丹綠補腎膠囊中次野鳶尾黃素和胡椒鹼的含量測定方法與流程
2023-06-08 13:38:11
本發明涉及醫藥檢測技術領域。
背景技術：
丹綠補腎膠囊由白花丹、綠包藤、射幹、胡椒、乾薑，輔料為澱粉製成；補腎滋陰壯陽。用於治療男性形衰體弱，性慾低下甚或陽痿、遺精、精少、精冷、不育等；女性未老先衰，容顏無華，顏面黑斑，月經不調、痛經、閉經、宮寒不孕等。
丹綠補腎膠囊質量標準為國家藥品標準WS-10436(ZD-0436)-2002-2012Z，其中只有一項含量測定，是採用HPLC法，以甲醇-水（77:23）為流動相測定胡椒鹼的含量。查閱文獻得知，目前有關胡椒鹼和次野鳶尾黃素的含量測定都是單獨進行測定的，目前還未查閱到採用一個色譜條件同時測定次野鳶尾黃素和胡椒鹼的報導；現有檢測方法次野鳶尾黃素與其他成分分離度較差，甚至會出現合峰。在上述背景情況下，為簡便、快捷、多指標控制丹綠補腎膠囊的質量，發明了採用普通液相色譜儀、等度洗脫，同時測定丹綠補腎膠囊中的次野鳶尾黃素和胡椒鹼的含量。並使其達到良好的分離效果，準確測定其含量。
技術實現要素：
本發明要解決的技術問題是提供一種丹綠補腎膠囊中次野鳶尾黃素和胡椒鹼的含量測定方法，該方法可同時測定次野鳶尾黃素和胡椒鹼含量，兩種成分能達到良好的分離效果，準確測定其含量，且操作簡單，快捷，易於掌握。
為解決上述技術問題，本發明所採取的技術方案是：一種丹綠補腎膠囊中次野鳶尾黃素和胡椒鹼的含量測定方法，包括以下步驟：
（1）色譜條件：
色譜柱：以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；
流動相：乙腈與0.1-0.2wt%磷酸水溶液，其中，乙腈：0.1-0.2wt%磷酸水溶液的體積比為49:51；
檢測波長：266±4nm；
柱溫：35-45℃；
流速：0.9-1.1ml/min；
（2）對照品溶液的製備：分別取次野鳶尾黃素和胡椒鹼對照品，加甲醇製成含次野鳶尾黃素和胡椒鹼的溶液，作為對照品溶液；
（3）供試品溶液的製備：取丹綠補腎膠囊內容物，混勻，加入甲醇溶解，過濾，取續濾液作為供試品溶液；
（4）測定法：分別吸取上述對照品溶液與供試品溶液，注入高效液相色譜儀，測定丹綠補腎膠囊中次野鳶尾黃素和胡椒鹼的含量。
優選的，色譜條件為：
色譜柱：以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；
流動相：乙腈-0.2wt%磷酸水溶液，其中，乙腈與0.2wt%磷酸水溶液的體積比為49:51；
檢測波長：266nm；
柱溫：40℃；
流速：1.0ml/min。
高效液相色譜系統的理論板數按胡椒鹼峰計算不低於5000。
每1ml對照品溶液中含次野鳶尾黃素10-30μg，胡椒鹼50-80μg。
優選的，每1ml對照品溶液中含次野鳶尾黃素10μg，胡椒鹼80μg。
供試品溶液的製備為：取適量丹綠補腎膠囊內容物，混勻，取0.35-1.05g，精密稱定，至具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25-75ml，超聲處理，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，微孔濾膜過濾，取續濾液作為供試品溶液。
優選的，供試品溶液的製備為：取適量丹綠補腎膠囊內容物，混勻，取0.35，精密稱定，至具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，超聲處理，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，微孔濾膜過濾，取續濾液作為供試品溶液。
對照品溶液與供試品溶液的進樣體積各為10μl。
色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18，4.6×250mm 5μm。
檢測器為二極體陣列檢測器。
DAD檢測器的英文全稱為Diode array detector，為二極體陣列檢測器。
採用上述技術方案所產生的有益效果在於：
（1）本發明採用普通液相色譜儀、等度洗脫，同時測定丹綠補腎膠囊中次野鳶尾黃素和胡椒鹼含量，兩種成分能達到良好的分離效果，準確測定其含量，實現了多指標控制丹綠補腎膠囊的質量，且操作簡單，快捷，易於掌握；
