一種含CpGODN和polyI:C佐劑的噴鼻型流感病毒疫苗製備方法

2023-06-11 11:27:21 3

專利名稱：一種含CpG ODN和poly I:C佐劑的噴鼻型流感病毒疫苗製備方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，更具體地，涉及一種含CpG 0DN和poly I:C佐劑的噴 鼻型流感疫苗的製備方法。
背景技術：
流感是由流感病毒引起的全球流行的呼吸道傳播疾病，接種流感疫苗是預防流感 的有效手段。 傳統的流感病毒疫苗包括流感全病毒滅活疫苗、流感病毒裂解疫苗和流感亞單位 疫苗，這些流感疫苗均採用肌肉注射方式。在俄羅斯和美國已經批准流感減毒活疫苗，該 疫苗採用冷適應的流感重組株經鼻腔噴霧給藥，但該疫苗未被批准用於3歲以下嬰幼兒使 用。 CpG ODN(oligodeoxynucleotides, 0DN)是一種含有非甲基化CpG 二核苷酸序 列的單鏈寡核苷酸，CpG I)N可以被免疫細胞上To:l.l樣受體-9(Toll-like rec印tor 9， TLR-9)所識別，並增強免疫反應。美國Dynavax公司以CpG ODN為佐劑的重組B肝疫苗在 三期臨床研究中顯示了優於普通B肝疫苗的免疫效果，接種兩針後抗體陽轉率達到95%， 而普通B肝疫苗接種三針陽轉率為81%。Poly I:C,即聚肌苷酸-聚胞苷酸(polyinosine-po:l.ycytidy:l.ic acid,poly ]::C)
是-一種合成的雙鏈RNA，Poly I:C可被免疫細胞上的Toll樣受體-3 (Toll-like rec印tor
3， TLR-3)所識別，並增強免疫反應。目前以Polyl :C主要作為免疫剌激劑、腫瘤治療藥物
使用，使用Poly I:C作為佐劑的狂犬病疫苗和流感疫苗尚處於臨床前研究階段。 傳統的流感病毒疫苗為流感病毒滅活全病毒疫苗或流感病毒裂解疫苗，成人劑量
含每型血凝素15微克，兒童劑量含每型血凝素7. 5微克，由於傳統疫苗使用肌肉注射方式
進行接種，而利用本專利製備的含CpG ODN和poly I: C佐劑的噴鼻型流感病毒疫苗採用噴
鼻給藥方式，接種方式更方便,並可以降低抗原用量，增加疫苗供應能力。 以CpG ODN和Po :1.yI: C兩種佐劑製備噴鼻型流感疫苗目前國內外未見文獻報導。

發明內容
本發明克服了傳統流感疫苗的缺陷，提供了一種免疫效果好、可以降低流感病毒
抗原用量，方便使用的噴鼻型流感疫苗,且可以應付流感大流行之下。 本發明的技術方案及步驟 (1)將H1N1、H3N2、B型流感病毒工作毒種分別接種於1000枚10日齡健康雞胚尿 囊腔增殖流感病毒； (2)收穫流感病毒,用截留分子量100 75kD的超濾膜進行超濾濃縮； (3)將超濾濃縮後的流感病毒樣品上樣於充分平衡的S印harose 4FF柱，收集第
一個洗脫峰為純化的流感病毒；
(4)經脫氧膽酸鈉裂解的流感病毒樣品，上樣於S印harose 6FF柱，純化獲得流感 病毒疫苗原液； (5)將以上步驟分別得到的H1N1、 H3N2、 B型流感病毒疫苗原液混合； (6)按照每劑含HIN1流感病毒血凝素和:H3N2流感病毒血凝素和B型流感病毒血
凝素1 10微克、CpG 0DN佐劑50 1000微克、poly I :C佐劑100 2000微克的配比，
分裝到噴鼻注射器即獲得含CpG 0DN和poly I: C佐劑的噴鼻型流感病毒疫苗。 其中流感病毒濃縮過程中使用的超濾膜截留分子量可以為300 750kD ;疫苗含
每型流感病毒血凝素可以為2 7. 5微克/劑，CpG DN佐劑可以為100 500微克/劑、
polyl:C佐劑可以為200 1000微克/齊U，疫苗不含有硫柳汞。 實施例1 1)增殖流感病毒 將H1N1、 H:3N2、 B型流感病毒工作毒種分別接種於1000枚10日齡健康雞胚尿囊
