新的豬肺炎支原體菌株及其疫苗組合物的製作方法

2023-06-08 15:10:56

專利名稱：新的豬肺炎支原體菌株及其疫苗組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新的豬肺炎支原體以及疫苗組合物，屬於獸用疫苗領域。
背景技術：
豬肺炎支原體是豬支原體肺炎的病原體。豬支原體肺炎是豬的ー種慢性消耗性呼吸道病，臨床感染率極高。該疾病導致持續幾周的持續性咳嗽、被毛失去光澤、生長遲緩和外觀不壯實。豬群一旦感染豬肺炎支原體，便難以清除，不僅嚴重影響豬群的生長發育，用藥量增加，而且容易繼發感染PRRSV (豬藍耳病病毒)、PCV (豬圓環病毒)等，從而導致多種疫苗接種失敗。豬肺炎支原體作為豬呼吸道病症候群的重要病原之一，毎年的經濟損失估計在2億 2. 5億美元之間。直接或間接對養豬業造成了巨大的經濟損失。目前，世界上預防和控制豬肺炎支原體感染的有效的手段是對豬群進行疫苗免疫。大多數疫苗均為含有佐劑的全菌體滅活疫苗，通常情況下這些疫苗均能提供較好的保護作用，如改善臨床症狀，減少肺損傷，減少因豬肺炎支原體感染用藥，提高生長效率等。目前，廣泛應用的疫苗是以豬肺炎支原體J株或P株作為抗原的滅活疫苗，使用J株或P株製備的疫苗在全球很多國家銷售和使用。然而，由於豬群中的流行株的變異，在臨床上仍能觀察到不同的豬群疫苗免疫後免疫效果方面存在差異，即存在ー些免疫效果欠佳的群體。臨床上觀察到的這些差異原因是由於豬群中的流行株與疫苗株間存在抗原差異造成的(Villarreal等，BMC Veterinary Research 2012，8:2)。有研究表明，目前豬群中流行的毒株在基因水平、蛋白水平以及毒力方面與疫苗使用的豬肺炎支原體J株或P株存在較大的差異(如文獻 Stakenborg 等，Vet Microbiol 2005，109:29-36 ;Calus 等，Vet Microbiol2007,120:284-91. ;Vicca 等 Vet Microbiol 2003,97:177-190. ;Meyns 等，Prev Vet Med2004, 66:265-275中所報導的 內容)。上述文獻資料表明，疫苗使用的豬肺炎支原體J株對豬支原體肺炎的臨床預防和 治療效果欠佳。

發明內容
有鑑於此，本發明的主要目的在於提供ー種經分離鑑定為免疫原性更好的豬肺炎支原體毒株，並以該毒株為抗原研製保護效果更好的疫苗。即發明人意外發現ー株豬肺炎支原體毒株，該毒株具有良好的免疫原性，與當前廣泛使用的豬支原體肺炎疫苗株J株相比，具有更好的免疫原性，製備成疫苗後有更好的免疫保護效果。S卩，本發明的第一方面是提供一種豬肺炎支原體菌株，菌株名稱為HN0613株，保藏編號為CCTCC M2012230，保藏單位為位於中國武漢的中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏日期:2012年6月13日。本發明還提供了上述豬肺炎支原體HN0613株製備的豬肺炎支原體抗原與含有該豬肺炎支原體抗原的豬支原體肺炎疫苗。優選地，本發明所述的豬支原體肺炎疫苗中，豬肺炎支原體抗原為滅活的豬肺炎支原體HN0613株的免疫原性胺基酸序列的嵌合病毒，或任何其它含豬肺炎支原體HN0613株免疫原性胺基酸序列的多肽或亞単位抗原。更優選地，所述的豬肺炎支原體抗原為滅活的豬肺炎支原體全菌抗原(即，滅活的豬肺炎支原體HN0613株)。