植物疾病檢測的製作方法

2023-05-31 18:38:11 3

植物疾病檢測的製作方法
【專利摘要】本公開涉及植物疾病的檢測。具體而言，本公開提供了植物疾病檢測的方法、組合物和裝置。
【專利說明】植物疾病檢測
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年3月21日提交的美國臨時申請N0.61/465，649的優先權，該文獻以引用方式全文併入本文。
【技術領域】
[0003]本公開總體而言涉及植物疾病檢測，更具體而言，本公開涉及早期檢測柑橘屬植物的感染性疾病的方法和系統。
[0004]ASCII文本文件形式的序列表的提交
[0005]以下提交的ASCII文本文件形式的內容以引用方式全部併入本文:序列表1-15的計算機可讀形式(CRF)(文件名=Tablel.txt，包含 134KB ；Table2.txt，包含 93KB ；Table3.txt,包含 94KB ；Table4.txt,包含 25KB ；Table5.txt,包含 48KB ；Table6.txt,包含 65KB ；Table7.txt,包含 21KB ；Table8.txt,包含 55KB ；Table9.txt,包含 140KB ；Tablel0.txt,包含 119KB ；Tablell.txt,包含 85KB ；Tablel2.txt,包含 113KB ；Tablel3.txt,包含 94KB ；Tablel4.txt，包含104KB ;以及Tablel5.txt，包含6KB)。這些文件在2011年3月21日建立。
【背景技術】
[0006]植物病原體通過在全世界內破壞農作物而在許多國家對農業生產提出了重大的挑戰。
[0007]具有主要的經濟影響的疾病的實例為「柑橘黃龍」病或黃龍病(HLB)，其在東南亞、巴西和USA破壞柑橘農作物。HLB為一種媒傳疾病，其是由亞洲韌皮桿菌(CandidatusLiberibacter asiaticus (CaLas))細菌引起的，並通過食用韌皮部的昆蟲柑桔木風(Asiancitrus psyllid)散播。儘管對人健康無害,但是由於HLB對生產、樹衰退、果實大小和形狀的影響，所以其破壞了柑橘植物。甜橙、柑橘和蜜柑是高度易受影響的，然後為酸橙、葡萄柚以及其他市售的重要的柑橘種類。據報導，僅有幾種檸檬栽培品種和幾種其他的物種(例如Citrus indica和Citrus macroptera)顯示出對細菌具有一些耐受性或可能的抗性。
[0008]基於核糖體區域序列的數據,韌皮桿菌(Candidatus Liberibacter)為變形菌的α亞類(Jagoueix et al.，1994)。通過亞洲韌皮桿菌柑桔木風(Diaphorina citri)傳播的CaLas在受感染柑橘的韌皮部生存，並且一旦獲得，便在昆蟲媒介的一生內傳播。殺蟲劑可以減少木蝨群體，但是由於細菌持續在媒介中，所以單獨的一些木蝨能夠散播疾病。
[0009]由於柑橘植物在長期內保持無疾病症狀，所以重要的是在症狀出現之前識別感染。如果在早期檢測到，則可以通過在商業化的果園裡選擇性地除去樹來終止或減少疾病由感染的樹的傳播。受感染的樹可以用於提升的營養治療，從而減少症狀以及降低發展。
[0010]到目前為止，具有較少的確定的方法來檢測具有韌皮桿菌細菌的柑橘感染(如果其無症狀)。聚合酶鏈式反應(PCR)測試為用於診斷HLB的一種潛在的方法。但是，PCR是昂貴且耗時的方法，由於植物中細菌的加載是不均勻的分布的並且可以隨著時間波動，所以其進一步受到挑戰。
[0011]由於CaLas生存在韌皮部，這種途徑可能是造成部分樹被感染後細菌快速散播的原因。就該原因而言，假定CaLas存在於受感染的樹的無症狀葉上，但是濃度接近或低於PCR 檢測的極限(4.6xl02l/g)。
[0012]產生主要的經濟影響的另一種植物病原體為柑橘衰退病毒(Citrus tristezavirus(CTV) )0 CTV為植物基病毒，其屬於多形多核病毒屬，長線形病毒科，並且適於在其宿主的韌皮部組織中複製。CTV具有長度大約2000nm、直徑為10_12nm的絲狀結構。估計其RNA基因組的大小為大約20Kb，並且其首先由Karsaev et al在1995年測序(Kersevl995)。CTV被認為具有任何已知植物病毒的最大基因組之一。CTV主要感染芸香科植物，其包含經濟重要的果實農作物，例如甜橙、克萊門氏小柑橘、酸橙和葡萄柚栽培品種。這些栽培品種通過將新的根莖嫁接到現存的幼枝上來繁殖。因此，任何受感染的接穗和根莖都起到人工媒介的作用，從而將病毒引入新的區域，然後通過蚜蟲、粉蝨和水蠟蟲在局部水平上散播。最近70年中，估計超過8億棵樹(主要為克萊門氏小柑橘和甜橙種類)由於全世界內CTV的感染而被毀壞。到目前為止，CTV表現成為柑橘工業的現實且明顯的經濟負擔。
[0013]根據所感染的宿主物種以及接穗-根莖的組合，CTV感染的農作物發展成3種明顯的症狀:(I)苗黃型(SY)表徵為褪綠葉、受感染的宿主的根系統減少以及產生低質量的果實；(2)推斷在接穗/根莖之間的壞疽誘導出立衰病(QD)，從而最初導致葉凋謝以及樹葉減少，然後在出現最初症狀之後的幾周埃整個相橘樹最終死亡；(3)莖紋病(SP)較少關於宿主植物的致命，但是會顯著降低活力，其由此會大大地影響農作物的產率；即使在耐受疾病的根莖，這些症狀也是明顯的。
[0014]控制柑橘農作物的CTV感染的量度包括檢疫期、建立接穗證明程序、除去及消除受感染的樹、以及引入耐受的根莖。這取決於受感染的面積/區域的嚴重性和大小。
[0015]到目前為止，在生物及分子水平廣泛地對CTV進行表徵(Bruessow2010)。用於檢測柑橘果實農作物的CTV感染的方法包括測試某些酸橙栽培品種的病毒索引、電子顯微鏡(EM) (Bar-Jos印hl979)、實時逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、以及光譜分析(FT-1R)。
[0016]本發明提供了用於檢測植物疾病的改善的方法和組合物。
[0017]發明概述
[0018]本公開涉及通過分析植物揮發性化合物VOC來檢測諸如黃龍病(HLB)之類的植物疾病以及植物中的柑橘衰退病毒(CTV)。此外，本公開還涉及通過分析植物基因表達來檢測諸如黃龍病(HLB)之類的植物疾病以及植物中的柑橘衰退病毒(CTV)。
[0019]在一個實施方案中，本發明提供了診斷柑橘植物中的黃龍病的方法，該方法包括:a)獲得由柑橘植物釋放的揮發性化學化合物樣品；b)測量樣品中一種或多種揮發性化學化合物的數量；以及c)將一種或多種揮發性化學化合物的測定量與一種或多種揮發性化學化合物的預定值比較，從而診斷柑橘植物中的黃龍病。
[0020]在一個實施方案中，本發明提供了診斷柑橘植物的黃龍病的方法，該方法包括:a)獲得由柑橘植物釋放的揮發性化學化合物樣品山)測量樣品中一種或多種揮發性化學化合物的數量，其中所述的化合物選自:沉香醇，十三烷(C13H28),戊酮(4-0H-4-Me-2-)，二十六燒，十四烯(1-)，二十三燒，香葉醒，十四燒，苯乙醒，水楊酸甲酯，cumacrene,石竹烯，十六醇，羅勒烯(e-β-)，香葉草基丙酮，二氧化碳，丙烷，2-甲基-戊烷，O-二甲苯，2-乙基-1，4-二甲基-苯，1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-苯，2，2，3，4-四甲基-戊烷，十五烷(C15H32)，己烯乙酸酯，十三醛，vocBB45061, vocBB45212, 46541，83748，62469，4549
I,51824，48023，48272，46850，45071，48807，47176，57101，50888，45074 和 90562 ;以及 c)將一種或多種揮發性化學化合物的測定量與一種或多種揮發性化學化合物的預定值比較，從而診斷柑橘植物中的黃龍病。
[0021]在一個方面中，本發明提供了診斷柑橘植物的黃龍病的方法，該方法包括:a)獲得由柑橘植物釋放的揮發性化學化合物樣品山)測量樣品中一種或多種揮發性化學化合物的數量，其中所述的化合物選自:沉香醇，十三烷(C13H28),戊酮(4-0H-4-Me-2-)，二十六烷，十四烯(1-)，二十三燒，香葉醒，十四燒，苯乙醒，水楊酸甲酯，cumacrene,石竹烯，十六醇，羅勒烯(e-β-)，香葉草基丙酮，二氧化碳，丙烷，2-甲基-戊烷，O-二甲苯，2-乙基-1，4- 二甲基-苯，1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-苯，2，2，3，4-四甲基-戊烷，十五烷(C15H32),己烯乙酸酯，十三醛，vocBB45061, vocBB45212, 46541，83748，62469，45491，51824，48023，48272，46850，45071，48807，47176，57101，50888，45074 和 90562 ；以及 c)將一種或多種揮發性化學化合物的測定量與一種或多種揮發性化學化合物的預定值比較，從而診斷柑橘植物中的黃龍病，其中通過測量由感染黃龍病的參照柑橘植物所釋放的一種或多種揮發性化學化合物的數量來確定預定值。
[0022]在一個方面中，本發明提供了診斷柑橘植物的黃龍病的方法，該方法包括:a)獲得由柑橘植物釋放的揮發性化學化合物樣品山)測量樣品中一種或多種揮發性化學化合物的數量，其中所述的化合物選自:沉香醇，十三烷(C13H28),戊酮(4-0H-4-Me-2-)，二十六烷，十四烯(1-)，二十三燒，香葉醒，十四燒，苯乙醒，水楊酸甲酯，cumacrene,石竹烯，十六醇，羅勒烯(e-β-)，香葉草基丙酮，二氧化碳，丙烷，2-甲基-戊烷，O-二甲苯，2-乙基-1，4- 二甲基-苯，1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-苯，2，2，3，4-四甲基-戊烷，十五烷(C15H32),己烯乙酸酯，十三醛，vocBB45061, vocBB45212, 46541，83748，62469，45491，51824，48023，48272，46850，45071，48807，47176，57101，50888，45074 和 90562 ；以及 c)將一種或多種揮發性化學化合物的測定量與一種或多種揮發性化學化合物的預定值比較，從而診斷柑橘植物中的黃龍病，其中通過測量由未感染黃龍病的參照柑橘植物所釋放的一種或多種揮發性化學化合物的數量來確定預定值。
[0023]在一個方面中，本發明提供了診斷柑橘植物的黃龍病的方法，該方法包括:a)獲得由柑橘植物釋放的揮發性化學化合物樣品山)測量樣品中一種或多種揮發性化學化合物的數量，其中所述的化合物選自:沉香醇，十三烷(C13H28),戊酮(4-0H-4-Me-2-)，二十六烷，十四烯(1-)，二十三燒，香葉醒，十四燒，苯乙醒，水楊酸甲酯，cumacrene,石竹烯，十六醇，羅勒烯(e-β-)，香葉草基丙酮，二氧化碳，丙烷，2-甲基-戊烷，O-二甲苯，2-乙基-1，4- 二甲基-苯，1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-苯，2，2，3，4-四甲基-戊烷，十五烷(C15H32),己烯乙酸酯，十三醛，vocBB45061, vocBB45212, 46541，83748，62469，45491，51824，48023，48272，46850，45071，48807，47176，57101，50888，45074 和 90562 ；以及 c)將一種或多種揮發性化學化合物的測定量與一種或多種揮發性化學化合物的預定值比較，從而診斷柑橘植物中的黃龍病，其中通過測量由感染黃龍病的參照柑橘植物所釋放的一種或多種揮發性化學化合物的數量來確定預定值，其中所述的參照柑橘植物與所述的柑橘植物處於相同的發育階段。[0024]在一個方面中，本發明提供了診斷柑橘植物的黃龍病的方法，該方法包括:a)獲得由柑橘植物釋放的揮發性化學化合物樣品山)測量樣品中一種或多種揮發性化學化合物的數量，其中所述的化合物選自:沉香醇，十三烷(C13H28),戊酮(4-0H-4-Me-2-)，二十六烷，十四烯(1-)，二十三燒，香葉醒，十四燒，苯乙醒，水楊酸甲酯，cumacrene,石竹烯，十六醇，羅勒烯(e-β-)，香葉草基丙酮，二氧化碳，丙烷，2-甲基-戊烷，O-二甲苯，2-乙基-1，4- 二甲基-苯，1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-苯，2，2，3，4-四甲基-戊烷，十五烷(C15H32),己烯乙酸酯，十三醛，vocBB45061, vocBB45212, 46541，83748，62469，45491，51824，48023，48272，46850，45071，48807，47176，57101，50888，45074 和 90562 ；以及 c)將一種或多種揮發性化學化合物的測定量與一種或多種揮發性化學化合物的預定值比較，從而診斷柑橘植物中的黃龍病，其中通過測量由未感染黃龍病的參照柑橘植物所釋放的一種或多種揮發性化學化合物的數量來確定預定值，其中所述的參照柑橘植物與所述的柑橘植物處於相同的發育階段。
