生產伽馬－羧化的蛋白的方法

2023-05-30 03:17:16

專利名稱：生產伽馬－羧化的蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及包含表達載體的宿主細胞，所述表達載體包含編碼需要伽馬-羧化作用的蛋白的核酸分子和相連的包含第一啟動子的表達控制序列，和編碼γ-穀氨醯羧化酶的核酸分子和相連的包含第二啟動子的表達控制序列。本發明進一步涉及以高產量生產需要γ-羧化作用的蛋白的方法。
背景技術：
出血是常見的臨床問題。它是疾病、外傷、手術和藥物治療的結果。機械性地阻止出血是必要的。由於出血的位置或由於從許多(小)脈管散開，這是非常困難的或甚至是不可能的。因而出血的病人可能需要用支持止血的試劑治療。這可以是血液衍生產品(血治療，heamotherapy)、引起內源止血劑的釋放的試劑、重組凝結因子(F)或延遲血液凝塊分解的試劑。
通常從地方醫院獲得的血液衍生產品之中第一線的治療(first linetreatment)是用於容量置換和支持止血的全血，包裝的紅細胞用於改善氧轉運容量，血小板濃縮物以提高血小板數量(如果數量低或有缺陷)和新鮮的冷凍血漿用於支持止血(血液凝結和血小板聚集)。支持止血的第二線的血漿衍生產品是血漿冷沉澱物、凝血酶原複合物濃縮物、活化的凝血酶原複合物濃縮物和純化的凝結因子。作為人類重組蛋白，無活性的(凝結因子VIII和IX)和活化的(凝結因子VIIa)，一些凝結因子當今是可獲得的。
血友病是遺傳的或後天的出血失調，有異常的或缺陷的凝結因子或抑制促凝血功能的針對凝結因子的抗體。最常見的血友病是血友病A(缺乏凝結因子VIII)和血友病B(因子IX)。提純的或重組的單獨的凝結因子是血友病病人的主要治療手段。有抑制性抗體的病人遇到了治療難題，因為抗體也可以中和向該病人施用的凝結因子。通過降解活化的凝結因子Va和VIIIa，蛋白C的活性形式(APC)是血漿凝結的抑制物。已經顯示重組的APC是敗血症病人中不適當的血漿凝結的有效治療手段。
儘管純化過程並不簡單和需要許多步驟，某些步驟目的在於消除汙染的病毒，用於治療用途的凝結因子可以從人類血漿獲得。但是儘管有血液衍生產品的大量的安全性測量和測試，也無法排除感染性病毒或朊病毒的汙染。由於這種風險，非常期望從無動物衍生成分的培養基中生長的重組細胞中產生人類治療性蛋白。這不總是簡單的，因為許多蛋白需要哺乳動物宿主來以完全功能性的形式產生，即，被正確地翻譯後修飾。在重組細胞中商業化生產的凝結因子有FVII(NovoSeven)、FVIII(Kogenate，Recombinate，Refacto)和FIX(BeneFix)(Roddie and Ludlam.Blood Rev.11169-177，1997)和Active Protein C(Xigris)。在獲取大量的全功能重組人凝結因子時的一個主要障礙在於FII、FVII、FIX、FX和蛋白C中存在的Gla結構域。這個結構域含有通過添加羧基基團翻譯後修飾的穀氨酸殘基。這些因子的生產受到如下事實的妨礙，即它們的過量表達引起羧化不足，由此產生無活性的蛋白。Gla修飾是被稱為γ-穀氨醯羧化酶(GGCX)的維生素K依賴性酶的作用的結果。許多科學家，特別是那些致力於凝結因子研究的科學家已經對這個酶進行了廣泛的研究(WO-A-8803926；Wu et al.Science 254(5038)1634-1636，1991；Rehemtulla et al.，Proc Natl Acad Sci USA 904611-4615，1993；StanleyJ.Biol.Chem.274(24)16940-16944，1999；Vo et al.，FEBS letters445256-260，1999；Begley et al.，The Journal of Biological Chemistry275(46)36245-36249，2000；Walker et al.，The Journal of BiologicalChemistry 276(11)7769-7774，2001；Bandyopadhyay，et al.Proc NatlAcad Sci USA 99(3)1264-1269，2002；Czerwiec et al.，Eur J Biochem2696162-6172，2002；Hallgren et al.，Biochemistry 41(50)15045-15055，2002；Harvey et al.，The Journal of Biological Chemistry 278(10)8363-8369，2003)。至少兩個科學團隊已經進行了通過與凝結因子FIX共表達GGCX來提高產量的嘗試，但是沒有成功(Rehemtulla，et al.1993，ibid；Hallgren et al.2002，ibid)。考慮到在γ-羧化蛋白方面的巨大興趣，可以推測有更多的共表達試驗失敗了並因此沒有被報導。
對於人類FII(凝血酶原)，為了獲得全功能的凝血酶原，10個Glu殘基中的至少8個必需被正確地修飾(Malhotra，et al.，J.Biol.Chem.260279-287，1985；Seegers and Walz ′Prothrombin and othervitamin K proteins′，CRC Press，1986)。獲得rhFII的高生產水平的廣泛的努力已經利用了幾種不同的系統，例如，CHO細胞、BHK細胞、293細胞和牛痘病毒表達系統，但是都失敗了或產生了羧化不足的產物，因而是功能上無活性的凝血酶原(Jφgensen et al.，J.Biol.Chem.2626729-6734，1987；Russo et al.，Biotechnol Appl Biochem 14(2)222-233，1991；Fischer et al.，J Biotechnol 38(2)129-136，1995；Herlitschka et al.Protein Expr.Purif.8(3)358-364，1996；Russo et al.，Protein Expr.Purif.10214-225，1997；Vo et al.1999，ibid；Wu and SuttieThromb Res 96(2)91-98，1999)。較早報導的羧化的重組人類凝血酶原的生產能力很低；突變凝血酶原20mg/L(Cote et al.，J.Biol.Chem26911374-11380，1994)，在CHO細胞中表達的人類凝血酶原0.55mg/L(完全羧化的，Jφrgensen et al.1987，同上)，在CHO細胞中的25mg/L(羧化的程度未顯示，Russo et al.1997，同上)。
WO 92/19636公開了人類和牛的維生素K依賴性羧化酶的克隆和序列鑑定。該申請建議在適合的宿主細胞中共表達維生素K依賴性羧化酶和維生素K依賴性蛋白來製備維生素K依賴性蛋白。沒有例舉羧化酶和維生素K依賴性蛋白的共表達。
需要改進的方法來以高產量生產活化的凝血因子。本發明要解決這種需求。
發明概述根據本發明的第一個方面，提供了包含表達載體的宿主細胞，所述表達載體包含編碼需要伽馬-羧化作用的蛋白的核酸分子和相連的(associated)包含第一啟動子的表達控制序列，和編碼γ-穀氨醯羧化酶的核酸分子和相連的包含第二啟動子的表達控制序列，其中所述第一啟動子比所述第二啟動子更強，足以使得需要伽馬-羧化作用的蛋白和γ-穀氨醯羧化酶以至少10∶1的比例表達。
根據本發明的另一個方面，提供了細胞，其被工程化以表達(i)需要伽馬-羧化作用的蛋白，和(ii)γ-穀氨醯羧化酶，其中所述蛋白(i)和(ii)以10∶1到500∶1之間的比例表達。
根據本發明的另一個方面，提供了遺傳地修飾的真核宿主細胞，其包含(i)編碼γ-穀氨醯羧化酶蛋白的多核苷酸序列，其中所述γ-穀氨醯羧化酶蛋白編碼序列可操作地與表達控制序列連接，所述表達控制序列允許所述細胞表達γ-穀氨醯羧化酶蛋白；和(ii)編碼需要所述γ-穀氨醯羧化酶蛋白的羧化作用的蛋白的多核苷酸，可操作地與表達控制序列連接，所述表達控制序列允許所述細胞表達所述需要羧化作用的蛋白；其中所述細胞能夠以至少1∶10的比例表達所述γ-穀氨醯羧化酶蛋白和所述需要羧化作用的蛋白。
根據本發明的進一步的方面，提供了載體，所述載體包含編碼需要伽馬-羧化作用的蛋白的核酸分子和相連的包括第一啟動子的表達控制序列，和編碼γ-穀氨醯羧化酶的核酸分子和相連的包含第二啟動子的表達控制序列，其中所述第一啟動子比所述第二啟動子更強，足以使得需要伽馬-羧化作用的蛋白和γ-穀氨醯羧化酶以至少10∶1的比例表達。