優選地，本發明所述的豬支原體肺炎疫苗中，豬肺炎支原體抗原的含量為所述的滅活的豬肺炎支原體HN0613株抗原抗原的含量為IO7 IO9CCU /頭份(以每頭份2ml計，下同)，即滅活的豬肺炎支原體抗原在滅活前豬肺炎支原體含量為IO7 IO9CCU /頭份(2ml);更優選地，所述的滅活的豬肺炎支原體HN0613株抗原含量為滅活前f2X IO8CCU/頭份；最優選地，滅活的豬肺炎支原體HN0613株的含量為滅活前2X IO8CXU /頭份(2ml)。優選地,本發明所述的豬支原體肺炎疫苗中，還包括疫苗佐劑,所述佐劑指包含一種或多種物質的組合物，能夠增強豬肺炎支原體的免疫原性和功效的物質。優選地，本發明所述的疫苗佐劑為Gel 01 (法國SCIPPIC)、氫氧化鋁膠、礦物油、可代謝油、卡波姆(Carbomer)、蜂膠、ISA206 (法國 SCIPPIC)、ISA760VG (法國 SCIPPIC)的一種或幾種的組合。更優選地，本發明所述的疫苗佐劑為卡波姆(Carbomer)(商品名Carbopol )、Gel 01 (法國SCIPPIC)、鋁膠；最優選地，發明所述的疫苗佐劑為Gel 01 (法國SCIPPIC)。 如本發明後續實施例所證明的，本發明的豬肺炎支原體HN0613株抗原製備的豬支原體肺炎疫苗，相對於豬肺炎支原體J株和P株的疫苗，可以更有效地預防和治療豬肺炎支原體引起的豬支原體肺炎及相關疾病。此外，發明人還意外地發現，本發明的豬肺炎支原體HN0613株抗原與其他的豬病原體抗原的配合更好，包括但不限於以下的豬病原體抗原豬圓環病毒2型抗原、豬流感病毒(SIV)抗原、豬生殖呼吸綜 合徵抗原(PRRSV)、副豬嗜血桿菌(HPS)抗原、豬偽狂犬病毒(PRV)抗原、豬波氏桿菌抗原、豬多殺性巴氏桿菌抗原，與本發明的本發明的豬肺炎支原體HN0613株抗原與其他的豬病原體抗原相互無幹擾；特別地令人驚奇的是，當本發明的豬肺炎支原體HN0613株抗原與豬圓環病毒2型的抗原相配合時,不僅兩種抗原之間無幹擾，而且相對於兩種抗原獨立製備的疫苗(即豬肺炎支原體單苗和豬圓環病毒2型單苗)而言，免疫效カ均有了顯著地提高。基於上述認識，本發明的另一方面是提供了一種預防或治療豬圓環病毒2型(PCV2)、豬肺炎支原體感染的抗原組合物，其包含至少ー種豬圓環病毒2型抗原和至少ー種豬肺炎支原體抗原。本發明的預防和治療豬圓環病毒2型和豬肺炎支原體感染的疫苗組合物中，包含滅活的豬圓環病毒2型或PCV 0RF2蛋白、滅活的豬肺炎支原體以及疫苗佐劑。豬圓環病毒2型抗原是指含有至少ー種PCV2抗原形式的任何組合物，所述抗原接種豬可誘導、刺激或增強抵抗PCV2感染的免疫應答。優選地，所述PCV2抗原是PCV2全病毒、優選為滅活的PCV2全病毒、含有PCV2免疫原性胺基酸序列(如0RF2蛋白)的嵌合病毒，任何其它至少含PCV2免疫原性胺基酸序列的多肽或亞単位或其他成分。PCV2抗原還可以包含以下組合物的任ー種抗原:如梅裡亞公司(Merial)的CirCOVaC ;
輝瑞公司(Pfizer)的Suvaxyn PCV2;哈爾濱維科生物技術開發公司的豬圓環病毒2型滅活疫苗(LG株)；福州大北農生物技術有限公司的豬圓環病毒2型滅活疫苗(DBN-SX07株)和基因工程亞單位疫苗(如勃林格殷格翰公司(Boehringer-1ngelheim)的Ingelvac (； I !'CO F LEX )
