天山雪蓮sikPrx基因在培育抗逆植物中的應用的製作方法

2024-01-19 12:50:15 2

專利名稱：天山雪蓮sikPrx基因在培育抗逆植物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種從菊科鳳毛菊屬植物天山雪蓮(Saussurea involucrata Kar. et Kir)中克隆得到SikPrx基因，構建植物表達載體，轉化植物，並對植物抗旱、抗寒和抗鹽效 果進行評價，增加了植物的抗逆性能。
背景技術：
在有氧環境下，各種生物的代謝產物中普遍含有活性氧族(ROS)，其中包括過氧 化氫(H2O2)、這些活性氧在機體的大量堆積可導致蛋白質損傷、膜脂過氧化、鹼基突變、 DNA斷裂等，妨礙各種生理生化代謝過程的正常進行，嚴重時導致細胞、組織死亡，因此逆 境對植物的傷害實際上可以歸結為過量的ROS對植物產生的傷害。為了減輕活性氧對植 物傷害，生物在進化過程中發展形成了各種抗氧化系統，以抵抗這些活性氧族的破壞作 用，並由一些酶類來修復由氧化作用所致的損害。抗氧化劑包括維生素E、維生素C、維生 素A、類胡蘿蔔素、超氧歧化酶(SOD)、穀胱甘肽過氧化物酶(GPx)、穀胱甘肽還原酶以及 peroxiredoxin (Prx)等。peroxiredoxin (Prx)基因是新近發現的一類編碼過氧化物酶的基因，主要包括硫 氧化還原蛋白過氧化物酶(TPx)、烷基過氧化氫還原酶C(AhpC)等，其中最早報導的是在釀 酒酵母中發現的TPx。該抗氧化酶系分布廣泛，幾乎存在於所有酵母、真菌、植物、寄生蟲、哺 乳動物和人類等多種生物體內。最初對Prx功能的描述主要來源於對細菌和酵母的研究。 其編碼蛋白屬於抗氧化蛋白超家族，其催化活性和蛋白序列與其它抗氧化劑完全不同，它 除了在清除活性氧中具有重要作用以外，還具有刺激細胞增殖，參與細胞的信號轉導等其 它多種功能。由於它在清除活性氧族中具有重要作用，已成為近年來研究的熱點。Prx不含有結合金屬的離子，無需與金屬離子結合就具有抗氧化作用。其抗氧化活 性是通過分解烷基過氧化物和過氧化氫，從而阻止強氧化劑-羥自由基的產生。Prx含高 度保守的具還原活性的半胱氨酸，與酶的抗氧化活性有關。根據已知的Prx基因序列與氨 基酸序列，可將其分為I-Cys和2-Cys兩類。前者僅在47位上有一個高度保守的半胱氨酸 殘基，後者則在47位和170位上分別有一個高度保守的半胱氨酸殘基。此外，2-Cys類Prx 在Cys47周圍的保守序列為苯丙氨酸-纈氨酸-半胱氨酸-脯氨酸，簡稱FVCP，而I-Cys類 Prx在Cys47周圍的保守序列為脯氨酸-纈氨酸-半胱氨酸-蘇氨酸，簡稱PVCT。2-Cys類Prx是通過一條肽鏈上的Cys47巰基與對應肽鏈上的Cysl70巰基之間 脫氫形成分子內二硫鍵即Cys47S-SCysl70，以供氫而還原氧化，然後再依靠其他供氫體將 還原型輔酶II的H+轉移至Prx，使其恢復原來的結構和功能。例如酵母的TPx，其結構為 25kDa的二聚體，當與過氧化物反應時，首先是一條肽鏈上的Cys47巰基被氧化為Cys47硫 鍵，再與另1條肽鏈上的Cysl70巰基結合，這樣氫離子可還原過氧水，從而發揮抗氧化作 用。爾後通過硫氧化還原蛋白氧化態與還原態間的轉換，將還原型輔酶II的氫離子轉移給 Prx，使Prx再生。許多試驗證明植物的2-CysPrxs大都定位於葉綠體中。正常條件下，當葉綠體中產生0_2後即能快速地為SOD歧化為H2O2和02，H2O2及其衍生物則被APX、GPX或2_Cys Prxs 快速地清除或還原。然而，在受到乾旱、鹽鹼、低溫逆境條件下，葉綠體的S0D、APX、GPX等活 性氧清除酶的生成易被抑制或易失活。因此，如何激活葉綠體清除酶或調節其基因表達，或 導入能夠高效表達的活性氧清除酶基因，對提高植物抗逆性具有重要意義。新疆雪蓮(Sasussured involucrate Kar. et Kir.)為多年生一次性開花結實的 高山草本植物，主要分布在2400 4000m的高原寒帶地區，其境特異，最高月平均溫度3 5°C，最低月平均溫度19 21°C。與一般抗寒植物不同，雪蓮在極端低溫下通過積極的生命 活動來適應嚴寒，在雪中能旺盛生長並且開花。具有極強的耐寒、抗輻射、抗風沙、抗缺氧的 能力，是天山雪線以上的惟一大型高等植物。雪蓮長年生長在極端環境下，決定了其具有許 多特殊的抗逆功能基因，其表達產物可能在逆境條件下，具有更好的穩定性和更好的活性 功能。目前還未見關於天山雪蓮peroxiredoxin (Prx)基因sikPrx的報導。