根據本發明的又另一個方面，提供了生產伽馬-羧化的蛋白的方法，包括(i)培養細胞，所述細胞被改造(adapted)來以至少10∶1的比例表達需要伽馬-羧化作用的蛋白和γ-穀氨醯羧化酶，在適合於表達這兩種蛋白的條件下培養，和(ii)分離伽馬-羧化的蛋白。在一個實施方式中，該方法用於生產伽馬-羧化的人類因子IX，在另一個實施方式中該方法用於生產伽馬-羧化的人類凝血酶原。在另一個實施方式中，所述生產的伽馬-羧化的蛋白是人類伽馬-羧化的因子X。
根據本發明的另一個方面，提供了在哺乳動物細胞系中生產伽馬-羧化的蛋白的方法，包括在所述哺乳動物細胞系中使所述需要伽馬-羧化作用的蛋白與γ-穀氨醯羧化酶共表達的步驟，其中表達的需要伽馬-羧化作用的蛋白的數量至少是表達的γ-穀氨醯羧化酶的數量的10倍，和(ii)分離伽馬-羧化的蛋白。在一個實施方式中，該方法用於生產伽馬-羧化的人類因子IX，在另一個實施方式中該方法用於生產伽馬-羧化的人類凝血酶原。在另一個實施方式中，所述生產的伽馬-羧化的蛋白是人類伽馬-羧化的因子X。
根據本發明的進一步的方面，提供了根據上述方法生產的分離的伽馬-羧化的蛋白，根據上述方法生產的分離的伽馬-羧化的蛋白在凝結治療中的用途，或根據上述方法生產的分離的伽馬-羧化的蛋白用於製造用於凝結治療(coagulation therapy)的藥物的用途。
根據本發明的再進一步的方面，提供了生產適合於誘導血液凝固或促進增加的或減少的凝結的藥物組合物的方法，包括純化從宿主細胞表達的活性羧化的蛋白，所述宿主細胞被改造來以10∶1到500∶1之間的比例表達需要伽馬-羧化作用的蛋白和γ-穀氨醯羧化酶，和將所述純化的羧化蛋白與一種或多種藥學上可接受的載體(carrier)或賦形劑混合，以及可從該方法獲得的藥物組合物。在一個實施方式中，所述活性羧化的蛋白是伽馬-羧化的人類因子IX，在另一個實施方式中所述活性羧化的蛋白是伽馬-羧化的人類凝血酶原。在另一個實施方式中，所述活性羧化的蛋白是人類伽馬-羧化的因子X。
附圖的簡要說明附

圖1a說明了PN32(凝血酶原+GGCX)共表達載體的質粒圖。
附圖1b表示了Ptext5(凝血酶原)表達載體的質粒圖。
附圖2表示了PP6(凝血酶原+GGCX)共表達載體的質粒圖。
附圖3a表示了F9NopA(因子IX+GGCX)共表達載體的質粒圖。
附圖3b表示了F9hglx(因子IX+GGCX)共表達載體的質粒圖。
發明的詳細說明我們設計了高水平表達適當羧化的重組維生素K依賴性凝血因子的不同方法，包括以不同的比例共表達維生素K依賴性凝結因子和γ-穀氨醯羧化酶(GGCX)。作為一個實例，我們表達了人類凝血酶原(rhFII)和人類GGCX。與其他人(Rehemtulla et al.，1993，同上；Hallgren et al.，2002，同上)已經嘗試的對rhFII和GGCX都使用強啟動子不同，我們使用一種策略，旨在強表達FII結合弱或極弱表達GGCX，使得表達的GGCX的數量是表達的rhFII的1/10以下。出乎我們意料，這種策略引起了高水平的、分泌的正確修飾的rhFII和宿主細胞的良好生存力，即使是細胞在無動物成分的化學成分明確的培養基中生長時。
我們已經以這樣的方式將GGCX和人類凝血酶原克隆到表達載體中，以使凝血酶原mRNA水平超過GGCX mRNA水平的至少9倍。這引起了與GGCX蛋白相比產生大量過剩的凝血酶原蛋白。
作為進一步的實例，我們使用相同的GGCX共表達載體表達了rhFIX。這產生了細胞系，在一種情況中細胞系產生因子IX mRNA的水平超過GGCX mRNA水平的至少9倍。在另一個細胞系中，因子IX∶GGCX mRNA比例大約4-5∶1。僅有產生至少10∶1的比例的細胞系顯示了顯著提高的rhFIX生產力(表1)。
表1.生產力和羧化的蛋白∶GGCx mRNA比例的總覽

*生產力是在類似生長條件下從旋轉培養物測量的。
¤數據來自Rehemtulla 1993和美國專利No.5,460,950。
通過與GGCX共表達的當前方法產生的維生素K依賴性凝血因子(FII、FVII、FIX、FX和它們的活化形式FIIa或凝血酶、FVIIa、FIXa、FXa)可以預期在預防和治療外傷、手術後的出血或肝、腎、血小板或血液凝結因子(血友病)的疾病方面是有用的。同樣地，凝結因子蛋白C和它的活化形式APC可以預期在預防和治療有或沒有蛋白C水平降低的升高的凝結失調方面是有用的。該方法還適合於需要翻譯後羧化作用的其他蛋白。
根據本發明的第一個方面，提供了包含表達載體的宿主細胞，所述表達載體包含編碼需要伽馬-羧化作用的蛋白的核酸分子和相連的包含第一啟動子的表達控制序列，和編碼γ-穀氨醯羧化酶的核酸分子和相連的包含第二啟動子的表達控制序列，其中所述第一啟動子比所述第二啟動子更強，足以使得需要伽馬-羧化作用的蛋白和γ-穀氨醯羧化酶以至少10∶1的比例表達。
在優選的實施方式中，表達的蛋白的比例在10∶1到1000∶1之間，更優選的10∶1到500∶1之間，再更優選的在25∶1到250∶1之間。特別適合的比例是約200∶1。
在獨立的實施方式中，兩種表達的蛋白的比例可以是至少10∶1，30∶1，45∶1，50∶1，100∶1，200∶1，250∶1，300∶1，400∶1，500∶1和1000∶1。
在一個特定的實施方式中，編碼需要伽馬-羧化作用的蛋白和相連的表達控制序列的核酸分子，和編碼γ-穀氨醯羧化酶和相連的表達控制序列的核酸分子，位於相同的表達載體上。在另一個實施方式中，這兩個核酸分子位於獨立的表達載體上。
根據本發明的進一步的方面，提供了根據SEQ ID NO14和SEQID NO15的核酸。
根據本發明的進一步的方面，提供了宿主細胞，所述宿主細胞用包含SEQ ID NO14或SEQ ID NO15的序列的載體轉染或轉化了，用於表達人類因子IX。
根據本發明的進一步的方面，提供了能表達人類凝結因子IX和人類伽馬羧化酶的宿主細胞，其中編碼人類凝結因子IX的核酸和編碼伽馬羧化酶的核酸分別可操作地與控制序列連接，所述控制序列能夠以至少10∶1的比例表達兩種蛋白。
根據本發明的進一步的方面，提供了非人類真核宿主細胞，所述宿主細胞被改造來以至少10∶1的比例表達人類凝結因子IX和人類伽馬羧化酶。在特定的實施方式中，編碼人類凝結因子IX的核酸和編碼伽馬羧化酶的核酸分別可操作地與控制序列連接，所述控制序列能以至少10∶1的比例表達兩種蛋白。
根據本發明的進一步的方面，提供了攜帶外源核酸的宿主細胞，所述外源核酸包含在hCMV啟動子控制下的人類凝結因子IX編碼核酸和在SV40啟動子控制下的人類羧化酶編碼核酸。
根據本發明的進一步的方面，提供了根據SEQ.ID NO1、SEQ IDNO2或SEQ.ID NO3的核酸。
根據本發明的進一步的方面，提供了宿主細胞，所述宿主細胞用包含SEQ.ID NO1、SEQ.ID NO2或SEQ ID NO3的序列的載體轉染或轉化了，用於表達人類凝血酶原。
根據本發明的進一步的方面，提供了能表達人類凝血酶原和人類伽馬羧化酶的宿主細胞，其中編碼人類凝血酶原的核酸和編碼伽馬羧化酶的核酸分別可操作地與控制序列連接，所述控制序列能夠以至少10∶1的比例表達兩種蛋白。
根據本發明的進一步的方面，提供了非人類真核宿主細胞，所述宿主細胞被改造來以至少10∶1的比例表達人類凝血酶原和人類伽馬羧化酶。在特定的實施方式中，編碼人類凝血酶原的核酸和編碼伽馬羧化酶的核酸分別可操作地與控制序列連接，所述控制序列能以至少10∶1的比例表達兩種蛋白。
根據本發明的進一步的方面，提供了攜帶外源核酸的宿主細胞，所述外源核酸包含在hCMV啟動子控制下的人類凝血酶原編碼核酸和在SV40啟動子控制下的人類羧化酶編碼核酸。
本申請使用凝血酶原和凝結因子IX作為需要羧化作用的蛋白進行了例證。然而，除了凝血酶原和因子IX以外的一些蛋白，它們的完全生物學活性取決於正確的γ-羧化作用。在人們已知的這些蛋白之中有凝結因子FVII，當前它僅以相對低的水平在重組哺乳動物細胞中商業化生產(約10mg/L或更低)。本發明適用於改善依賴於γ-羧化作用的任何蛋白的生產率，這種蛋白包括，但不限於凝血酶原、凝結因子II(FII)、凝結因子VII(FVII)、凝結因子IX(FIX)、凝結因子X(FX)、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、骨Gla蛋白(也稱為BGP或骨鈣蛋白)、基質Gla蛋白(MGP)、富脯氨酸Gla多肽1(prolinerich Gla polypeptide 1)(PRRG1)、富脯氨酸Gla多肽2(PRRG2)、生長停滯-特異性蛋白6(Growth arrest-specific protein 6)(Gas 6)。其他適合的蛋白是在毒蛇(Acanthophiina亞科)的毒液和錐形蝸牛(Conus textile)毒液中的FXa樣蛋白。
這些蛋白的每一種，包括它們的核酸和胺基酸序列，都是公知的。表2列出了可用於本發明的各種蛋白的野生型和突變形式的代表性序列。
表2.


