Apex1用作檢測肝細胞癌的蛋白質分子標記的應用的製作方法

2023-06-11 23:22:51 2

專利名稱：Apex1用作檢測肝細胞癌的蛋白質分子標記的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體地說，涉及DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl 的應用，更具體地說，涉及DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl作為肝細胞癌的蛋白質分 子標記的應用。
背景技術：
肝細胞癌是世界範圍內第四位常見的惡性腫瘤，我國第二位常見惡性腫瘤，每年 大約有250，000名患者死於肝細胞癌。肝細胞癌惡性程度高，容易復發和轉移，預後差，而 且早期診斷較困難，往往延誤了最佳治療時期。西方發達國家肝癌的發病率較低，國際上對 肝癌的基礎研究仍較為薄弱，而我國是肝癌高發國家，發病率和死亡率呈現上升趨勢，且發 病年齡構成年輕化，每年用於肝癌治療的醫療支出大為增加，肝癌成了嚴重危害我國人民 生命財產安全的頭號敵人，並且是影響社會經濟發展的一個重要因素，加大力度進行我國 肝癌的基礎研究具有戰略意義，而分離和鑑定新的肝癌相關基因是目前肝癌基礎研究中的 前沿課題。到目前為止，已有不下20種的基因異常表達被確定與肝癌的發生發展有關，但已 確定的肝癌相關基因在肝癌中的異常表達率並不高，肝癌的發病機制至今仍未闡明，肝癌 的早期診斷率仍有待提高。此外，傳統的肝癌手術加化療以及近年來配合使用的多種基因 治療方法仍沒有明顯提高肝癌患者的生存率，因而尋找新的肝癌相關基因、尤其是肝癌高 表達基因對於探討肝癌的發病機制具有重要意義。因此，研究和開發在肝細胞癌中高表達的基因和/或蛋白質具有重要意義，尋找 新的在肝細胞癌中高表達的基因和/或蛋白質也具有迫切需要性。DNA 脫嘌呤 / 脫嘧啶位點裂解酶(DNA-(apurinic or apyrimidinic site) lyase, EC4.2.99. 18, Apurinic-apyrimidinic endonuclease 1, AP endonuclease 1，APE nuclease, APE, APEN, APEXl，APE, APX, HAPl，REF-I，REFl，REDOX FACTOR 1)的NCBI的登錄號為NP_001632，Swissprot登錄號為P27695，IPI號為 IPI00215911. 3 (human3. 28version)。已經有大量的研究表明DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂 解酶APEXl與很多癌症有關。根據現有研究，在大部分癌症(例如，生殖細胞癌、前列腺癌、 卵巢癌、非小細胞肺癌等)中，APEXl在癌組織中高表達；而在有些癌症(例如結腸腺瘤和 結腸癌)中，APEXl的表達水平不變，但其細胞定位發生了變化。Di Mas等發現DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl的亞細胞定位的變化 可以用於人類肝細胞癌的預後診斷(Subcellular localization of APEXl/Ref-1 in human hepatocellularcarcinoma:possible prognostic significance. Mol Med. 2007 ； 13(1-2) 89-96)。但現有技術中尚未見到有關於採用DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl的表達 量作為人類肝細胞癌標誌物的相關報導。

發明內容
通過篩選在人類肝細胞癌組織及相應的癌旁組織中差異表達的蛋白質，本申請的 發明人找到了一種在人類肝細胞癌組織及相應的癌旁組織中存在差異表達的蛋白質(在 癌組織中上調表達)，經質譜鑑定為DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl。免疫印跡實驗 證實，DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl的確在肝細胞癌組織及相應的癌旁組織中存在 差異表達(在癌組織中表達上調)。利用人肝細胞癌細胞株IfepG2和人正常肝細胞株L02 進行的免疫螢光實驗，證明DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl在這兩種細胞株間存在 差異表達(在人肝細胞癌細胞株H印G2中表達上調)。通過對62對人肝細胞癌的癌組織與 癌旁組織進行的免疫組織化學實驗進一步證實了 DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl在 人類肝細胞癌的癌組織與癌旁組織中存在差異表達(在癌組織中表達上調)。基於DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl的表達量與肝細胞癌的相關性，因此， APEXl可以作為一種蛋白質分子標記物，並根據其在肝細胞中的表達量以確定患者是否患 有肝細胞癌。