[0025]在一個方面中，本發明提供了診斷柑橘植物的黃龍病的方法，該方法包括:a)獲得由柑橘植物釋放的揮發性化學化合物樣品山)測量樣品中一種或多種揮發性化學化合物的數量，其中所述的化合物選自:沉香醇，十三烷(C13H28),戊酮(4-0H-4-Me-2-)，二十六烷，十四烯(1-)，二十三燒，香葉醒，十四燒，苯乙醒，水楊酸甲酯，cumacrene,石竹烯，十六醇，羅勒烯(e-β-)，香葉草基丙酮，二氧化碳，丙烷，2-甲基-戊烷，O-二甲苯，2-乙基-1，4- 二甲基-苯，1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-苯，2，2，3，4-四甲基-戊烷，十五烷(C15H32),己烯乙酸酯，十三醛，vocBB45061，vocBB45212, 46541，83748，62469，45491，51824，48023，48272，46850, 45071，48807, 47176，57101，50888，45074 和 90562 ；以及 c)將一種或多種揮發性化學化合物的測定量與一種或多種揮發性化學化合物的預定值比較，從而診斷柑橘植物中的黃龍病，其中使用質譜來測量樣品中一種或多種揮發性化學化合物的數量。
[0026]在一個方面中，本發明提供了診斷柑橘植物的黃龍病的方法，該方法包括:a)獲得由柑橘植物釋放的揮發性化學化合物樣品山)測量樣品中一種或多種揮發性化學化合物的數量，其中所述的化合物選自:沉香醇，十三烷(C13H28),戊酮(4-0H-4-Me-2-)，二十六烷，十四烯(1-)，二十三燒，香葉醒，十四燒，苯乙醒，水楊酸甲酯，cumacrene,石竹烯，十六醇，羅勒烯(e-β-)，香葉草基丙酮，二氧化碳，丙烷，2-甲基-戊烷，O-二甲苯，2-乙基-1，4- 二甲基-苯，1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-苯，2，2，3，4-四甲基-戊烷，十五烷(C15H32),己烯乙酸酯，十三醛，vocBB45061, vocBB45212, 46541，83748，62469，45491，51824，48023，48272，46850，45071，48807，47176，57101，50888，45074 和 90562 ；以及 c)將一種或多種揮發性化學化合物的測定量與一種或多種揮發性化學化合物的預定值比較，從而診斷柑橘植物中的黃龍病，其中使用差示遷移光譜儀來測量樣品中一種或多種揮發性化學化合物的數量。
[0027]在一個方面中，本發明提供了診斷柑橘植物的黃龍病的方法，該方法包括:a)獲得由柑橘植物釋放的揮發性化學化合物樣品山)測量樣品中一種或多種揮發性化學化合物的數量，其中所述的化合物選自:沉香醇，十三烷(C13H28),戊酮(4-0H-4-Me-2-)，二十六烷，十四烯(1-)，二十三燒，香葉醒，十四燒，苯乙醒，水楊酸甲酯，cumacrene,石竹烯，十六醇，羅勒烯(e-β-)，香葉草基丙酮，二氧化碳，丙烷，2-甲基-戊烷，O-二甲苯，2-乙基-1，4- 二甲基-苯，1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-苯，2，2，3，4-四甲基-戊烷，十五烷(C15H32),己烯乙酸酯，十三醛，vocBB45061, vocBB45212, 46541，83748，62469，45491，51824，48023，48272，46850，45071，48807，47176，57101，50888，45074 和 90562 ；以及 c)將一種或多種揮發性化學化合物的測定量與一種或多種揮發性化學化合物的預定值比較，從而診斷柑橘植物中的黃龍病，其中所述的柑橘植物為瓦倫西亞橘植物。
[0028]在一個實施方案中，本發明提供了診斷柑橘植物的柑橘衰退病毒(CTV)的方法，該方法包括:a)獲得由柑橘植物釋放的揮發性化學化合物樣品；b)測量樣品中一種或多種揮發性化學化合物的數量；以及c)將一種或多種揮發性化學化合物的測定量與一種或多種揮發性化學化合物的預定值比較，從而診斷柑橘植物中的CTV疾病。
[0029]在一個實施方案中，本發明提供了診斷柑橘植物的柑橘衰退病毒(CTV)的方法，該方法包括:a)獲得由柑橘植物釋放的揮發性化學化合物樣品；b)測量樣品中一種或多種揮發性化學化合物的數量，其中所述的化合物選自:月桂烯，蒈烯(S-3-)，羅勒烯(e-β-)，十六醇，檸檬烴，二十四烷，布藜烯U-);以及c)將一種或多種揮發性化學化合物的測定量與一種或多種揮發性化學化合物的預定值比較，從而診斷柑橘植物中的CTV疾病。
[0030]在一個方面中，本發明提供了診斷柑橘植物的柑橘衰退病毒(CTV)的方法，該方法包括:a)獲得由柑橘植物釋放的揮發性化學化合物樣品；b)測量樣品中一種或多種揮發性化學化合物的數量，其中所述的化合物選自:月桂烯，蒈烯(S-3-)，羅勒烯(e-β-)，十六醇，檸檬烴，二十四烷，布藜烯(α-);以及c)將一種或多種揮發性化學化合物的測定量與一種或多種揮發性化學化合物的預定值比較，從而診斷柑橘植物中的CTV疾病，其中通過測量由感染CTV的參照柑橘植物所釋放的一種或多種揮發性化學化合物的數量來確定預定值。
[0031]在一個方面中，本發明提供了診斷柑橘植物的柑橘衰退病毒(CTV)的方法，該方法包括:a)獲得由柑橘植物釋放的揮發性化學化合物樣品；b)測量樣品中一種或多種揮發性化學化合物的數量，其中所述的化合物選自:月桂烯，蒈烯(S-3-)，羅勒烯(e-β-)，十六醇，檸檬烴，二十四烷，布藜烯(α-);以及c)將一種或多種揮發性化學化合物的測定量與一種或多種揮發性化學化合物的預定值比較，從而診斷柑橘植物中的CTV疾病，其中通過測量由未感染CTV的參照柑橘植物所釋放的一種或多種揮發性化學化合物的數量來確定預定值。
[0032]在一個方面中，本發明提供了診斷柑橘植物的柑橘衰退病毒(CTV)的方法，該方法包括:a)獲得由柑橘植物釋放的揮發性化學化合物樣品；b)測量樣品中一種或多種揮發性化學化合物的數量，其中所述的化合物選自:月桂烯，蒈烯(S-3-)，羅勒烯(e-β-)，十六醇，檸檬烴，二十四烷，布藜烯(α-);以及c)將一種或多種揮發性化學化合物的測定量與一種或多種揮發性化學化合物的預定值比較，從而診斷柑橘植物中的CTV疾病，其中通過測量由感染CTV的參照柑橘植物所釋放的一種或多種揮發性化學化合物的數量來確定預定值，並且其中所述的參照柑橘植物與所述的柑橘植物處於相同的發育階段。
[0033]在一個方面中，本發明提供了診斷柑橘植物的柑橘衰退病毒(CTV)的方法，該方法包括:a)獲得由柑橘植物釋放的揮發性化學化合物樣品；b)測量樣品中一種或多種揮發性化學化合物的數量，其中所述的化合物選自:月桂烯，蒈烯(S-3-)，羅勒烯(e-β-)，十六醇，檸檬烴，二十四烷，布藜烯(α-);以及c)將一種或多種揮發性化學化合物的測定量與一種或多種揮發性化學化合物的預定值比較，從而診斷柑橘植物中的CTV疾病，其中通過測量由未感染CTV的參照柑橘植物所釋放的一種或多種揮發性化學化合物的數量來確定預定值，並且其中所述的參照柑橘植物與所述的柑橘植物處於相同的發育階段。
[0034]在一個方面中，本發明提供了診斷柑橘植物的柑橘衰退病毒(CTV)的方法，該方法包括:a)獲得由柑橘植物釋放的揮發性化學化合物樣品；b)測量樣品中一種或多種揮發性化學化合物的數量，其中所述的化合物選自:月桂烯，蒈烯(S-3-)，羅勒烯(e-β-)，十六醇，檸檬烴，二十四烷，布藜烯(α-);以及c)將一種或多種揮發性化學化合物的測定量與一種或多種揮發性化學化合物的預定值比較，從而診斷柑橘植物中的CTV疾病，其中使用質譜儀和/或差示遷移光譜儀來測量樣品中一種或多種揮發性化學化合物的數量。
[0035]在一個實施方案中，本發明提供了診斷柑橘植物的黃龍病的方法，該方法包括:a)獲得由柑橘植物產生的核酸分子樣品；b)測量樣品中一種或多種核酸分子的數量；以及c)將一種或多種核酸分子的測定量與一種或多種核酸分子的預定值比較，從而診斷柑橘植物中的黃龍病。
[0036]在一個實施方案中，本發明提供了診斷柑橘植物的黃龍病的方法，該方法包括:a)獲得由柑橘植物產生的核酸分子樣品；b)測量樣品中一種或多種核酸分子的數量，其中所述的核酸分子選自:GH3.1 (S22545043)，GH3.4 (S44237769)，KA02 (S44303609)，水楊酸甲基轉移酶(S44277040)，WRKY70 (S44288591)，MYB-related TF (S44256583)，U-box (S22566824)，HSP82 (S44237646)，蔗糖酶(S35152777)，萜烯合成酶環化酶(S22583829)，NN 脂質轉移蛋白質(LTP) (S44279331)，酸性纖維素酶 8 (S22606212)，ω -6-FAD (S44244604)酸性纖維素酶(S22606212)，萜烯合成酶 I (S44285742)，ERTF2 (S44250648)，12-氧代-植物二烯酸酯還原酶(S34125138)，脂氧化酶 2 (S34124539)，NNLTP (NCBI 編號:ΕΥ754661.1)，β -澱粉酶(S44303510)，棒麴黴素 3 (S22533016)，葡萄糖-磷酸-運送蛋白 2(S22591828, S22591828, S44257732, S22591828)，ENT-異貝殼杉烯酸羥化酶 2 (S44251582)，棒麴黴素 3 (S22533016)，α -澱粉酶(S44224848)，WRKY70 (S44225142，S44227900, S44288591);以及c)將一種或多種核酸分子的測定量與一種或多種核酸分子的預定值比較，從而診斷柑橘植物中的黃龍病。
[0037]在一個方面中，本發明提供了診斷柑橘植物的黃龍病的方法，該方法包括:a)獲得由柑橘植物產生的核酸分子樣品山)測量樣品中一種或多種核酸分子的數量，其中所述的核酸分子選自:GH3.1 (S22545043)，GH3.4 (S44237769)，KA02 (S44303609)，水楊酸甲基轉移酶(S44277040)，WRKY70 (S44288591), MYB-related TF(S44256583)，U-box(S22566824),HSP82(S44237646)，蔗糖酶(S35152777)，萜烯合成酶環化酶(S22583829)，NN脂質轉移蛋白質(LTP) (S44279331)，酸性纖維素酶 8(S22606212)，ω -6-FAD (S44244604)酸性纖維素酶(S22606212)，萜烯合成酶 I (S44285742)，ERTF2 (S44250648)，12-氧代-植物二烯酸酯還原酶(S34125138)，脂氧化酶 2(S34124539)，NNLTP(NCBI 編號:EY754661.1),β -澱粉酶(S44303510)，棒麴黴素3 (S22533016)，葡萄糖-磷酸-運送蛋白2 (S22591828，S22591828, S44257732, S22591828)，ENT-異貝殼杉烯酸羥化酶 2 (S44251582)，棒麴黴素3(S22533016)，α -澱粉酶(S44224848), WRKY70 (S44225142, S44227900, S44288591);以及
c)將一種或多種核酸分子的測定量與一種或多種核酸分子的預定值比較，從而診斷柑橘植物中的黃龍病，其中所述的核酸分子為mRNA分子。[0038]在一個方面中，本發明提供了診斷柑橘植物的黃龍病的方法，該方法包括:a)獲得由柑橘植物產生的核酸分子樣品山)測量樣品中一種或多種核酸分子的數量，其中所述的核酸分子選自:GH3.1 (S22545043)，GH3.4 (S44237769)，KA02 (S44303609)，水楊酸甲基轉移酶(S44277040)，WRKY70 (S44288591), MYB-related TF(S44256583)，U-box(S22566824),HSP82(S44237646)，蔗糖酶(S35152777)，萜烯合成酶環化酶(S22583829)，NN脂質轉移蛋白質(LTP) (S44279331)，酸性纖維素酶 8(S22606212)，ω -6-FAD (S44244604)酸性纖維素酶(S22606212)，萜烯合成酶 I (S44285742)，ERTF2 (S44250648)，12-氧代-植物二烯酸酯還原酶(S34125138)，脂氧化酶 2(S34124539)，NNLTP(NCBI 編號:EY754661.1),β -澱粉酶(S44303510)，棒麴黴素3 (S22533016)，葡萄糖-磷酸-運送蛋白2 (S22591828，S22591828, S44257732, S22591828)，ENT-異貝殼杉烯酸羥化酶 2 (S44251582)，棒麴黴素3 (S22533016)，α -澱粉酶(S44224848)，WRKY70 (S44225142, S44227900, S44288591)；以及c)將一種或多種核酸分子的測定量與一種或多種核酸分子的預定值比較，從而診斷柑橘植物中的黃龍病，其中通過測量由感染黃龍病的參照柑橘植物所產生的一種或多種核酸分子的數量來確定預定值。
