一種將目的dna片段插入載體中的方法
2023-05-31 23:15:36
專利名稱：一種將目的dna片段插入載體中的方法
技術領域：
本發明屬於生物工程領域，特別涉及一種將目的DNA片段插入載體中的方法。
背景技術：
為了快速定向把目的基因片段插入到指定載體中，常規的操作模式是聚合酶鏈式 反應得到目的片段，然後T/A克隆到T載體中，經過連接，轉化，篩選，測序步驟驗證後，再通 過雙酶切把目的基因酶切下來，再與線性化指定載體連接，然後再重複連接，轉化，篩選，測 序步驟，最後得到目的克隆。缺點如下1)聚合酶鏈式反應的擴增引物的設計，需要引入酶切位點以及保護鹼基，如果保 護鹼基選擇的不合適，會造成側翼鏈甲基化影響，導致後續酶切無法進行；如果保護鹼基加 的少了，由於目前引物合成儀器上的局限性，經常會在5』端缺少1 2個鹼基，這樣，沒有 空間環境，後續酶切也無法進行。2)酶切位點的選擇，單酶切或者同工酶基本不能選擇，首先是插入方向沒辦法控 制，由於酶切得到的粘端一致，目的基因可以正向，也可以反向連入指定載體；其次是載體 自連的控制，加入連接酶，載體自連的機率遠遠大於片段插入的機率。這樣就需要用小牛鹼 性磷酸酶去預處理酶切過的指定載體，小牛鹼性磷酸酶加的量不足，起不到降低指定載體 自連的效果；小牛鹼性磷酸酶加的量過大，作用時間稍微長一些，會破壞掉指定載體切點， 後續連接等步驟也就無法進行，進而試驗失敗。目前出現了可以把PCR產物快速，定向，有效的克隆到任何目標載體的同源重組 酶克隆方法，如目前市場上的商業產品有美國BD公司In-Fusion Kit和美國Genscript公 司的CloneEZ PCR Cloning Kit，這些同源重組酶克隆方法都不需要附加任何多餘序列， 如磷酸化，補平，加A等，不受限制性內切酶酶切位點的限制，不需要使用中間載體。但是這 些克隆方法價格昂貴，同時存在重組酶識別鹼基數目的局限性，發生重組的同源互補鹼基 數一定要求在15個鹼基，條件苛刻，缺乏靈活性，並且沒有外切的功效。
發明內容
因此，本發明要解決的技術問題就是針對現有的同源重組克隆方法存在同源互補 鹼基數一定要求在15個鹼基的不足，提供一種新的將目的DNA片段插入載體中的同源重組 克隆的方法，該方法要求同源互補鹼基數為3 20個鹼基。本發明解決上述技術問題所採用的技術方案是一種將目的DNA片段插入載體中 的方法，包括以下步驟1)設計併合成擴增目的DNA片斷的引物，該引物的最外側有3 20個鹼基與線性 載體最外側完全互補，用該引物擴增目的DNA片段，得到兩側最外端增加了與線性載體兩 側最外端完全互補的3 20個鹼基的目的DNA片段；2)將步驟1)中得到的目的DNA片段和線性載體混合，加入同源外切重組酶進行反 應，所述的同源外切重組酶是同時具有3』端至5』端外切酶活性和同源重組酶活性的重組酶，反應得到插入了目的DNA片段的重組載體。本發明上述將目的DNA片段插入載體中的方法的示意圖見圖1。根據本發明，步驟1)是設計併合成擴增目的DNA片斷的引物，該引物的最外側有 3 20個鹼基與線性載體最外側完全互補，用該引物擴增目的DNA片段，得到兩側最外端增 加了與線性載體兩側最外端完全互補的3 20個鹼基的目的DNA片段。其中，所述的與線 性載體兩側最外端完全互補的鹼基的數目是3 20個，較佳的是6 17個，最佳的是10 15個。所述的目的DNA片段的兩端是與線性載體兩側最外端完全同源互補的3 20個鹼 基序列，中間是待插入載體的目的DNA片段的鹼基序列。在同源互補序列和目的DNA片段 鹼基序列之間較佳的還可以加入限制性內切酶酶切位點的鹼基序列。同本領域常規的方法 一樣，該酶切位點的引入也可以通過PCR引物的設計中引入。目的DNA片段的長度可以達 12kbp，較佳的是 500bp 4000bp。根據本發明，步驟2)是將步驟1)中得到的目的DNA片段和線性載體混合，加入同 源外切重組酶進行反應，所述的同源外切重組酶是同時具有3』端至5』端外切酶活性和同 源重組酶活性的重組酶，反應得到插入了目的DNA片段的重組載體。其中，所述的同源外切 重組酶可以現有的任何具有3』端至5』端外切酶活性和同源重組酶活性的重組酶。同源 外切重組酶具有3』端至5』端外切酶活性，其對雙鏈PCR產物進行3』到5』切割，直到切 割突出的單鏈與線性化載體的突出端完全互補，然後進行重組，因此可以在較大範圍內選 擇PCR產物與線性化載體的互補鹼基數量，實現載體和目的DNA片段的重組。所述的同源 外切重組酶較佳的如上海捷瑞生物工程有限公司的Ezfusion酶。線性載體對於重組克隆 至關重要。沒有完全線性化的載體會產生非常高的背景。通過過柱純化或者電泳回收可 得到完全線性化的載體。所述的載體可以是本領域的所有的載體。如質粒pET15b、pUC57、 pBluesCriptIISK(+)、pET28a或pIRES等。線性化載體可以是平末端，也可以粘性末端。所 述的反應的體系和反應條件和本領域的常規方法相同。本發明得到的插入了目的DNA片段的重組載體，可以按照原始載體的常規性能和 操作方法，用於轉化相應的宿主細胞，然後進行本領域常規的其他操作。本發明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。相比於現有技術，本發明的有益效果如下本發明是專門為把PCR產物快速，定 向，有效的克隆到任何目標載體的一種方法。