需要理解的是，本發明不限於特定蛋白或有待共表達的這些蛋白之一的蛋白編碼序列。此外，特別對於血液凝結因子，本領域中已經公開了蛋白的許多突變形式。本發明同樣的適合於這些突變形式，包括蛋白的天然發生的等位變體，就象適合野生型序列一樣。在一個實施方式中，本發明可以採取任何野生型蛋白或與其具有至少90％、優選的至少95％的序列同一性的蛋白。
兩個序列之間的序列同一性可以通過配對方式的計算機比對分析，使用例如BestFit、PILEUP、Gap或FrameAlign的程序來確定。優選的比對工具是BestFit。在實踐中，當從序列資料庫中搜索查詢檢索的相似/相同序列時，一般必需使用適合的算法，例如Blast、Blast2、NCBI Blast2、WashU Blast2、FastA或Fasta3和計分矩陣例如Blosum62來進行相似序列的初步鑑定。這些算法力圖緊密地接近Smith-Waterman的「金標準(gold-standard)」比對算法。因而，用於評定相似性，即，兩種原始多肽序列如何排列的優選的軟體/搜尋引擎程序是Smith-Waterman。同一性是指直接匹配，相似性容許保守性替換。
在此使用的術語「γ-穀氨醯羧化酶」或「GGCX」是指催化穀氨酸殘基的羧化作用的維生素K依賴性酶。
GGCX酶是廣泛分布的，已經從許多不同的物種，例如白鯨Delphinapterus leucas、蟾魚Opsanus tau、雞(Gallus gallus)、盲鰻(Myxine glutinosa)、鱟(Limulus polyphemus)和錐形蝸牛Conus textile(Begley et al.，2000，ibid；Bandyopadhyay et al.2002，ibid)克隆出來。來自圓錐蝸牛的羧化酶類似於牛羧化酶，已經在COS細胞中表達(Czerwiec et al.2002，ibid)。類似於GGCX的其他蛋白可以在昆蟲和原核生物中發現，例如Anopheles gambiae、Drosophila melanogaster和Leptospira，NCBI登記號分別為gi 31217234、gi 21298685、gi24216281、gi 24197548和(Bandyopadhyay et al.，2002，ibid)。羧化酶顯示了顯著的的進化保守性。一些非人類酶已經顯示了、或預測具有類似於我們使用的人類GGCX的活性，因而可被用作人類酶的替代物。
表3列出了可被用於本發明中、與人類GGXC同源的(按物種來源分類的)預測的蛋白的代表性序列。
表3.

表8分子特徵

通過在核糖體滑動位點的一個-1移碼，1a ORF伸展至稱為1ab的具有6729胺基酸殘基的蛋白質。ORF 1a和1ab編碼兩個通過蛋白質水解被轉化為16個涉及RNA複製的很大程度上還未被研究的酶的多蛋白(綜述參見Snijder，E.J.，P.J.Bredenbeek，J.C.Dobbe，V. Thiel，J.Ziebuhr，L.L. Poon，Y.Guan，M.Rozanov，W.J.Spaan，and A.E.Gorbalenya.2003.Unique and Conserved Features of Genome andProteome of SARS-coronavirus，an Early Split-off From the CoronavirusGroup 2 Lineage.J.Mol.Biol.331991-1004)。

以上確定的每種GGCX蛋白和來自其他物種的GGCX蛋白可被用作本發明中的羧化酶。
實現差別表達兩種共表達的蛋白的一種途徑是使用不同的啟動子作為各自的表達控制序列的部分。本領域有大量能以不同程度或幅度表達異源蛋白的不同啟動子和其他表達控制序列的實例。已經適當地發展了重組表達技術使得蛋白表達領域的技術人員能夠選擇啟動子和其他控制序列來以期望的比例共表達需要羧化作用的蛋白和羧化酶。選擇使用哪些特定的啟動子和其他表達控制序列是各人的選擇問題。
在一個實施方式中，與需要伽馬-羧化作用的蛋白相連的控制序列包含強啟動子。在一個實施方式中，這個啟動子是人類巨細胞病毒(hCMV)即時-早期(immediate-early)啟動子。強啟動子在此被定義為產生超過1000個轉錄產物/細胞的啟動子。弱啟動子在此被定義為產生少於1000個轉錄產物/細胞的啟動子。
在另一個實施方式中，與γ-穀氨醯羧化酶相連的控制序列包含弱啟動子。在一個實施方式中，這個啟動子是SV40早期啟動子。在另一個實施方式中，需要伽馬-羧化作用的蛋白和γ-穀氨醯羧化酶處於不同的啟動子元件的控制之下，控制γ-穀氨醯羧化酶表達的啟動子比控制需要伽馬-羧化作用的蛋白表達的啟動子更弱。
在另一個實施方式中，γ-穀氨醯羧化酶處於SV40早期啟動子的控制之下，需要伽馬-羧化作用的蛋白處於人類巨細胞病毒(hCMV)即時-早期啟動子的控制之下。在根據本發明的這個特定方面的一個實施方式中，需要伽馬-羧化作用的蛋白是人類因子X。在另一個實施方式中，需要伽馬-羧化作用的蛋白是人類凝血酶原。在另一個實施方式中，需要伽馬-羧化作用的蛋白是人類因子IX。
已經使用強CMV啟動子(Boshart et al.Cell 41521-530，1985)來過量表達因子IX或凝血酶原，和更弱的SV40啟動子(Wenger et al.Anal Biochem 221416-418，1994)來控制GGCX表達，例證了本發明。能根據本發明使用的其他強啟動子包括，但不限於，pEF-1α[人類延伸因子1α亞基基因)(Mizushima and Nagata，Nuc Acids Res 185322，1990；Goldman et al.，BioTechniques 211013-1015，1996)、pRSV[勞氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)(Gorman et al.，Proc Natl Acad Sci USA796777-6781，1982)]和pUbC[人類遍在蛋白(Schorpp et al.，Nuc AcidsRes 241787-1788，1996)]。
確保生產的蛋白(需要羧化作用的蛋白)與修飾酶相比是過量的，產生至少10∶1的比例，是很重要的。實現低水平表達修飾酶(γ-穀氨醯羧化酶)的途徑包括1)使用弱啟動子來控制修飾酶的表達，包括、但不限於，SV40即時早期啟動子、最小化的FIX啟動子(Rouet et al.，The Journal ofBiological Chemistry 26720765-20773，1992)或HSV胸苷激酶啟動子(Wenger et al.，1994，ibid)。
2)對啟動子、或強啟動子的增強子序列進行突變來降低啟動子強度。
3)移除或改變Kozak序列(翻譯起始信號)來降低翻譯效率(Kozak.Nuc Acids Res 158125-8148，1987；Kozak.Proc Natl Acad Sci USA878301-8305，1987，1990)。
4)將編碼待生產的蛋白(需要羧化作用的蛋白)的核酸和編碼GGCX的核酸克隆到獨立的載體上，用大量過剩的含待生產蛋白的構建體轉染，以產生具有含待生產蛋白的構建體的多個拷貝的細胞。
5)將編碼待生產的蛋白的DNA和編碼GGCX修飾載體的DNA克隆到獨立的載體上，共轉染或單獨轉染，使用放大系統來放大待生產蛋白的表達。
6)分離重組表達低水平(但高於內源水平)的GGCX的穩定的細胞系，用作表達需要γ-羧化作用的蛋白的宿主細胞系。
7)向GGCX中導入突變來降低GGCX底物親合性。
除了這些之外，重組蛋白表達領域的技術人員知道能夠用於產生宿主細胞的其他的方法，所述宿主細胞以至少10∶1的比例表達需要羧化作用的蛋白和羧化酶蛋白。
根據本發明的進一步的方面，提供了細胞，其被工程化或被改造以表達(i)需要伽馬-羧化作用的蛋白，和(ii)γ-穀氨醯羧化酶，其中所述蛋白(i)和(ii)以10∶1到500∶1之間的比例表達。在特定的實施方式中，γ-穀氨醯羧化酶在內源水平(即，在未工程化或改造的細胞中的水平)的2到5倍之間被表達。
根據本發明的進一步的方面，提供了重組細胞，其被改造以表達(i)γ-穀氨醯羧化酶蛋白，高於在相當的未改造細胞中的組成性水平，和(ii)需要羧化作用的蛋白，其中表達的γ-穀氨醯羧化酶蛋白和需要羧化作用的蛋白的數量處於至少1∶10的比例中。