（2）本發明通過紫外掃描兩種成分的紫外吸收，次野鳶尾黃素在266±4nm有最大吸收；胡椒鹼在343nm有最大吸收，但其在200nm～378nm均有較高的響應值，綜合考慮以266±4nm為檢測波長，進行含量測定。直接以甲醇超聲處理，過濾，進樣即可。通過調整乙腈-0.1-0.2wt%磷酸水溶液的體積比，使兩種成分能很好的分離，分離度均大於1.5。
附圖說明
圖1是本發明實施例1中對照品溶液的高效液相色譜圖；
圖2是本發明實施例1中供試品溶液的高效液相色譜圖；
圖3是現有技術提供的對照品溶液的高效液相色譜圖；
圖4是現有技術提供的供試品溶液的高效液相色譜圖。
具體實施方式
下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但並不構成對本發明的任何限制，任何人在本發明的權利要求範圍內所做的有限次的修改仍在本發明的權利要求範圍內。
實施例1
丹綠補腎膠囊中次野鳶尾黃素和胡椒鹼的含量測定方法，依次包括下述步驟：
1.儀器與試藥
（1）儀器：Agilent高效液相色譜儀，二極體陣列檢測器，四元梯度泵
（2）試藥：乙腈（色譜純），純化水，其它試劑均為分析純。次野鳶尾黃素對照品（批號111557-200602）、胡椒鹼對照品（批號110775-201405）均購於中國食品藥品檢定研究院。
2.實驗條件
色譜條件與系統適應性試驗：色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 4.6×250mm 5μm；流動相：乙腈-0.1wt%磷酸水溶液（體積比49:51）；檢測波長為266±4nm；柱溫：35℃；流速：0.9ml/min；理論板數按胡椒鹼峰計算應不低於5000。
3．樣品測定：
對照品溶液的製備：分別取次野鳶尾黃素和胡椒鹼對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇製成每1ml含次野鳶尾黃素30μg，胡椒鹼50μg的溶液，作為對照品溶液。
供試品溶液的製備：取適量丹綠補腎膠囊內容物，混勻，取1.05g，精密稱定，至具塞錐形瓶中。精密加甲醇75ml，稱定重量，超聲30分鐘，放置室溫，再稱定重量，用甲醇補足減失重量，搖勻，0.45μm微孔濾膜過濾，取續濾液為供試品溶液。
測定法：分別精密吸取對照品與供試品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定丹綠補腎膠囊中次野鳶尾黃素和胡椒鹼的含量。次野鳶尾黃素和胡椒鹼兩種成分能很好的分離，分離度大於1.5。
實施例2
丹綠補腎膠囊中次野鳶尾黃素和胡椒鹼的含量測定方法，依次包括下述步驟：
1.儀器與試藥
（1）儀器：Agilent高效液相色譜儀，二極體陣列檢測器，四元梯度泵
（2）試藥：乙腈（色譜純），純化水，其它試劑均為分析純。次野鳶尾黃素對照品（批號111557-200602）、胡椒鹼對照品（批號110775-201405）均購於中國食品藥品檢定研究院。
2.實驗條件
色譜條件與系統適應性試驗：：色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 4.6×250mm 5μm；流動相：乙腈-0.2wt%磷酸水溶液（體積比49:51）；檢測波長為266±4nm；柱溫：45℃；流速：1.1ml/min；理論板數按胡椒鹼峰計算應不低於5000。
3．樣品測定：
對照品溶液的製備：分別取次野鳶尾黃素和胡椒鹼對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇製成每1ml含次野鳶尾黃素20μg，胡椒鹼65μg的溶液，作為對照品溶液。
供試品溶液的製備：取適量丹綠補腎膠囊內容物，混勻，取0.60g，精密稱定，至具塞錐形瓶中。精密加甲醇50ml，稱定重量，超聲30分鐘，放置室溫，再稱定重量，用甲醇補足減失重量，搖勻，0.45μm微孔濾膜過濾，取續濾液為供試品溶液。
測定法：分別精密吸取對照品與供試品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定丹綠補腎膠囊中次野鳶尾黃素和胡椒鹼的含量。次野鳶尾黃素和胡椒鹼兩種成分能很好的分離，分離度大於1.5。
實施例3
丹綠補腎膠囊中次野鳶尾黃素和胡椒鹼的含量測定方法，依次包括下述步驟：
1.儀器與試藥
（1）儀器：Agilent高效液相色譜儀，DAD檢測器，四元梯度泵
