一種基於化學發光體系的硫化氫檢測方法與流程
2023-06-12 14:46:16
本發明屬於分析化學領域，具體涉及一種基於化學發光體系的硫化氫檢測方法。
背景技術：
硫化氫（h2s）已經被報導是生物體內扮演著重要功能的生物信號分子，它是繼一氧化氮（no）和一氧化碳（co）之後被廣泛認可的第三種氣體遞質。生物體內的硫化氫主要是三種酶反應的副產物產生的。硫化氫參與一系列的生理活動，比如保護血管流量和壓力、調節細胞生長和死亡、減少缺血再灌注損傷、調節炎症以及與自由基反應產生的抗氧化效應等。生物體內硫化氫的濃度是受到嚴格控制的，正常血液中硫化氫濃度大約在30-100µm。硫化氫濃度的異常與許多疾病有關，如高血壓、動脈粥硬化、糖尿病、阿爾茨海默病等，實現對體內硫化氫的檢測顯得尤為重要。現階段，研究人員開發出的主要檢測方法有螢光法、表面增強拉曼法、電致化學發光法、氣象色譜法等。但是這些方法均需要複雜而漫長的前期準備工作或貴重繁瑣的儀器操作。因此，發展一種簡單快捷的硫化氫檢測方法是迫切需要的。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種成本低、操作簡單、重現性好的基於化學發光體系的硫化氫檢測方法。
為實現上述目的，本發明採用如下技術方案：
一種基於化學發光體系的硫化氫檢測方法，包括以下步驟：
步驟s1：製備辣根過氧化物酶催化的魯米諾-過氧化氫化學發光體系，用bpcl微弱化學發光測量儀測定該體系的化學發光信號，得到第一發光強度；
步驟s2：將不同濃度的硫化氫分別和辣根過氧化物酶混合，然後分別加入到魯米諾-過氧化氫化學發光體系內，用bpcl微弱化學發光測量儀測定各體系的化學發光信號，得到不同濃度硫化氫下體系的發光強度並結合第一發光強度，繪製標準曲線；
步驟s3：將待測樣品和辣根過氧化物酶混合，然後加入到魯米諾-過氧化氫化學發光體系內，用bpcl微弱化學發光測量儀測定該體系的化學發光信號，得到第二發光強度並結合標準曲線，實現待測樣品中硫化氫濃度的檢測。
進一步，所述步驟s1具體如下：
步驟s1-1：將辣根過氧化物酶溶液與過氧化氫溶液混合，室溫反應數分鐘，得到第一溶液；
步驟s1-2：將魯米諾溶液添加到ph為7.0的tris-hcl緩衝液中，得到第二溶液；
步驟s1-3：將第一溶液與第二溶液混合，得到辣根過氧化物酶催化的魯米諾-過氧化氫化學發光體系，立即用bpcl微弱化學發光測量儀測定體系的化學發光信號，得到第一發光強度。
進一步，所述步驟s2具體如下：
步驟s2-1：將不同濃度的硫化氫分別與辣根過氧化物酶溶液混合，室溫反應數分鐘，然後再與過氧化氫溶液混合，室溫反應數分鐘，得到第一溶液；
步驟s2-2：將魯米諾溶液添加到ph為7.0的tris-hcl緩衝液中，得到第二溶液；
步驟s2-3：將第一溶液與第二溶液混合，立即用bpcl微弱化學發光測量儀測定各體系的化學發光信號，得到不同濃度硫化氫下體系的發光強度並結合第一發光強度，繪製標準曲線。
進一步，所述步驟s3具體如下：
步驟s3-1：將待測樣品與辣根過氧化物酶溶液混合，室溫反應數分鐘，然後再與過氧化氫溶液混合，室溫反應數分鐘，得到第一溶液；
步驟s3-2：將魯米諾溶液添加到ph為7.0的tris-hcl緩衝液中，得到第二溶液；
步驟s3-3：將第一溶液與第二溶液混合，立即用bpcl微弱化學發光測量儀測定體系的化學發光信號，得到第二發光強度並結合標準曲線，實現待測樣品中硫化氫濃度的檢測。
進一步，所述辣根過氧化物酶的濃度為4-6µg/ml，h2o2溶液的濃度為3-5mm，辣根過氧化物酶與h2o2的體積比為1-2:5；
所述魯米諾溶液的濃度為5-7mm，tris-hcl緩衝液的濃度為18-22mm，魯米諾溶液與tris-hcl緩衝液的體積比為1-2:8；
所述辣根過氧化物酶與魯米諾溶液的體積比為1-2:5。
優選地，所述辣根過氧化物酶的濃度為5µg/ml，辣根過氧化物酶用量為20µl，所述h2o2的濃度為4mm，h2o2的用量為50µl；
所述魯米諾溶液的濃度為6mm，魯米諾溶液用量為100µl，所述tris-hcl緩衝液的濃度為20mm，tris-hcl緩衝液的用量為100µl。
本發明採用以上技術方案，藉助魯米諾-過氧化氫體系，構建了一個用於檢測硫化氫的化學發光體系，辣根過氧化物酶作為催化劑，可以增強該化學發光體系的發光強度。硫化氫是辣根過氧化酶的抑制劑，可以抑制酶的活性，降低其催化發光的能力，當硫化氫存在時，作為催化劑的辣根過氧化酶活性被抑制，進而魯米諾-過氧化氫體系的化學發光會減弱，用不同濃度的硫化氫測定各體系的發光信號，信號強度和硫化氫濃度呈線性相關，根據得到的線性關係用於待測樣品中硫化氫濃度的檢測。
本發明的顯著優點在於：