相應的，特異性抗DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl的抗體，包括各種抗 DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl的單克隆抗體和多克隆抗體，由於其能夠用於檢測 DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl的表達量，因而可以用於檢測肝細胞癌，或者用於制 備檢測肝細胞癌的製劑或試劑盒。因此，本發明的首要目的在於，提供一種DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl的 應用，以用於肝細胞癌的檢測，特別是肝細胞癌的中早期檢測。本發明提供的應用為用作檢測肝細胞癌的蛋白質分子標記，該檢測是檢測APEXl 在肝組織細胞中的表達量。根據本發明，所述檢測是檢測APEXl在肝組織細胞中是否均存在上調表達。本發明還有一個目的在於，提供一種抗DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl的 抗體的應用。本發明提供的抗DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl的抗體的應用為用於製備 檢測肝細胞癌的製劑，該檢測是檢測APEXl在肝組織細胞中的表達量。本發明提供的抗DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl的抗體的應用為用於製備 檢測肝細胞癌的試劑盒，該檢測是檢測APEXl在肝組織細胞中的表達量。根據本發明，抗DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl的抗體包括單克隆抗體和 多克隆抗體。本發明還有一個目的在於，提供一種體外檢測肝組織中DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點 裂解酶APEXl的表達是否異常的方法。本發明提供的方法為用特異性抗DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl的抗體檢 測待測肝組織細胞中DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl的數量，並與正常肝組織中的 DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl的數量進行比較。


圖1為DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl的免疫印跡檢測結果，其中，泳道 1-6為肝細胞癌組織的檢測結果，泳道1』 _6』為與泳道1-6對應的癌旁組織的檢測結果。圖2為對圖1的免疫印跡圖譜進行數據分析得出的蛋白質表達量相對分布圖，其中，HCC為肝細胞癌患者的癌組織，non-HCC為癌旁組織。圖3為DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl的免疫螢光實驗結果，其中，Al為 H印G2細胞中APEXl的分布情況，A2為H印G2的細胞核，A3為Al和A2的疊加圖，Bl為L02 細胞中APEXl的分布情況，B2為L02的細胞核，B3為Bl和B2的疊加圖。圖4為DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl的免疫組織化學實驗結果，其中，A 為肝細胞癌的癌組織的檢測結果，B為癌旁組織的檢測結果，物鏡放大倍數為20倍。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用於說明本 發明而非用於限定本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如《分子克隆實 驗室手冊》(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件進行。在本發明的下述實施例中，尿素、3-[(3_膽醯胺丙基)_ 二乙銨]-1-丙磺酸 (CHAPS)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、二硫蘇糖醇(DTT)、三(羥甲基)氨基乙烷(Tris)、碘代乙 醯胺(IAA)購自Bio-Rad公司；CLM-2262L-Leu(U-13C6,98% )購自劍橋同位素實驗室；透 析胎牛血清購自Gibco公司；D9785細胞培養粉末、β -巰基乙醇、L-GlruL-Lys和L-Met購 自 Sigma 公司；胰蛋白酶(Trypsin，sequencing grade)購自 Promega 公司；SCX 柱禾Π SAX 柱以及PH緩衝液試劑盒購自Column Technology公司；!fepG2細胞株和L02細胞株購自中 國科學院上海生命科學研究院生物化學和細胞研究所的細胞庫。