[0039]在一個方面中，本發明提供了診斷柑橘植物的黃龍病的方法，該方法包括:a)獲得由柑橘植物產生的核酸分子樣品山)測量樣品中一種或多種核酸分子的數量，其中所述的核酸分子選自:GH3.1 (S22545043)，GH3.4 (S44237769)，KA02 (S44303609)，水楊酸甲基轉移酶(S44277040)，WRKY70 (S44288591), MYB-related TF (S44256583)，U-box (S22566824),HSP82(S44237646)，蔗糖酶(S35152777)，萜烯合成酶環化酶(S22583829)，NN脂質轉移蛋白質(LTP) (S44279331)，酸性纖維素酶 8(S22606212)，ω -6-FAD (S44244604)酸性纖維素酶(S22606212)，萜烯合成酶 I (S44285742)，ERTF2 (S44250648)，12-氧代-植物二烯酸酯還原酶(S34125138)，脂氧化酶 2(S34124539)，NNLTP(NCBI 編號:EY754661.1),β -澱粉酶(S44303510)，棒麴黴素3 (S22533016)，葡萄糖-磷酸-運送蛋白2 (S22591828，S22591828, S44257732, S22591828)，ENT-異貝殼杉烯酸羥化酶 2 (S44251582)，棒麴黴素3(S22533016)，α -澱粉酶(S44224848), WRKY70 (S44225142, S44227900, S44288591);以及c)將一種或多種核酸分子的測定量與一種或多種核酸分子的預定值比較，從而診斷柑橘植物中的黃龍病，其中通過測量由未感染黃龍病的參照柑橘植物所產生的一種或多種核酸分子的數量來確定預定值。
[0040]在一個方面中，本發明提供了診斷柑橘植物的黃龍病的方法，該方法包括:a)獲得由柑橘植物產生的核酸分子樣品山)測量樣品中一種或多種核酸分子的數量，其中所述的核酸分子選自:GH3.1 (S22545043)，GH3.4 (S44237769)，KA02 (S44303609)，水楊酸甲基轉移酶(S44277040)，WRKY70 (S44288591), MYB-related TF(S44256583)，U-box(S22566824),HSP82(S44237646)，蔗糖酶(S35152777)，萜烯合成酶環化酶(S22583829)，NN脂質轉移蛋白質(LTP) (S44279331)，酸性纖維素酶 8(S22606212)，ω -6-FAD (S44244604)酸性纖維素酶(S22606212)，萜烯合成酶 I (S44285742)，ERTF2 (S44250648)，12-氧代-植物二烯酸酯還原酶(S34125138)，脂氧化酶 2(S34124539)，NNLTP(NCBI 編號:EY754661.1),β -澱粉酶(S44303510)，棒麴黴素3 (S22533016)，葡萄糖-磷酸-運送蛋白2 (S22591828，S22591828, S44257732, S22591828)，ENT-異貝殼杉烯酸羥化酶 2 (S44251582)，棒麴黴素3(S22533016)，α -澱粉酶(S44224848), WRKY70 (S44225142, S44227900, S44288591);以及C)將一種或多種核酸分子的測定量與一種或多種核酸分子的預定值比較，從而診斷柑橘植物中的黃龍病，其中通過測量由感染黃龍病的參照柑橘植物所產生的一種或多種核酸分子的數量來確定預定值，其中所述的參照柑橘植物與所述的柑橘植物處於相同的發育階段。
[0041]在一個方面中，本發明提供了診斷柑橘植物的黃龍病的方法，該方法包括:a)獲得由柑橘植物產生的核酸分子樣品山)測量樣品中一種或多種核酸分子的數量，其中所述的核酸分子選自:GH3.1 (S22545043)，GH3.4 (S44237769)，KA02 (S44303609)，水楊酸甲基轉移酶(S44277040)，WRKY70 (S44288591), MYB-related TF(S44256583)，U-box(S22566824),HSP82(S44237646)，蔗糖酶(S35152777)，萜烯合成酶環化酶(S22583829)，NN脂質轉移蛋白質(LTP) (S44279331)，酸性纖維素酶 8(S22606212)，ω -6-FAD (S44244604)酸性纖維素酶(S22606212)，萜烯合成酶 I (S44285742)，ERTF2 (S44250648)，12-氧代-植物二烯酸酯還原酶(S34125138)，脂氧化酶 2(S34124539)，NNLTP(NCBI 編號:EY754661.1),β -澱粉酶(S44303510)，棒麴黴素3 (S22533016)，葡萄糖-磷酸-運送蛋白2 (S22591828，S22591828, S44257732, S22591828)，ENT-異貝殼杉烯酸羥化酶 2 (S44251582)，棒麴黴素3(S22533016)，α-澱粉酶(S44224848), WRKY70 (S44225142, S44227900, S44288591);以及c)將一種或多種核酸分子的測定量與一種或多種核酸分子的預定值比較，從而診斷柑橘植物中的黃龍病，其中通過測量由未感染黃龍病的參照柑橘植物所產生的一種或多種核酸分子的數量來確定預定值，其中所述的參照柑橘植物與所述的柑橘植物處於相同的發育階段。
[0042]附圖簡述
[0043]圖1-針對GC停留時間和補償電壓(CV)繪製的GC/DMS圖，其示出了由HLB-感染的Hamlin橘樹得到的VOC的相對離子計數。
[0044]圖2-用於由GC/DMS數據提取信息的小波變換。原始的光譜數據可以分解為低頻部分和高頻部分。
[0045]圖3-健康(下方線)與HLB感染症狀(上方線)Hamlin橘樹的GC概況片段。
[0046]圖4-通過使用與Adams文庫相匹配的停留指數和質譜來識別揮發性BinBase資料庫(「vocBB」)中的揮發性代謝物。面板(A)示出了 Adams指數與Fiehn指數的相關性；面板(B)示出了資料庫中與水楊酸甲酯相應的MS光譜。
[0047]圖5-用於佔據揮發性BinBase資料庫的4種柑橘精油的聚類圖。資料庫中，所有的精油均創建了新的入口。通過vocBB數據處理，所有的樣品均被正確的集中。
[0048]圖6-HLB感染的植物中的揮發性能，Ft.Pierce, FL。左側面板:在感染後6周，套入袋中的葉，其吸收Twister揮發物。右側面板:通過PCR和症狀描述監測疾病的進程。
[0049]圖7-對於健康和HLB感染的植物而言，在植物發育過程中暫時排放柑橘揮發物。
[0050]圖8-在健康和HLB感染的柑橘植物之間，顯著差異(p〈0.05)的代謝物的數量。正方形標記的線:所有的化合物；菱形標記的線:具有所識別的結構的化合物。
[0051]圖9-在健康和HLB感染的柑橘植物之間，顯著差異(p〈0.05)的代謝物(由星形顯示)的實例。上方:所識別的揮發物；下方:結構上未識別的揮發物。
[0052]圖10-與香味和芳香化合物有關的途徑的HLB調節。
[0053]圖11-與使用qRT-PCR進行的茉莉酮酸枝生物合成以及確認有關的特定基因的HLB調節。CO=健康；AH=表觀健康;AS=無症狀；以及SY=有症狀的植物。[0054]圖12-在成熟果實中萜類化合物途徑的確認:在該途徑中對兩種基因進行qRT-PCR分析。CO=健康；AH=表觀健康；AS=無症狀；以及SY=有症狀的植物。
[0055]圖13-在幼葉和成熟葉子中萜類化合物途徑的確認:在該途徑中對兩種基因進行qRT-PCR分析。CO=健康;AH=表觀健康;AS=無症狀；以及SY=有症狀的植物。
[0056]圖14-對於HLB疾病的早期檢測而言，單萜化合物作為潛在生物標誌物的識別。
[0057]圖15-對於葉和果實中的HLB疾病而言，水楊酸甲基轉移酶(一種早期的生物標誌物)的上調節的qRT-PCR證實。
[0058]圖16-在果實中通過HLB調節的基因/途徑的網絡。
[0059]圖17-部分(A)為與泛素依賴的降解過程有關的HLB調節的基因；部分(B)為果實中HSP82的qRT-PCR分析；部分(C)為由擬南芥知識庫，在柑橘中推斷的蛋白質-蛋白質相互作用的網絡。
[0060]圖18-健康植物與僅感染CTV的植物的主要成分分析(「PCA」)得分圖:可以觀察到健康和感染CTV植物之間的分離，並且除了一些可能的異常值以外，這兩類可以大體上分離。
[0061]圖19-所有三類的PCA得分圖:健康、CTV和CTV+Stubborn。在健康和所有CTV相關的樣品之間仍可以觀察到清楚的分離，但是在CTV和CTV+Stubborn之間存在明顯的重疊。
[0062]圖20-與CTV具有較強關係的化學品的3種實例:月桂烯、蒈烯(δ -3-)、和羅勒烯(e-β-)。這些化學品為在「健康與僅感染CTV」(圖18)和「健康與CTV相關」(圖19)存在的18種化學品中的3種。
[0063]圖21-基於SPME GC/MS HLB生物標誌物的HLB檢測(Florida)。在HLB疾病和健康樣本之間可以觀察到基於9種可分辨的生物標誌物的分離。
[0064]圖22-使用兩種平行的化學分析系統(氣相色譜質譜儀(GC/ITMS)和差示遷移光譜儀(GC/DMS))監測的得自所選的植物葉子的V0C。將由光譜輸出得到的停留時間配對並編入指數，並且在兩種數據組中相當的光譜特徵可以設置用於識別柑橘健康和疾病的假定的生物標誌物。
[0065]圖23-兩種相關的品種華盛頓臍橙和瓦倫西亞橘的GC/ITMS (TIC)光譜，補償至相同規模。
[0066]圖24-由各品種(華盛頓臍橙和瓦倫西亞橘)得到的3種質譜相對彼此顯示的在2種樣品中存在的突出峰的展開圖。上方3個光譜得自華盛頓臍橙，下方3個光譜得自瓦倫西亞橘。
[0067]圖25-V0C標誌物的對數歸一化濃度的以及它們跨越2個品種(華盛頓臍橙和瓦倫西亞橘)的分布概況的盒形圖:峰13 (RT68.464min)、峰18 (RT75.037min)、峰24(RT121.567min)和峰 34(RT141.903)。
[0068]圖26-基於GC/ITMS數據的PCA得分圖，其中使用了通過Student t檢驗被識別為明顯的4種變量:示出了由各主要成分捕獲的總可釋方差。
[0069]圖27-由瓦倫西亞橘葉子的頂部空間的分析得到的總離子色譜和GC/DMS光譜。
[0070]圖28-根據GC/DMS光譜，瓦倫西亞橘和華盛頓臍橙的平均信號強度以及它們的差異(上方面板:陽離子光譜；下方面板:陰離子光譜)。[0071]圖29-基於GC/DMS數據和Student t檢驗的所選像素，基於(A)僅陽離子光譜、(B)僅陰離子光譜、以及(C)同時兩種離子光譜的主要成分分布:(+:瓦倫西亞橘；0:華盛頓臍橙)。通過主要成分I和2解釋的方差為(A:49%和14.0%)、(B:40.0%和17.0%)以及(C:43.6% 和 16.0%)。
[0072]圖30-就華盛頓臍橙品種而言，所有SPME-GC/ITMS光譜的點積值總和(TIC)。
[0073]圖31-就瓦倫西亞橘而言，所有SPME-GC/ITMS光譜的點積值總和。
[0074]圖32-使用用於現場取樣的手提箱大小的可攜式GC/DMS傳感器。左側面板:可攜式GC/DMS結構的簡單顯示；中間面板:使用可攜式GC/DMS傳感器的現場取樣和分析；右側面板:用於提供電力的太陽能面板。
[0075]圖33-使用可攜式GC/DMS的分離植物類別的基準研究。面板A:由植物葉子得到的VOC的GC/DMS ;面板B:分離植物類別的主要成分的分析。
[0076]圖34-跨越整個信號領域的Student t檢驗的P值(p〈0.1)。
[0077]圖35-就上方的3個主要成分而言，各個像素的加載係數。
[0078]圖36-健康和HLB的平均光譜。
[0079]圖37-健康和CTV之間的分離。
[0080]圖38-基於整個停留時間範圍(左側面板)和最初的3分鐘(右側面板)的GC/DMS信號的小波係數，HLB和健康之間的分離。
[0081]圖39-使用健康和CTV樣品的GC/DMS信號的小波係數，健康和CTV樣品的分離。
[0082]圖40-顯示由健康和疾病的瓦倫西亞和Hamlin橘樹得到的VOC的相對總離子計數的色譜。
[0083]實施方案的具體描述
[0084]呈現以下描述使本領域的普通技術人員能夠進行和使用各實施方案。具體的裝置、技術和應用的描述僅以實例的方式提供。對本文所述的實施例進行的修改對於本領域的普通技術人員而言很容易是顯而易見的，並且在不脫離各實施方案的精神和範圍的條件下，本文所定義的一般原理可以用於其它實施例和應用。因此，各實施方案無意於限定本文所述的實施例，並且顯示但符合權利要求所述的範圍。