腔，置34t:培養72小時； 將雞胚置於4。C冷庫過夜，收集尿囊液合併，得流感病毒收穫液12500毫升。流感 病毒收穫液加入甲醛溶液12. 5ml ，於2-8"C滅活振搖滅活24小時。滅活的病毒液經40g 離心30分鐘，經0. 8微米中空纖維系統澄清過濾後，採用截留分子量100kD的超濾膜濃縮 至150毫升。 3)S印harose 4FF柱純化 將超濾濃縮後的流感病毒樣品上樣於.lraol/L :PBS (pH:7. 0)充分平衡的 S印harose4FF柱(XK50,Zl00柱，柱體積1850ml),收集第一個洗脫峰為純化的流感病毒，共 250ml。 4)病毒裂解，S印harose 6FF柱純化 純化的流感病毒加入脫氧膽酸鈉至終濃度.5% (g/ral)振搖下裂解6分鐘，裂解 液分兩次上樣於S印harose 6FF柱(XK50/100柱，柱體積1830ml)，純化獲得流感病毒單價 疫苗原液420ml。 5)將以上步驟分別得到的H1N1、 H3N2、 B型流感病毒疫苗原液混合；
6)稀配分裝 根據H1N1、 H3N2、 B型流感病毒單價疫苗原液的血凝素濃度測定值，按照每劑含 H1N1和H3N2和B型每型血凝素10微克、含CpG ODN佐劑50微克、含Polyl :C佐劑100微 克的配方配製半成品，分裝到噴鼻注射器即獲得含CpG ODN和poly I:C佐劑的噴鼻型流感病毒疫苗。 實施例2 1)增殖流感病毒 將H1N1、 H:3N2、 B型流感病毒工作毒種分別接種於1000枚10日齡健康雞胚尿囊
腔，置34t:培養72小時； 2)收穫流感病毒，超濾濃縮 將雞胚置於4。C冷庫過夜，收集尿囊液合併，得流感病毒收穫液12500毫升。流感 病毒收穫液加入甲醛溶液12. 5ml ，於2-8"C滅活振搖滅活24小時。滅活的病毒液經40g 離心30分鐘，經0. 8微米中空纖維系統澄清過濾後，採用截留分子量300kD的超濾膜濃縮 至148毫升。 3)S印harose 4FF柱純化 將超濾濃縮後的流感病毒樣品上樣於.lraol/L :PBS (pH:7. 0)充分平衡的 S印harose4FF柱(XK50,Zl00柱，柱體積1850ml),收集第一個洗脫峰為純化的流感病毒，共 250ml。 4)病毒裂解，S印harose 6FF柱純化 純化的流感病毒加入脫氧膽酸鈉至終濃度.5% (g/ral)振搖下裂解6分鐘，裂解 液分兩次上樣於S印harose 6FF柱(XK50/100柱，柱體積1830ml)，純化獲得流感病毒單價 疫苗原液420ml。 5)將以上步驟分別得到的H1N1、 H3N2、 B型流感病毒疫苗原液混合；
6)稀配分裝 根據H1N1、 H3N2、 B型流感病毒單價疫苗原液的血凝素濃度測定值，按照每劑含
H1N1和H3N2和B型每型血凝素7. 5微克、含CpG ODN佐劑100微克、含Polyl :C佐劑200
微克的配方配製半成品，分裝到噴鼻注射器即獲得含CpG ODN和poly I: C佐劑的噴鼻型流
感病毒疫苗。 實施例3 1)增殖流感病毒 將H1N1 、 H3N2、 B型流感病毒工作毒種分別接種於1000枚10日齡健康雞胚尿囊
腔，置34。C培養72小時； 2)收穫流感病毒，超濾濃縮 將雞胚置於4t:冷庫過夜，收集尿囊液合併，得流感病毒收穫液12500毫升。流感 病毒收穫液加入甲醛溶液12. 5ml，於2-8"C滅活振搖滅活24小時。滅活的病毒液經4000g 離心30分鐘，經0. 8微米中空纖維系統澄清過濾後，採用截留分子量75k:[)的超濾膜濃縮 至145毫升。 3)S印harose 4FF柱純化 將超濾濃縮後的流感病毒樣品上樣於0. Olmol/L PBS (pH7. 0)充分平衡的 S印harose4FF柱(XK5/1(K)柱，柱體積185(Ml)，收集第一個洗脫峰為純化的流感病毒，共 250ml。 4)病毒裂解，S印harose 6FF柱純化 純化的流感病毒加入脫氧膽酸鈉至終濃度O. 5% (g/ml)振搖下裂解60分鐘，裂解液分兩次上樣於S印harose 6FF柱(XK50/100柱，柱體積1830ml)，純化獲得流感病毒單價 疫苗原液420ml 。 5)將以上步驟分別得到的H1N1、 H3N2、 B型流感病毒疫苗原液混合；