因PCV2基因組大小為1767bp或1768bp，不同毒株之間核苷酸序列同源性較高，均在90%以上，因此PCV2SH株(GenBank登錄號為AY686763)、PCV2LG株(GenBank登錄號為HM038034), PCV2DBN-SX07-2 (GenBank 登錄號為 HM641752)均在本發明之內。優選地，本發明中豬圓環病毒2型抗原為滅活全病毒抗原，優選PCV2SH株，保藏號為 CGMCC No. 23890，公開於專利文獻 CN101240264A。優選地，本發明所述的滅活的豬圓環病毒2型每劑量或每頭份含量滅活前為3X IO5 0 IO8 tlTCIDン頭份，更優選本發明所述的滅活的豬圓環病毒2型含量為滅活前Ixio60TCID50/ 頭份。優選地，本發明中豬圓環病毒2型抗原為含有PCV2免疫原性胺基酸序列的多肽或亞單位或其他成份，更優選地，豬圓環病毒2型抗原為PCV2亞單位抗原，最優選地，豬圓環病毒2型抗原為PCV20RF2蛋白。其中，本發明PCV20RF2蛋白，優選序列表SEQN01. DNA序列編碼的蛋白或序列表SEQ N02.胺基酸序列的蛋白或與其同源性在75%以上優選80%、更優選90%的蛋白能達到本發明目的的蛋白序列。本發明對PCV20RF2蛋白沒有特別的限制，只要其具有保留對PCV2的免疫原性，任何PCV20RF2蛋白都可用作本文所述PCV20RF2DNA和/或多肽的來源。優選地，所述PCV20RF2蛋白的含量為2 20 U g/頭份，優選5 U g/頭份。豬肺炎支原體抗原是指含有滅活的豬肺炎支原體抗原，所述抗原接種豬可誘導、刺激或增強抵抗豬肺炎支原體感染的免疫應答。豬肺炎支原體包括本領域技術人員熟知的臨床分離的野毒株。優選地，所述豬肺炎支原體抗原是完整的豬肺炎支原體，優選為滅活形式，更優選為豬肺炎支原體HN0613株。

正如本領域技術人員所知，不同的微生物野外分離株在基因序列上有微小的變異，然而，當變異不影響其蛋白質合成、結構或者主要作用功能區時，該微生物之他種野外分離株即使基因序列無法百分之百相同，其基本的生理功能並不會有所改變。但是同源性比較如果針對全部的基因來進行比對，在實際上是非常巨大的工程，不太可行，目前國際上常使用16S Ribosomal RNA (16S rRNA)來進行細菌型的分辨，因此在相似性的比較上可以用16S rRNA來進行比對而得到其同源性。所以本發明所使用的支原體抗原並不限定於本發明所使用的野外分離株，16s rRNA基因是細菌染色體上編碼rRNA相對應的DNA序列，存在於所有細菌的染色體基因組中。16S rRNA具有高度的保守性和特異性以及該基因序列足夠長(包含約50個功能域)因此，本發明包括與豬肺炎支原體(HN0613株)16S rRNA的同源性在80%上以上的菌株，更優選與HN0613株16S rRNA同源性在至少90%，至少95%，至少95% 99%的豬肺炎支原體菌株，即不改變豬肺炎支原體16S rRNA的前提下，本領域技術人員可以通過簡單的篩選或誘變本發明的豬肺炎支原體，獲得與本發明豬肺炎支原體16S rRNA高度同源的菌株，並獲得相應地具有相同或相似免疫原性的抗原組合物。優選地，本發明所述的滅活的豬肺炎支原體為HN0613株，保藏號為CCTCCM2012230。優選地，本發明所述的滅活的豬肺炎支原體滅活前含量為IO7 IO9CXU /頭份。更優先的豬肺炎支原體含量為2 X IO8CCU /頭份優選地，本發明所述的疫苗佐劑混合物為Gel 01 (法國SCIPPIC)、氫氧化鋁膠、礦物油、可代謝油、卡波姆(Carbomer)、蜂膠、ISA206(法國 SCIPPIC)、ISA760VG(法國 SCIPPIC)的一種或幾種的組合。更優選地，本發明所述的疫苗佐劑為卡波姆(Carbomer)(商品名Carbopol), Ge I Ol (法國SCIPPIC)、鋁膠；最優選地，發明所述的疫苗佐劑為Gel 01 (法國SCIPPIC)。優選地，本發明所述的所述的疫苗佐劑的用量為5% 30%重量，所述的疫苗組合物中抗原成份的混合物用量為70% 95%重量，即PCV2抗原、滅活的豬肺炎支原體的用量