相比於美國BD公司In-Fusion Kit和美國 Genscript公司的CloneEZ PCR Cloning Kit的克隆方法，其僅僅具有同源重組的功能， 沒有外切的功效，因此將同源重組的PCR產物與線性化載體的同源鹼基數量限定在較小的 範圍內。而本發明具有外切與同源重組的雙重功效，在較大範圍內(即3 20個鹼基)選 擇PCR產物與線性化載體的同源鹼基數量，可以實現載體和目的DNA片段的重組，使重組末 端鹼基數目的選擇更加靈活，可以根據研究的目的而在該範圍內任意設計。本發明無需DNA 連接酶，只要把目標載體線性化(平末端，粘性末端都可以)，PCR產物無需任何酶促處理， 直接和目標載體混合，20分鐘一站式解決所有問題。有效的避免了在克隆過程中遇到的合 適內切酶的選擇，磷酸化，補平，加A，使用中間載體等等一系列複雜步驟。徹底解決了大部 分限制性內切酶酶切PCR產物時效率極低以及必須選擇合適的保護鹼基的難題。實現完美 的無縫連接。重組率高，無載體自連的假陽性。使用本發明的重組方法，可以定向克隆長達 12kb的片段。操作簡單，成本較低，適用範圍更廣，簡化核酸篩選操作流程，極具廣泛推廣的價值。
以下結合
本發明的特徵和有益效果。圖1是本發明將目的DNA片段插入載體中的方法的示意圖。
具體實施例方式下面用實施例來進一步說明本發明，但本發明並不受其限制。下列實施例中未注 明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例11)插入片段的製備PCR引物的序列如下正向引物:TGCCGCGCGGCAGCCATGAGCCATATTCAACGG；反向引物:GTTAGCAGCCGGATCGAAAAACTCATCGAGCATCAAATG。劃線部分為外切重組同源載體序列，其餘部分為模板序列。引物由上海捷瑞生物 工程有限公司合成。以質粒pET28a (購自Novagen公司)為模板，利用上述引物進行PCR反應。PCR反 應採用上海捷瑞生物工程有限公司的PCR擴增試劑盒。PCR反應體系和反應程序如下。PCR擴增體系 PCR 擴增條件:94°C，2min ；94°C 20s, 60°C 20s, 72°C 40s, 35cycles ；72°C，3min。PCR產物是813bp的Kan+基因，PCR產物的鹼基序列如序列表中SEQID NO :1所 示。PCR產物的純化採用上海捷瑞生物工程有限公司的純化試劑盒，按照說明書步驟進行純 化。2)線性載體的製備用NdeI/BamHI酶切質粒pET 15b (購自Novagen Inc)，所有的內切酶購自MBIfermentas 公司。酶切體系為 酶切反應37°C，2小時。然後酶切產物電泳，回收。所有的電泳回收方面的試劑盒 都是上海捷瑞生物工程有限公司，按照說明書步驟進行電泳回收純化。酶切線性化後，載體 兩端的序列分別是TGCCGCGCGGCAGCC ；GTTAGCAGCCGGATC。與上述PCR引物的劃線部分完全 一致，為後續外切重組做好準備。3)同源重組反應體系的建立使用上海捷瑞生物工程有限公司的EZfusion PCR定向克隆同源重組試劑盒，按其 說明書要求將步驟1)中純化的PCR產物和步驟2)純化的線性化載體進行連接。具體的步 驟是按如下反應體系混合各試劑，將該反應體系在25°C放置30分鐘，然後冰上放置10分 鍾。所得的連接反應液立即用於轉化或者-20°C凍存，稍後轉化。反應體系如下 4)轉化1.新鮮製備的或_70°C下保存的100 μ 1 XLlO-gold感受態細胞(購自Invitrogen Inc)，置於冰上，完全解凍後輕輕地將細胞均勻懸浮。2.加入10 μ 1步驟3)中所得的連接反應液，輕輕混勻。冰上放置30分鐘。3. 42 °C水浴熱激90秒。冰上放置2分鐘。4.加600 μ 1 SOC培養基，37°C 250rpm振蕩培養1小時。
5.室溫下4000rpm離心5分鐘，用槍頭吸掉500 μ 1上清液，用剩餘的培養基將細
胞懸浮。6.將細胞均勻細緻的塗布在90mm SOC平板上。7.平板在37°C下正向放置1小時以吸收過多的液體，然後倒置培養過夜。5)重組鑑定和有效克隆的獲得率的測定培養皿上的克隆數目為355個，隨機挑取16個單一菌落，37°C過夜培養，用上海捷 瑞生物工程有限公司的質粒提取試劑盒按照說明書提取質粒。直接用T7引物作為測序引 物對這16個克隆進行測序，結果顯示14個為包含目的片段的陽性克隆，2個空載體。原因 是NdeI或BamHI酶切的不充分，載體只被一個酶線性化，載體自身發生同源外切重組。實施例21)插入片段的製備PCR引物的序列如下正向引物:CCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATGAGCCATATTCAACGG；反向引物:GCTTTGTTAGCAGCCGGATCGAAAAACTCATCGAGCATCAAATG。2)線性載體的製備，同實施例1。3)同源重組反應體系的建立，同實施例1。4)轉化，同實施例1。5)重組鑑定和有效克隆的獲得率的測定培養皿上的克隆數目是136個，隨機挑取16個單一菌落進行測序，結果顯示15個 為包含目的片段的陽性克隆，1個空載體。實施例31)插入片段的製備PCR引物的序列如下正向引物CAGCCATGAGCCATATTCAACGG；反向引物GGATCCGAAAAACTCATCGAGCATCAAATG。2)線性載體的製備，同實施例1。3)同源重組反應體系的建立，同實施例1。4)轉化，同實施例1。5)重組鑑定和有效克隆的獲得率的測定培養皿上的克隆數目是63個，隨機挑取16個單一菌落進行測序，結果顯示13個 為包含目的片段的陽性克隆，3個空載體。序列表上海捷瑞生物工程有限公司 一種將目的DNA片段插入載體中的方法P4-091167C1PatentIn version 3. 41813