根據本發明的進一步的方面，提供了遺傳地修飾的真核宿主細胞，其包含(i)編碼γ-穀氨醯羧化酶蛋白的多核苷酸序列，其中所述γ-穀氨醯羧化酶蛋白編碼序列可操作地與表達控制序列連接，所述表達控制序列允許所述細胞表達γ-穀氨醯羧化酶蛋白；和(ii)編碼需要所述γ-穀氨醯羧化酶蛋白的羧化作用的蛋白的多核苷酸，可操作地與表達控制序列連接，所述表達控制序列允許所述細胞表達所述需要羧化作用的蛋白；其中所述細胞能夠以至少1∶10的比例表達所述γ-穀氨醯羧化酶蛋白和所述需要羧化作用的蛋白。
根據本發明的進一步的方面，提供了細胞，其被改造以表達需要伽馬-羧化作用的蛋白和γ-穀氨醯羧化酶，其中編碼需要伽馬-羧化作用的蛋白的核酸和編碼γ-穀氨醯羧化酶的核酸處於調節序列的控制之下，所述調節序列適合於確保表達的需要伽馬-羧化作用的蛋白的數量是γ穀氨醯羧化酶蛋白的數量的至少10倍。
在一個實施方式中，需要伽馬羧化作用的蛋白和γ-穀氨醯羧化酶中的至少一個是從已經通過重組技術導入到細胞中的核酸表達的。進行本發明的一個替換性途徑是表達內源蛋白(需要羧化作用的蛋白或羧化酶)，但是用異源序列替換內源控制序列(啟動子等等)來實現期望的表達水平。
宿主細胞優選的是真核細胞。典型的宿主細胞包括，但不限於昆蟲細胞、酵母細胞和哺乳動物細胞。哺乳動物細胞是特別優選的。適合的哺乳動物細胞系包括，但不限於，CHO、HEK、NS0、293、Per C.6、BHK和COS細胞，和它們的衍生物。在一個實施方式中，宿主細胞是哺乳動物細胞系CHO-S。
早先，羧化作用依賴性蛋白的過量表達一般產生羧化不足的產物。這是由於內源性宿主細胞羧化作用能力是有限的。另一方面，GGCX活性的極大(16到70倍)過量表達沒有改善產物產率(Rehemtulla etal.，Proc Natl Acad Sci USA 904611-4615，1993)，(Berkner and Pudota，Proc Natl Acad Sci USA.95446-471，1998)，(Hallgren et al.，Biochemistry 41(50)15045-15055，2002)。這一點的原因還未完全了解。我們的發明需要GGCX的中度過量表達。這確保了高於內源水平的GGCX從細胞中表達出來，例如，GGCX活性水平僅升高1.5到5倍。在這種適度升高的水平之下，如在實施例1中所示，獲得了令人驚訝的高水平的完全羧化的rhFII。
因此應當理解的是，使本發明與上述共表達教導相區分的、需要羧化作用的蛋白和羧化酶的表達比例，不包括內源性產生的GGCX的水平。為了滿足所需要的高產量，必需以高於普通細胞中存在的水平來表達羧化酶和需要羧化作用的蛋白。
在優選的實施方式中，使用的細胞或細胞系具有很少的或沒有組成性表達的羧化酶和/或需要羧化作用的蛋白。
在一個實施方式中，γ-穀氨醯羧化酶以低於或等於需要伽馬-羧化作用的蛋白的數量的10％表達。在替換性的、進一步的實施方式中，γ-穀氨醯羧化酶以低於或等於需要伽馬-羧化作用的蛋白的數量的5％、2％、1％、0.5％、0.25％、0.1％、0.05％或0.01％表達。
可以使用本領域技術人員熟知的技術來測量兩種蛋白的表達程度。這包括直接測量，例如，測量蛋白的生物學活性、或蛋白的數量(例如，使用抗體)，或間接測量，例如通過測量mRNA轉錄產物水平(例如，如實施例3中的Taqman分析)。以下參考文獻公開了測量GGCX酶活性的途徑(Lingenfelter et al.，Biochemistry 358234-8243，1996；Berkner et al.，Proc Natl Acad Sci USA 95446-471，1998；Hallgren et al.，Biochemistry 41(50)15045-15055，2002；and，Berkner etal.，Proc Natl Acad Sci USA 896242-6246，1992)。
對於本發明，兩種蛋白的表達比例通過mRNA轉錄產物水平(例如，通過Taqman分析)來間接地確定。
在一個實施方式中，需要伽馬羧化作用的蛋白是維生素K依賴性凝結因子。在進一步的實施方式中，需要伽馬-羧化作用的蛋白優選的選自由凝血酶原、凝結因子II、凝結FII、凝結因子VII、凝結FVII、凝結因子IX、凝結FIX、凝結因子X、凝結FX、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、骨Gla蛋白、基質Gla蛋白、生長停滯-特異性蛋白6和Acanthophiinae FXa-樣蛋白構成的組。
在一個特定的實施方式中，需要伽馬-羧化作用的蛋白是因子IX。在另一個特定的實施方式中，需要伽馬-羧化作用的蛋白是凝血酶原。在另一個實施方式中，需要伽馬-羧化作用的蛋白是因子X。
本發明對於任何來源的需要羧化作用的蛋白具有普通的應用。然而，如果表達的蛋白將用於人類治療目的，人類蛋白是特別優選的。
在一個實施方式中，γ-穀氨醯羧化酶是小鼠、大鼠、牛或錐形蝸牛(conus snail)來源的。在另一個實施方式中，γ-穀氨醯羧化酶是人類蛋白。
根據本發明的進一步的方面，提供了生產伽馬-羧化的蛋白的方法，包括(i)培養細胞，所述細胞被改造來以至少10∶1的比例表達需要伽馬-羧化作用的蛋白和γ-穀氨醯羧化酶，在適合於表達這兩種蛋白的條件下培養，和(ii)分離伽馬-羧化的蛋白。
根據本發明的進一步的方面，提供了在哺乳動物細胞系中生產伽馬-羧化的蛋白的方法，包括在所述哺乳動物細胞系中使所述需要伽馬-羧化作用的蛋白與γ-穀氨醯羧化酶共表達的步驟，其中表達的需要伽馬-羧化作用的蛋白的數量至少是表達的γ-穀氨醯羧化酶的數量的10倍；和(ii)分離伽馬-羧化的蛋白。
生產伽馬-羧化的蛋白的方法，包括a)遺傳修飾真核細胞，來導入編碼需要羧化作用的蛋白和伴隨的表達控制序列的第一多核苷酸，和編碼γ-穀氨醯羧化酶和伴隨的表達控制序列的第二多核苷酸，來產生真核宿主細胞，所述真核宿主細胞能以至少10∶1的比例共表達需要羧化作用的蛋白和γ-穀氨醯羧化酶蛋白；b)在容許第一和第二多核苷酸序列表達的條件下在適合的培養基中培養所述細胞；和c)從培養基或宿主細胞分離羧化的蛋白。
表達載體通常包括複製起點、啟動子、翻譯起始位點、任選的信號肽、多聚腺苷酸位點和轉錄終止位點。這個載體通常還含有用於選擇的一個或多個抗生素抗性標記基因。適合的表達載體可以是質粒、粘粒或病毒，例如噬菌體或逆轉錄病毒。將多肽的編碼序列置於適合的啟動子(即，HSV、CMV、TK、RSV、SV40等等)、控制元件和轉錄終止子(這些是相連的表達控制序列)的控制下，使得在被該表達載體構建體轉化或轉染的宿主細胞中，編碼所述多肽的核酸序列被轉錄成RNA。編碼序列可以，或可以不含有用於將多肽分泌出宿主細胞的信號肽或前導序列。優選的載體通常包含至少一個多克隆位點。在某些實施方式中，克隆位點或多克隆位點處於啟動子和要表達的基因之間。通過將第二核酸序列克隆到克隆位點中使得其是連續的並且是符合基因序列的讀碼框的，從而這些克隆位點可以用於產生N-末端融合蛋白。在其他實施方式中，可以有克隆位點或多克隆位點位於基因的緊接著的下遊，以與如上所述的N-末端融合物類似的方式，來便於C-末端融合物的生成。
可以通過本領域技術人員公知的很多種方法，例如轉染、轉化和電穿孔，來遺傳地修飾宿主細胞(導入額外核酸)。
本發明還擴展到通過本發明的方法生產的純化的伽馬羧化的蛋白，和它們在凝結治療中的用途。
根據本發明的再另一個方面，提供了一種在受試者中促進提高或降低的凝結的方法，包括向需要的病人施用藥理學上有效量的、通過以上描述的方法獲得的分離的伽馬-羧化的蛋白。
根據本發明的進一步的方面，提供了生產適合於誘導血液凝固的藥物組合物的方法，包括純化從宿主細胞表達的活性羧化的蛋白，所述宿主細胞被改造來以至少10∶1的比例表達需要伽馬-羧化作用的蛋白和γ-穀氨醯羧化酶，和將所述純化的羧化蛋白與一種或多種藥學上可接受的載體或賦形劑混合。
基於蛋白的治療劑通常是冷凍保存的、冷藏保存的、在室溫下保存的，和/或處在凍幹的狀態。
本發明的組合物可以通過本領域公知的常規步驟、使用常規的藥物賦形劑來獲得，但是最可能的是處於適合於注射的形式，胃腸外地注射或直接注射到受傷部位。
