用於微流控晶片單細胞自動分析的雙光路裝置製造方法

2023-06-07 10:45:16 2

用於微流控晶片單細胞自動分析的雙光路裝置製造方法
【專利摘要】一種用於微流控晶片自動檢測的雷射誘導螢光雙光路裝置，包括雙光路光學單元、數據採集單元、數據處理單元、微流控電源、光路控制單元。其特徵是光路中的所有元件位置均固定，僅通過旋轉光路轉換盤，即可改變雷射傳播方向，使其在進樣階段和檢測階段分別沿兩個不同的光路傳播，從而實現單一雷射器在單細胞選取和細胞組分雷射誘導螢光檢測兩個功能間的自動轉換。本裝置適用於單細胞自動分析，可自動完成單細胞進樣、溶膜、分離、檢測全過程，重複性好、精密度高。
【專利說明】用於微流控晶片單細胞自動分析的雙光路裝置
【技術領域】
[0001]本發明涉及微流控晶片單細胞自動分析，特別是一種基於雙光路的微流控晶片單細胞自動分析裝置。
【背景技術】
[0002]單細胞分析論對於疾病的早期診斷和治療還是藥物的設計和副作用控制都具有潛在的重要意義。因此研究高效、簡便的單細胞分析方法和儀器，在臨床實踐中顯得尤為重要。單細胞組分分析通常包括細胞進樣、衍生、溶膜、分離及檢測等多個步驟，操作較複雜。儘管微晶片以其網絡通道結合微閥、微泵在單細胞操控方面取得了一些成果，實現了單細胞分析的所有步驟集成在一塊微流控晶片上完成。但是，對單細胞進樣和溶膜等步驟的操作，仍需依靠實驗人員藉助顯微鏡利用各種細胞操控技術手動完成。之後，才能利用雷射誘導螢光檢測裝置進行細胞組分檢測。
[0003]現有的用於單細胞分析的微流控晶片雷射誘導螢光檢測裝置是單光路結構，其基本原理是:雷射器固定在倒置顯微鏡一側。激發光經空間濾波擴束器到達二色分光鏡，被反射至晶片微通道，並聚焦成直徑幾十微米的光斑。被測細胞或組分經過光斑受到激發，發射光經二色分光鏡到達倒置顯微鏡光學聚焦系統，並被反射至探測針孔，經長波濾光片進入光電倍增管。光電倍增管的陰極將入射光的能量轉換為光電子，光電子經由連接於光電倍增管的微光測量儀收集並轉換成電信號輸出到記錄儀。由於現有檢測裝置是單光路結構，雷射光斑位置固定，如需檢測不同區域的目標，則需手工移動被測物，操作複雜、費時，且不易重複。以十字型通道晶片上的單細胞分析為例，在單細胞進樣階段，需先在明視場下，將通道交叉區域置於顯微鏡視野，利用微流控技術手動操控細胞，將單個細胞從大量細胞基體中捕捉出來，輸送到分離通道，進行溶膜。然後需迅速將分離通道末端檢測點置於顯微鏡視野並迅速將明視場轉為暗視場，再利用晶片毛細管電泳進行組分分離和雷射誘導螢光檢測。
[0004]因此，現有的單光路裝置不易實現連續和自動檢測，存在裝置複雜、手工操作繁瑣、效率低、重現性差等問題，不易被更多實驗人員所掌握。同時也影響了微分析系統在單細胞分析領域的進一步發展。而用於單細胞自動分析的裝置還未見專利和相關文獻報導。

【發明內容】

[0005]為了克服現有單細胞分析裝置的缺點，提高檢測效率及實驗重現性、簡化儀器裝置，本發明提供一種使雷射光束在進樣通道和分離通道自動切換的雙光路裝置，本發明還提供與之配合的微流控電源裝置以及數據採集和處理接口。
[0006]本發明的技術解決方案如下:
一種用於微流控晶片單細胞自動分析的雙光路裝置，其特徵是包括雙光路光學單元、數據採集單元、微流控電源、光路控制單元:其中:雙光路光學單元中的光電倍增管(119)的輸出端與數據採集單元中的放大電路(2)連接；數據採集單元中的模數轉換器(3)通過RS232接口與數據處理單元(4)連接；數據處理單元(4)的輸出經RS232接口與直流高壓電源(5)連接；數據處理單元(4)的輸出經RS232接口與光路控制單元的數模轉換器(6)連接，控制伺服電機(7)驅動光路轉換盤(102)。