發明內容
本發明的一個目的是為植物抗逆育種提供有價值的天山雪蓮 peroxiredoxin (Prx)的基因sikPrx，其發明的目還在於構建植物表達載體 pBI121-sikPrx，在轉基因植物中得到表達，提高轉基因植物的抗寒性、抗旱性和耐鹽性，通 過該基因的過量表達，使植物的抗逆脅迫性能得到提高，最終獲得抗寒性、抗旱性和耐鹽性 能力明顯增強的植物。通過天山雪蓮低溫誘導下基因的表達譜分析，從已建的天山雪蓮cDNA文庫中篩 選到了一個peroxiredoxin (Prx)的基因sikPrx，其序列為1。該基因基因全長935bp， 開放閱讀框為792bp，編碼263個胺基酸。通過亞細胞定位在線軟體分析表明，該蛋白質含 有定位於葉綠體信號肽，長54個胺基酸。在成熟肽的第62位和182位含有2個-Cys，Cys62 位周圍含保守序列為苯丙氨酸_纈氨酸_半胱氨酸_脯氨酸(FVCP)，屬2-Cys類Prx，與已 知的油菜(Brassica napus)的 2_Cys-peroxiredoxin 同源性最高。本發明的目的是通過以下過程和方法實現的本發明所述的從天山雪蓮中克隆sikPrx基因，其序列為1。本發明的從天山雪蓮中克隆sikPrx基因的過程如下以天山雪蓮cDNA文庫單克隆質粒為模板，用PPl其序列為2和PP2其序列 為3為引物進行擴增，得到目的基因；sikPrx基因植物表達載體構建構建植物表達載體pBI121-SikPrx ；利用上述基因構建植物表達載體，通過農桿菌介導法遺傳轉化獲得轉基因植物NaCl處理後，轉sikPrx基因菸草的相對含水量比對照菸草的含水量高；傷害率較 對照減弱；MDA含量較低；過氧化物酶活性是對照菸草的10倍。轉sikPrx基因菸草在鹽脅 迫下表現出極強的抗鹽性。不同濃度PEG6000處理後，轉sikPrx基因菸草的相對含水量比對照菸草的含水量 高；隨著PEG6000濃度的升高，傷害率呈上升趨勢，較對照菸草低；MDA含量較低；過氧化物 酶活性始終高於對照菸草。水分脅迫試驗中，轉sikPrx基因菸草的相對含水量始終高於對照組菸草，隨著脅迫的時間延長，相對含水量的下降趨勢小於對照菸草；傷害率較對照減弱，下降的幅度高達 10倍；MDA含量較對照較低；過氧化物酶的活力呈現明顯的上升趨勢。轉SikPrx基因菸草 在乾旱脅迫下表現出極強的抗旱性。低溫脅迫試驗中，轉SikPrx基因菸草的相對含水量始終高於對照組菸草，相對含 水量的下降趨勢小於對照菸草；傷害率較對照低；MDA含量較對照較低；過氧化物酶的活力 呈現明顯的上升趨勢。轉SikPrx基因菸草在低溫下表現出極強的抗寒性。轉天山雪蓮peroxiredoxir^Prx)基因sikPrx菸草的抗逆功能分析表明，轉基因 菸草對乾旱、高鹽和低溫都表現出了極強的抗性水平。


圖 1 是天山雪蓮 pGM-sikPrx PCR 鑑定圖 Figl :The amplification of pGM-sikPrx圖 2 是天山雪蓮 pGM-sikPrx 酶切鑑定圖 Fig2 :The enzyme digestion ofpGM-sikPrx圖3是天山雪蓮sikPrx胺基酸同源性分析Fig3 :The homology analysis of amino acid of sikPrx圖 4 是 pBI121-sikPrx PCR 鑑定 Fig4 :PCR identification ofpBI121-sikPrx圖 5 是 sikPrx 轉化菸草 PCR 檢測 Fig5 :The