水性懸浮液一般含有細粉狀形式的活性成分和一種或多種懸浮劑，例如，羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、海藻酸鈉、聚乙烯-吡咯烷酮、黃蓍樹膠和阿拉伯樹膠；分散劑或潤溼劑，例如卵磷脂或環氧烷(alkylene oxide)與脂肪酸的縮合產物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)、或環氧乙烷(ethylene oxide)與長鏈脂族醇的縮合產物，例如heptadecaethyleneoxycetanol，或環氧乙烷與來源於脂肪酸和己糖醇的偏酯的縮合產物例如聚氧乙烯山梨醇單油酸酯，或環氧乙烷與長鏈脂族醇的縮合產物，例如heptadecaethyleneoxycetanol，或環氧乙烷與來源於脂肪酸和己糖醇的偏酯的縮合產物，例如聚氧乙烯山梨醇單油酸酯，或環氧乙烷與來源於脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的縮合產物，例如聚乙烯單油酸山梨醇酐酯。水性懸浮液也可含有一種或多種防腐劑(例如對羥基苯甲酸乙酯或丙酯)、抗氧化劑(例如抗壞血酸)、著色劑、調味劑、和/或甜味劑(例如蔗糖、糖精或阿斯巴甜)。
油性懸浮液可以通過將活性成分懸浮在植物油(例如，花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油)或礦物油(例如液體石蠟)中來配製。油性懸浮液也可含有稠化劑，例如蜂蠟、固體石蠟或十六醇。可以添加甜味劑，例如以上列出的，和調味劑來提供適口的口服製品。可以通過添加抗氧化劑，例如抗壞血酸來保存這些組合物。
適合於通過添加適合的稀釋劑來製備用於注射的水性製品的粉末，一般地含有活性成分和適合的載體和賦形劑、懸浮劑和一種或多種穩定劑或防腐劑。稀釋劑可含有其他適合的賦形劑，例如防腐劑、滲透壓調節劑和穩定劑。
本發明的藥物組合物也可處於水包油乳化劑(oil-in-wateremulsions)的形式。油相可以是植物油，例如橄欖油或花生油，或礦物油，例如液體石蠟，或任何這些的混合物。適合的乳化劑可以是，例如，天然發生的樹膠，例如阿拉伯樹膠或黃著樹膠，天然發生的磷脂例如大豆、卵磷脂，來源於脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯(例如單油酸山梨醇酐酯)和所述偏酯與環氧乙烷的縮合產物，例如聚氧乙烯單油酸山梨醇酐酯。
本發明的藥物組合物也可以處於無毒胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌溶液或懸浮液形式，其可以根據已知步驟使用一種或多種適合的分散或潤溼劑和懸浮劑來配製，這些已經在上文記載了。無菌可注射製品也可以是無毒的胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或懸浮液，例如，1，3-丁二醇溶液。
關於製劑的進一步的信息，讀者可參考Comprehensive MedicinalChemistry(Corwin Hansch；Chairman of Editorial Board)，PergamonPress 1990的卷5的25.2章；或者Drugs and the pharmaceutical sciences；Protein formulation and delivery(Eugen J.McNally，executiveeditor)，Marcel Dekker Inc 2000的卷99。
與一種或多種賦形劑組合產生單個劑量形式的活性成分的數量可以取決於治療的宿主和施用的特定途徑而變化。例如，打算向人類注射的製劑一般含有，例如，0.5mg到2g的活性試劑，與適合的和方便數量的賦形劑複合，賦形劑可以從總組合物重量的約百分之5到約百分之98變化。劑量單位形式一般含有約1mg到約500mg的活性成分。蛋白性的治療劑通常是冷凍保存的或是凍幹的。關於施用途徑和劑量方案的進一步信息，讀者可參考Comprehensive Medicinal Chemistry(Corwin Hansch；Chairman of Editorial Board)，Pergamon Press 1990的卷5的25.3章。
用於治療或預防目的的化合物的劑量大小將根據狀況的性質和嚴重度、動物或病人的年齡和性別和施用途徑，根據醫學的公知原則自然地改變。在使用化合物用於治療或預防目的時，一般地這樣施用，使得日劑量在例如每公斤體重接受0.5mg到75mg的範圍內，如果需要，以分開的劑量給藥。一般地，當採用胃腸外途徑時，施用更低的劑量。因而，例如，對於靜脈內施用，一般使用在例如每公斤體重0.5mg到30mg的範圍內的劑量。類似地，例如，對於通過吸入的施用，使用在例如每公斤體重0.5mg到25mg的範圍內的劑量。
通過以下非限制性的實施例進一步描述本發明除非另有陳述，本發明的實施將採用本領域技術人員能力之內的分子生物學和重組DNA技術的常規方法。這些技術已經在文獻中完整地說明了。參見，例如，Sambrook et al.，eds.，Molecular CloningALaboratory Manual(3rded.)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(2001)；Ausubel et al.，eds.，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley Sons，New York，NY(2002)；Glover Hames，eds.，DNA Cloning 3A Practical Approach，Vols.I，II， III，IRL Press，Oxford(1995)；Colowick Kaplan，eds.，Methods inEnzymology，Academic Press；Weir et al.，eds.，Handbook ofExperimental Immunology，5thed.，Blackwell Scientific Publications，Ltd.，Edinburgh，(1997)。
實施例1編碼人類FII(hPT)和人類GGCX的cDNA的擴增人類肝臟mRNA從Clontech購買，使用來自Invitrogen的Superscript系統進行cDNA合成。獲得的cDNA用作擴增人類FII的模板，使用引物 PTF0 5』-ATTCCTCAGTGACCCAGGAGCTGACA-3』，(SEQ ID NO3)和引物 PTEXT 5』-CTACTCTCCAAACTGATCAATGACCTTCTGTATCCACTTCTT-3』，(SEQ ID NO4)。
擴增人類GGCX，使用引物 hglx5，5』-TCCGCAGAGCAATGGCGGTGTCT-3』，(SEQ ID NO5)和hglx3，5』-CCAACATCTGGCCCCTTCAGAACT-3』，(SEQ ID NO6)。
將編碼FII的PCR產物直接克隆到用TA-TOPO處理的載體pCDNA3.1V5/His(Invitrogen)中。選擇按正確方向插入hFII cDNA的克隆，得到Ptext5對照構建體(附圖1b)。在SV40啟動子的控制下的GGCX編碼cDNA通過使用限制性內切酶BamH1和NotI，將GGCX編碼片段從pCDNA3.1V5/His TA-TOPO轉移到pZeoSV2+載體(Invitrogen)來獲得。除去GGCX插入物下遊的EcoRV-NotI限制性位點。然後將來自產生的pZeoSV2-GGCX質粒的平端ClaI-BclI片段(含有SV40啟動子和含有GGCX的插入物，但不含GGCX編碼序列下遊的多聚腺苷酸位點和多聚腺苷酸信號)克隆到pCDNA3.1+(Invitrogen)的平端DraIII限制性位點中。選擇相對於CMV啟動子具有串聯插入的(相同的轉錄方向)pSV40-GGCX片段的克隆，將來自Ptext5的平端KpnI-NotI FII編碼片段克隆到EcoRV位點中，來獲得PN32構建體(附圖1a)。PN32和Ptext5的DNA序列在附錄2中。所有的克隆方法是根據標準方法和/或廠商推薦的步驟。
PN32構建體包括以下關鍵特徵-人類巨細胞病毒(hCMV)即時-早期啟動子控制人類凝血酶原cDNA的轉錄，後面是牛生長激素(BGH)多聚腺苷酸信號用於有效的轉錄終止，和mRNA的多聚腺苷酸化。
-SV40早期啟動子控制人類γ-羧化酶cDNA(GGCX)的轉錄，沒有明顯的多聚腺苷酸位點或信號。
-其他特徵如附圖1a)所示。
為了比較，使用無GGCX的PText5構建體(附圖1b)。PTEXT5的核苷酸序列在SEQ ID NO1中示出。PN32的核苷酸序列在SEQ IDNO2中示出。