[0007](I)雙光路光學單元:包括雷射光源、光路轉換盤、平面反射鏡組、顯微鏡物鏡組、樣品臺、聚光透鏡組、凹面反射鏡、針孔、長波通濾光片、光電倍增管。光路中的所有元件位置均固定，僅通過一個可旋轉的光路轉換盤，改變雷射傳播方向；
雙光路光學單元包括初始階段即單細胞進樣階段光路和檢測階段光路:
其中:單細胞進樣階段光路，包括雷射光源(101)、光路轉換盤(102)、平面反射鏡組(103~105，109)、顯微鏡物鏡(106)、聚光透鏡(107)、半透半反鏡(108)、凹面反射鏡(110)、針孔(117)、長波通濾光片(118)、光電倍增管(119)、樣品臺(120);沿光源(101)發出光束的前進方向即OX軸方向，依次是光路轉換盤(102)上的圓孔，平面反射鏡(103)且平面反射鏡(103)法線在XOZ平面內與OX軸成30°~60°角；平面反射鏡(104)法線在XOZ面內與平面反射鏡(103)法線平行，方向相反，距離2(T30 mm;平面反射鏡(105)法線在XOY面內且與OX軸成130°~160°角；顯微鏡物鏡(106)聚焦雷射光束成直徑10-20 μ m的光斑，預先進行螢光標記的單個細胞在微流控晶片(8)通道交叉點流經雷射光斑，發出螢光；聚光透鏡(107)置於微流控晶片(8)上方，匯聚螢光和雷射；半透半反鏡(108)與平面反射鏡(105)法線在XOY面內垂直，透過雷射，反射螢光；平面反射鏡(109)置於沿半透半反鏡(108)反射的螢光前進方向且法線 在XOZ面內與OX軸成30°飛0°角；凹面反射鏡(I 10)法線在XOZ面內且與OX軸平行，將螢光平行反射；沿凹面反射鏡(110)反射的螢光方向依次是針孔(117)、長波通濾光片(I 18)、光電倍增管(119)；
檢測階段光路，包括雷射光源(101)、光路轉換盤(102)、平面反射鏡組(Ilf 112，116)、顯微鏡物鏡(113)、聚光透鏡組(114)、半透半反鏡(115)、凹面反射鏡(110)、針孔(117)、長波通濾光片(118 )、光電倍增管(119 )、樣品臺(120 );光路轉換盤旋轉30°、0°，沿光源(101)發出光束的前進方向即OX軸方向，是光路轉換盤(102)上的平面反射鏡；光路轉換盤(102)上的平面反射鏡法線在XOZ平面內與OX軸成30°飛0°角；光路轉換盤(102)上的平面反射鏡將雷射反射至平面反射鏡(111)，平面反射鏡(111)法線在XOZ面內與光路轉換盤(102)上的平面反射鏡法線平行，方向相反，距離2(T30 mm。平面反射鏡(112)、顯微鏡物鏡(113)、聚光透鏡(114)、半透半反鏡(115)的位置、方向分別對應於初始光路上的元件。平面反射鏡(116 )法線在XOZ面內與(109 )法線垂直；
單細胞進樣階段光路和檢測階段光路共用原件有:雷射光源(101)、光路轉換盤(102)、凹面反射鏡(110)、針孔(117)、長波通濾光片(118)、光電倍增管(119)、樣品臺(120);雷射光源(101)發出的雷射經光路轉換盤(102)的偏轉實現光路的轉換；兩個光路的發射光分別經凹面反射鏡(110)匯聚，沿針孔(117)、長波通濾光片(118)，最終到達光電倍增管(I 19)。