amplification of transgenic tobacco ofsikPrx圖 6 是 sikPrx 轉基因菸草 RT-PCR 分析 Fig6 =RT-PCR analysis on sikPrx transgenic tobacco圖7是逆境脅迫對轉基因菸草形態的影響圖8是鹽脅迫對轉基因菸草生理指標的影響圖9是PEG6000脅迫對轉基因菸草生理指標的影響圖10是水分脅迫對轉基因菸草生理指標的影響圖11是低溫脅迫對轉基因菸草生理指標的影響圖12是天山雪蓮sikPrx植物表達載體pBI121_SikPrx的構建流程 1 中1, MarkerIII 2-3, pGM-sikPrx 1, MarkerIII 2-3, pGM-sikPrx圖 2 中1. enzyme digestion(Xbal/SacI) 3. enzyme digestion (EcoRl)2. 4 Plasmid 5. MarkIII圖 4 中l.Markerlll 2. Negaive 3-5. PCR of pBI121_sikPrx圖 5 中l-10.pBI121-sikPrx 轉化菸草 0. Negative Μ· Marker III圖 6 中3-5.pBI121-sikPrx 轉化菸草 2. Negative Μ· Marker III圖 7 中
l,500mmoINaCl 處理 2，30% PEG6000 處理 8d 3，乾旱脅迫 9d 的實驗
具體實施例方式實驗涉及的藥品瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒為Tiangen公司生產；EcoR I、XbaI、 SacI、T41igase和Taq酶均購於上海生物公司；pGM-Τ載體購於北京Tiangen公司；DNA瓊 脂糖凝膠回收試劑盒購於北京百泰克公司。具體實驗操作依據[美]J.薩姆布魯克D. W.拉 塞爾的《分子克隆實驗指南》。實施例1 天山雪蓮cDNA文庫單克隆質粒的提取取天山雪蓮cDNA文庫單克隆保存的甘油管於IOmlLB液體培養基(Cm 50 μ g/ml) 中，37°C 220rpm振蕩培養過夜。蘸取菌液於LB固體培養基(Cm 50 μ g/ml)平板上劃線培 養，37°C暗培養12-16hr。挑取單克隆於20mlLB液體培養基(Cm 50 μ g/ml)中，37°C 220rpm 振蕩培養14hr，提取質粒，具體方法如下1)將菌液分裝於1. 5ml Ep管，12000rpm離心3min，棄上清液；2)加入400ml STE溶液，重懸，12000rpm離心3min，棄上清液；
3)沉澱用150 μ L鹼裂解溶液I重懸，混勻；4)加入新鮮配製的300 μ L鹼裂解溶液II，輕輕混勻，至溶液清澈；5)加入225 μ L鹼裂解溶液III，輕輕混勻，冰上放置5min ；離心(12000rpm， 5min)；6)吸取上清於另一新Ep管，加入等體積三氯甲烷，充分混勻，室溫放置5min ；離心 (10000rpm,5min)；7)小心吸取上清於另一新Ep管，加入兩倍體積無水乙醇約為850 μ L，-20°C放置 IOmin ；離心(12000rpm, 5min)；8)棄去上清，沉澱用70%乙醇洗滌兩次，室溫吹乾後溶於40 μ L TE (含RNase A 20 μ g/ml)溶液中，37°C溫育 30min。實施例2 從天山雪蓮中克隆到SikPrx基因以天山雪蓮cDNA文庫單克隆質粒為模板，用PPl其序列為2和PP2其序列 為3為引物進行擴增，同時以去離子水為模板進行擴增作為陰性對照。PP1 為2
5' TCTAGAAGATTCAACGATGGCT 3'
PP2為3
5』 GAGCTCTTAGTTATACAGCTGCAA 3』
PCR反應體系(20 μ 1)為:
10XPCR Buffer 2. 0 μ 1
dNTPs (各 2. 5mM) 0. 5 μ 1
MgCl2 (25mM)1. 2μ 1
上遊引物(25 μ Μ)0. 5μ 1
下遊引物(25 μ Μ)0. 5μ 1