在本發明的下述實施例中，使用的溶液/培養基配方如下不含穀氨醯胺的RPMI1640培養基5%透析胎牛血清，0.2mM苯甲基磺醯氟 (PMSF)，ImM EDTA,苯甲異惡唑青黴素25mg/mL，慶大黴素50mg/mL，青黴素100U/mL，鏈黴素 100mg/mL,兩性黴素 B 0. 25mg/mL,制黴菌素 50U/mL。裂解液8mol/L尿素、4% CHAPS、40mmol/L Tris 和 65mmol/L DTT。裂解緩衝液8mol/L尿素，40mmol/L Tris, 65mmol/L DTT。TBST =Tris 2. 42g/L，氯化鈉 8g/L, Tween-20 lml/L，用 HCl 調節 pH 到 7. 6。本申請的發明人用非酶解樣品製備法(nonenzymatic sample preparation, NESP)製備了肝細胞癌的癌組織與癌旁組織的蛋白質樣品，並採用CDIT技術結合溶液內酶 解及陰陽多維液相色譜串聯質譜的蛋白質組學標記定量技術對其中的蛋白質進行鑑定並 比較其表達量，結果發現DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl在肝細胞癌組織中上調表 達，另外，免疫印跡實驗、免疫螢光實驗和免疫組織化學實驗均證明DNA脫嘌呤/脫嘧啶位 點裂解酶APEXl的確在肝細胞癌組織及相應的癌旁組織中存在差異表達。實施例1、肝細胞癌的癌組織及癌旁組織蛋白質樣品的製備從東方肝膽外科醫院獲取5例肝細胞癌患者的癌組織及癌旁組織，該5例患者，均 由2名病理科醫生確診，患有肝細胞癌，5例患者的病理資料如表1所示。表1、5例肝細胞癌患者的病理資料
以非酶解樣品製備法製備上述5例患者的肝細胞癌的癌組織及癌旁組織蛋白質樣 品(所用癌組織及癌旁組織樣品均為取自同一肝細胞癌患者的成對樣品)，具體過程如下手術切除的新鮮組織塊迅速置於冰上，快速切成幾個肉眼可見、無壞死區域的小 塊。用預冷的不含穀氨醯胺的RPMI1640培養基洗滌組織小塊數次後，在液氮中快速研磨 成細胞沉澱，然後將細胞沉澱分別溶於裂解液中，然後於冰浴條件下，使用超聲細胞破碎儀 (JY92-2D，寧波新芝科器研究所)間歇超聲破碎2min後，於15000r/min、4°C離心lh，取上 清，以改良的Bradford法(見Bio-Rad公司產品說明書)進行總蛋白質定量。實施例2、HepG2和L0213C標記的細胞的培養和樣品製備在含有13C標記的CLM-2262L_Leu，10%透析胎牛血清，L_Gln，L-Lys以及L-Met的 D9785培養基的6cr的培養皿中分別培養H印G2或L02細胞。待細胞生長到6代後，將H印G2細胞或L02細胞轉移到IOcm培養皿中進行培養。待細胞生長密度達到80%時，用4°C預冷的PBS洗三遍，加入裂解液進行裂解。然 後用刮刀將這兩種13C標記的細胞分別刮下收集，冰浴超聲破碎，15000g離心lh，取上清，用 改良的Bradford法(見Bio-Rad公司產品說明書)定量其總蛋白質含量。實施例3、癌組織及癌旁組織的差異表汰蛋白的篩誅採用CDIT 技術(參照 Yasushi Ishihama et al. Nat Biotechnol. 2005 ；23 (5) 617-621)結合溶液內酶解技術(參照 William Μ. Old et al. Mol Cell Proteomics. 2005 ； 4:1487-1502)與陰陽多維液相色譜串聯質譜技術(參照Jie Dai et al. J Proteome Res. 2007 ；6(1) 250-262)進行差異表達蛋白的篩選，具體過程如下取實施例1中獲得的5對肝細胞癌組織及癌旁組織蛋白質樣品各lOOug，分別將5 例肝細胞癌組織蛋白質樣品以及5例肝細胞癌的癌旁組織樣品進行混合，得到500ug癌組 織蛋白質樣品和500ug癌旁組織蛋白質樣品。取實施例2中13C標記的H印G2和L02細胞的蛋白質樣品，將二者等比例混合作為內標。取500ug的肝細胞癌的癌組織或癌旁組織蛋白質樣品分別與500ug13C標記的內標 混合，得到兩種組織_細胞混合蛋白質樣品各lmg。分別向混合蛋白質樣品中加入裂解緩衝液至總體積ΙΟΟμ 1，再加入Sul的IM DTT，混勻後37°C反應2小時，然後加入20μ 1的IM ΙΑΑ，混勻後室溫避光反應45分鐘。
然後用4倍體積的_20°C預冷的丙酮進行沉澱，_20°C反應至少4小時。25000g離 心45分鐘，去上清，加入50mmol/L的碳酸氫銨200 μ 1，再加入20 μ g胰蛋白酶(蛋白質和 胰蛋白酶的比例為50 1)，37°C酶解反應4小時後，補加胰蛋白酶至總蛋白質和胰蛋白酶 比例為25 1，酶解過夜至總酶解時間16小時。酶解完成後用MilliporelOKD孔徑大小的 超濾膜超濾，收取濾過液，真空冷凍乾燥。酶解後的每份肽段混合物首先用SCX/SAX柱進行分析，然後用完全自動化的多維 液相色譜串聯質譜儀LTQTM0rbitrapTM(購自Thermo Firmigan公司)進行分析，得到的原始 數據採用SEQUEST軟體(Thermo Finnigan公司)進行資料庫搜索，並採用Census定量分 析軟體(http://fields, scripps. edu/census/index. php)對鑑定到的蛋白質進行定量分 析，定量結果如表2和表3所示。