為70% 95%重量。 由上可知，本發明的豬肺炎支原體HN0613株抗原製備的豬支原體肺炎疫苗，是ー種可以有效預防和治療目前的流行的豬支原體肺炎的疫苗；由後續實施例所證明，本發明的豬支原體肺炎疫苗，免疫效果明顯高於目前大量使用的豬肺炎支原體J株和P株疫苗，具有不影響增重、肺病變損失小的優點。其次，本發明的豬肺炎支原體HN0613株抗原與其他的豬病原體抗原配合好，相互不影響各自的免疫效カ的發揮，特別令人驚奇地是，當豬肺炎支原體HN0613株抗原與PCV2的抗原(滅活的PCV2抗原或PCV20RF2蛋白抗原)可以顯著地提高各自的免疫效カ，因此，在臨床使用中，可起到打一針該疫苗即可預防豬圓環病毒病、豬支原體肺炎兩種種病的目的，和現有的疫苗相比較，本發明的技術方案對豬肺炎支原體有更好的保護效果。


圖1為Friis固體培養基豬肺炎支原體菌落狄氏染色圖；圖2為豬肺炎支原體PCR鑑定圖。
具體實施例方式菌株(毒株)的來源所選用的豬圓環病毒2型(Porcine Circovirus Type 2，PCV2)毒株為PCV2b基因型SH株，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行保藏，保藏日期2008年3月4日，保藏號為CGMCC23890。所選用的豬肺炎支原體HN0613株，已在中國典型培養物保藏中心進行保藏，保藏日期:2012年6月13日，保藏號為CCTCCM2012230。PBS 液配方IOOOml 蒸餾水中加入 NaCl 9g、Na2HPO4 12H20 6g、NaH2PO4. 2H200. 4g，pH 7. 2。本發明其他化學試劑，如無特別說明，均為分析純，併購自國藥集団。本發明實施例中肺病變指數評分標準根據7個肺葉病變程度進行評定，最大得分為28分。特異性損傷的肺葉面積為0%時，記為0分，1% 25%記為I分，26% 50%記為2分，51% 75%記為3分，大於75%為4分。本發明實施例統計分析方法為統計7個肺葉的肺病變指數，確定病變程度。用SPSS計算機軟體進行ANOVA分析，比較各組間差異，確定病變差異的有效性。為使本發明更加容易理解，下面結合具體實施例，進ー步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍，下列實施例中未提及的具體實驗方法，通常按照常規實驗方法進行。
實施例1、豬肺炎支原體HN0613株的分離鑑定1.材料與方法1.1 材料1.1.1病料來源2006年從河南省各地採集疑似豬支原體肺炎病變肺臟，共16份。1.1. 2培養基豬肺炎支原體Friis培養基購自BD公司；豬血清購自GIBCO公司；酚紅指示劑購自美國AMRESC0公司。1.1. 3生化試劑化學試劑購自國藥集團化學試劑有限公司。細菌基因組DNA提取試劑盒購自TIANGEN公司，狄氏染色試劑盒購自於重慶龐通醫療器械有限公司。生化鑑定試劑購自杭州天和微生物試劑有限公司。1. 1.4陰、陽性血清兔抗豬肺炎支原體J株特異性血清，按參考文獻方法製備(Meens, J. , Selke, M. , Gerlach,G.F.,2006.1dentification and immunologicalcharacterization of conserved Mycoplasma hyopneumoniae lipoproteins Mhp378 andMhp651. Vet. Microbiol. 