模板 DNA (ddH20)0. 5μ 1
Taq DNA Polymerase(2. 5U/μ 1)0. 3μ 1
ddH2014. 5μ 1Total20. 0μ 1PCR 反應程序為95°C預變性 4min ；95°C變性 30s，60°C 復性 30s，72°C 延伸 45s， 30cycles ；72°C延伸 IOmin ；4°C保溫。PCR反應結束後，產物經濃度為1. 0 %的瓊脂糖凝膠電泳分離後，使用Tiangen 的瓊脂糖凝膠回收試劑盒按照說明書方法分別回收目的基因，得到的目的片段命名為 sikPrxο 如圖 1、2。實施例3 構建sikPrx基因植物表達載體構建植物表達載體pBI121-SikPrx。用Xbal/SacII分別雙酶切植物表達載體 PBI121，獲得載體片段。回收目的基因片段和載體片段。將目的基因片段與載體片段進行 體外連接，經鑑定正確的重組質粒分別命名為pBI121-sikPrx。在本實施方案中，我們選用 菸草作為轉基因植物材料，也可選用其它植物作為轉基因材料。如圖4、12。在本實施方案中，sikPrx基因和pBI121構成一個植物表達載體，用於植物的轉 化。根據本發明的這一實施方案，構建所選用的植物表達載體除了 PBI121之外，還可以選 用其他植物表達載體。實施例4 農桿菌的轉化4. 1農桿菌感受態的製備1)從新鮮的GV3101平板上挑取一個單菌落於LB液體培養基(5ml)+Rif (50ug/ ml)+Gen(50ug/ml)中，於 28°C、200rpm 振蕩培養 48hr ；2)取 200ul 菌液於 20ml 的含 Rif (50ug/ml)及 Gen(50ug/ml)的 LB 液體培養基中 活化培養至OD6tltl = 0. 5-0. 8收集菌液，冰浴30min ；3)分裝菌液於1. 5ml離心管，於4°C，6000rpm離心5min，棄盡上清，收集農桿菌細 胞；4)將沉澱的農桿菌用750ul預冷的0. 05mol/LCaCl2重懸，4 °C，8000rpm離心 5min ；5)棄上清用75ul 0.05mol/lCaCl2(10%甘油)重懸細胞，保存於_70°C。4. 2植物表達載體轉化根癌農桿菌GV3101 (凍融法)1)吸取10 μ 1上述重組載體質粒(約0. 5 μ g/ μ 1)，與75 μ 1 GV3101感受態細胞 輕輕混勻，冰浴30min，然後液氮凍存5min ；2)迅速置於37°C水浴2min ；3)加入 600 μ 1 液體 LB 培養基(Rif+Gen)，28°C、200rpm 振蕩培養 5hr ；4)將上述培養液於6000rpm離心5min，收集農桿菌細胞，棄去500 μ 1液體培養 基，剩餘100 μ 1重懸細胞；5)將菌液塗布在含有 Kan 50 μ g/ml, Rif50 μ g/ml 及 Gen50 μ g/ml 的固體 LB 培 養基平板上，28°C培養24-48hr。4. 3陽性克隆篩選挑取若干單菌落，進行菌落PCR，將篩選出的陽性克隆命名為 pBI121-sikPrx-GV3101。在本實施方案中，植物表達載體導入農桿菌的方法為凍融法。凍融法為本領域技術人員非常熟悉的技術操作，不是本發明的關鍵。通過PCR檢測陽性的農桿菌菌株，用於轉 化植物。實施例5 菸草遺傳轉化及再生本發明中對於靶植物的轉化方法不是關鍵，可以使用本領域技術人員所熟悉的各 種不同的轉化技術將重組DNA序列導入待轉化的靶植物細胞。這些方法包括但不僅限於農 桿菌侵染法，微粒轟擊法，顯微注射法，共沉澱法，電穿孔法，以及子房注射植物受精胚囊法 等均可。本方案中用於將轉化細胞再生成植株的方法，可以使用適合於其他靶植物。最好 使被轉化的序列穩定的整合到靶植物細胞的基因組中，從而使其在傳代的過程中不被丟 失。另外，用於轉化靶植物的核苷酸序列可以以線性，環形或其它重組載體的形式如人工染 色體的形式存在。5. 