表2、肝細胞癌組織/13C標記細胞含有定量信息肽段的定量結果 表3、肝細胞癌的癌旁組織/13C標記細胞含有定量信息肽段的定量結果 根據表2和表3的結果，DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl在肝細胞癌組織 /13C標記細胞和癌旁組織/13C標記細胞中的定量結果分別為1. 802481252和0. 687241904， 在肝細胞癌組織中高表達2. 5倍以上，肝細胞癌組織中表達明顯上調，其中，DNA脫嘌呤/ 脫嘧啶位點裂解酶APEXl在肝細胞癌組織/13C標記細胞中有3條非重複肽段(共鑑定到9 次)包含定量信息，而在癌旁組織/13C標記細胞中有3條非重複肽段(共鑑定到18次)包 含定量信息。實施例4、DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl的驗證取6對NESP法製備的肝細胞癌組織及相應的癌旁組織的蛋白質樣品，其病理資料如表4所示。表4、6例肝細胞癌標本的病理資料 使用購買的抗DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl抗體對上述6對肝細胞癌組 織及相應的癌旁組織的蛋白質樣品進行免疫印跡分析，過程如下每個樣品取IOyg蛋白質樣品，用12% SDS-PAGE分離，轉移至PVDF膜(購自 GEHealthcare 公司)上；一抗使用鼠抗人DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEX 1單克隆抗體(購自 LifeSpanBiosciences公司，1 1000)，4°C孵育過夜，用TBST洗滌三次，每次5分鐘；二抗為抗鼠抗體(購自Santa Cruz公司，1 10000)，室溫孵育1小時，再用TBST 洗滌三次，每次10分鐘；加入ECL plus試劑(購自GE Healthcare公司)，反應5分鐘，X-光片曝光檢測。檢測結果如圖1所示，然後對圖1的免疫印跡圖譜採用Gel-Pro Analyzer凝膠定 量分析軟體(MediaCybemetic公司)進行數據分析，得出蛋白質表達量的相對分布圖，結果 如圖2所示。圖1結果顯示，肝細胞癌組織中DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl的雜交條 帶的濃度都明顯高於相應的癌旁組織，另外，肝細胞癌組織中DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解 酶APEXl的剪切體雜交條帶的濃度(主條帶下的次條帶)也明顯高於相應的癌旁組織，該 剪切體參與線粒體DNA的修復。而由於癌細胞中線粒體DNA遭受活性氧基團的損傷的程度 高，因此APEXl的剪切體濃度上升，且HCC和non-HCC在APEXl主條帶下的條帶的濃度變化 是不同的，即APEXl的剪切的變化與HCC是相關的。圖2結果顯示，DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl在肝細胞癌組織中的表達 量均明顯高於相應的癌旁組織，平均比值為1. 955，P值(配對t檢驗)為0. 001583。根據圖1和圖2的結果，DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl在肝細胞癌的癌 組織中存在高表達，該結果與質譜結果一致。選取H印G2細胞(人肝細胞癌細胞株)和L02細胞(人正常肝細胞株)進行免疫 螢光實驗，過程如下
在圓形蓋玻片上，用含10%透析胎牛血清的DMEM培養L02細胞和H印G2細胞；
PBS洗滌兩次後，_20°C預冷的100%丙酮固定；PBS洗滌兩次，5%脫脂牛奶封閉30分鐘；加入鼠抗人DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl單克隆抗體(購自 LifeSpanBiosciences公司，1 30封閉液稀釋)，室溫孵育lh, TBST洗3遍，每次7分鐘；加入螢光染料Alexa 488標記的羊抗鼠抗體(購自Molecular Probes公司， 1 300封閉液稀釋)，室溫孵育45分鐘，TBST洗3遍，每次7分鐘；加入DAPI溶液(購自Signa公司，1 1000雙蒸水稀釋)，孵育1分鐘，PBS洗10分鐘；封片，4 °C避光保存。使用雷射共聚焦顯微鏡觀察，結果如圖3所示。根據圖3結果，DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl在HepG2細胞中的表達水 平明顯高於其在L02細胞中的表達水平，這與從組織中得到的結果相一致。