116:85 - 95.)。未免兔血清作為陰性血清。1. 2 方法1. 2.1病料處理取疑似支原體肺炎病變肺臟，在超淨臺內用無菌手術剪刀剪取發病部位邊緣組織，放入無菌平皿，將病肺組織剪成l_2mm3碎塊，接種Friis肉湯，37°C培養，每日觀察培養液的PH值變化。培養液變色時，取第一代經0. 45 ii m過濾器過濾的培養物0. 5ml接種到1.5ml含青黴素2000U/ml的Frris肉湯培養基中，37°C繼續培養，培養基變黃後直接取培養物進行移植傳代，如培養物變色，進行塗片，分別進行革蘭氏染色和瑞氏染色，鏡檢。如革蘭氏染色未發現細菌，同時瑞氏染色發現支原體樣菌體時，取0. 2ml培養物塗布於Frris平板固體培養基表面，置37°C,5%C02條件下培養,姆日觀察是否有支原體樣菌落。取支原體樣單個菌落接種於Friis肉湯，培養基顏色變黃後取0. 2ml培養物塗布於Frris平板固體培養基表面置37°C，5%C02條件下進行純化培養，如此進行純化培養2次。將最後一次純化培養生長的支原體樣菌落接種Frris液體培養基所得的顏色變黃培養物保存於_70°C備用。1. 2. 2菌落狄氏染色按參考文獻進行(曹澍澤.獸醫微生物學及免疫學技術[M].北京北京農業大學出版社.1992. 49 50，126 129，371 373.)，採用無菌方法從固體培養基上切下菌落，放到載玻片上，在兩邊墊上竹籤，滴上狄氏染色液後再蓋上ー塊玻片，置於4°C染色30min後低倍鏡下觀察結果。1. 2. 3PCR鑑定及測序分析用細菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA模板。PCR引物參考文獻進行合成IJ.Caron, M. Ouardani, and S.Dea.Diagnosis and Differentiation of Mycoplasmahyopneumoniae and Mycoplasma hyorhmis Infections in Pigs by PCR Amplificationof the p36 and p46Genes[J]. Journal of clinical microbiology, 2000，38(4):1390 1396 )。FSp36，5 』-GGGCCGATGAAACCTATTAAAATAGCT-3』 Rsp36，5 』-GCCGCGAAATTAAATATTTTTAATTGCATCCTG-3』，上海生工合成。PCR 反應體系超純水 34.5 y IUOXPCR Buffer 5 u l.dNTP4ロ1、引物各2111、模板2111、TaqDNA聚合酶0.5 ill。按下列參數進行PCR反應預變性940C 3min ；94°C 30s，53°C退火 30s，72°C延伸 90s，35 個循環後；72°C終延伸 lOmin。擴增結束後取上述產物瓊脂糖凝膠電泳檢測。直接將有特異性條帶的PCR產物及引物提交至上海生エ進行測序分析。1. 2. 4生化試驗生化試驗參考文獻進行(曹澍澤.獸醫微生物學及免疫學技術[M].北京北京農業大學出版社.1992. 49 50，126 129，371 373.)。主要進行洋地黃皂甙敏感性試驗、尿素酶試驗、葡萄糖分解試驗、精氨酸水解試驗、三苯基氯化四氮唑(TTC)還原試驗、七葉甙水解試驗、甘露醇分解試驗、薄膜和斑點形成試驗。1. 2. 