1農桿菌浸染液的製備1)從-70°C保存的含有pBI121-sikPrx-GV3101的GV3101農桿菌甘油管中挑取 菌塊，接種於5ml附加有Kan 50 μ g/ml, Rif 50 μ g/ml, Gen 50 μ g/ml的LB液體培養基中， 28 0C，200rpm 振蕩培養約 30hr ；2)吸取 200 μ 1 菌液，再用 20ml LB 液體培養基(Kan 50 μ g/ml，Rif50 μ g/ml，Gen 50 μ g/ml)稀釋，28°C，200rpm 振蕩培養約 4hr ；3)活化的菌液培養至OD6tltl = 0. 4-0. 6時，即為轉化用的浸染液。5. 2 浸染1)超淨工作檯上將浸染液倒入無菌培養皿中，將無菌菸草葉片剪成Icm2大小的方 塊，放入菌液中，振蕩浸染IOmin ；2)取出菸草葉片，用濾紙吸乾淨葉盤上附著的菌液；3)在共培養基(MS+6-BA2. 0mg/L+IAA0. 3mg/L)上覆一張無菌濾紙，將浸染過的葉 盤均勻地擺放在濾紙上；在26°C暗培養條件下共培養2-3天。5. 3抗性愈傷組織篩選及出芽誘導將共培養過的菸草葉盤轉移至MS+6-BA 2. Omg/L+IAA 0. 3mg/L+Kan 50mg/L+Cb 500mg/L的菸草誘導選擇培養基上，葉盤傷口充分接觸培養基。每15-20天轉接一次，轉接
1-2次以後，葉盤邊緣逐漸產生淡綠色、緻密的愈傷組織，繼續培養直至誘導出叢生芽。5. 4轉化植株的生根培養和移栽待叢生芽長至2-3cm左右時，將其切下轉接到MS+IAA 0. 3mg/L+Kan 50mg/L+Cb 500mg/L的菸草生根選擇培養基上進行生根培養。轉基因菸草15天左右開始有根生成，待根系發達時，將根系生長良好的轉化植 株，去除封口膜，室溫環境中進行煉苗7天左右，然後用水洗淨培養基，將苗轉入基質(蛭 石腐質土 =2 1)中，26°C，16hr 40 μ mol · πΓ2 · s—1光照，70%相對溼度條件下培養，前
2-3天需遮陰、避光、保溼。實施例6 轉基因菸草的分子檢測6. 1轉基因菸草的PCR鑑定6. 1. 1 菸草 DNA 的提取(SDS 法)(1)稱取植物幼嫩葉片約0. Ig於研缽中，加液N充分研磨至粉末狀。
(2)將粉末分裝至1. 5mL的小離心管中，加入800 μ 1的CTAB提取緩衝液，充分混 勻，於 65°C水浴 20-30min。(3)將離心管冷卻至室溫後，加入400 μ 1的氯仿，充分混勻後，於10，OOOrpm離心 5min。(4)吸取上清至另一離心管，加入1/10V的10%的CTAB和600 μ 1的氯仿，充分混 勻後，10，OOOrpm離心5min。(重複一次)(5)吸取上層液體至另一離心管，加入1/10V的NaAC(pH5. 2)和2V的預冷的無水 乙醇，在_20°C沉澱IOmin。(6) 10，OOOrpm離心IOmin後，倒掉液體，可在離心管底部看到白色膠狀物質即為 DNA。(7)用70%的乙醇洗沉澱2次後，吸乾液體，吹乾後加入40 μ 1的ddH20溶解。6. 1.2轉基因菸草的PCR鑑定以提取的轉化基因的菸草DNA為模板，用LPl其序列為2和LP2其序列為 3為引物進行擴增，同時以去離子水為模板進行擴增作為陰性對照，擴增體系如實施 例2。如圖5。6. 2轉基因菸草的RT-PCR檢測6. 2. 1待檢測植株總RNA的提取TIANGEN公司的TRNzol總RNA提取試劑提取已鑑定的轉基因菸草和未轉化的菸草 總 RNA 1)將研缽及所用的器具在180°C烘箱烘烤6hr以上，其餘所使用的槍頭、離心管均 使用0. 1 %的DEPC處理，高壓滅菌；2)取植物幼嫩葉片約0. Ig於研缽中，加液N充分研磨至粉末狀；3)將粉末分裝至1. 5mL的小離心管中，加入Iml的TRNzol提取試劑，充分快速混 勻，室溫放置3-5min。4) 10000rpm，4°C離心5min，吸上清至一新的離心管，加入200 μ 1氯仿，劇烈振蕩 混勻；5) 10000rpm，4°C離心5min，吸取上層液體至另一新的離心管後，加入600 μ 1預冷 的異丙醇，於_20°C沉澱30min ；6) IOOOOrpm,4°C離心IOmin後，倒掉液體，在離心管底部即可見到白色沉澱，即為 總 RNA。