[0085]本公開涉及植物疾病的診斷。
[0086]疾病
[0087]在一些實施方案中，本發明公開了用於檢測植物的黃龍病(HLB) /柑橘黃龍病的方法和組合物。在一些方面中，本文公開了用於檢測柑橘植物的HLB/柑橘黃龍的方法和組合物。
[0088]在一些實施方案中，本發明公開了用於檢測植物的柑橘衰退病毒(CTV)的方法和組合物。在一些方面中，本文公開了用於檢測柑橘植物的CTV的方法和組合物。
[0089]揮發性化合物
[0090]在一些實施方案中，本公開涉及揮發性化合物(V0C)。如本文所用，「揮發性化合物」涉及任何種類的「揮發性化合物」，包括「誘導的揮發性化合物」(IVOC)和「生物生成的揮發性有機化合物」(BV0C)。
[0091]植物向大氣中排放大量的它們的固定碳作為VOC ;這些VOC的生產是宿主植物的內部生理狀態的應答。例如，當植物被昆蟲或食草動物食用時，它們的直接防禦應答是釋放揮發性有機化合物(Farmer，2001)。在應激反應下所排放的揮發性化合物通常被稱為「誘導的VOC」(IVOC)，其由植物葉子、果實和根釋放。這種應答不僅在生物攻擊下被誘導，而且也可以被非生物應激誘導，從而暫時改變植物的VOC概況。IVOC在植物-植物交流(Baldwin et al.2006; Bezemer and van Dam2005; Rohloff and Bones2005)、食草動物防禦(Glendinning et al.2009; Kessler and Baldwin2001; Runyon et al.2006)中起到重要作用，並且顯示有助於生物應激的抗性(Kishimoto et al.2005;Park et al.2007)。因此，在植物系統中,所排放的VOC的組合物(其數目達幾千種)包含潛在代謝過程的重要的生物化學信息(Dudareva et al.2004;Sumner et al.2003;Weckwerth2008)。可以使用分析方法收集和測量表達的V0C，從而提供植物健康狀態的短時快照。因此，VOC的測量作為監測植物生理過程的非侵入性且快速的方式的吸引人的手段，包括:開花(MUller et al.2002)、成熟(ripening) (Herrmann et al.2002)、成熟(maturing) (Rapparini et al.2001)、應激(Karl et al.2008; Lee et al.2009; Loreto et al.2006)、以及疾病狀態(Paolini etal.2008)。
[0092]捕獲和分析VOC的方法
[0093]在一些實施方案中，本發明提供了用於捕獲由植物得到的VOC的方法。如本文所提供，植物VOC取樣可以由整株植物、果實和葉子原位實施，或者由分離的植物組織直接實施(Tholl et al.2006)。
[0094]在一些方面中，可以將所排放的VOC收集在定位於最接近整株植物的固體吸附劑上，或者使用真空系統收集在吸附劑上，從而在現場的條件下由植物取樣大量的空氣。在一個方面中，普通使用的技術使用了直接靜態頂空取樣方法，由此植物VOC被收集/吸附在表面官能化的所謂的固相微萃取(SPME)纖維上。然後，在熱條件下所收集的揮發物會解吸附，並且揮發物被引入到用於化學分析的GC/MS系統中(Stewart-Jones and Poppy2006);該取樣方法適用於概括新鮮和乾燥的植物樣品(Zini et al.2002) 0
[0095]在一些實施方案中，本發明提供了用於分析VOC的方法。由於植物所排放的大量的V0C，所以可以與由各植物系統收集全球VOC指紋平行使用多種分析技術(Goff andKlee2006)。
[0096]GC/MS
[0097]在一個方面中，使用氣相色譜質譜(GC/MS )來分析植物VOC (Lytovchenko etal.2009)。氣相色譜質譜為發展良好的分析分離和監測技術，其中絡合的樣品混合物色譜分離分級成更簡單的成分，並且洗脫的成分以線性方式被引入到MS中用於檢測和定量。此夕卜，GC/MS理想地適用於分析低分子量的有機化合物，例如V0C，從而生成存在於樣品中分子化合物的原子和結構信息。諸如分析熱解吸附(TD)之類的樣品引入技術與GC/MS (使用了 Tenax-TA和PDMS膜)以連接方式連接，用於取樣非侵入性分析生物樣品所使用的VOC(Yun)。
[0098]在其他方面中，可以使用核磁共振(NMR)或液相色譜質譜(LC/MS)來分析植物VOC。
[0099]在一些方面中，使用可攜式檢測裝置來檢測所關注的生物標誌物。如果選擇裝置是可攜式的，則可以進行原位分析。可攜式檢測裝置包括但不限於離子遷移光譜(IMS)、差示遷移光譜(DMS)/場不對稱離子遷移光譜(FAIMS)、以及基於GC技術的單元。[0100]DMS 和 GC/DMS
[0101]在一個方面中，使用差示遷移光譜(DMS)來分析植物VOC。DMS為氣相分離和檢測技術；其通過以下過程進行操作:在越過短的大分子距離上在快速交替的高低電場下利用帶電離子的非線性行為來誘導分離和隨後的檢測(Krebs et al2005)。其在環境壓力下具有ppb水平的敏感度下的操作能力(Eiceman et al2004)、其較低的電力消耗、以及其較小的尺寸和進一步小型化的潛力使得DMS成為特別良好地適用於氣體樣品的分析以及VOC的內場分析。在一些方面中，DMS與氣象色譜(GC)偶聯(以連接方式連接)，以便取得其他的色譜分離。
[0102]DMS已經廣泛地用於細菌樣品的表徵(Prasad et al.2007; Schmidt etal.2004)。此外,還用於病毒的研究(Ayer et al.2008)。DMS已經成功地用於分析由增殖細菌樣品得到的VOC(Shnayderman et al.2005)、碳化的火災殘害殘餘物以及噴氣燃料(Luand Harrington2007; Rearden et al.2007),以用於辨別應用。GC/DMS已經用於表徵和區別由正常健康柑橘果實的皮部分排放的揮發性化合物、以及感染柑橘「膨脹」紊亂的那些(Zhao et al.2009)。
[0103]在一個實施方案中，本發明提供了使用GC和DMS檢測來分析由生物樣品得到的VOC的方法。在一些方面中，GC與DMS的組合增加了 DMS的診斷能力。在GC/DMS試驗中，各化學品可以通過其各自的補償電壓(CV)和停留時間來分離和表徵，其中所述的補償電壓和停留時間指示了特定的化學品物質。GC/DMS圖提供了由植物排放的揮發性化合物的快照，其可以用作化學品識別標誌(圖1)。
[0104]在一些實施方案中，本發明提供了實施GC/DMS分析的方法。在一個方面中，各個GC/DMS樣品使用三維數據結構表徵，其中所述的三維數據結構由停留時間、補償電壓和相應的信號強度構成。為了利用3-D數據結構中所有的信息，可以在無需總結跨越停留時間或補償電壓的信號的條件下保持原始數據。主要成分分析(PCA)可以用於3-D數據，從而初步顯現由不同的組得到的樣品的分布。基於PCA結果，可以設計下一步來研究所述的數據。
[0105]在一些方面中，使用小波變換將主要信息濃縮成低頻區域，同時將大部分的噪聲內容物移至高頻區域(圖2)。基於小波係數的選擇策略，可以保持相關係數以用於進一步分析。在一些方面中，可以使用多變量分析方法(包括線性方法，例如主要成分分析(PCA)和偏最小二乘法(PLS);以及非線性方法，例如支持向量機)以顯現和定量檢驗各組之間的分離。針對由生物標誌物文庫得到的化合物校正VOC檢測裝置
[0106]在一些方面中，可以使用由生物標誌物文庫得到的化合物標準品來訓練和校正VOC檢測裝置。經訓練的裝置能夠針對絡合物背景並以極低的濃度區別所關注的化合物(例如基於DMS/FAMS的裝置的檢測極限可以低至幾ppb)。
[0107]在一些方面中，如果使用吸附膜或其他預濃縮器和/或背景去除手段預濃縮所關注的化合物，則可以進一步改善檢測極限。
[0108]某因表汰
[0109]在一些實施方案中，本公開涉及植物基因表達。如本領域的任一技術人員公知，在有機體中，基因以DNA編碼。通常，為了使基因表達，編碼基因的DNA被轉錄成mRNA，然後mRNA被翻譯成蛋白質。基因轉錄成mRNA稱為「基因表達」。在基因組水平下，所有的mRNA共同稱為「轉錄物組」，同樣有機體中所有的DNA被稱為其「基因組」。
[0110]分析基因表達的方法
[0111]用於分析基因表達的方法是本領域公知的。方法包括例如RNA印跡法、實時PCR、微陣列和RNAseq (使用下一代DNA測序技術的整個轉錄物組測序)。響應於任何特定病原體或害蟲的完全型疾病在複雜的RNA群體的表現，包括編碼(mRNA)和非編碼(小RNA)序列。可以使用新的下一代DNA測序方法(NGS)將上述情況分析至前所未有的深度，其中所述的方法揭示了極稀有的mRNA、剪切變體、等位基因變體和SNP。已經應用於植物中(Navarroet al., 2009; Donaire et al.，2009)的該技術取得了所研究的有機體的大量的生物信息學知識。就缺乏整個基因組序列信息的植物物種而言，可以替代使用廣泛的EST資料庫。通常使用qRT-PCR分析來證實所獲得的轉錄物組數據，或者與蛋白質組或代謝物組分析整合。此外，使用生物網格理論來分析深入的轉錄物組概況可以幫助定義基因調節網絡並識別重要的疾病特異性生物標誌物。
[0112]在一個方面中，用於基於雜交的快速檢測的微陣列技術(在Carter and Cary2007中有所描述)用於基因表達分析。這種整合的採樣-反饋核酸裝置可以用於例如識別恰好在果園的植物中的所關注基因的表達。此外，該裝置經得起未經訓練的員工的現場使用，並且可以使用低成本的側向流層析技術來實現。
[0113]在另一個方面中，可以使用定量實時PCR(qRT-PCR)來評價基因的表達，其中所述的定量實時PCR為已經建立用於病原體檢測的技術。可以由樣品提取mRNA，並評價作為特定疾病的生物標誌物的特定mRNA的表達水平。在一個方面中，本發明提供了基於疾病特異性基因表達的生物標誌物，可以使用qRT-PCR或上文所述的現場可調節的微陣列來檢測所述的生物標誌物，從而進行疾病特異性的診斷。
[0114]植盤
[0115]在一些實施方案中，本公開涉及植物疾病的檢測。在一些方面中，本公開涉及柑橘植物的疾病檢測。本發明所提供的方法、組合物和裝置可以舉例但非限定地用於檢測以下類型的植物的疾病:柑橘(包括華盛頓臍橙、瓦倫西亞橘、和Hamlin橘品種、柑橘、克萊門氏小柑橘、檸檬、酸橙和葡萄柚)、馬鈴薯和西紅柿。
[0116]疾病檢測的方法
[0117]在一些實施方案中，本發明提供了檢測植物疾病的方法。在一些實施方案中，本發明提供了通過分析由植物得到的VOC來檢測植物疾病的方法。在一些實施方案中，本發明提供了通過分析植物的基因表達來檢測植物疾病的方法。
[0118]通過VOC分析的疾病檢測方法
[0119]在一些實施方案中，本發明提供了通過VOC分析的植物疾病檢測方法。
[0120]在一些方面中，本公開涉及通過監測植物釋放的VOC來確定植物材料中疾病存在的方法，其中所述的植物材料例如為整株植物、葉材料、果實、漿果、花、接穗、花器官、根莖、種子、球莖、海藻、植物的塊莖。
[0121]在一個方面中，本公開涉及其中通過VOC分析來檢測植物疾病的方法。在通過VOC分析來檢測植物疾病的方法中，獲得針對疾病進行測試的植物所釋放的VOC樣品。然後，通過一種或多種方法來分析植物所釋放的VOC樣品，以便確定樣品中存在的一種或多種VOC的特性和/或數量。然後，將在樣品中存在的VOC的特性和/或數量與由健康和/或受感染的植物得到的VOC值相比較，以便確定待測試植物是否患有疾病。在一些方面中，在進行測試植物的VOC分析之前，由健康和/或受感染的植物的VOC值是已知的，並且將由測試植物得到的VOC值與健康或疾病植物相關的VOC的預定值相比較，以便確定測試植物的疾病狀態。在一些方面中，在進行測試植物的VOC分析的同時或之後，確定由健康和/或受感染的植物得到的VOC值，並且一旦與健康或疾病植物相關的VOC值是已知的，則將由測試植物得到的VOC值與由健康和/或受感染的植物得到的VOC值相比較，以便確定測試植物的疾病狀態。
[0122]在一個方面中，本公開涉及這樣的方法，其中使用合適的分析方法預先繪製VOC概況，其中所述的合適的分析方法例如氣相色譜質譜(GC/MS)、和/或氣相色譜/差示遷移光譜(GC/DMS);並且指示特定疾病存在情況的VOC識別標誌被識別。就非原位分析而言，可以使用特定的吸附表面來收集V0C，例如固相微萃取(SPME )和Twi ster裝置。
[0123]在一些方面中，可以使用GC/MS來實施吸附在SPME纖維上的VOC分析。由於VOC的分布和/或組成被存在的病原體改變，所以GC/MS概況可以起到病原體存在或缺乏的識別標誌的作用。但是，由於MS允許用於化學品識別，所以可能有利的是僅選擇描述了植物健康狀態的具有統計學意義的VOC的GC峰。任何強峰的選擇算法可以用於取得上述目的。與這些峰有關的質譜可以用於建立所關注的揮發物的化學品特性。任何合適的MS結構分析方法(例如電子電離(EI)/化學電離(Cl)的組合，MSn等)都可以使用。