DNAArtificial (人工序列)克隆片段gene(1). . (813)Kan+基因1atgagccatattcaacgggaaacgtcttgctctaggccgcgattaaattccaacatggat60
gctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatc120
tatcgattgtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagc180
gttgccaatgatgttacagatgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcct240
cttccgaccatcaagcattttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcg300
atccccgggaaaacagcattccaggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatatt360
gttgatgcgctggcagtgttCCtgCgCCggttgcattcgattcctgtttgtaattgtcct420
tttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttg480
gttgatgcgagtgattttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaa540
gaaatgcataaacttttgccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctca600
cttgataaccttatttttgacgaggggaaattaataggttgtattgatgttggacgagtc660
ggaatcgcagaccgataccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtgagttttct720
ccttcattacagaaacggctttttcaaaaatatggtattgataatcctgatatgaataaa780
ttgcagtttcatttgatgctcgatgagtttttc81權利要求
一種將目的DNA片段插入載體中的方法，其特徵在於，包括以下步驟1)設計併合成擴增目的DNA片斷的引物，該引物的最外側有3～20個鹼基與線性載體最外側完全互補，用該引物擴增目的DNA片段，得到兩側最外端增加了與線性載體兩側最外端完全互補的3～20個鹼基的目的DNA片段；2)將步驟1)中得到的目的DNA片段和線性載體混合，加入同源外切重組酶進行反應，所述的同源外切重組酶是同時具有3』端至5』端外切酶活性和同源重組酶活性的重組酶，反應得到插入了目的DNA片段的重組載體。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟1)中所述的同源互補序列和目的DNA 片段鹼基序列之間還加入限制性內切酶酶切位點的鹼基序列。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟1)中所述的目的DNA片段的長度 500bp 4000bp。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟2)中所述的同源外切重組酶是上海捷 瑞生物工程有限公司的Ezfusion酶。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟2)中所述的載體是質粒pET15b、 pUC57、pBluescriptII SK(+)、pET28a 或pIRES。
6.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟2)中所述的線性化載體是平末端或粘 性末端。
全文摘要
本發明公開了一種將目的DNA片段插入載體中的方法，包括以下步驟1)設計併合成擴增目的DNA片斷的引物，該引物的最外側有3～20個鹼基與線性載體最外側完全互補，用該引物擴增得到目的DNA片段；2)將目的DNA片段和線性載體混合，加入同時具有3』端至5』端外切酶活性和同源重組酶活性的重組酶進行反應，得到插入了目的DNA片段的重組載體。本發明具有外切與同源重組的雙重功效，在較大範圍內(即3～20個鹼基)選擇PCR產物與線性載體的同源鹼基數量，使重組末端鹼基數目的選擇更加靈活；無需DNA連接酶，只要把目標載體線性化，PCR產物無需任何酶促處理，直接和目標載體混合，20分鐘一站式解決所有問題，實現完美的無縫連接，操作簡單，成本較低。
文檔編號C12N15/66GK101899467SQ200910051959
公開日2010年12月1日 申請日期2009年5月26日 優先權日2009年5月26日
發明者肖愛軍, 赫英俊, 邵標 申請人:上海捷瑞生物工程有限公司