7)用70%的乙醇(DEPC處理)洗滌沉澱2次後，吸乾液體，吹乾後加入30 μ 1 ddH20 (DEPC處理)溶解，保存於_20°C備用。6. 2. 2cDNA 第一鏈的合成在DEPC 處理的 0. 2ml 離心管中加入 RNA 2 μ 1，dNTP (2. 5mM) 1 μ 1，Oligo dT 1 μ LddH2O 5μ 1後，在70°C水浴5min後迅速置於冰上lmin。然後在離心管中加入Rnase Inhibitor 0. 5 μ 1，AMV 反轉錄酶 0. 5 μ 1，42°C 0. 5hr,95°C 5min 後，冷卻至 4°C。6. 2. 3cDNA第二鏈的合成及擴增在PCR反應管中加入cDNA第一鏈反應產物1 μ l，5XTaq buffer 4 μ 1， MgCl2 (25mM) 1. 0μ 1，dNTP (2. 5mM) 0. 5 μ 1，上下遊引物(25ymol)各 0· 5 μ 1，ddH20 補至20 μ 1，條件同實施例2。如圖6。實施例7轉基因植株抗逆生理指標的測定過氧化物酶(POD)的活力測定、丙二醛(MDA)含量的測定、相對含水量的測定和傷 害率的測定參照李合生(李合生.植物生理生化實驗原理和技術[Μ].北京高等教育出版 社，2003. Ρ164-165，，Ρ260-261，Ρ261-263)。重複 3 次。如圖 8、9、10、11。轉基因植株被鑑定後，通過無性繁殖獲得無菌苗，在MS培養基上生根後。植株成 活後選取生長一致的苗(5-7葉期)，用打孔器打取已檢測的陽性轉基因菸草和非轉基因的 菸草(NC89)植株的葉片各10片，放入裝有IOml的去離子水的玻璃試管中。低溫脅迫設置 四個溫度梯度15°C，4°C，0°C，-4°C。在低溫培養箱中，待溫度降到設定溫度時，處理8h，後 取植株第二到第五片葉片進行各項生理指標測定。PEG6000 模擬乾旱設置四個濃度梯度0% PEG6000,10% PEG6000,20% PEG6000, 30% PEG6000, NC89空白菸草對照組，每個濃度分別處理三棵，各組每株每天施IOOml PEG6000溶液，高濃度的PEG6000溶液從低濃度開始，每隔24h遞增10%，直到達到終濃度， 處理9d後取植株第二到第五片葉片進行各項生理指標測定。NaCl 設置四個濃度梯度0mmolNaCl、IOOmolNaCl，200mmolNaCl，500mmolNaCl， NC89空白菸草對照組，每個濃度分別處理三棵，各組分別每株每天施IOOmlNaCl溶液，高濃 度的NaCl溶液從低濃度開始，每隔24h遞增lOOmmolNaCl直到達到終濃度，處理8d後取植 株第二到第五片葉片進行各項生理指標測定。序列表石河子大學天山雪蓮SikPrx基因在培育抗逆植物中的應用31935DNA ^Lljll^ (Saurrea. involucrata Kar. etKir.)5，UTP(1). . . (9)CDS(10). . . (801)3，UTP(802). . . (935)1Translation of DNAMAN2(10—801)Universal codeTotal amino acid number :263，MW = 340940162]Max0163]10164]10165]0166]610167]210168]0169]1210170]410171]0172]1810173]610174]0175]2410176]810177]0178]3010179]1010180]0181]3610182]1210183]0184]4210185]1410186]0187]4810188]1610189]0190]5410191]1810192]0193]6010194]2010195]0196]6610197]2210198]0199]7210200]241