6)稀配分裝 根據H1N1、 H3N2、 B型流感病毒單價疫苗原液的血凝素濃度測定值，按照每劑含 H1N1和H3N2和B型每型血凝素5微克、含CpG ODN佐劑250微克、含Polyl :C佐劑500微 克的配方配製半成品，分裝到噴鼻注射器即獲得含CpG ODN和poly I:C佐劑的噴鼻型流感
病毒疫苗。 實施例4 1)增殖流感病毒 將II1N1 、 H3N2、 B型流感病毒工作毒種分別接種於1000枚10日齡健康雞胚尿囊
腔，置34。C培養72小時； 2)收穫流感病毒，超濾濃縮 將雞胚置於4t:冷庫過夜，收集尿囊液合併，得流感病毒收穫液12500毫升。流感 病毒收穫液加入甲醛溶液12. 5ml，於2-8"C滅活振搖滅活24小時。滅活的病毒液經棚g 離心30分鐘，經0. 8微米中空纖維系統澄清過濾後，採用截留分子量30k:[)的超濾膜濃縮 至155毫升。 3)S印harose 4FF柱純化 將超濾濃縮後的流感病毒樣品上樣於0. Olmol/L PBS (pH7. 0)充分平衡的 S印harose4FF柱(XK5/1(K)柱，柱體積185(Ml)，收集第一個洗脫峰為純化的流感病毒，共 250ml。 4)病毒裂解，S印harose 6FF柱純化 純化的流感病毒加入脫氧膽酸鈉至終濃度O. 5% (g/ml)振搖下裂解60分鐘，裂解 液分兩次上樣於S印harose 6FF柱(XK5/1柱，柱體積183ni:l.)，純化獲得流感病毒單價 疫苗原液420ml。 5)將以上步驟分別得到的H1N1、 H3N2、 B型流感病毒疫苗原液混合；
6)稀配分裝 根據H1N1 、 H:3N2、 B型流感病毒單價疫苗原液的血凝素濃度測定值，按照每劑含
H1N1和H3N2和B型每型血凝素2微克、含CpG ODN佐劑500微克、含Polyl: C佐劑1000微
克的配方配製半成品，分裝到噴鼻注射器即獲得含CpG ODN和polyl :C佐劑的噴鼻型流感
病毒疫苗。 實施例5 1)增殖流感病毒 將H1N1 、 H3N2、 B型流感病毒工作毒種分別接種於1000枚10日齡健康雞胚尿囊
腔，置34。C培養72小時； 2)收穫流感病毒，超濾濃縮 將雞胚置於4t:冷庫過夜，收集尿囊液合併，得流感病毒收穫液12500毫升。流感 病毒收穫液加入甲醛溶液12. 5ml，於2-8t:滅活振搖滅活24小時。滅活的病毒液經4000g 離心30分鐘，經0. 8微米中空纖維系統澄清過濾後，採用截留分子量750kD的超濾膜濃縮至155毫升。 3)S印harose 4FF柱純化 將超濾濃縮後的流感病毒樣品上樣於0. Olmol/L PBS (pH7. 0)充分平衡的 S印harose4FF柱(XK5/1(K)柱，柱體積1850ml)，收集第一個洗脫峰為純化的流感病毒，共 250ml 。 4)病毒裂解，S印harose 6FF柱純化 純化的流感病毒加入脫氧膽酸鈉至終濃度O. 5% (g/ml)振搖下裂解60分鐘，裂解 液分兩次上樣於S印harose 6FF柱(XK5/1柱，柱體積183ni:l.)，純化獲得流感病毒單價 疫苗原液420ml。 5)將以上步驟分別得到的H1N1、 H3N2、 B型流感病毒疫苗原液混合；
6)稀配分裝 根據H1N1 、 H:3N2、 B型流感病毒單價疫苗原液的血凝素濃度測定值，按照每劑含