獲得凝血酶原生產細胞系將附圖1中的兩個構建體轉染到CHO-S細胞(Invitrogen)中。選擇穩定的轉染子，使用商業上可獲得的凝血酶原活性化驗(Chromogenix)篩選高產的克隆。在這個化驗中，首先用蛇毒毒素(Ecarin，可從Sigma獲得)處理含凝血酶原的樣品來產生凝血酶。然後通過添加生色底物(S-2238)化驗凝血酶活性，生色底物在被凝血酶處理時產生顏色。兩種構建體並行地進行轉染和克隆的選擇。在含有9％熱鈍化的胎牛血清的DMEM培養基中進行細胞培養。然後改造獲得的克隆以在無動物成分的培養基中生長。獲得的最好的生產克隆來自用PN32(FII+GGCX)的轉染，當在無動物成分的化學成分明確的培養基中培養時，其產生了多達400mg/L的人類重組凝血酶原(遠遠超過任何已公開的水平)。純化重組生產的rhFII(根據Josic et al.，Journal of Chromatography B，790183-197，2003中公開的方法)，根據標準技術通過使用Q-Sepharose柱的離子交換層析來分級，獲得純的完全羧化的rhFII。達到78mg/L的發酵罐生產的rhFII是完全羧化的，與從人類血漿純化的凝血酶原具有相同的生物學活性。通過蛋白的N-末端測序和通過凝血酶原酶化驗(Mao et al.JBC，27330086-30091，1998)分析羧化作用。在人類乏血小板血漿(platelet-poorplasma)中通過添加組織因子觸發凝血酶產生，基本上如Stig等描述的(Blood Coagulation and Fibrinolysis，14457-462，2003)測量內源凝血酶潛力(potential)。
在無動物成分的化學成分明確培養基中，用PText5構建體獲得的最好的克隆得到達10mg/L的生產率，這與文獻中報導的處在相同的範圍。從PText5克隆獲得的完全羧化的凝血酶原的部份估計約50％。因而，使用含γ-羧化酶的低表達水平配置的PN32構建體，最終獲得的完全活性rhFII至少要十倍高。對於每種構建體，鑑定了具有類似表達水平的幾個克隆。
實施例2在CHO細胞系中ggcx活性的測量分別通過用PN32構建體(共表達人類GGCX)和PTEXT5(沒有共表達GGCX)轉染獲得的兩個生產rhFII的CHO-S細胞系，使用補充有5μg/ml維生素K的無蛋白培養基在旋轉瓶中生長。每天替換十分之一的生長培養基。培養7天後收穫細胞，如Berkner等(Proc NatlAcad Sci USA 896242-62461992)描述的製備微體(microsomes)。從收穫的細胞的培養物上清液純化人類重組FII。如Berkner和Pudota(Proc Natl Acad Sci USA 95446-471 1998)以及Lingenfelter和Berkner(Biochemistry 358234-8243，1996)描述的測量GGCX活性。我們的測量顯示，使用相同的生長條件，在人類GGCX共表達CHO細胞系中，GGCX活性是僅表達rhFII的CHO細胞系的1.5倍。
實施例3在CHO-S細胞系中γ-羧化酶和凝血酶原的mRNA表達的實時逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)分析通過用PN32(FII+GGCX)和Ptext5(僅FII)構建體分別穩定轉染獲得的兩個CHO-S細胞系，使用補充有維生素K的元蛋白培養基在旋轉瓶中培養。培養4、5和6天後抽取培養物樣品來覆蓋(cover)mRNA產生方面的估計的峰值水平。根據賣主Invitrogen提供的方案，用TrizolTM分離RNA。用來自Ambion的DNA-freeTM試劑盒對分離的RNA進行DNaseI處理。使用隨機的六聚引物和來自用於RT-PCR的SuperscriptTMFirst-Strand Synthesis System，Invitrogen的試劑盒內容物，進行cDNA合成。
使用軟體Primer ExpressTM，Applied Biosystems選擇用於實時RT-PCR的引物和Vic標記的探針。
人類γ-羧化酶寡核苷酸5′ACACCTCTGGTTCAGACCTTTCTT3′正向引物(SEQ ID NO7)5′AATCGCTCATGGAAAGGAGTATTT3′反向引物(SEQ ID NO8)5′CAACAAAGGCTCCAGGAGATTGAACGC 3′探針(SEQ ID NO9)擴增子長度86bp人類凝血酶原寡核苷酸5′TGGAGGACAAAACCGAAAGAGA 3′正向引物(SEQ ID NO10)5′CATCCGAGCCCTCCACAA 3′反向引物(SEQ ID NO11)5′CTCCTGGAATCCTACATCGACGGGC 3′探針(SEQ ID NO12)擴增子長度69bp通過Operon/Qiagen製造引物，探針從Applied Biosystems訂購。還使用了齧齒動物GAPDH對照引物和探針(Applied Biosystems；ABI# 4308318 TaqManRodent GAPDH Control Reagents Protocol)-擴增子長度177bp。在ABI PrismTM7700 Sequence detector，AppliedBiosystems上進行實時RT-PCR反應。在瓊脂糖凝膠上確認預期長度的擴增的PCR產物。對所有三個基因進行稀釋系列(dilution series)來研究PCR反應的效率。相對於對照基因齧齒動物GAPDH的表達，表示了γ-羧化酶和凝血酶原的表達水平。
凝血酶原

γ-羧化酶

根據檢測的rhFII∶GGCX的相對表達水平，取決於採樣的天數計算出約74-232∶1的比例。對於用PN32轉染的細胞系，共表達rhFII和GGCX，每個細胞的轉錄產物數目計算為GGCX mRNA是大約8，rhFIImRNA是大約2000，因而得出rhFII∶GGCX比例大約250∶1。對於相同的樣品，GAPDH對照mRNA轉錄產物/細胞大約4000。
實施例4人類FII的生產與實施例1中類似地，將實施例1中克隆的人類FII和GGCX cDNA插入到pCDNA3.1中。為了得到更高的GGCX水平，將來自pZeoSV2+的多聚腺苷酸信號包括在被克隆入pCDNA3.1的平端化DraIII位點中的pSV40-GGCX-pA片段中。與實施例1相比，選擇具有反向的含GGCX的片段的克隆。然後按與實施例1相同的方法進行FII片段的克隆。最終的構建體PP6在附圖2中示出，PP6的核苷酸序列在SEQ IDNO13中示出。
如實施例1中描述的通過轉染CHO-S獲得兩個凝血酶原生產細胞系，B2F4和H3B10。如實施例1中一樣從這兩個細胞系中純化和表徵凝血酶原。B2F4的培養物得到了30-70mg/L的生產率，完全羧化的部分為55-87％(rhFII越多，完全羧化的越少)。添加丁酸鹽得到了稍高一些的生產率，但是降低了完全羧化的rhFII的部分，被認為不是有益的。H3B10生長緩慢，得到約50mg/L的生產率，相對於培養物中的細胞數目來說是很高的，完全羧化的rhFII的部分是約60％。與在實施例1中獲得的細胞系相比，對CHO細胞系使用PP6構建體產生了較少的完全羧化的rhFII。然而，完全活性的重組凝血酶原的產生仍然遠高於早先公開的水平。
實施例5通過測量mRNA的數量在CHO-S細胞系中γ-羧化酶和凝血酶原的表達的實時RT-PCR分析通過與實施例3相同的方法和相同的引物，通過實時PCR分析，分析了實施例4的B2F4和H3B10細胞系。在峰值生產率收集10ml的培養物樣品，以與實施例3中的樣品相當。由於這個克隆的緩慢生長，克隆H3B10的樣品來自第10天，對於克隆B2F4，樣品來自第6天。
表4，共表達GGXC的凝血酶原生產細胞系的實時RT-PCR分析結果。對每個B2F4和H3B10的兩個獨立100ml旋轉器培養物取樣用於實時RT-PCR分析。

*來自實施例3的P1E2數據用於對比。
對於克隆H3B10，計算的rhFII mRNA∶GGCX mRNA比例大約是30∶1，對於克隆B2F4大約50∶1，對於克隆P1E2大約250∶1。