[0008](2)數據採集單元:所述光電倍增管的輸出端連接放大電路、模數轉換器和RS232接口與數據處理單元相連。
[0009](3)微流控電源:所述數據處理單元的輸出經RS232接口與直流高壓電源連接，程序控制電源施加夾流電壓於通道內樣品溶液，完成單細胞進樣。
[0010](4)光路控制單元:所述數據處理單元的輸出經RS232接口、數模轉換器、伺服電機驅動光路轉換盤旋轉90°，雷射光斑被置於檢測點位置。
[0011](5)數據處理單元:處理所述的數據採集單元的數據；程序控制所述的微流控電源；程序控制所述的光路控制單元。
[0012]優選的，所述的微流控晶片單細胞自動分析的雙光路裝置中的光源為雷射光源，該雷射光源安裝在卡槽內，由卡槽精確定位，拆卸方便，可根據需要更換不同波長雷射器。
[0013]優選的，所述的微流控晶片單細胞自動分析的雙光路裝置中的所有光學元件位置均固定，僅通過一個可旋轉的光路轉換盤，改變雷射傳播方向。
[0014]優選的，所述的微流控晶片單細胞自動分析的雙光路裝置中的光路轉換盤由電機帶動，繞軸心旋轉，轉換盤邊緣處成90度角位置，分別設置一圓孔和一反射鏡，以直接透過或反射雷射。進樣階段轉換盤旋轉至初始位置，雷射直接穿過圓孔，經過一組平面反射鏡反射並由物鏡聚焦，到達晶片上通道交叉區域，用作單細胞進樣。單細胞進樣後，轉換盤被旋轉至終止位置，雷射被盤上的反光鏡反射至盤外反射鏡組，經過三次反射並由另一物鏡聚焦，到達晶片上分離通道末端檢測點位置，用作單細胞組分雷射誘導螢光檢測。兩路產生的螢光經各自光路的平面反射鏡均可被反射到同一個針孔和長波通濾光片，最後至光電倍增管。
[0015]優選的，所述的微流控晶片單細胞自動分析的雙光路裝置中的樣品臺為三維微調工作檯，可手動微調晶片位置，輔助對焦。移動範圍0-13 _，精度0.001 _。
[0016]優選的，所述的微流控晶片單細胞自動分析的雙光路裝置中的數據處理單元具有數據採集處理程序、微流控電源控制程序和光路控制程序。數據處理單元可以是計算機，也可以是具有數據處理功 能的晶片等。
[0017]本發明微流控晶片單細胞自動分析的雙光路裝置的特點和優點:
1.本發明裝置的雙光路設計，通過光路轉換，使單一雷射光源在進樣階段和檢測階段分別沿兩個不同的光路傳播，從而實現單一雷射器在雷射閥門與雷射誘導螢光激發光源兩個功能間的自動轉換；
2.所述的數據處理單元可處理所述的數據採集單元所採集的數據，根據此數據控制所述的微流控電源和光路控制單元，從而實現單細胞自動分析；
3.所述的雷射光源可根據需要更換為不同波長的雷射光源。
[0018]綜上，本裝置各單元的協同工作，實現了單細胞各個分析步驟的自動連續進行，提高了工作效率，克服了手動操作的不利因素，重現性好、精確度高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1是本發明微流控晶片單細胞自動分析雙光路裝置結構框圖。
[0020]圖2是本發明裝置雙光路光學單元結構示意圖。
[0021]圖3是本發明裝置單細胞自動分析示意圖。
[0022]1:雙光路光學單元101:雷射光源102:光路轉換盤 103~105，109，111 ~112，116:平面反射鏡
106、113:顯微鏡物鏡 107、114:聚光透鏡108、115:半透半反鏡
110:凹面反射鏡117:針孔118:長波通濾光片
119:光電倍增管120:樣品臺2:放大電路3:模數轉換器4:數據處理單元
5:直流高壓電源6:數模轉換器7:伺服電機