H1N1和H3N2和B型每型血凝素1微克、含CpG ODN佐劑1000微克、含Polyl :C佐劑2000
微克的配方配製半成品，分裝到噴鼻注射器即獲得含CpG ODN和poly I: C佐劑的噴鼻型流
感病毒疫苗。 實施例6 1)增殖流感病毒 將H1N1 、 H3N2、 B型流感病毒工作毒種分別接種於1000枚10日齡健康雞胚尿囊
腔，置34。C培養72小時； 2)收穫流感病毒，超濾濃縮 將雞胚置於4t:冷庫過夜，收集尿囊液合併，得流感病毒收穫液12500毫升。流感 病毒收穫液加入甲醛溶液12. 5ml，於2-8t:滅活振搖滅活24小時。滅活的病毒液經4000g 離心30分鐘，經0. 8微米中空纖維系統澄清過濾後，採用截留分子量300kD的超濾膜濃縮 至145毫升。 3)S印harose 4FF柱純化 將超濾濃縮後的流感病毒樣品上樣於0. Olmol/L PBS (pH7. 0)充分平衡的 S印harose4FF柱(XK50/100柱，柱體積1850ml),收集第一個洗脫峰為純化的流感病毒，共 25ni:l-。4)病毒裂解，S印harose 6FF柱純化 純化的流感病毒加入脫氧膽酸鈉至終濃度0. 5% (g/ml)振搖下裂解60分鐘，裂解 液分兩次上樣於S印harose 6FF柱(XK50/100柱，柱體積1830ml)，純化獲得流感病毒單價 疫苗原液420ral。 5)將以上步驟分別得到的H1N1、 H3N2、 B型流感病毒疫苗原液混合；
6)稀配分裝 根據H1N1、 H3N2、 B型流感病毒單價疫苗原液的血凝素濃度測定值，按照每劑含 HlNl和:H3N2和B型每型血凝素5微克、含CpG ODN佐劑500微克、含Polyl :C佐劑500微 克的配方配製半成品，分裝到噴鼻注射器即獲得含CpG ODN和poly I:C佐劑的噴鼻型流感
病毒疫苗。 實施例7
1)增殖流感病毒 將H1N1 、 H3N2、 B型流感病毒工作毒種分別接種於1000枚10日齡健康雞胚尿囊
腔，置34。C培養72小時； 2)收穫流感病毒，超濾濃縮 將雞胚置於4t:冷庫過夜，收集尿囊液合併，得流感病毒收穫液12500毫升。流感 病毒收穫液加入甲醛溶液12. 5ml，於2-8t:滅活振搖滅活24小時。滅活的病毒液經4000g 離心30分鐘，經0. 8微米中空纖維系統澄清過濾後，採用截留分子量300kD的超濾膜濃縮 至145毫升。 3)S印harose 4FF柱純化 將超濾濃縮後的流感病毒樣品上樣於0. Olmol/L PBS (pH7. 0)充分平衡的 S印harose4FF柱(XK50/100柱，柱體積1850ml),收集第一個洗脫峰為純化的流感病毒，共 25ni:l-。 4)病毒裂解，S印harose 6FF柱純化 純化的流感病毒加入脫氧膽酸鈉至終濃度0. 5% (g/ml)振搖下裂解60分鐘，裂解 液分兩次上樣於S印harose 6FF柱(XK50/100柱，柱體積1830ml)，純化獲得流感病毒單價 疫苗原液420ral。 5)將以上步驟分別得到的H1N1、 H3N2、 B型流感病毒疫苗原液混合；
6)稀配分裝 根據H1N1、 H3N2、 B型流感病毒單價疫苗原液的血凝素濃度測定值，按照每劑含 H:1N1和:H3N2和B型每型血凝素5微克、含CpG DN佐劑100微克、含Poly:l: :C佐劑500微 克的配方配製半成品，分裝到噴鼻注射器即獲得含CpG ODN和poly I:C佐劑的噴鼻型流感