實施例6人類凝結因子IX(FIX)的生產從購自Invitrogen的人類基因庫肝臟cDNA擴增人類凝結因子(human coagulation factor)IX cDNA。寡核苷酸引物為5』-末端；F9f.ampl.5′-CACCATGCAGCGCGTGAACATGAT-3′(SEQ ID NO16)，和3』末端；F9r.ampl.5′-CCTTGGAAATCCATCTTTCATTA-3′(SEQ ID NO17)。
通過DNA測序確認正確序列的克隆。使用Pfx聚合酶(Invitrogen)和克隆引物PCR擴增人類FIX片段來產生平端片段。使用T4多核苷酸激酶將平端片段磷酸化，克隆到來自實施例1和實施例4的、EcoRV消化的和去磷酸化的pCDNA-GGCX載體中。這樣，獲得了類似於用於生產人類凝血酶原的共表達構建體(實施例1和實施例4)的、用於共表達人類FIX和GGCX的構建體。通過DNA測序和在COS-7細胞中的瞬時表達確認正確序列的克隆。載體構建體F9NopA可以在附圖3a中看到，載體構建體F9hglx在附圖3b中示出。載體F9NopA和F9hglx之間的差異是GGCX基因的轉錄方向。F9NopA的核苷酸序列在SEQ ID NO14中示出，F9hglx的核苷酸序列在SEQID NO15中示出。
生產rhFIX的細胞系的建立使用實施例1中描述的步驟將rhFIX構建體轉染到CHO-S細胞中。通過細胞上清液的ELISA對每個FIX構建體根據rhFIX表達篩選約3000個克隆。使用的抗體來自Haemathology Technology Inc.和DakoCytomation。選擇克隆，進行改造以在無蛋白的化學成分明確的CHO培養基上生長。細胞在T-燒瓶中37℃生長，或在旋轉瓶中32-37℃生長。兩種培養物的CO2濃度都是5％。通過在pH 7.0進行Q-Sepharose陰離子交換色譜將產生的rhFIX純化到同質。通過使用FIX缺陷血漿(Precision Biologic)的凝結化驗，測定重組hFIX活性。獲得的最好的生產rhFIX的克隆是N4D5，其是使用F9NopA構建體獲得的，在T-燒瓶中無蛋白的化學成分明確培養基中生長產生多達4μg/ml的活性rhFIX。相同的克隆在旋轉瓶中生長產生達7.1μg/ml的rhFIX。總的生產率，還包括不完全羧化的、非活性的rhFIX，通過Western印跡分析估計至少30μg/ml。用rhFIX構建體F9hglx獲得的最好的生產克隆是P1G9，在相似條件下產生0.7(T-燒瓶)-1.3(旋轉)μg/ml的rhFIX。結果指明，通過使用F9NopA構建體以低水平共表達GGCX改進了rhFIX生產率，而使用構建體F9hglx共表達GGCX沒那麼有益。還注意到，在細胞系發育過程期間在同時的生產率篩選中，產生N4D5克隆的F9NopA構建體，一般地得出比產生P1G9克隆的F9hglx構建體更高的ELISA信號。
N4D5細胞系的生產率是早先公開的、在可比較的狀況下獲得的水平的4-6倍，其中IC4、IG8、r-FIX BHK和r-FIX 293是在參考文獻中提及的克隆的名稱(表5)。
表5.人類FIX生產細胞系的生產率的比較


實施例7通過測量mRNA的數量在CHO-S細胞系中γ-羧化酶和因子IX的表達的實時RT-PCR分析重組hFIX生產克隆在32-37℃在旋轉瓶子中、在100ml補充有維生素K的無蛋白的化學成分明確培養基中生長。在峰值rhFIX濃度收集5-10ml樣品，分析人類FIX和GGCX轉錄產物，以及GAPDH對照(持家，house-keeping)基因的轉錄產物的含量。步驟和實施例3中一樣。rhFIX的引物如下人類因子IX引物5′AATAGTGCTGATAACAAGGTGGTTTG 3′正向引物(SEQ ID NO18)5′CACTGCTGGTTCACAGGACTTCT 3′ 反向引物(SEQ ID NO19)5′TCCTGTACTGAGGGATATCGACTTGCAGAAAAC 3′探針(SEQ ID NO20)擴增子長度84bp取決於培養物溫度和培養物接種量，在不同的天數信使RNA水平出現峰值。發現mRNA的峰值水平與培養基中rhFIX的峰值濃度符合得很好。
表6.rhFIX生產克隆的實時RT-PCR分析的結果

根據實時RT-PCR分析我們還發現，儘管2^-delta Ct-值隨培養時間和條件變化，對於每個克隆FIX∶GGCX mRNA比例大約是相同的。對於最好的rhFIX生產克隆N4D5，該比例是大約45∶1。另一個克隆P1G9的分析得出了大約4.5∶1的更低的比例。P1G9克隆僅生產了N4D5生產的rhFIX數量的20％。
序列表SEQ ID NO1GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTCGACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTGCCCTTATTCCTCAGTGACCCAGGAGCTGACACACTATGGCGCACGTCCGAGGCTTGCAGCTGCCTGGCTGCCTGGCCCTGGCTGCCCTGTGTAGCCTTGTGCACAGCCAGCATGTGTTCCTGGCTCCTCAGCAAGCACGGTCGCTGCTCCAGCGGGTCCGGCGAGCCAACACCTTCTTGGAGGAGGTGCGCAAGGGCAACCTGGAGCGAGAGTGCGTGGAGGAGACGTGCAGCTACGAGGAGGCCTTCGAGGCTCTGGAGTCCTCCACGGCTACGGATGTGTTCTGGGCCAAGTACACAGCTTGTGAGACAGCGAGGACGCCTCGAGATAAGCTTGCTGCATGTCTGGAAGGTAACTGTGCTGAGGGTCTGGGTACGAACTACCGAGGGCATGTGAACATCACCCGGTCAGGCATTGAGTGCCAGCTATGGAGGAGTCGCTACCCACATAAGCCTGAAATCAACTCCACTACCCATCCTGGGGCCGACCTACAGGAGAATTTCTGCCGCAACCCCGACAGCAGCACCACGGGACCCTGGTGCTACACTACAGACCCCACCGTGAGGAGGCAGGAATGCAGCATCCCTGTCTGTGGCCAGGATCAAGTCACTGTAGCGATGACTCCACGCTCCGAAGGCTCCAGTGTGAATCTGTCACCTCCATTGGAGCAGTGTGTCCCTGATCGGGGGCAGCAGTACCAGGGGCGCCTGGCGGTGACCACACATGGGCTCCCCTGCCTGGCCTGGGCCAGCGCACAGGCCAAGGCCCTGAGCAAGCACCAGGACTTCAACTCAGCTGTGCAGCTGGTGGAGAACTTCTGCCGCAACCCAGACGGGGATGAGGAGGGCGTGTGGTGCTATGTGGCCGGGAAGCCTGGCGACTTTGGGTACTGCGACCTCAACTATTGTGAGGAGGCCGTGGAGGAGGAGACAGGAGATGGGCTGGATGAGGACTCAGACAGGGCCATCGAAGGGCGTACCGCCACCAGTGAGTACCAGACTTTCTTCAATCCGAGGACCTTTGGCTCGGGAGAGGCAGACTGTGGGCTGCGACCTCTGTTCGAGAAGAAGTCGCTGGAGGACAAAACCGAAAGAGAGCTCCTGGAATCCTACATCGACGGGCGCATTGTGGAGGGCTCGGATGCAGAGATCGGCATGTCACCTTGGCAGGTGATGCTTTTCCGGAAGAGTCCCCAGGAGCTGCTGTGTGGGGCCAGCCTCATCAGTGACCGCTGGGTCCTCACCGCCGCCCACTGCCTCCTGTACCCGCCCTGGGACAAGAACTTCACCGAGAATGACCTTCTGGTGCGCATTGGCAAGCACTCCCGCACCAGGTACGAGCGAAACATTGAAAAGATATCCATGTTGGAAAAGATCTACATCCACCCCAGGTACAACTGGCGGGAGAACCTGGACCGGGACATTGCCCTGATGAAGCTGAAGAAGCCTGTTGCCTTCAGTGACTACATTCACCCTGTGTGTCTGCCCGACAGGGAGACGGCAGCCAGCTTGCTCCAGGCTGGATACAAGGGGCGGGTGACAGGCTGGGGCAACCTGAAGGAGACGTGGACAGCCAACGTTGGTAAGGGGCAGCCCAGTGTCCTGCAGGTGGTGAACCTGCCCATTGTGGAGCGGCCGGTCTGCAAGGACTCCACCCGGATCCGCATCACTGACAACATGTTCTGTGCTGGTTACAAGCCTGATGAAGGGAAACGAGGGGATGCCTGTGAAGGTGACAGTGGGGGACCCTTTGTCATGAAGAGCCCCTTTAACAACCGCTGGTATCAAATGGGCATCGTCTCATGGGGTGAAGGCTGTGACCGGGATGGGAAATATGGCTTCTACACACATGTGTTCCGCCTGAAGAAGTGGATACAGAAGGTCATTGATCAGTTTGGAGAGTAGAAGGGCAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGCGGTT
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1.一種包含表達載體的宿主細胞，所述表達載體包含編碼需要伽馬-羧化作用的蛋白的核酸分子和相連的包含第一啟動子的表達控制序列，和編碼γ-穀氨醯羧化酶的核酸分子和相連的包含第二啟動子的表達控制序列，其中所述第一啟動子比所述第二啟動子更強，足以使得需要伽馬-羧化作用的蛋白和γ-穀氨醯羧化酶以至少10∶1的比例表達。
2.如權利要求1中所要求的宿主細胞，其中所述核酸分子在單個表達載體中。
3.如權利要求1或2中所要求的宿主細胞，其中所述第一啟動子是人類巨細胞病毒(hCMV)即時-早期啟動子，和所述第二啟動子是SV40早期啟動子。
4.一種細胞，其被工程化以表達(i)需要伽馬-羧化作用的蛋白，和(ii)γ-穀氨醯羧化酶，其中所述蛋白(i)和(ii)以10∶1到500∶1之間的比例表達。
5.如權利要求1到4中任何一個所要求的細胞，其中所述需要伽馬-羧化作用的蛋白選自由凝結因子VII、凝結FVII、凝結因子IX、凝結FIX、凝血酶原、凝結因子II、凝結FII、凝結因子X、凝結FX、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、骨Gla蛋白、基質Gla蛋白、生長停滯-特異性蛋白6和Acanthophiinae FXa-樣蛋白構成的組。
6.如權利要求1到4的任何一個所要求的細胞，其中所述需要伽馬-羧化作用的蛋白是維生素K依賴性凝結因子。
7.如權利要求1到6的任何一個所要求的細胞，其中所述需要伽馬-羧化作用的蛋白是因子IX。
8.如權利要求1到6的任何一個所要求的細胞，其中所述需要伽馬-羧化作用的蛋白是因子X。
9.如權利要求1到6的任何一個所要求的細胞，其中所述需要伽馬-羧化作用的蛋白是凝血酶原。
10.如權利要求1到9的任何一個所要求的細胞，其中所述需要伽馬-羧化作用的蛋白是人類蛋白。
11.如權利要求1到10的任何一個所要求的細胞，其中γ-穀氨醯羧化酶是人類蛋白。
12.如權利要求1到11的任何一個所要求的細胞，其中所述細胞選自由哺乳動物細胞、酵母細胞或昆蟲細胞構成的組。
13.如權利要求12所要求的細胞，其中所述細胞是哺乳動物細胞。
14.一種遺傳修飾的真核宿主細胞，包括(i)編碼γ-穀氨醯羧化酶蛋白的多核苷酸序列，其中所述γ-穀氨醯羧化酶蛋白編碼序列可操作地與表達控制序列連接，所述表達控制序列允許所述細胞表達γ-穀氨醯羧化酶蛋白；和(ii)編碼需要所述γ-穀氨醯羧化酶蛋白的羧化作用的蛋白的多核苷酸，可操作地與表達控制序列連接，所述表達控制序列允許所述細胞表達所述需要羧化作用的蛋白；其中所述細胞能夠以至少1∶10的比例表達所述γ-穀氨醯羧化酶蛋白和所述需要羧化作用的蛋白。
15.一種載體，包含編碼需要伽馬-羧化作用的蛋白的核酸分子和相連的包含第一啟動子的表達控制序列，和編碼γ-穀氨醯羧化酶的核酸分子和相連的包含第二啟動子的表達控制序列，其中所述第一啟動子比所述第二啟動子更強，足以使得需要伽馬-羧化作用的蛋白和γ-穀氨醯羧化酶以至少10∶1的比例表達。
16.如權利要求3中所要求的載體，其中所述第一啟動子是人類巨細胞病毒(hCMV)即時-早期啟動子，和所述第二啟動子是SV40早期啟動子。
17.如權利要求3或4中所要求的載體，其中所述需要伽馬-羧化作用的蛋白選自由凝結因子VII、凝結FVII、凝結因子IX、凝結FIX、凝血酶原、凝結因子II、凝結FII、凝結因子X、凝結FX、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、骨Gla蛋白、基質Gla蛋白、生長停滯-特異性蛋白6和Acanthophiinae FXa-樣蛋白構成的組。
18.如權利要求15到17的任何一個所要求的載體，其中所述需要伽馬-羧化作用的蛋白是因子IX。
19.如權利要求15到17的任何一個所要求的載體，其中所述需要伽馬-羧化作用的蛋白是因子X。
20.如權利要求15到17的任何一個所要求的載體，其中所述需要伽馬-羧化作用的蛋白是凝血酶原。
21.一種生產伽馬-羧化的蛋白的方法，包括(i)培養細胞，所述細胞被改造來以至少10∶1的比例表達需要伽馬-羧化作用的蛋白和γ-穀氨醯羧化酶，在適合於表達這兩種蛋白的條件下培養，和(ii)分離伽馬-羧化的蛋白。
22.一種在哺乳動物細胞系中生產伽馬-羧化的蛋白的方法，包括在所述哺乳動物細胞系中使所述需要伽馬-羧化作用的蛋白與γ-穀氨醯羧化酶共表達的步驟，其中表達的需要伽馬-羧化作用的蛋白的數量至少是表達的γ-穀氨醯羧化酶的數量的10倍，和(ii)分離伽馬-羧化的蛋白。
23.根據權利要求21或22中要求的方法生產的分離的伽馬-羧化的蛋白。
24.根據權利要求21或22生產的分離的羧化的蛋白在凝結治療中的用途。
25.根據權利要求21或22生產的分離的羧化的蛋白在製造用於凝結治療的藥物方面的用途。
26.一種生產適合於誘導血液凝固或促進增加的或減少的凝結的藥物組合物的方法，包括純化從宿主細胞表達的活性羧化的蛋白，所述宿主細胞被改造來以10∶1到500∶1之間的比例表達需要伽馬-羧化作用的蛋白和γ-穀氨醯羧化酶，和將所述純化的羧化蛋白與一種或多種藥學上可接受的載體或賦形劑混合。
27.可從權利要求26的方法獲得的藥物組合物。
28.一種生產伽馬-羧化的人類因子X的方法，包括(i)培養細胞，所述細胞被改造來以至少10∶1的比例表達人類因子X和人類γ-穀氨醯羧化酶，在適合於表達這兩種蛋白的條件下培養，和(ii)分離伽馬-羧化的因子X。
29.根據權利要求28生產的分離的因子X在凝結治療中的用途。
30.根據權利要求28生產的分離的因子X在製造用於凝結治療的藥物方面的用途。
31.包含可從權利要求28的方法獲得的伽馬-羧化的人類因子X的藥物組合物。
32.一種生產伽馬-羧化的人類因子IX的方法，包括(i)培養細胞，所述細胞被改造來以至少10∶1的比例表達人類因子IX和人類γ-穀氨醯羧化酶，在適合於表達這兩種蛋白的條件下培養，和(ii)分離伽馬-羧化的因子IX。
33.根據權利要求32生產的分離的因子IX在凝結治療中的用途。
34.根據權利要求32生產的分離的因子IX在製造用於凝結治療的藥物方面的用途。
35.包含可從權利要求32的方法獲得的伽馬-羧化的人類因子IX的藥物組合物。
36.一種生產伽馬-羧化的人類凝血酶原的方法，包括(i)培養細胞，所述細胞被改造來以至少10∶1的比例表達人類凝血酶原和人類γ-穀氨醯羧化酶，在適合於表達這兩種蛋白的條件下培養，和(ii)分離伽馬-羧化的凝血酶原。
37.根據權利要求36生產的分離的凝血酶原在凝結治療中的用途。
38.根據權利要求36生產的分離的凝血酶原在製造用於凝結治療的藥物方面的用途。
39.包含可從權利要求36的方法獲得的伽馬-羧化的人類凝血酶原的藥物組合物。
40.一種在受試者中促進提高或降低的凝結的方法，包括向有此需要的病人施用藥理學有效量的、通過權利要求21或22的方法獲得的分離的伽馬-羧化的蛋白。
全文摘要
本發明涉及生產大量的伽馬－羧化的蛋白的方法和工具，包括(i)培養細胞，所述細胞被改造來以至少10∶1的比例表達需要伽馬－羧化作用的蛋白和γ－穀氨醯羧化酶，在適合於表達這兩種蛋白的條件下培養，和(ii)分離伽馬－羧化的蛋白。
文檔編號C12N9/64GK1867669SQ200480030037
公開日2006年11月22日 申請日期2004年10月12日 優先權日2003年10月14日
發明者C·芬格, A·勒夫格倫, A·特林 申請人:阿斯特拉曾尼卡有限公司