[0124]在一個方面中，本公開涉及在合適的時候使用用於體內和體外測量植物材料的化學品識別標誌的合適的現場傳感器裝置來場內測量植物VOC的方法。可以實施此類測量來檢測與特定疾病有關的VOC識別標誌，並基於之前收集的VOC文庫來檢測病原體的存在和特性。可以使用合適的數據挖掘方法。由原體生物標誌物的資料庫得到的化合物可以用於設備的訓練/校正，其中所述的原體生物標誌物的資料庫是在使用所選的GC/MS和/或其他合適的分析方法進行場內檢測之前集合得到的。
[0125]在一個方面中，本發明提供了連接的分析系統來監測和測量用於植物疾病檢測的柑橘植物品種所排放的揮發性有機化合物。在一些方面中，基於VOC的傳感器可以用於檢測對病原體感染產生的宿主植物應答，以及通過植物的場內取樣來監測植物的疾病狀態，從而尋找感染前和感染後所排放的VOC識別標誌內的差異。在一些方面中，可以了解由柑橘樹葉散發的背景VOC的基線變化。在一些實施方案中，實施分析來確定普通栽培的柑橘品種之間存在多少變化性，這可以影響疾病特異性VOC的任何文庫的生成。
[0126]在一些方面中，相同物種的柑橘植物的不同品種具有相似的但不同的VOC表達概況，並且通過分析由植物排放的V0C，這種識別標誌可以用於兩種不同的但是極其相關的柑橘品質之間的區別。在一些方面中，可以使用將兩種檢測技術的輸出相關聯的GC/MS和GC/DMS檢測來建立用於DMS的柑橘揮發物的VOC識別標誌。
[0127]在一些方面中，本發明提供了通過識別並測量指示特定疾病(例如柑橘的HLB或CTV)的化學識別標誌、基於柑橘以及其他植物所釋放的揮發性代謝物來分類柑橘以及其他植物的健康狀態的方法。在一些方面中，分類過程涉及兩個主要的步驟:1)繪製指示某些病原體存在的VOC分布；以及2)場內測量VOC識別標誌並與之前繪製的VOC概況相比較，以便確定植物的健康狀態。此外，可以進行多種分析方法的應答的比對。
[0128]植物VOC概況的繪製[0129]可以使用非可攜式的分析設備，例如GC/MS，來實施VOC的最綜合的分析。使用指定的特異性吸附表面(例如固相微萃取(SPME)纖維或其他固體吸附劑相(例如Twister))，樣品的這種原位收集是可行的。在一些方面中，分析考慮了揮發性化合物可以根據葉的年齡、類型、一年的季節等其他因素而改變。
[0130]通常，理想的是減少試驗中潛在變量的數量。纖維的選擇允許精細調節收集用於進一步研究的化合物的範圍；可以使用多種類型的纖維來收集更大量的化合物。在一個方面中，具有Carboxen/聚二甲基矽氧烷(CAR/PDMS)聚合物塗層的SPME纖維用於收集柑橘植物所排放的揮發物。
[0131]在一個方面中，按照以下實施VOC取樣過程。在通過GC/MS進行分析之前，纖維或吸附劑相限定用於根據製造商的建議，由背景環境化學品中除去任何起始點被吸附的化學品。就初始取樣而言，纖維定位於鋁保持器(用於保護脆弱的尖端)中的葉表面附近。為了限定葉VOC上晝夜循環的作用，可以在一天的特定時間點時實施取樣。暴露時間取決於植物VOC生產的效率。待考慮的一個因素可以為環境溫度；在一些方面中，最大的VOC生產可以在60-75F範圍內發生。暴露時間可以根據條件而改變。在一個實施方案中，暴露時間可以為大約1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12小時。在一些方面中，在最佳的VOC生產條件下，暴露時間可以為大約6小時，並且在非最佳VOC生產條件下可以為大約12小時(例如在一年的變冷時間的夜晚)。在取樣後，可以提交纖維用於生物化學分析。
[0132]在一些方面中，可以實施由不同的分析技術得到的數據的相關性。由GC/DMS得到的化合物識別標誌可以與GC/MS相關，使得可以在兩組數據組中減小化學化合物的識別。GC/MS色譜上的單個的峰可以與DMS的輸出光譜相關。使用合適的參照化合物的比對光譜允許GC/MS信號區域中的峰與GC/DMS區域中的匹配相當的峰相關。這種匹配可以允許建立用於DMS傳感器的化學品文庫數據。在一些方面中，可以將重要的VOC代謝物生物標誌物定位於GC/DMS信號空間中，其中所述的生物標誌物並非呈現於GC/ITMS數據中，或者反之，由於對兩種檢測器的某些化學品的敏感性不同。
[0133]在一些方面中，如果僅考慮由病原體生物標誌物得到的信號而非考慮總的分析空間，則可以進一步改善使用GC/DMS裝置的分類精確性。可以使用由生物標誌物文庫得到的化合物標準品來訓練和校正檢測裝置。經訓練的裝置能夠對複雜的背景及極低的濃度來區別所關注的化學品(基於DMS/FAMS的裝置的檢測極限可以低至幾ppb)。如果使用吸附膜或其他預濃縮器和/或背景去除手段來預濃縮所關注的化合物，則可以進一步改善檢測極限。當與特定疾病相關的化學化合物被檢測到時，傳感器將提供正的輸出。如果由與某些疾病相關的資料庫得到的大量的化學品被檢測到時，則正的輸出將更有效力(假陽性的機率較低)。可以使操作者慎重的是在某些條件下，哪種效力閾值將植物考慮為不含病原體的或受感染的是最佳的。任何合適的是，可以針對特定的植物種類、果園、一天的時間、季節等進行調節。
[0134]通過VOC分析檢測植物的HLB
[0135]在一些實施方案中，本發明提供了用於通過分析VOC來檢測植物HLB/柑橘黃龍病的方法。可以通過本文所述的方法由植物得到V0C，並且可以如本文所述來分析V0C，以便識別在生病的以及對照植物中呈現的化學品。所選的VOC可以用於HLB病原體的檢測，以及在HLB感染過程中植物VOC的排放與代謝物的變化的相關性。[0136]在一些方面中，本公開涉及用於確定由於HLB疾病相關的柑橘樹葉排放的揮發性化合物的方法。此外，本公開涉及這樣的方法，其中通過利用氣相色譜質譜(GC/MS)來記錄VOC概況，以及識別指示HLB病原體存在的生物標誌物。可以使用特定的吸附表面(例如固相微萃取(SPME)和Twister裝置)來收集V0C。
[0137]此外，在一些方面中，本公開還涉及利用合適的數據挖掘方法來建立健康和HLB生病植物的氣相色譜中的差異。本公開具體涉及HLB生物標誌物的特性，其中所述的生物標誌物包括但不限於以下化合物:二氧化碳、丙烷、2-甲基-戊烷、ο-二甲苯、十三烷(C13H28)、2_乙基-1,4-二甲基-苯、1-甲基-4-(1-甲基乙稀基)-苯、2，2，3，4_四甲基-戍烷、烴(例如十五烷(C15H32)等)。
[0138]通過VOC分析檢測植物的CTV
[0139]在一些實施方案中，本發明提供了通過分析VOC來檢測植物柑橘衰退病毒(CTV)。可以通過本文所述的方法由植物獲得V0C，並且可以如本文所述來分析V0C，以便識別在生病的和對照的植物中呈現的化學品。所選的VOC可以用於CTV病原體的檢測，以及在CTV感染過程中植物VOC的排放與代謝物的變化的相關性。
[0140]VOC分析可以用於檢測柑橘品種中的CTV，並且在一些方面中，其可以用於場內實時監測植物的健康。在一個方面中，由於VOC分析是非侵入性的，則其是有利的。生物生成的揮發性有機化合物(BVOC)為所有活的有機體、特別是用於所述的目的以及保持、生長和功能的植物所產生的VOC形式。此外，BVOC作為由於非生物/生物應激(水和水應激)、鋅和營養缺陷的應激反應的一部分而被釋放。此外，BVOC還可以稱為「誘導的VOC」 (IVOC)0作為CTV感染後的結果，由柑橘品種的葉所排放的BV0C/IV0C概況可以顯著改變。
[0141]在一些方面中，柑橘品種的場內VOC取樣方法用於健康和CTV感染的農作物之間的區別，其中所述的取樣方法使用了具有飛行質譜分析的熱脫附氣相色譜(GC/T0F-MS)時間的Twister和靜態頂空取樣。在一些方面中，本發明提供的VOC取樣方法用於監測針對CTV的植物健康。
[0142]本公開具體涉及CTV生物標誌物的特性，其中所述的生物標誌物包括但不限於以下化合物:月桂烯、蒈烯(S-3-)、羅勒烯(e-β-)、十六醇、檸檬烴、二十四烷、以及布藜烯
(α -)。
[0143]通過基因表達分析的疾病檢測方法
[0144]在一些實施方案中，本發明提供了通過基因表達分析的植物疾病檢測方法。
[0145]在一個方面中，在通過基因表達分析檢測植物疾病的方法中，獲得由用於疾病測試的植物所表達的核酸(例如RNA)樣品。然後，通過一種或多種方法來分析植物表達的核酸樣品，以便確定樣品中存在的一種或多種核酸的特性和/或數量。然後，將樣品中存在的核酸的特性和/或數量與由健康和/或受感染的植物得到的基因表達值相比較，以便確定測試植物是否患有疾病。在一些方面中，已知由健康和/或受感染的植物得到的基因表達值後，將測試植物的基因表達分析的分析時間以及由測試植物得到的基因表達值與健康或生病植物相關的基因表達的預定值相比較，以便確定測試植物的疾病狀態。在一些方面中，在測試植物的基因表達分析的同時或之後確定由健康和/或受感染的植物得到的基因表達值，並且一旦已知與健康或生病的植物相關的基因表達值，便將由測試植物得到的基因表達值與由健康和/或受感染的植物得到的基因表達值相比較，以便確定測試植物的疾病狀態。
[0146]在一些方面中，通過基因表達分析的植物疾病檢測是基於宿主早期應答的分析，以及在特定高生理學活性組織(例如葉或果皮組織)中早期調節基因的識別。在一些方面中，在集中與宿主應答的多個qRT-PCR檢驗中使用這些基因，該qRT-PCR檢驗可以用於補充定向於病原體的疾病測試，或者在病原體效價低於用於疾病檢測的另一種設備的敏感度閾值時，允許在無症狀階段進行早期檢測。
[0147]疾病和環境條件影響了宿主植物的短距離和長距離信號發射機制。在葉組織中發生的感染可有誘導其他組織(例如果實)的轉錄物組應答，在這種情況下，感染信號通過誘導宿主應答基因而被擴增。病原體誘導的基因可以以幾百或幾千個RNA分子來轉錄，同時病原體DNA可以以僅僅幾個拷貝存在並且可以低於檢測的敏感度水平。基因中各宿主應答的表達可以是組織和/或發育階段依賴性的。在某些方面中，特定的植物組織可以具有響應於病原體的基因表達模式(其可以被用作植物病原體的傳感器)。
[0148]在一些方面中，基因表達生物標誌物可以用於通過澄清現存樹木的疾病狀態來改善疾病管理程序。在一些實施方案中，植物基因表達的分析允許在較早的無症狀階段進行疾病的檢測，其中限定植物的繼發感染仍在實踐。此外，在一些方面中，由於基因表達生物標誌物成為可利用的，所以其可以用於使潛在的治療策略合法化，並且用於在柑橘胚質篩選抗性，或者使轉基因方法合法化。在一些方面中，通過分析響應於病原體的柑橘基因的表達，可以在基因改善程序中使用傳統的或生物技術方法，針對抗性栽培品種篩選柑橘胚質，而使其包含在內。
[0149]識別基因表達和VOC之間的相關性
[0150]在一些實施方案中，本發明提供了響應於病原體和/或環境條件而使得植物基因表達與植物VOC釋放具有相關性的方法。
[0151]在一些方面中，早期感染或環境應答的基因表達宿主生物標誌物可以容易地整合到當前及未來的疾病診斷技術和平臺(例如PCR、側向流微陣列(LFM)、差示遷移分光計(DMS)和GC/MS)中，以用於共檢測特定的基因轉錄物或揮發物，由此輕微地升高植物疾病檢測的領域、範圍和/或精確性。
[0152]此外，本公開涉及不同分析方法的相關性，S卩，涉及聯合使用的不同分析方法的設備響應的比對。
實施例
[0153]以下實施例進行示例性的，並且無意於以任何方式限定本公開的任何方面。
[0154]實施例1:基因表達和HLB
[0155]研發合適的試驗設計來檢驗宿主應答以及清楚地識別在不同感染階段由HLB調節的應答生物標誌物。在幼年和成熟階段，針對果實和葉，分析4種類型的組織。最初的兩種類別為有症狀的和無症狀的樣品(皮和葉)，其得自位於Fort Pierce (St.LucieCounty, FL)的 the USHRL-USDA Farm 的、受感染的「瓦倫西亞」甜澄(C.sinensis L.0sb.)樹。使用由樹冠的不同區域收集到的4-6片葉的葉柄，在CaLas存在下，通過PCR分析樹。第三個類別為在相同區域，由PCR陰性表觀健康的樹得到的果實。第四個類別由水果構成，其得自位於 Citrus Research and Education Center (Lake Alfred, FL)處的未發生疾病的區域中的健康「瓦倫西亞」樹。使用苯酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)提取來提取RNA，然後使用 RNeasy MinElute Cleanup kit (Qiagen, Valencia, CA),根據製造商的說明書來純化。使用RNA來實施深入的轉錄物組分析(其使用了 Illumina Genome Analyzer II,根據製造商的說明書進行)以用於cDNA文庫的構建和序列運行分析。使用生物分析器確定各文庫的品質(BioRad, Hercules, CA)。各文庫以獨立的泳道運行，從而獲得測序的每個cDNA分子的末端至多85個鹼基對的讀序長度。這種類型的過程被稱為RNAseq。