病毒疫苗。 實施例8 流感病毒疫苗的動物免疫原性檢測 採用健康家兔作為動物模型，對實施例1 實施例7製備的噴鼻型流感病毒疫苗 與市售流感裂解疫苗進行了免疫原性比較，實驗設計如下 實施例1-實施例7製備的噴鼻流感疫苗對家兔採用噴鼻免疫接種方式，每組5隻 家兔，每次噴鼻.2ral， 0、 14天各免疫一次,第二次免疫後7天採血分離血清，測定免前免後 血清中對H1N1型、H3N2型、B型流感病毒的血凝抑制抗體滴度，計算每隻家兔(免後血凝抑 制抗體/免前血凝抑制抗體)的比值，並計算每組家兔(免後血凝抑制抗體/免前血凝抑 制抗體)比值的幾何平均數。 流感病毒裂解疫苗分為噴鼻和肌肉注射兩組，每組5隻家兔，每次免疫0. 2ml，、 14天各免疫一次，第二次免疫後7天採血分離血清，測定免前免後血清中對H1N1型、H3N2 型、B型流感病毒的血凝抑制抗體滴度，計算每隻家兔(免後血凝抑制抗體/免前血凝抑制 抗體)的比值,並計算每組家兔(免後血凝抑制抗體/免前血凝抑制抗體)比值的幾何平 均數。 免疫結果如下表所示本發明製備的噴鼻型流感疫苗與現有流感病毒疫苗的比較
免疫組別(免後血凝抑制抗體/免前血凝抑制抗體)幾何平均數H1N1型H3N2型B型
流感病毒裂解疫 苗(注射)6.965.274.59
流感病毒裂解疫 苗(噴鼻)1.321.521.15
實施例1 (噴鼻)10.5686.96
實施例2 (噴鼻)13.9310.568
實施例3 (噴鼻)21.111613.92
實施例4 (噴鼻)12.1210.568
實施例5(噴鼻)9.199.19
實施例6 (噴鼻)21.1118.3816
實施例7 (噴鼻)〗2.1210.559.19 從上表可以看出，本發明製備的噴鼻型流感病毒疫苗經噴鼻途徑免疫的免疫原性 均優於市售流感疫苗經注射途徑、噴鼻途徑免疫的免疫原性,說明本發明製備的含CpG0DN 和Poly I: C佐劑噴鼻型流感疫苗適宜於預防流行性感冒。
權利要求
一種含CpG ODN和poly I:C佐劑的噴鼻型流感病毒疫苗製備方法，其步驟是(1)將H1N1、H3N2、B型流感病毒工作毒種分別接種於1000枚10日齡健康雞胚尿囊腔增殖流感病毒；(2)收穫流感病毒，用截留分子量100～750kD的超濾膜進行超濾濃縮；(3)將超濾濃縮後的流感病毒樣品上樣於充分平衡的Sepharose 4 FF柱，收集第一個洗脫峰為純化的流感病毒；(4)經脫氧膽酸鈉裂解的流感病毒樣品，上樣於Sepharose 6FF柱，純化獲得流感病毒疫苗原液；(5)將以上步驟分別得到的H1N1、H3N2、B型流感病毒疫苗原液混合；(6)按照每劑含H1N1流感病毒血凝素和H3N2流感病毒血凝素和B型流感病毒血凝素1～10微克、CpG ODN佐劑50～1000微克、poly I:C佐劑100～2000微克的配比，分裝到噴鼻注射器即獲得含CpG ODN和poly I:C佐劑的噴鼻型流感病毒疫苗。
2. 根據權利要求1所述的一種含CpG DN和poly I: C佐劑的噴鼻型流感病毒疫苗制 備方法，其特徵是所述流感病毒濃縮過程中使用的超濾膜截留分子量為300 750kD。
3. 根據權利要求l所述的一種含CpG 0DN和poly I: C佐劑的噴鼻型流感病毒疫苗制 備方法，其特徵是所述疫苗含每型流感病毒血凝素2 7. 5微克/劑，CpG 0DN佐劑100 250微克/齊U、 poly I :C佐齊[J 200 500微克/劑。
全文摘要
本發明一種含CpG ODN和poly I:C佐劑的噴鼻型流感病毒疫苗製備方法，屬於生物技術領域，其步驟為，採用雞胚培養增殖流感病毒，經超濾濃縮、柱層析後獲得純化的流感病毒，經裂解後獲得流感疫苗原液，將所需型別流感疫苗原液與CpG ODN佐劑、polyI:C佐劑配比後製備而成。本發明提供了一種可以降低流感病毒抗原用量，方便免疫接種的新型噴鼻型流感病毒疫苗製備方法，適宜於在全球大流感流行威脅下迅速提高流感疫苗供應能力。
文檔編號A61K39/39GK101745109SQ201010103470
公開日2010年6月23日 申請日期2010年2月1日 優先權日2010年2月1日
發明者代雲波, 向左雲, 張翊 申請人:雲南沃森生物技術股份有限公司