5生長抑制試驗(GIT)Friis平板接種0.1ml對數生長期的豬肺炎支原體培養物，將未稀釋的抗血清25ul吸附於滅菌的6mm濾紙片，將吸有血清的濾紙片貼附於平板表面，培養至菌落可見。正常兔血清處理的紙片作為陰性對照。培養觀察圓紙片周圍有無菌落抑制環的產生。抑制寬度達2mm以上時判為豬肺炎支原體陽性。1. 2. 6分離菌株的致病性將分離菌株培養物經氣管注射I 2周齡健康易感豬3頭，每頭5ml (HN0613,108CCU/ml)。另設3頭條件相同的對照豬，各氣管注射培養基5ml，作為對照。試驗豬、對照豬隔離飼養。攻毒後按常規飼養，飼料中無抗生素。觀察28日，每日測體溫。注射28日後剖檢，根據豬支原體肺炎肺病變指數記分標準對試驗豬的肺病變進行記分。試驗組與對照組進行肺病變指數差異分析。對試驗豬及對照豬按1. 2. 4進行豬肺炎支原體的分離，對分離株按1. 2. 3方法進行PCR鑑定。 2.結果2.1培養結果16份病料中僅有I份病料接種的培養基7日後變黃色，過濾接種後5日培養液變黃，培養液均勻混濁，轉接於含青黴素的Friis培養基變色後，革蘭氏染色未發現細菌，瑞氏染色發現支原體樣菌體。轉接於固體培養基後，菌落生長入培養基內部。菌落呈典型煎荷包蛋狀，與支原體菌落形態相符，命名為HN0613株豬肺炎支原體。2. 2狄氏染色結果在低倍鏡下觀察到，在Friis固體培養基的豬肺炎支原體的菌落被染成不褪色的中心深藍色菌落(參見附圖1)，與支原體菌落染色特性相符。2. 3PCR 鑑定所提取的分離培養物模板經PCR擴增後，再經瓊脂糖凝膠電泳檢測，待檢病料或培養物均在750bp IOOObp之間接近IOOObp的位置有一條帶，與預期948bp相符(參見附圖2，其中l.Marker DL 2000; 2.病料分離株HN0613; 3.致病性試驗分離株；4.陰性對照)。2. 4序列測定與分析將所分離菌株PCR擴增產物測序與GenBank中進行blast比較。結果顯示，HN0613分離菌株P36基因序列與NCBI中公布的Mhp P36基因序列相應序列同源性為98%以上。測序結果見SEQ ID Nq. 4。2. 5生化及血清學鑑定分離菌株生化反應與豬肺炎支原體生化特性相符(表I)。表1HN0613分離株生化及生長抑制試驗結果表
權利要求
1.一種豬肺炎支原體，其特徵在於，所述豬肺炎支原體為保藏號為CCTCC M2012230的豬肺炎支原體HN0613株。
2.一種預防或治療豬支原體肺炎相關疾病的豬支原體肺炎疫苗，其特徵在於，含有豬肺炎支原體HN0613株製備的豬肺炎支原體抗原。
3.根據權利要求2所述的疫苗，其特徵在於，所述的豬肺炎支原體抗原為滅活的豬肺炎支原體HN0613株，或含有豬肺炎支原體HN0613株的免疫原性胺基酸序列嵌合病毒，或任何其它含豬肺炎支原體HN0613株免疫原性胺基酸序列的多肽或亞單位抗原。
4.根據權利要求3所述的疫苗，其特徵在於，所述的滅活的豬肺炎支原體HN0613株抗原的含量為I X IO7 I X IO9CXU/頭份。
5.根據權利要求4所述的疫苗組合物，其特徵在於，所述的疫苗組合物還包括佐劑。
6.一種含豬肺炎支原體抗原的疫苗組合物，其特徵在於，所述的疫苗組合物含有豬肺炎支原體抗原，與以下豬病原體抗原的一種或幾種的組合豬圓環病毒2型、豬流感病毒抗原、豬生殖呼吸症候群抗原、副豬嗜血桿菌抗原、豬偽狂犬病毒抗原、豬波氏桿菌抗原、豬多殺性巴氏桿菌抗原。
7.一種預防和治療豬圓環病毒2型、豬肺炎支原體感染的疫苗組合物，其特徵在於，所述的疫苗組合物含有至少一種豬肺炎支原體抗原，和至少一種豬圓環病毒2型抗原。