8:微流控晶片。
【具體實施方式】
[0023]以下結合實施例和附圖對本發明作進一步說明，但不應以此限制本發明的保護範圍。
[0024]實施例1
參閱圖1和圖2，本發明是一種用於微流控晶片單細胞自動分析的雙光路裝置，其構成包括:
I)雙光路光學單元1:微流控 晶片8置於樣品臺(120)。初始階段即單細胞進樣階段光路，雷射光源(101)，由卡槽精確定位，拆卸方便，可根據需要更換不同波長雷射器。光源(101)發出的光束沿OX軸穿過光路轉換盤(102)上的圓孔，經平面反射鏡(103~105)反射至顯微鏡物鏡(106)，其中103、104法線在XOZ面內平行且與OX軸成45°角，平面反射鏡(105)法線在XOY面內且與OX軸成135°角。雷射光束在通道交叉點經顯微鏡物鏡(106)聚焦成直徑10-20 μ m的光斑，當預先進行螢光標記的單個細胞流經雷射光斑，發出螢光。螢光和雷射經聚光透鏡(107)匯聚到達半透半反鏡(108)，半透半反鏡(108)與平面反射鏡(105)法線在XOY面內垂直。在此，雷射透過半透半反鏡(108)，而螢光被反射至平面反射鏡(109)，平面反射鏡(109)法線在XOZ面內且與OX軸成45°角。然後，螢光被反射至凹面反射鏡(110)，凹面反射鏡(110)法線與OX軸平行，將螢光平行反射至針孔(117)。螢光經過針孔(117)過濾並透過長波通濾光片(118)，最終到達光電倍增管(119)。雙光路裝置中的所有光學元件均精確定位，僅通過一個可旋轉的光路轉換盤(102)，改變雷射傳播方向；終止階段即檢測階段光路，光路轉換盤旋轉90°，光源(101)發出的光束沿OX軸到達光路轉換盤(102)，被光路轉換盤(102)上的平面反射鏡反射而改變方向至平面反射鏡(111)，經與進樣階段平行的光路到達晶片通道檢測點位置，激發的螢光經與進樣階段平行的光路最終到達光電倍增管(119)，詳見圖2。
[0025]2)數據採集單元:所述光電倍增管(119)的輸出端連接放大電路(2)、模數轉換器
(3)和RS232接口與數據處理單元(4)相連。
[0026]3)直流高壓電源:所述數據處理單元(4)的輸出經RS232接口與直流高壓電源(5 )連接，程序控制電源施加夾流電壓於通道內樣品溶液，完成單細胞進樣。
[0027]4)光路控制單元:所述數據處理單元(4)的輸出經RS232接口、數模轉換器(6)、伺服電機(7)驅動光路轉換盤旋轉90°，雷射光斑被置於微流控晶片(8)分離通道末端檢測點位置。
[0028]5)數據處理單元:處理所述的數據採集單元的數據；數據處理單元(4)具有數據採集處理程序、微流控電源控制程序和光路控制程序。程序控制所述的直流高壓電源(5)執行進樣階段的單細胞進樣和檢測階段的晶片毛細管電泳分離；程序控制所述的光路控制單
J Li ο
[0029]所述的微流控晶片單細胞自動分析的雙光路裝置中的光路轉換盤(102)由伺服電機(7)帶動，繞軸心旋轉，轉換盤邊緣處成90度角位置，分別設置一圓孔和一反射鏡，以直接透過或反射雷射。
[0030]所述的微流控晶片單細胞自動分析的雙光路裝置中的樣品臺(120)為三維微調工作檯，可手動微調晶片(8)位置，輔助對焦。移動範圍0-13 mm，精度0.001 mm。
[0031]本發明裝置的工作過程包括:
1.開啟雷射光源(101 )，雙光路光學單元(I )，數據處理單元(4)等。
[0032]2.微流控晶片(8)置於樣品臺(120)，微調樣品臺，雷射光斑在微通道內精確聚焦。