[0156]使用Velvet軟體處理並收集原始數據。使用BWA(Li and Durbin, 2009)實施單個讀序和疊連群與甜橙的單一基因組(15，808序列；NCBI Unigene Build#ll, 4/20/09)比對。
[0157]使用Mapman and Blast2G0軟體實施轉錄物組數據的功能分析,從而在途徑和網絡中分類差異調節的基因，並理解在不同的疾病階段所誘導的細胞代謝中的主要變化。在統計分析之後，最受疾病影響的途徑被識別，並且在這些途徑中，選擇似乎在無症狀階段受到高度調節的重要基因。使用qRT-PCR分析來分析這些基因，從而證實它們的表達圖案，並核實它們在其中HLB病原體尚未被其他檢測方法檢測到的植物中是否可以作為感染的早期指示劑工作。
[0158]在6對比較(對照、表觀、無症狀和有症狀的階段)間的果實中，受到CaLas感染的差異調節的基因(由甜橙的單一基因(在NCBI中呈現)表示)示於表1-6中。相對於葉，在表觀健康、無症狀和有症狀的階段下，HLB差異調節的基因示於表9-14中。
[0159]使用Taqman Real Time PCR，以下基因顯示在果實組織中，在疾病的無症狀階段，是統計學差異表達的，並且它們可以被認為是宿主的HLB生物標誌物:GH3.1 (上調節的)(S22545043) ;GH3.4 (上調節的)(S44237769) ;KA02 (下調節的)(S44303609);水楊酸甲基轉移酶(上調節的)(S44277040) ；WRKY70 (上調節的)(S44288591) ；MYB-相關的TF (上調節的)(S44256583) ;U-盒(S22566824) ;HSP82(下調節的)(S44237646);蔗糖酶(上調節的)(S35152777);萜烯合成酶環化酶(下調節的)(S22583829) ;NN脂質轉移蛋白質(LTP)(上調節的)(S44279331);酸性纖維素酶8 (下調節的)(S22606212) ; ω-6-FAD (下調節的)(S44244604)。
[0160]與葉分析相關(未成熟和成熟階段)，在qRT-PCR分析中識別在無症狀階段的多種差異調節的基因，其可用作生物標誌物。在未成熟階段，這些基因為:酸性纖維素酶(S22606212);萜烯合成酶 I (S44285742) ；ERTF2 (S44250648) ; 12-氧代-植物二烯酸酯還原酶(S34125138);脂氧化酶 2 (S34124539) ;NNLTP (NCBI 編號:EY754661.1) ; β -澱粉酶(S44303510);棒麴黴素 3 (S22533016);葡萄糖-磷酸-運送蛋白 2 (S22591828, S22591828，S44257732, S22591828)。在成熟階段，這些候選的生物標誌物為:ΕΝΤ_異貝殼杉烯酸羥化酶 2(S44251582);棒麴黴素 3 (S22533016) ; α -澱粉酶(S44224848) ；WRKY70 (S44225142, S44227900,S44288591)。
[0161]實施例2 =HLB 感染-VOC 的 GC/MS
[0162]基於試驗室的傳統氣相色譜質譜(GC/MS)分析允許識別在VOC生產中由於病原體感染而產生的差異，並使用MS數據識別特定的「生物標誌物」化合物。使用GC/MS實施吸附在SPME纖維上的VOC的分析(圖3)。在加熱時，吸附的化學品可以解吸附，從而被引入到GC/MS設備中並進行分析。由於VOC的分布由於病原體的存在而改變，所以GC/MS概況可以揭示與病原體存在或缺乏相關的化學化合物。可以使用任何強峰的選擇算法來選擇可以區別健康和受感染的植物的統計學顯著的峰。在我們的實施例中，所得的數據按照以下
進一步處理。
[0163]為了減少色譜數據的範圍並抵抗由可能的噪聲和輕微的信號未對準而產生的潛在幹擾，使用自回歸(AR)模型來提取各色譜的特徵。[Zhao2009，Zhao2008]p階AR模型可以通過以下等式(I)表示:(請參見由所引用的原文得到的等式)(1)，其中x(n)為數據系列的信號點，ai為AR係數，P為模型階數，而en為估測誤差。AR模型的目的在於使用係數ai (i=l,…，P ；p:模型階數)由其之前的P值(x(n-l), x(n_2),…，x (n-p))預測第η個值x(n)0 AR建模方法的目標在於估計AR係數，該係數可以通過優化方法擬合原始數據。使用該模型，可以使用P維的特徵向量仏1，&2唚&?)來表徵各色譜概況。作為識別區別峰的第一步，色譜峰基於預定容窗內峰位豐度以及平局值穿越率(mean-value crossing rate)而位於各概況中。將點i的相鄰範圍的單一邊長設定為k，如果點i具有比範圍[i_k，i+k]內所有的點具有更高的強度，則點i被認為是峰候選物。為了確保所選的峰並非為噪聲信號，則信號點(.)的平均值穿越率被定義。如果在範圍[i_k，i+k]內具有峰，則該峰及其相鄰的點需要明確地高於該範圍內信號的平均值。簡言之，該峰位容窗內的信號點不會圍繞平均值振動。除了過零率以外，我們建議引入稱為「平均值穿越率」(H)的標準，從而確定圍繞平均值的信號振動。平均值穿越率越低，則所觀察到的信號越不可能是噪聲。就橘樹樣品的色譜而言，使用k=10和n=50%的值。在檢測峰以後，Studentt檢驗用於相應的峰強度。代表了小P值(P〈0.05)的峰被認為是統計學顯著的且潛在的生物標誌物。為了研究對照和受影響的植物之間的分類，主要成分分析(PCA)和主要成分回歸(PCReg)分別用於在視覺上和數量上檢驗分類的結果。留一法策略(其為用於小樣品組的典型的證實策略)與PCReg結合,從而提供診斷精確性的定量評估[Bullinger, 2008;Freitas, 2008]。
[0164]對GC峰進行記錄， 其中所述的GC峰被識別為健康和疾病批料的GC概況的區別特徵。與這些峰相關的質譜用於建立所關注的化學化合物的化學特徵。可以使用合適的MS結構分析方法，例如電子電離(EI)/化學電離(Cl)的組合、MSn等。所得的化學品列表可以用作用於特定植物類型的生物標誌物檢測的參照資料庫。此類資料庫可以擴展至多種病原體。當發現新的生物標誌物時，可以進一步更新資料庫。此外，發現會得到不夠強的差異的化合物可以由資料庫中除去。
[0165]在本公開中，表明受HLB病感染的Hamlin橘樹的特異性化學化合物包括但不限於:二氧化碳、丙烷、甲基-戍燒、ο- 二甲苯、十二燒(C13H28)、2_乙基-1，4- 二甲基-苯、1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-苯、2，2, 3, 4-四甲基-戍燒、經(例如十五燒(C15H32)等)。通過監測這些化合物，可以監測HLB感染的植物。可能的是得到特定的VOC的生物化學途徑是未知的；但是這些化合物的測量連同代謝物的表達的繪製可以使診斷植物感染(其可以幫助種植者進行判定)成為可能。
[0166]實施例3:HLB 感染-SPME GC/MS HLB (Florida)
[0167]在該研究中，確定9種不同的生物標誌物在HLB和健康植物之間產生分離。就18種收集的樣品(9種HLB感染的，而9種健康的)而言，我們發現9個具有顯著Student t檢驗結果(p〈0.1)的峰(圖21)。確定可以用於區別HLB感染的和健康的植物的9種潛在的生物標誌物如下:二氧化碳、丙烷、2_甲基-戍燒、ο-二甲苯、十二燒(C13H28)、2_乙基_1，4-二甲基-苯、1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)_苯、2，2, 3, 4-四甲基-戍燒、烴(例如十五燒(C15H32)等)。具體而言，在HLB中，ο-二甲苯、十三烷、2-乙基-1，4-二甲基-苯、1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-苯、2，2，3，4-四甲基-戊烷、十五烷是上調節的；在HLB感染的植物中，二氧化碳、丙烷、2-甲基-戊烷、十三烷是下調節的。使用留一法證實策略，PLSR產生的分類精確率為 83.33% (健康為 6/9，HLB 為 9/9)。
[0168]實施例4:揮發性資料庫的研發
[0169]研發分析並解釋揮發物概況的資料庫，其中所述的揮發物概況是使用Twister-GC-TOF方法由實地和溫室樣品得到的。可以通過公共網際網路查詢界面(http://eros.fiehnlab.ucdavis.edu:8O80/binbase-compound/,choose 『volatile』 whenselecting the database),針對光譜、化合物識別器或化合物名稱來查詢揮發物的BinBase 資料庫(vocBB)。
[0170]圖4中，面板(A)示出了揮發性化合物如何被識別為真正的代謝物:首選，使用市售的Adams揮發物文庫，其使用了傳統的基於烷烴的Kovats停留指數，該指數被轉化我們的基於(更合適的)脂肪酸甲酯的「Fiehn停留指數」。除了購買的真正的標準品以外，所有的2000個Adams揮發物光譜均被轉化，並支持Fiehnlab VocBB0例如，在超過2100種揮發物概況中，潛在的揮發性化合物水楊酸甲酯(參見在成熟果實和幼葉中，響應於HLB感染的水楊酸甲酯轉移酶的誘導(圖15))均檢測為陽性，其中所述的超過2100種揮發物概況是目前為止已經獲得的，並且由Adams文庫通過匹配的質譜和停留指數來注釋，參見圖4中的面板(B)。
[0171]到目前為止，vocBinBase數據已經儲存了 1465有效的揮發物光譜，其中183種被識別為起源於例如Twister塗料或有塑膠袋包裝材料的化學加工品。此類加工品的峰自動地由數據輸出中排除，即，不能混亂柑橘植物感染的IVOC概況的統計學分析。此外，vocBB以這樣的可能性為特徵:使用資料庫識別器注釋所識別的代謝物，以便通過共同的酶和基因注釋直接將揮發物概況與基因組數據整合。例如，水楊酸甲酯在KEGG生物化學途徑中儲存為C12305，其與苯甲酸途徑圖譜07110相連。儘管KEGG未分配基因編號給水楊酸甲酯的形成或降解，但是備選資料庫證實了生物途徑，如下:通過TAIR AraCyc來源，將水楊酸甲酯與擬南芥基因AtBSMTl (At3gll480)連接的MetaCyc資料庫。
[0172]因此，已經通過允許多個資料庫識別器與揮發物概況數據組一起輸出而建立的vocBB揮發物資料庫。所有識別的代謝物均被撥入vocBB中以用於這些多個穿越資料庫的編號，以便簡單地將揮發物概況與基因表達網絡整合。
[0173]vocBB資料庫本身是由實際Twister GC-TOF質譜概況構建的。從2010年7月起，vocBB包含120萬個質譜，這些質譜是由研究18種物種的2125個樣品生成的。大量的市售可得的物種參照標準品(也稱為「精油」)已經用於增加物種的數量，並由此增加了儲存在資料庫中的真正的揮發性代謝物的數量。例如，多種柑橘精油作為沉澱器樣品用於同樣證明了 Twister GC-TOF技術的功能的資料庫中，以及處理這些數據的資料庫中。在資料庫中，香檸檬、甜橙、葡萄柚和檸檬的揮發物概況生成了揮發性代謝物的許多新的入口(圖5)。使用所述概況的數據的簡單的等級聚類，這些精油的所有樣品均正確地聚類而不具有任何錯誤的分類。該測試提供了這樣的證據:Twister GC-TOF能夠簡單地檢測揮發物並使用用於分類樣品來源的強度(在聚類圖中，由藍色變為紅色)。因此，對於柑橘揮發物而言，所述的研究可以作為原理論證。此外，顯示由於我們獲得了這樣的證據:與表觀健康和對照樹相t匕，在HLB感染的柑橘果實中存在大量的基因表達差異，所以柑橘的果實精油可以用於HLB感染的檢測。
[0174]此外，在受控的溫室條件下實施HLB感染的研究。圖6示出了 HLB感染的試驗建立和記錄。在使用HLB接種(Cleopatra根莖X瓦倫西亞橘接穗)柑橘植物後，在第6、11、16和21周時，記錄22種受感染的植物的揮發物概況。通過PCR檢測感染的發展以及症狀的發展。清潔的Twister和清潔的袋通過郵遞送至Florida中的場所；然後揮發物被誘捕到Twister上,該Twister使用Reynolds?烤肉袋放置在受感染的和健康的對照植物的封閉的柑橘樹枝中。在IOAM開始I小時的暴露時間、搖晃各植物達5分子來實施取樣。作為陰性對照，在各時間點，通過Twister揮發物吸附取樣溫室空氣以及得自空袋的空氣。空氣溫度為75° F，溼度為89.6%。隨後，通過郵遞將Twister送回至UC Davis用於分析。
[0175]總計，在該研究中檢測到456種揮發性化合物，與陰性對照相比，其中260種化合物在袋封的樣品中，保持為以更高的濃度被檢測。有趣的是，在該研究中，檢測到191種揮發性代謝物，這些物質之前在vocBinBase資料庫中不存在，在次證明與目標方法相比，資料庫方法的用途，其中在所述的目標方法中，分析物可以被預定義，並隨後進行篩選。使用停留時間和MS匹配，這些新的、柑橘依賴的代謝物中的一些代謝物被清楚地識別，如上文給出:z-石竹烯、苯甲酸苄酯、莰烯、δ -3-蒈烯、香茅醛、2，5- 二甲氧基-P-異丙基苯、二乙基琥珀酸酯、P-乙基苯乙酮、十四烷酸異丙酯、cis-p-孟-2-烯-1-醇、甲基癸基酮、香葉酸甲酯、橙花醛、2-辛醇、α -松萜、順香檜烯水合物、香檜烯、反式倍半香檜烯、Y -萜品烯、異松油烯、η-十四醇乙基α-側柏烯。