1、所需要的原材料簡單易得，成本低廉，不需要複雜的合成步驟。
2、操作簡單，無須昂貴的儀器和複雜的操作，對硫化氫的檢測簡單而又快速。
3、本發明方法能夠直接用於檢測硫化氫，從0.78µm到40µm的濃度範圍內對硫化氫呈現較好的線性響應。
附圖說明
圖1為本發明的硫化氫檢測示意圖；
圖2為不同濃度硫化氫的發光光譜，加入不同濃度的硫化氫，相應的發光強度會變化，從a到h的硫化氫濃度分別為0µm、0.78µm、1.56µm、3.12µm、6.25µm、12.5µm、25µm、40µm；
圖3為不同濃度硫化氫相應的化學發光強度的變化，△i=i0-i，i0與i分別為硫化氫不存在和存在時的化學發光強度。
具體實施方式
以下結合附圖和具體實施方式對本發明作進一步詳細的說明。
溶液配製：
辣根過氧化物酶溶液：稱取1mg辣根過氧化物酶，加水溶解於1ml離心管中，得到濃度為1mg/ml的辣根過氧化物酶溶液，使用時，根據需要逐級稀釋配製成4µg/ml、5µg/ml、6µg/ml……的溶液備用。
h2o2溶液：取濃度為30%的h2o2溶液500µl到離心管，加水到5ml得到濃度1m的貯備液，使用時，根據需要逐級稀釋配製成3mm、、4mm、5mm……的溶液備用。
魯米諾溶液：稱取魯米諾0.08858g到5ml的離心管中，用0.1mnaoh溶液溶解，得到100mm的貯備液備用，使用時，根據需要逐級稀釋配製成5mm、6mm、7mm……的溶液備用。
實施例1
辣根過氧化物酶催化的魯米諾-過氧化氫化學發光體系
（1）取5µg/ml的辣根過氧化物酶20µl和4mm的h2o2溶液50µl在離心管混合，室溫反應三分鐘；
（2）將6mm的魯米諾溶液100µl和20mm，ph7.0的tris-hcl緩衝液800µl加入到化學發光池。
（3）將步驟（1）所得的混合液加入到化學發光池內，立即用bpcl微弱化學發光測量儀測定該體系的化學發光信號，因為辣根過氧化物酶是該體系化學發光反應的催化劑，所以得到較強的發光強度。
實施例2
標準曲線的繪製
（1）取5µg/ml的辣根過氧化物酶20µl分別與不同濃度的硫化氫混合，室溫反應三分鐘；然後再加入4mm的h2o2溶液50µl，室溫反應三分鐘；
（2）將6mm的魯米諾溶液100µl和20mm，ph7.0的tris-hcl緩衝液800µl加入到化學發光池；
（3）將步驟（1）所得的混合液加入到化學發光池內，立即用bpcl微弱化學發光測量儀測定不同濃度硫化氫下各體系的化學發光信號，記錄監測結果。
隨著硫化氫濃度升高，相對應體系的發光信號降低，根據記錄的讀數擬合相關線性方程，得到的線性方程用於待測樣品中硫化氫濃度的檢測。
如圖2所示，因為硫化氫可以抑制過氧化物酶的催化活性，從而使酶的催化能力降低，導致化學發光強度的減弱，從a到h的硫化氫濃度分別為0µm、0.78µm、1.56µm、3.12µm、6.25µm、12.5µm、25µm、40µm；從圖2可以得出，各體系的發光強度隨著硫化氫濃度的增加而逐漸減弱。
圖3為不同濃度硫化氫相應的化學發光強度的變化，△i=i0-i，i0與i分別為硫化氫不存在和存在時的化學發光強度，得到的標準曲線方程為：
y=32411logc+11759，相關係數r2=0.9904；
其中，c表示硫化氫濃度，y表示△i。
實施例3
待測樣品中硫化氫濃度的檢測
準備以下溶液：
辣根過氧化物酶：濃度4-6µg/ml；
h2o2溶液：濃度3-5mm；
魯米諾溶液：濃度5-7mm，
tris-hcl緩衝液：濃度18-22mm，
（1）取5µg/ml的辣根過氧化物酶20µl與待測樣品混合，室溫反應三分鐘；然後再加入4mm的h2o2溶液50µl，室溫反應三分鐘；
（2）將6mm的魯米諾溶液100µl和20mm，ph7.0的tris-hcl緩衝液800µl加入到化學發光池；
（3）將步驟（1）所得的混合液加入到化學發光池內，立即用bpcl微弱化學發光測量儀測定該體系的化學發光信號，收集待測樣品的化學發光強度，代入實施例2的標準曲線方程，從而獲得待測樣品中的硫化氫濃度。
進一步，測定過程中，各溶液的濃度及用量可以選擇如下：辣根過氧化物酶的濃度為4-6µg/ml，h2o2溶液的濃度為3-5mm，辣根過氧化物酶與h2o2的體積比為1-2:5；
魯米諾溶液的濃度為5-7mm，tris-hcl緩衝液的濃度為18-22mm，魯米諾溶液與tris-hcl緩衝液的體積比為1-2:8；
辣根過氧化物酶與魯米諾溶液的體積比為1-2:5。
以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利範圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋範圍。