Max ORF starts at AA pos 3(may be DNA pos 9)for 263AA(789bases), Mff = 29085 gattcaacg atg get tgt tea tct get tea cct get ctt ctt tct tct cca ate get aga Met Ala Cys Ser Ser Ala Ser Pro Ala Leu Leu Ser Ser Pro lie Ala Arg 70809010010120
tac att tcc ccc aaa tcc gtt ctc tcc caa acc cta agt ttt tcc ggt tc
aac Asn
ttc Ser
tcc Ser
tct Ser
Tyr lie Ser Pro Lys 130140
ctc gat caa ttt cag ate caa Ser lie Asn Phe Arg Ser Lys 190200
cgc tcg ttg caa tcg att cgt tgt Ala Arg Cys Asn Arg Phe Val Val
250260
aga ctt cga age aga age cgt ttt Asp Phe Glu Ala Glu Ala Val Phe
310320
tat egg gag gaa ata tgt ggt act lie Gly Arg Lys Tyr Val 370
tga gat cac tgc ttt Glu lie Ihr Ala Phe 430
ggg tgt ttc tgt aga Gly Val Ser Val Asp
aac Ihr
att Leu
gtc Ser
gga Glu
tgg ggg Gly Gly
tgg tga GlyAsp
gtc Ser
aga caa Asp Lys
aga tga Asp Glu
atg ccc Cys Pro
gtt Phe
gga Glu
aac Ihr
age Ala
ttc Ser 490 cct Leu 550 taa Asn 610 agg Gly 670 aat Met 730
tgg atg gaa Gly Trp Lys
tgt Val
ι
ggt Val
ι
gag Arg
gtt Leu
tat lie
aac Ihr
Ser Val Leu Ser Gln Thr
150160
ate cat cca ctc cgc act Ser lie His Ser Ala Leu 210 220 caa ggc tgg act acc act Lys Ala Gly Leu Pro Leu
270280
tga tea aga gtt cat caa Asp Gln Glu Phe lie Asn
330340
ctt ctt cta ccc att gga Val Leu Phe Phe Tyr Pro Leu Asp 380390400
tag cga ccg ata tgc tga att tga Ser Asp Arg Tyr Ala Glu Phe Glu 440450460
cag cgt gtt ctc gca tct tgc ttg Ser Val Phe Ser His Leu Ala Trp 500510520
ttt gaa cta tcc att gat ttc gga Leu Asn Tyr Pro Leu lie Ser Asp 560570580
gat caa aga tea ggg gat age gtt lie Lys Asp Gln Gly lie Ala Leu 620630640
tea gca ctc gac gat caa caa tct Gln His Ser Thr lie Asn Asn Leu 680690700
act tea cgc att gca att tgt aca Leu His Ala Leu Gln Phe Val Gln 740750760
gcc tgg ggg gaa gtc aat gaa gcc Pro Gly Gly Lys Ser Met Lys Pro
Leu Ser Phe Ser Gly Ser