為了進一步證實DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl在肝細胞癌組織和癌旁組 織之間的表達差異，隨機選取62對肝癌的癌組織和對應的癌旁組織樣本，使用兩張肝癌組 織晶片(分別為0D-CT-DgLiv03-002肝癌組織晶片和0D-CT-DgLiv03-003肝癌組織晶片， 均購自上海芯超生物科技有限公司)進行免疫組織化學研究，其中，選取的樣本的具體資 料分別如表5和表6所示表5、OD-CT-DgLiV03-002肝癌組織晶片資料及打分情況 表6、OD-CT-DgLiV03-003肝癌組織晶片資料及打分情況 免疫組織化學研究的實驗過程如下將組織切片置於60°C恆溫箱烘烤約3個小時，取出後依次使用二甲苯、二甲苯/乙醇(1 1)、100%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、50%乙醇和水，進行脫蠟水化處理；PBS洗3次，每次5分鐘；0. 3% H2O2 (甲醇稀釋)浸泡半小時，PBS洗3次，每次5 分鐘；高壓修復抗原，雙蒸水洗2次，每次5分鐘；PBS洗2次，每次5分鐘；10%血清室 溫封閉20分鐘；加入鼠抗人DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl單克隆抗體(購自 LifeSpanBiosciences 公司，1 200 稀釋)，4°C過夜，PBST 洗 3 次，每次 5 分鐘;加入生物素標記的馬抗鼠抗體(來自ABC試劑盒，購自VECTOR公司)，室溫孵育 30分鐘，PBST洗3次，每次5分鐘；PBS洗2次，每次5分鐘；加入ABC溶液(來自ABC試劑盒，購自VECTOR公司)，室溫孵育30分鐘，PBS洗3 次，每次5分鐘；DAB溶液(購自上海生工生物工程技術服務有限公司)顯色；蘇木精(購自VECTOR 公司，H3404)染色20秒；組織切片依次使用50 %乙醇、70 %乙醇、80 %乙醇、90 %乙醇、100 %乙醇、二甲苯 /乙醇(1 1)、二甲苯，進行脫水透明處理。然後使用中性樹脂封片，於顯微鏡觀察，結果如圖4所示。對組織晶片進行評估，結果顯示組織晶片中共59對有效樣本(去掉一對樣本破 壞嚴重的和2對均為癌組織的樣本)，並根據染色強度和陽性率打分，其中，染色強度打分 標準為陰性為0分、弱陽性為1分、中等陽性為2分、強陽性為3分；陽性率打分標準為 低於5%為0分，5% 30%為1分，31 % 60%為2分，60%以上為3分。將染色強度的得 分與陽性率的得分相加，獲得組織切片的綜合得分，得分情況分別如表5和表6所示。根據表5和表6的結果綜合細胞質與細胞核中的信息，肝細胞癌組織的平均綜合 得分為4. 88，癌旁組織的平均綜合得分為2. 66，兩者具有極顯著差異，P值(Wilcoxon rank sumtest)為4· 011E-07，在約75% (44對)的樣本對中，DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶 APEXl在肝細胞癌中高表達。病理分級I，I-II的樣本組與病理分級II的樣本組之間存在 顯著差異，P值小於0. 01，病理分級I，I-II的樣本組與病理分級II-III的樣本組之間也存 在顯著差異，P值小於0. OLDNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl的表達水平與細胞的分 化程度成反比。如果僅利用細胞核中的信息，肝細胞癌組織的平均綜合得分為2. 92，癌旁組 織的平均綜合得分為1.03，兩者具有極顯著差異，P值(Wilcoxon rank sum test)為 1. 924E-07，在約75% (44對)的樣本對中，DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl在肝細 胞癌中高表達。病理分級I，I-II的樣本組與病理分級II的樣本組之間存在顯著差異，P值 小於0.01，病理分級I，I-II的樣本組與病例分級II-III的樣本組之間也存在顯著差異，P 值小於0. 01，細胞核中DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl的表達水平與細胞的分化程 度成反比。如果僅利用細胞質的信息，病理分級I，I-II的樣本組與病理分級II的樣本組之 間存在顯著差異，P值小於0.01，病理分級I，I-II的樣本組與病例分級II-III的樣本組之 間也存在顯著差異，P值小於0. 01，細胞質中DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl的表達 水平與細胞的分化程度成反比。