[0033]3.注入細胞懸液，直流高壓電源(5)，施加一組電壓如圖3a所示，使細胞成單行由樣品池S流向樣品廢液池SW，同時緩衝溶液由B和BW流向SW，形成夾流。當細胞流經雷射光斑，產生螢光，信號由光電倍增管(119)接收，經放大電路(2)，模數轉換器(3)送數據處理單元(4)處理。數據處理單元(4)根據信號大小判斷是否為單細胞，如否，不做動作；如是，則啟動伺服電機(7)以及調整直流高壓電源(5)。
[0034]4.如3所述，數據處理單元(4)啟動伺服電機(7)，推動光路轉換盤(102)旋轉90°角，雷射光斑被轉換至微流控晶片(8)分離通道末端檢測點位置，如圖3b所示。
[0035]5.如3所述，數據處理單元(4)調整直流高壓電源(5)，輸出一組溶膜和分離電壓，完成單細胞選取、溶膜和組分分離。
[0036]6.單細胞 組分在微流控晶片(8)分離通道末端檢測點被雷射激發，螢光信號由光電倍增管(119)接收，經放大電路(2)，模數轉換器(3)送數據處理單元(4)處理，輸出結果。
[0037]實施例2
其它同實施例1，不同之處在於，103、104法線在XOZ面內平行且與OX軸成60°角，平面反射鏡(105)法線在XOY面內且與OX軸成120°角。平面反射鏡(109)法線在XOZ面內且與OX軸成60°角。
【權利要求】
1.一種用於微流控晶片單細胞自動分析的雙光路裝置，其構成包括雙光路光學單元、數據採集單元、微流控電源、光路控制單元；其中:雙光路光學單元中的光電倍增管(119)的輸出端與數據採集單元中的放大電路(2)連接；數據採集單元中的模數轉換器(3)通過RS232接口與數據處理單元(4)連接；數據處理單元(4)的輸出經RS232接口與直流高壓電源(5)連接；數據處理單元(4)的輸出經RS232接口與光路控制單元的數模轉換器(6)連接，控制伺服電機(7)驅動光路轉換盤(102)； 1)雙光路光學單元(I):包括初始階段即單細胞進樣階段光路和檢測階段光路: 其中:單細胞進樣階段光路，包括雷射光源(101)、光路轉換盤(102)、平面反射鏡組(103~105，109)、顯微鏡物鏡(106)、聚光透鏡(107)、半透半反鏡(108)、凹面反射鏡(110)、針孔(117)、長波通濾光片(118)、光電倍增管(119)、樣品臺(120);沿光源(101)發出光束的前進方向即OX軸方向，依次是光路轉換盤(102)上的圓孔，平面反射鏡(103)且平面反射鏡(103)法線在XOZ平面內與OX軸成30°~60°角；平面反射鏡(104)法線在XOZ面內與平面反射鏡(103)法線平行，方向相反，距離2(T30 mm;平面反射鏡(105)法線在XOY面內且與OX軸成130 °~160°角；顯微鏡物鏡(106)聚焦雷射光束成直徑10-20 μ m的光斑，預先進行螢光標記的單個細胞在微流控晶片(8)通道交叉點流經雷射光斑，發出螢光；聚光透鏡(107)置於微流控晶片(8)上方，匯聚螢光和雷射；半透半反鏡(108)與平面反射鏡(105)法線在XOY面內垂直，透過雷射，反射螢光；平面反射鏡(109)置於沿半透半反鏡(108)反射的螢光前進方向且法線在XOZ面內與OX軸成30°飛0°角；凹面反射鏡(110)法線在XOZ面內且與OX軸平行，將螢光平行反射；沿凹面反射鏡(110)反射的螢光方向依次是針孔(117)、長波通濾光片(I 18)、光電倍增管(119)； 檢測階段光路，包括雷射光源(101)、光路轉換盤(102)、平面反射鏡組(Ilf 