170180
ccc cgt tcg ctc ttc tac Pro Val Arg Ser Ser Ihr
230240
agt tgg aaa caa ggc acc Val Gly Asn Lys Ala Pro
290300
tgt taa get ctc tga tta Val Lys Leu Ser Asp Tyr
350360
ctt cac ttt tgt ttg tcc Phe Thr Phe Val Cys Pro
410420
gaa gtt gaa cac aga agt Lys Leu Asn Thr Glu Val
470480
ggt aca aac aga tag aaa Val Gln Thr Asp Arg Lys
530540
tgt gac aaa gtc aat ttc Val Thr Lys Ser lie Ser
590600
gag agg get att cat aat Arg Gly Leu Phe lie lie
650660
tgc aat egg cag aag cgt Ala lie Gly Arg Ser Val
710720
aga gaa ccc aga tga ggt Glu Asn Pro Asp Glu Val
770780
tga tcc taa act cag caa Asp Pro Lys Leu Ser Lys
790 800 810 820 830 840
781 gga ata ctt tgc age tgt ata act aaa ttc att att att aaa ata taa ttt taa gaa ggg
261 Glu Tyr Phe Ala Ala Val * * *
850 860 870 880 890
841 gtgggtgttt ttttttgcgg actccaggca tcactaactg ggagcgcttt tcctagtata
901 tataacaaac ccccccaagc ctaatatagt gatag
2
22
DNA
人工序列
2
tctagaag attcaacgatggct
3
22
DNA
人工序列
3
gagctcgagtttaggatcaggc
權利要求
1.一種從天山雪蓮中克隆SikPrx基因，其特徵在於該基因935bp，其序列為1， 在5』非編碼區有9bp，3』非編碼區有134bp，最大開放閱讀框為792bp，編碼263個胺基酸。 通過亞細胞定位在線軟體分析表明，該蛋白質含有定位於葉綠體信號肽，長54個胺基酸。 在成熟肽的第62位和182位含有2個-Cys，Cys62位周圍含保守序列為苯丙氨酸-纈氨 酸_半胱氨酸_脯氨酸(FVCP)，屬2-Cys類Prx。
2.一種利用上述基因SikPrx基因構建的植物表達載體。
3.一種從天山雪蓮中克隆序列為1的SikPrx基因的用途，其特徵在於利用上述 基因構建植物表達載體，通過遺傳轉化獲得抗寒轉基因植物。
4.一種從天山雪蓮中克隆序列為1的SikPrx基因的用途，其特徵在於利用上述 基因構建植物表達載體，通過遺傳轉化獲得抗旱轉基因植物。
5.一種從天山雪蓮中克隆序列為1的SikPrx基因的用途，其特徵在於利用上述 基因構建植物表達載體，通過遺傳轉化獲得抗鹽轉基因植物。
全文摘要
本發明涉及一種天山雪蓮sikPrx基因在培育抗寒、抗旱和抗鹽植物中的應用，本發明從天山雪蓮中克隆sikPrx基因，利用上述基因構建植物表達載體，遺傳轉化獲得抗逆轉基因植物。本發明從天山雪蓮中克隆sikPrx基因，並在轉基因植物中得到表達，提高轉基因植物的抗寒、抗旱和抗鹽性，通過該基因的過量表達，使植物的抗低溫脅迫、抗旱和抗鹽性能得到提高，最終獲得抗逆能力明顯增強的植物。
文檔編號C12N15/53GK102115758SQ200910113590
公開日2011年7月6日 申請日期2009年12月22日 優先權日2009年12月22日
發明者喻娜, 張煜星, 徐登獻, 王愛英, 祝建波 申請人:石河子大學