8.根據權利要求7所述的疫苗組合物，其特徵在於，所述的疫苗組合物含有豬肺炎支原體HN0613株抗原和豬圓環病毒2型抗原。
9.根據權利要求7所述的疫苗組合物，其特徵在於，所述的豬肺炎支原體HN0613株抗原為滅活的豬肺炎支原體HN0613株，或含有豬肺炎支原體HN0613株的免疫原性胺基酸序列嵌合病毒，或任何其它含豬肺炎支原體HN0613株免疫原性胺基酸序列的多肽或亞單位抗原的任意一種或幾種的組合。
10.根據權利要求7所述的疫苗組合物，其特徵在於，所述的豬圓環病毒2型抗原選自滅活的或活的豬圓環病毒2型2a、2b、2c或2d基因型的抗原的一種或幾種的組合；豬圓環病毒2型的免疫原性胺基酸序列嵌合病毒，或任何其它含豬圓環病毒2型免疫原性胺基酸序列的多肽或亞單位抗原的任意一種或幾種的組合。
11.根據權利要求10所述的疫苗組合物，其特徵在於，所述的豬圓環病毒2型抗原為豬圓環病毒2型2b基因型的抗原，或豬圓環病毒2型ORF2蛋白。
12.根據權利要求11所述的疫苗組合物，其特徵在於，所述的豬圓環病毒2型抗原為杆狀病毒表達的PCV20RF2蛋白。
13.根據權利要求7所述的疫苗組合物，其特徵在於，所述的豬圓環病毒2型抗原的含量為 3 X IO5.0 Ixio8 0TCID50/ 頭份。
14.根據權利要求13所述的疫苗組合物，其特徵在於，所述的豬圓環病毒2型抗原的含量為 IXIO6 ciTCID5q/ 頭份。
15.根據權利要求11所述的疫苗組合物，其特徵在於，所述的豬圓環病毒2型的ORF2蛋白含量為2 20 μ g/頭份。
16.根據權利要求9所述的疫苗組合物，其特徵在於，所述的所述的滅活的豬肺炎支原體HN0613株抗原含量為I X IO7 I X IO9CXU/頭份。
17.根據權利要求7所述的疫苗組合物，其特徵在於，所述的疫苗組合物還包括佐劑，所述佐劑的用量為5% 30%重量，所述的疫苗組合物中抗原成份的用量為70% 95%重量。
18.一種製備權利要求Γ17任意一項所述疫苗組合物的方法，其特徵在於，為將豬肺炎支原體抗原、豬圓環病毒2型抗原濃縮並混合而獲得的。
19.根據權利要求18所述的方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟將豬圓環病毒2型病毒液或PCV2 ORF2蛋白液與豬肺炎支原體菌液處理並濃縮後混合，然後將混合液與疫苗佐劑混合，以500轉/分鐘攪拌10分鐘即獲得疫苗組合物；優選地，所述豬圓環病毒2型病毒液為濃縮後配成疫苗，疫苗中豬圓環病毒2型含量為滅活前I X IO6 0TCID50/頭份；所述的豬肺炎支原體菌液濃縮後配成疫苗，疫苗中豬肺炎支原體含量為滅活前I X IO8CCU/頭份。
全文摘要
本發明提供一株經分離鑑定為免疫原性更好的豬肺炎支原體毒株HN0613株，還提供了上述豬肺炎支原體HN0613株製備的豬肺炎支原體抗原與含有該豬肺炎支原體抗原的豬支原體肺炎疫苗。本發明還提供了一種豬圓環病毒2型、豬肺炎支原體的二聯組合疫苗，包含PCV 2抗原(滅活的豬圓環病毒2型抗原或PCV2ＯＲＦ2蛋白)、滅活的豬肺炎支原體以及疫苗佐劑。本發明的組合疫苗，可起到打一針該疫苗即可預防豬圓環病毒病和豬支原體肺炎目的，對豬肺炎支原體感染的預防保護效果。
文檔編號A61P31/20GK103031258SQ201210224389
公開日2013年4月10日 申請日期2012年6月29日 優先權日2012年6月29日
發明者張許科, 孫進忠, 白朝勇 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司