112，116)、顯微鏡物鏡(113)、聚光透鏡組(114)、半透半反鏡(115)、凹面反射鏡(110)、針孔(117)、長波通濾光片(118 )、光電倍增管(119 )、樣品臺(120 );光路轉換盤旋轉30°、0°，沿光源(101)發出光束的前進方向即OX軸方向，是光路轉換盤(102)上的平面反射鏡；光路轉換盤(102)上的平面反射鏡法線在XOZ平面內與OX軸成30°飛0°角；光路轉換盤(102)上的平面反射鏡將雷射反射至平面反射鏡(I 11 )，平面反射鏡(111)法線在XOZ面內與光路轉換盤(102)上的平面反射鏡法線平行，方向相反，距離2(T30 mm;平面反射鏡(112)、顯微鏡物鏡(113)、聚光透鏡(114)、半透半反鏡(115)的位置、方向分別對應於初始光路上的元件；平面反射鏡(116)法線在XOZ面內與(109 )法線垂直； 單細胞進樣階段光路和檢測階段光路共用原件有:雷射光源(101)、光路轉換盤(102)、凹面反射鏡(110)、針孔(117)、長波通濾光片(118)、光電倍增管(119)、樣品臺(120);雷射光源(101)發出的雷射經光路轉換盤(102)的偏轉實現光路的轉換；兩個光路的發射光分別經凹面反射鏡(110)匯聚，沿針孔(117)、長波通濾光片(118)，最終到達光電倍增管(I 19)； 2)數據採集單元:包括放大電路(2)、模數轉換器(3)，所述光電倍增管(119)的輸出端連接放大電路(2)、模數轉換器(3)和RS232接口與數據處理單元(4)相連； 3)直流高壓電源:所述數據處理單元(4)的輸出經RS232接口與直流高壓電源(5)連接，程序控制電源施加夾流電壓於通道內樣品溶液，完成單細胞進樣； 4)光路控制單元:包括數模轉換器(6)、伺服電機(7)，所述數據處理單元(4)的輸出經RS232接口、數模轉換器(6)、伺服電機(7)驅動光路轉換盤(102)旋轉90°，雷射光斑被置於微流控晶片(8)分離通道末端檢測點位置； 5)數據處理單元:處理所述的數據採集單元的數據；程序控制所述的直流高壓電源(5)執行進樣階段的單細胞進樣和檢測階段的晶片毛細管電泳分離；程序控制所述的光路控制單元。
2.根據權利要求1所述的用於微流控晶片單細胞自動分析的雙光路裝置，其特徵在於，所述的雷射光源(101),安裝在卡槽內。
3.根據權利要求1所述的用於微流控晶片單細胞自動分析的雙光路裝置，其特徵在於，通過一個可旋轉的光路轉換盤(102)，改變雷射傳播方向。
4.根據權利要求1所述的用於微流控晶片單細胞自動分析的雙光路裝置，其特徵在於，雙光路裝置中的光路轉換盤(102)由電機帶動並繞軸心旋轉；光路轉換盤(102)邊緣處成90度角位置，分別設置一圓孔和一反射鏡，以直接透過或反射雷射。
5.根據權利要求1所述的用於微流控晶片單細胞自動分析的雙光路裝置，其特徵在於，雙光路裝置中的樣品臺為三維微調工作檯，移動範圍0-13 mm，精度0.001 mm。
6.根據權利要求1至5任一 項所述的微流控晶片單細胞自動分析的雙光路裝置，其特徵在於所述的數據處理單元具有數據採集處理程序、微流控電源控制程序和光路控制程序。
【文檔編號】G01N15/14GK103983557SQ201410192064
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月8日 優先權日:2014年5月8日
【發明者】劉彧, 李金波, 陳奕冰, 簡丹丹, 高健 申請人:齊魯工業大學