成每升Knop培養基中含有葡萄糖 3g，酵母粉 3g，KH2PO4O. 025g, Ca(NO3)2O. lg，MgSO4O. 025g, KC10. 012g， FeCl3O. OOlg。
4.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的IfepesBuffer組成lmol/L NaCl, 0. 01mol/L KC1，0. 01mol/L CaCl2,0. 02mol/L Hepes,0. 2mol/L 甘露醇，0. 2mol/L 山梨醇。
全文摘要
本發明涉及一種低電壓瞬時電脈衝構建小球藻生物反應器的方法。首先獲得了具有高通透性細胞壁的活體小球藻，利用低電壓及瞬時電脈衝的條件，將基因載體及外源基因導入活體小球藻，避免了轉化藻體時高強度電壓或長時間電脈衝對小球藻的損傷，從而使外源基因平穩地進入小球藻細胞，建立小球藻生物反應器。本發明利用較溫和的低電壓瞬時電脈衝電擊轉化法成功地構建了小球藻生物反應器，條件溫和，低成本，便捷的使外源基因安全地進入小球藻細胞的新方法，對於生產高附加值產品，特別是來源緊俏的基因工程產品具有廣泛應用前景。
文檔編號C12N1/13GK102329733SQ20111028212
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月22日 優先權日2011年9月22日
發明者劉麗麗, 吳海月 申請人:天津師範大學