[0176]總體而言，在受控的HLB感染時間過程研究中，79種代謝物被識別，由此可用於途徑分析以及與轉錄物組數據相比較。在一元統計學及多變量工具中分析揮發物概況。原則上，單變量方法由於其更容易理解而是有利的，並且可以在潛在的場測試以及證實研究中以更直接的方式使用潛在的生物標誌物。並不奇怪，當柑橘樹仍年幼並且活躍地發育具有不斷成熟的葉時，在該研究中影響揮發物概況的最重要的參數為時間過程本身。
[0177]因此確定，幾乎所有的揮發性代謝物或者通過增加強度或者通過降低強度而受到植物發育的影響，並且在11-16WAI下有時甚至受到最強排放的影響。圖7示出了整合了健康和受感染的植物的示例性的短暫概況。顯而易見的是在信號強度下，可能是由於葉成熟，許多萜類化合物減少，這在HLB感染的果實中在基因表達萜類化合物途徑的下調節中有所反應。同樣如圖7所示，經過一段時間，其他化合物增加。
[0178]隨後，與健康對照相比較，針對HLB感染的影響來研究揮發物概況。如通過檢測HLB感染的症狀和PCR陽性檢測而明顯的是，在感染後的第6周時，最初的幾株植物被檢測到PCR陽性，而在第21周時，大部分接種的植物測試到PCR陽性，並且實際顯示可見的疾病症狀以及矮化生長。相似地，存在最初極少數的揮發性化合物，其在健康和受感染的植物之間具有顯著差異Ρ〈0.05，而在感染後的第21周，100種揮發物經測試是不同的。
[0179]令人驚奇的是，大部分這些顯著的差異在排放中受到抑制(圖8)，而僅有幾種化合物增加。與一些基因表達研究所表明的結果不同，在感染後我們未發現萜類化合物的增加，或者甚至未檢測到水楊酸甲酯的存在。水楊酸甲酯作為信使化合物以細胞內的水平工作，並且可以不作為潛在的生物標誌物被釋放到大氣中。[0180]相反，我們識別了大量的潛在的揮發性代謝物生物標誌物用於檢測HLB感染，其中的一些標誌物在症狀明顯之前形成。其實例在圖9中給出，其中顯示己烯乙酸酯和十三醛在第21周在HLB感染下作為兩種差異調節的化合物，而結構尚未識別的代謝物可以甚至在較早的時間點下表明HLB感染(圖9)。代謝基因中的差異範圍(參見以下實施例5)表明主要和次要代謝物可以在揮發物排放之前受到上調節。
[0181]實施例5:基因表達數據和揮發物的相關性
[0182]在本實施例中，研發生物調節網絡來關聯和顯現通過深入的轉錄物組測序而獲得的基因表達數據。這些活動是通過以下完成的:基於柑橘的轉錄物組的分析而致力於發現和證實用於HLB早期檢測的生物標誌物。
[0183]我們使用了之前公開的葉的轉錄物組分析的數據組，以及使用RNA-seq技術在Illumina GA-1I分析器上在我們的試驗室中由柑橘果實皮組織得到的那些。由柑橘果實皮組織得到的數據組表明以下所述並證實的信息。這些數據組包含158656個疊連群，與NCBI甜橙單一基因組相比，該單一基因組包含15808個唯一的基因(在我們仍不具有參照柑橘基因組序列時進行了此項工作)。
[0184]大約一半(45.7%)的這些基因(15808)能夠與我們的疊連群相匹配，並且超過90%的繪製讀序被指定為I柑橘NCBI單一基因。一旦疊連群匹配，我們便使用與該疊連群相關的讀序的總數作為計量來測量該基因的表達。我們在有症狀、無症狀、表觀健康以及野生型果實之間進行了 6對比較，從而計算單個基因表達的變化(對數倍數比)。在我們所檢測的15808個基因中，我們發現在HLB感染的不同階段，大約1156-1723個基因是差異表達的(上調節或下調節)。
[0185]接著,我們使用Pathexpress軟體(Conesa et al.，2005)和MapMan軟體對這些基因進行功能表徵。我們觀察到在差異調節的途徑中，許多途徑涉及會導致揮發性(香味和芳香)化合物的生物合成的途徑，並且當它們在果實的無症狀和有症狀階段受到調解時，我們在圖10中強調了這些途徑。在導致萜類化合物合成的途徑以及其他重要的途徑中，觀察到轉錄的變化。這些途徑包括在質體中發生的、類異戊二烯生物合成的非甲羥戊酸途徑或者4-磷酸-2-C-甲基-D-赤藻糖醇/5-磷酸-1-脫氧代-D-木酮糖途徑(MEP/D0XP途徑)。此外，質體4-羥-3-甲基丁 -2-烯-1-基二磷酸還原酶(ISPH)和香葉草基香葉草基pirophosphate合成酶I基因在HLB感染的果實中受到上調節，並且可能影響與該途徑有關的類胡蘿蔔素的生物合成以及揮發性化合物。在胞液中，HLB調節的途徑包括會產生倍半萜烯和固醇的茉莉酸、甲羥戊酸途徑。
[0186]轉錄物組分析顯示在疾病的早期和晚期階段，引入了編碼脂肪氧合酶、丙二烯氧化物合成酶和12-氧植物二烯還原酶的基因(圖11)。這些結果是使用qRT-PCR分析證實的，其中所述的分析選擇了 2種基因:脂氧合酶2和12-氧植物二烯還原酶。
[0187]成熟果實的定量實時分析證實了通過深入的轉錄物組概況確定的表達模式。有趣的是，在在成熟的葉中，在有症狀的階段誘導了所述的兩種基因，而且，這證明茉莉酸介導的防禦應答是通過葉組織中的HLB感染而誘導的。
[0188]編碼多種類型的萜烯合成酶(其與單萜和二萜的生物合成有關)的基因顯示受到HLB疾病的差異調節，該證據可能影響了柑橘果實的芳香組合物及營養性質(圖12)。這些酶涉及多種職烯、赤黴素、brassinoesteroid、生物鹼和植物揮發物的合成和運輸,這些酶在植物的繁育和防禦中起到不同的作用(Mercke et al.，2004)。在4種類型的植物的果實和葉中，使用qRT-PCR來分析與萜類化合物代謝有關的2種基因(圖12和13)。數據證明在HLB感染的果實中，萜類化合物途徑受到下調節。相反，在幼葉中，萜烯合成酶3和萜烯合成酶環化酶由HLB疾病誘導，同時，在成熟的葉中，萜烯合成酶3在無症狀和有症狀階段受到下調節(圖13)。當我們的數據不能預示所編碼的酶的底物特異性時，這些萜類化合物基因的轉錄調節未必一定預示哪種特定類型的萜烯被誘導。我們能說的是這些基因的誘導可能在無環、單環和雙環單萜的生產中引起差異(圖14)。
[0189]表現出被誘導的另一種揮發物途徑為水楊酸相關的途徑，響應於HLB感染而誘導的水楊酸甲基轉移酶在成熟的果實和幼葉中觀察到(圖15)。這種基因造成了水楊酸甲酯中水楊酸的轉化，並且已知其在不同的植物中在病原體攻擊後被誘導(Loughrin etal., 1993; Huang et al.，2006)。在TMV接種的菸葉中生產的氣態MeSA與受感染的和健康的植物之間的傳播有關的空氣傳播的防禦信號，並且在感染後生產的氣態MeSA的量在相鄰的健康菸草植物中誘導PR-1蛋白質的表達(Shulaev et al.，1997)。儘管多種病原體誘導了水楊酸甲酯的生產，但是識別由感染的葉和果實排放的揮發物中的水楊酸甲酯可以用於HLB診斷。
[0190]除了會導致生產揮發物途徑的途徑以外，我們識別出許多用於疾病早期檢測的、差異調節的其他生物標誌物。我們構建了這樣的網絡，基於已知的途徑和文獻分析，所述的網絡連接了不同的途徑。在圖16中示出的這種網絡提供了對果實中由HLB疾病誘導的代謝的鮮明的洞察。碳水化合物代謝在果實中被改變，並且蔗糖代謝和糖酵解受到嚴重的影響，同時在質體中，與光反應有關的多個基因被誘導。
[0191]激素功能障礙在響應於HLB感染的宿主中可以起到重要的作用。有趣的是，在有症狀的果實中，赤黴素和細胞分裂素相關的基因主要受到下調節，同時乙烯的生物合成和信號傳導被誘導。關於細胞功能的調節，蛋白質的降解和修飾過程受到所述疾病的高度影響。實際上，與C3HC4類型的RING指紋蛋白質(其與泛素的降解過程有關)有關的基因在HLB感染的果實中是差異表達的(圖17A)。在無症狀和有症狀階段，這些結果與基因熱休克蛋白質82的下調節相連(圖17B)。這種基因熱休克蛋白質82的基因通過使用文獻-輔助的蛋白質相互作用的資料庫(Cusick et al.，2009)來構建生物調節網絡而被識別，從而在柑橘中推斷出使用graphviz軟體可視的所預測的PPI網絡(圖17C)。有趣的是,熱休克蛋白質(HSP82和HSP70)(在柑橘中，在所推斷的PPI網絡中是高度相互作用的蛋白質)在由感染的果園得到的3種類型的果實(表觀健康、無症狀和有症狀的階段)中受到下調節。這些蛋白質起到分子伴侶的作用，從而穩定蛋白質、減少蛋白質的錯摺疊或有利於蛋白質的再摺疊，其中所述的蛋白質在應激事件中已經變性。在植物細胞中，HSP70和HS090涉及信號傳導，從而導致植物防禦。推測，在HLB疾病的不同階段下所觀察到的熱休克蛋白質的下調節會增加果實中蛋白質的錯摺疊的過程。
[0192]實施例6:與CTV有關的VOC
[0193]檢驗Twister-GC-TOF方法對CTV檢測的作用。在該研究中，除了收集健康和CTV樣品以外，我們還收集使用2種被稱為「CTV」和「stubborn」的疾病感染的另一種類的樣品。總之，我們得到12中CTV樣品、10種健康樣品以及11種CTV+stubborn樣品。
[0194]對單變量和多變量數據分析而言，Twister數據組生成了峰表。總之，分析33種樣品，並在穿越整個樣品組中檢測383個普通的峰；125個BVOC代謝物被識別，而其餘的263個未識別。然後，將數據經歷主要成分分析(PCA)以及最小二乘法判別分析(PLS-DA)以用於分類和確認。
[0195]我們發現，3個種類的樣品共用了 383個峰(其中的120個被識別)。首先，我們對所有的383個峰使用Student t檢驗，從而具有它們的P值以用於CTV和健康之間的比較。通過建立P值閾值為〈0.1，保留41個峰用於分析。圖18基於41種所選的化學品示出了CTV和健康之間的分離。使用留一法證實策略，PLSR產生的分類精確率為86.36% (CTV為10/12，對照為 9/10)。
[0196]圖18為僅為CTV與健康的PCA得分圖。可以觀察到健康和感染的CTV之間的分離，並且除了一些可能的異常值以外，可以廣泛地分為2類。然後將所指導的分析用於數據組，並使用留一法證實(L-0-0)方法評估模型的精確率。使用4種PLS成分，得到的精確率為96.36%。使用加載圖和單變量分析，可以監測到VOC有助於健康和CTV之間的分離。
[0197]然後，我們將CTV和CTV+stubborn結合為整個一組，並使用Student t檢驗得到p值，從而用於健康以及組合組之間的比較。此外，使用〈0.1作為閾值，保留31個峰用於分析。圖19示出了基於31個峰的健康與組合組之間的分離。使用留一法證實策略，PLSR產生的分類精確率為84.85% (組合組為18/23，對照為10/10)。這表明即使一些感染CTV的樹感染了另一種疾病，仍能良好地檢測CTV感染的樹。
[0198]在2個可分離的峰組中呈現18個峰(一組為「健康與CTV」，另一組為「健康與CTV相關的」)，這樣我們可以假定它們應該與CTV具有更穩定的關係。3種所選的化學品為月桂烯、蒈烯(δ-3-)、以及羅勒烯(e-β-)(圖20)。基於28個峰，使用留一法證實策略，對「純的」CTV樣品的檢測的精確率增加至90.91% (CTV為10/12，對照為10/10)。
[0199]總之，用於各組比較的高的診斷精確率證明Twister-GC-TOF方法對CTV感染和CTV相關的生物標誌物檢測的作用。
[0200]實施例7:由瓦倫西亞橘和華盛頓臍橙得到的VOC的比較
[0201]材料和方法
[0202]如圖22所示，使用連接的分析設備分析由柑橘樹葉樣品所排放的VOC概況。Varian Saturn4000 系列氣相色譜電離離子講質譜(GC/E1-1TMS) (Varian; WalnutCreek, CA)修改為與位於同一 CG溫箱中的2個相同的CG柱(VF-5ms，Varian)相連的前方的2個注射口。由2個複製的SPME纖維上得到的化學品同時解吸附到2個注射口中，並且解吸附的樣品VOC經歷相同的GC溫箱溫度概況，然後使用2個傳感器垂直檢測。使用離子阱質譜分析由I個柱上得到的洗脫化合物(左側)，同時將另一個柱的輸出收集到DMS(右側)中。MS測量允許在特定的停留時間下獲得片段離子物質的荷質比(m/z)，其中所述的停留時間對於特定的化學品而言是獨特的。通過將這些m/z痕量與標準NIST08及Wiley09資料庫相比，我們可以通過MS匹配識別VOC樣品中存在的特定化學化合物。同樣，差示遷移分光計測量了正離子和氟離子物質的豐度，其記錄為掃描補償電壓(sweepingcompensationvoltage)的函數。
[0203]A.用於試驗的柑橘樣品