該結果與前面的質譜結果、免疫印跡結果以及免疫螢光結果相一致。因此，可根據DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl在肝細胞癌的癌組織和癌旁 組織中存在的明顯的差異表達，用於肝細胞癌的中早期診斷，而不僅為預後的評價標準。綜上所述，DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl在肝細胞癌的癌組織和癌旁組 織中存在明顯的差異表達，顯然與肝細胞癌的發生發展有著密切的相關性，因此它的表達 量可以用於檢測肝細胞癌。相應的，特異性抗DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl的抗 體，包括各種抗DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl的單克隆抗體和多克隆抗體，由於其 能夠用於檢測DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl的表達量，因而可以用於檢測肝細胞 癌，或者用於製備檢測肝細胞癌的製劑或試劑盒，這對於本領域的技術人員來說是顯而易 見的。雖然有關DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl動態的生物學功能及腫瘤相關機 制還有待進一步研究，但是將它作為檢測肝細胞癌的標記物卻是肯定的。DNA脫嘌呤/脫嘧 啶位點裂解酶APEXl可作為肝細胞癌的標誌物，而它在胞內的生物學功能提示DNA脫嘌呤 /脫嘧啶位點裂解酶APEXl可能作為肝癌的預後分子標記和臨床治療的靶分子。
權利要求
DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEX1用作檢測肝細胞癌的蛋白質分子標記的應用，其特徵在於，所述檢測是檢測APEX1在肝組織細胞中的表達量。
2.如權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述檢測APEXl在肝組織細胞中的表達量為 檢測APEXl在肝組織細胞中是否均存在上調表達。
3.—種抗DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl的抗體的應用，其特徵在於，用於製備 檢測肝細胞癌的製劑，所述檢測是檢測APEXl在肝組織細胞中的表達量。
4.如權利要求3所述的應用，其特徵在於，所述抗DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶 APEXl的抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體。
5.如權利要求3所述的應用，其特徵在於，所述檢測APEXl在肝組織細胞中的表達量為 檢測APEXl在肝組織細胞中是否均存在上調表達。
6.一種抗DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl的抗體的應用，其特徵在於，用於製備 檢測肝細胞癌的試劑盒，所述檢測是檢測APEXl在肝組織細胞中的表達量。
7.如權利要求6所述的應用，其特徵在於，所述抗DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶 APEXl的抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體。
8.如權利要求6所述的應用，其特徵在於，所述檢測APEXl在肝組織細胞中的表達量為 檢測APEXl在肝組織細胞中是否均存在上調表達。
9.一種體外檢測肝組織中DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl的表達是否異常的 方法，其特徵在於，所述方法為用特異性抗DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl的抗體檢 測待測肝組織細胞中DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl的數量，並與正常肝組織中的 DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEXl的數量進行比較。
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述抗DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶 APEXl的抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體。
全文摘要
本發明提供了一種DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEX1的應用。本發明提供的APEX1的應用為DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEX1作為檢測肝細胞癌的蛋白質分子標記的應用，該檢測是檢測APEX1在肝組織細胞中的表達量。DNA脫嘌呤/脫嘧啶位點裂解酶APEX1在肝細胞癌的癌細胞和癌旁細胞中存在明顯的差異表達，因此，可根據其在肝細胞中的表達量檢測患者是否患有肝細胞癌。
文檔編號G01N33/535GK101930004SQ20091005372
公開日2010年12月29日 申請日期2009年6月24日 優先權日2009年6月24日
發明者徐孟傑, 曾嶸, 李辰, 武禕, 阮宏強 申請人:中國科學院上海生命科學研究院