[0204]萎縮柑橘樹的華盛頓臍橙以及瓦倫西亞橘變種(Four WindsGrowers, Inc.; Winters, CA)購買得到，其被嫁接到相同的根莖上，並在試驗室條件下,在人工白光和受控的溫度(21±2°C)下生長並儲存。為了測量葉的揮發物概況，我們研發了捕獲這些化合物的方法。在高於根莖嫁接上由樹上分離單片葉，使用蒸餾水(DI)漂洗，染色後乾燥，並立即放置在IOmL硼矽酸鹽玻璃頂空取樣瓶，並使用Teflon隔膜覆蓋(Supelco; Walnut Creek, CA)。洗漆葉,從而除去覆蓋在葉上的任何殺蟲劑:任何殺蟲劑的存在均會導致GC/ITMS和GC/DMS光譜的顯著差異。由各品種共收集得到的17種葉樣品用於分析(每個品種2棵樹)。
[0205]將樣品放置在溫度受控的鋁盤中，並保持在45°C，從而平衡由葉散發至頂空中的揮發性化合物。使用85 μ m聚丙烯酸酯塗敷固相微萃取(SPME, Supelco; Walnut Creek, CA)纖維用於收集揮發物。將纖維插入頂空中，並暴露I小時。成對取樣，並允許同時進行GC/MS和GC/DMS分析。在每次使用之前，加熱PSME纖維，並限定在恆定流速的氦氣下在250°C條件下達90分鐘，從而除去被吸附在聚合物上的任何殘餘的不相關的化合物。
[0206]B.氣相色譜質譜(GC/MS)
[0207]為了分析被吸附在SPME纖維上的化學化合物，將它們在250°C下在GC注射口處解吸附達7.5分鐘。使用Varian Saturn4000series GC/ITMS實施色譜分析,其中所述的Varian Saturn4000series GC/ITMS全套裝配有Combipal3000自動化取樣處理系統，並使用2個30m x0.25mm x0.25 μ m相柱(VF_5ms，Varian)(其固定相為組成為5%苯基、95% 二甲基的聚娃氧燒)。將其中的I個柱與離子講質譜儀(Varian;Walnut Creek, CA)相連,而另一個相同的柱與差示遷移分光計(SVAC-1; Sionex; Bedford, MA)相連。GC溫箱被低溫驟冷(cryochill)至5°C，以幫助在色譜分離之前將初始解吸附的揮發物集中在柱頭上。在流動速率lmL/min的氦氣下,運行2個分析柱(Airgas, Inc.; Woodland, CA)。GC概況如下設定:初始溫度設定為5°C並保持15分鐘；以1°C /min梯度升高至75°C並保持15分鐘；以10C /min的梯度升高至100°C並保持15分鐘；以5°C /min的梯度升高至125°C並保持5分鐘；以5°C /min的梯度升高至140°C。使用無分流注射將注射口保持在250攝氏度，以確保所有化合物完全轉移至分析柱中。
[0208]使用離子阱質譜記錄氣相色譜以生產總離子分析圖(TIC)。傳輸線和離子阱歧管分別保持在180°C和270°C下。使用電子源(70eV)使分析物分子形成片段。MS掃描範圍設定至記錄為35-400Th範圍。通過使用質譜檢索V2.0軟體將離子碎片圖譜與使用了 NIST08和Wiley09質譜文庫的質譜資料庫而試驗性地識別洗脫的化學化合物。
[0209]C.氣相色譜差示遷移光譜(GC/DMS)
[0210]在該研究中使用的差示遷移光譜(DMS)單元中，當離子經過密封的反射性63Ni源、並在反應性離子載氣物質(其也是在該過程中生成的)之間間接通過電荷轉移時，由氣體分子生成離子。然後，離子通過具有所施加的零均不對稱無線電頻率電壓脈衝的電極，其中所述的脈衝具有短的強正脈衝以及長的弱負脈衝。在弱和高的視野條件下，離子流動性的非線性使得離子彼此之間分離，並產生2種試驗記錄:1個記錄為針對正電荷離子物質，而另一個為針對負電荷離子物質。通過施加補償電壓，允許所選的離子通過，並登記它們的離子電流。信號振幅反應了樣品中化學品的豐度。在該研究中，我們使用了 1100V的RF、-43V至15V的補償電壓掃描，並且使用流動速率為250mL/min的5級超純氮載氣。
[0211]GC/MS數據分析
[0212]分析由各種柑橘品種得到的17種樣品。選擇最可重複的色譜來形成用於多變量分析的平衡色譜組。總之，使用10個SPME GC/1TMS光譜，每個品種5個。基於光譜的總點積值來進行選擇，值越低，結果越可重複。(參見圖30和31)。使用樣品11，13，14，15，16(得自2種品種)。在初步研究中，我們觀察到與葉的表面積成比例的VOC豐度的變化，其依次隨著葉組織的大小而變化。SPME CG/1TMS的視覺檢查表明分別在49_86min和119_149min下存在2種主要的峰的突出聚類，並且在2個各自的聚類內的洗脫峰顯示高度保守的停留時間以及MS碎片概況(圖23和表16)。在圖24中，針對華盛頓臍橙和瓦倫西亞橘，我們展示3種GC概況；如可以見的那樣，VOC概況彼此高度相似。顯而易見的是，在由2種品種生產的VOC之間存在高度的重疊。通過人工檢查以及注釋創建由2種品種得到的位於TIC光譜內的所有主要峰的峰表，並且記下停留時間和碎片圖案，並使用MS檢索V2.0針對NIST08/Wiley09質譜數據進行試驗性的匹配(參見表16)。將41V0C峰定位；通過峰高對VOC豐度定量；然後將隨後的峰表進行多變量分析(PCA)。為了防止與混合因素(例如葉影響分類的葉的大小)的任何可能的偏差，對各樣品，將所選的峰高對所有所選峰的總豐度(總峰高)歸一化。然後，使用Student t檢驗而檢測到統計顯著差異的峰。然後，使用PCA檢測基於不同的峰的2種品種的分離(圖26)。
[0213]GC/DMS數據分析
[0214]GC/DMS數據由正離子光譜和負離子光譜構成，各光譜顯示離子豐度為停留時間和補償電壓的函數。為了檢驗2種品種的GC/DMS信號的分離，我們使用了 Student t檢驗來檢測可辨的像素，該像素具有區別2種品種的潛力。為了進一步檢驗所選的數據點的特徵，分別使用PCA和主成分回歸(PCR)來視覺呈現基於這些數據點的品種的差異，並定量研究所選像素的可分離性。
[0215]結果和討論
[0216]考慮到已知植物會散發大量的揮發性化合物，並不驚奇的是我們能夠通過GC/MS和GC/DMS檢測大量的排放的V0C。色譜峰分析顯示大量的低豐度化合物、以及較高豐度的更普遍的化學品物質(圖23)。如我們所預計的那樣，我們觀察到在華盛頓臍橙和瓦倫西亞橘品種之間存在許多大豐度的化學品的重疊，表明2種品種可能具有會導致生產這些排放的VOC的極相似的生物化學過程。
[0217]總之，在華盛頓臍橙和瓦倫西亞品種中，通過人工檢查由GC概況識別41種主要的VOC (表16)。然後，使用(p〈0.05)閾值，對歸一化的峰使用Student t檢驗。發現在2種品種之間具有顯著差異的4種VOC以及可能的化學品匹配列於表17中。圖25中示出了這4個明顯的VOC峰的歸一化豐度(Y軸)，其示出了 2種品種的VOC豐度的差異。此外，還基於4種可潛在區別的VOC進行隨後的PCA分析(圖26)。由PCl和PC2捕獲的總變化率分別為93.62%和6.06%,因此表明數據組中的大部分的變化率是通過PCl捕獲的，並且一些較少的貢獻得自PC2。基於由我們的原始的Student t檢驗得到的4種重要的V0C，2組之間的分離是顯而易見的。
[0218]表15為在2種品種中突出的、41種主要的VOC的峰識別表，顯示了停留時間。給定峰的ID、質譜概況以及NIST05內的可能匹配:正向和反向匹配得分如所示。
[0219]表16.發現在華盛頓臍橙和瓦倫西亞橘之間具有顯著差異的GC峰的可能化學品匹配。
[0220]
【權利要求】
1.一種診斷柑橘植物黃龍病的方法，該方法包括: a)獲得由所述的柑橘植物釋放的揮發性化學化合物樣品； b)測量所述的樣品中的一種或多種揮發性化學化合物的數量；其中所述的化合物選自:沉香醇，十二燒(C13H28),戍酮(4-0H-4-Me_2-)，二十六燒，十四烯(1-), 二十二燒，香葉醒，十四燒，苯乙醒，水楊酸甲酯，cumacrene,石竹烯，十六醇，羅勒烯(e-β-)，香葉草基丙酮，二氧化碳，丙烷，2-甲基-戊烷，ο- 二甲苯，2-乙基-1，4- 二甲基-苯，1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-苯，2，2，3，4-四甲基-戊烷，十五烷(C15H32),己烯乙酸酯，十三醛，vocBB45061,vocBB45212,46541，83748，62469，45491，51824，48023, 48272，46850, 4507I, 48807，47176，57101，50888，45074 和 90562 ；以及 c)將所述的一種或多種揮發性化學化合物的測定量與所述的一種或多種揮發性化學化合物的預定值比較，從而診斷所述的柑橘植物中的黃龍病。
2.權利要求1所述的方法，其中所述的預定值是通過測量由感染黃龍病的參照柑橘植物所釋放的一種或多種揮發性化學化合物的數量而確定的。
3.權利要求1所述的方法，其中所述的預定值是通過測量由未感染黃龍病的參照柑橘植物所釋放的一種或多種揮發性化學化合物的數量而確定的。
4.權利要求2或3的 任意一項所述的方法，其中所述的參照柑橘植物與所述的柑橘植物處於相同的發育階段。
5.權利要求1所述的方法，其中使用質譜來測量所述的樣品中的一種或多種揮發性化學化合物的數量。
6.權利要求1所述的方法，其中使用差示遷移分光光度計來測量所述的樣品中的一種或多種揮發性化學化合物的數量。
7.權利要求1-6的任意一項所述的方法，其中所述的柑橘植物為瓦倫西亞橘植物。
8.—種診斷柑橘植物的柑橘衰退病毒(CTV)的方法，該方法包括: a)獲得由所述的柑橘植物釋放的揮發性化學化合物樣品； b)測量所述的樣品中的一種或多種揮發性化學化合物的數量；其中所述的化合物選自:月桂烯，蒈烯(δ-3-)，羅勒烯(e-β-)，十六醇，檸檬烴，二十四烷，布藜烯U-)；以及 c)將所述的一種或多種揮發性化學化合物的測定量與所述的一種或多種揮發性化學化合物的預定值比較，從而診斷所述的柑橘植物中的CTV病。
9.權利要求8所述的方法，其中所述的預定值是通過測量由感染CTV的參照柑橘植物所釋放的一種或多種揮發性化學化合物的數量而確定的。
10.權利要求8所述的方法，其中所述的預定值是通過測量由未感染CTV的參照柑橘植物所釋放的一種或多種揮發性化學化合物的數量而確定的。
11.權利要求9或10的任意一項所述的方法，其中所述的參照柑橘植物與所述的柑橘植物處於相同的發育階段。
12.權利要求8所述的方法，其中使用質譜來測量所述的樣品中的一種或多種揮發性化學化合物的數量。
13.權利要求8所述的方法，其中使用差示遷移分光光度計來測量所述的樣品中的一種或多種揮發性化學化合物的數量。
14.一種診斷柑橘植物的黃龍病的方法，該方法包括: a)獲得由柑橘植物產生的核酸分子樣品； b)測量所述的樣品中的一種或多種核酸分子的數量，其中所述的核酸分子選自:GH3.1(S22545043)，GH3.4 (S44237769)，KA02 (S44303609),水楊酸甲基轉移酶(S44277040), WRKY70(S44288591), MYB-related TF(S44256583)， U-box(S22566824),HSP82(S44237646)，蔗糖酶(S35152777)，萜烯合成酶環化酶(S22583829)，NN脂質轉移蛋白質(LTP) (S44279331)，酸性纖維素酶 8(S22606212)，ω-6-FAD(S44244604)酸性纖維素酶(S22606212)，萜烯合成酶 I (S44285742)，ERTF2 (S44250648)，12-氧代-植物二烯酸酯還原酶(S34125138)，脂氧化酶 2(S34124539)，NNLTP(NCBI 編號:EY754661.1),β -澱粉酶(S44303510)，棒麴黴素3 (S22533016)，葡萄糖-磷酸-運送蛋白2 (S22591828，S22591828, S44257732, S22591828)，ENT-異貝殼杉烯酸羥化酶 2 (S44251582)，棒麴黴素3(S22533016)，α -澱粉酶(S44224848), WRKY70 (S44225142, S44227900, S44288591);以及 c)將所述的一種或多種核酸分子的測定量與所述的一種或多種核酸分子的預定值比較，從而診斷所述的柑橘植物中的黃龍病。
15.權利要求14所述的方法，其中所述的核酸分子為mRNA分子。
16.權利要求14所述的方法，其中所述的預定值是通過測量由感染黃龍病的參照柑橘植物所產生的一種或多種核酸分子的數量而確定的。
17.權利要求14所述的方法，其中所述的預定值是通過測量由未感染黃龍病的參照柑橘植物所產生的一種或多種核酸分子的數量而確定的。
18.權利要求16或17的任意一項所述的方法，其中所述的參照柑橘植物與所述的柑橘植物處於相同的發育階段。
【文檔編號】G01N27/62GK103562718SQ201280025051
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2012年3月21日 優先權日:2011年3月21日
【發明者】C·E·戴維斯, O·菲恩, A·M·丹德卡爾, A·阿克肖諾夫, 趙偉祥, W·張, F·馬迪內裡, K·J·斯科格爾森 申請人:加州大學評議會