（2）試藥：乙腈（色譜純），純化水，其它試劑均為分析純。次野鳶尾黃素對照品（批號111557-200602）、胡椒鹼對照品（批號110775-201405）均購於中國食品藥品檢定研究院。
2.實驗條件
色譜條件與系統適應性試驗：色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 4.6×250mm 5μm；流動相：乙腈-0.2wt%磷酸水溶液（體積比49:51）；檢測波長為266nm；柱溫：40℃；流速：1.0ml/min；理論板數按胡椒鹼峰計算應不低於5000。
3.方法學考察
（1）線性範圍的考察：
取混合對照品溶液，分別進樣1、2、5、10、20、30μl，測定峰面積，以峰面積為縱坐標，進樣量為橫坐標，進行線性回歸，得標準曲線。
次野鳶尾黃素的進樣量在0.01030~0.3090μg，與峰面積呈良好的線性關係，回歸方程為Y=4445.4x-1.513，r=0.9998；結果見表1。胡椒鹼的進樣量在0.08173~2.4519μg，與峰面積呈良好的線性關係，回歸方程為Y=5517.6x-55.041，r=0.9998。結果見表2。
表1次野鳶尾黃素對照品測定結果
表2胡椒鹼對照品測定結果
（2）精密度試驗：精密吸取混合對照品溶液10μl重複進樣6次，測得峰面積RSD＜2.0%。結果見表3。
表3精密度試驗結果
（3）穩定性試驗：取同一供試品（批號：16070811）溶液，間隔一段時間進樣一次，結果次野鳶尾黃素峰面積RSD＜2.0，表明24小試內穩定。結果見表4。
表4穩定性試驗結果
（4）重複性試驗：取同一批樣品（批號：16070811）分別取0.175g、0.35g、0.525g各三份製備供試品溶液，按擬定的含量測定方法測定。結果見表5。
表5樣品重複性試驗
（5）回收率試驗：取已知含量的樣品（批號：16070811），分別精密加入一定量的次野鳶尾黃素和胡椒鹼對照品，按供試品製備與測定方法，平行做9組，結果見表6、7。
表6次野鳶尾黃素回收率測定結果
表7胡椒鹼回收率測定結果
（6）樣品測定：
對照品溶液的製備：分別取次野鳶尾黃素和胡椒鹼對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇製成每1ml含次野鳶尾黃素10μg，胡椒鹼80μg的溶液，作為對照品溶液。
供試品溶液的製備：取適量丹綠補腎膠囊內容物，混勻，取0.35g，精密稱定，至具塞錐形瓶中。精密加甲醇25ml，稱定重量，超聲30分鐘，放置室溫，再稱定重量，用甲醇補足減失重量，搖勻，0.45μm微孔濾膜過濾，取續濾液為供試品溶液。
測定法：分別精密吸取對照品與供試品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定，結果見表8。
表8樣品含量測定結果
本發明實施例1對照品溶液和供試品溶液的高效液相色譜圖分別為圖1和圖2所示。圖1中，12.860min為次野鳶尾黃素的峰，22.205min為胡椒鹼的峰；圖2中，13.077min為次野鳶尾黃素的峰，21.866min為胡椒鹼的峰；兩種成分能很好的分離，分離度大於1.5。
對比例：
丹綠補腎膠囊質量標準為國家藥品標準WS-10436(ZD-0436)-2002-2012Z，其中只有一項含量測定，是採用HPLC法，以甲醇-水（77:23）為流動相測定胡椒鹼的含量。
現有技術測定丹綠補腎膠囊含量的具體方法為：
色譜條件：以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；甲醇-水（77:23）為流動相；檢測波長為343nm。
對照品溶液的製備：取胡椒鹼對照品適量，精密稱定，加無水乙醇製成每1ml含80μg的溶液，既得。
供試品溶液的製備：取裝量差異項下的本品內容物，研細，混勻，取0.35g，精密稱定，置100ml棕色量瓶中，加無水乙醇80ml，超聲處理（功率250W，頻率20kHz）30分鐘，放冷，加無水乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，既得。
測定法：分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，既得。
現有技術提供的對照品溶液和供試品溶液的高效液相色譜圖見圖3和圖4所示。圖3中，8.406min為胡椒鹼的峰；圖4中，8.411min為胡椒鹼的峰。
本發明在同一色譜條件下測定樣品中次野鳶尾黃素和胡椒鹼的含量，兩種成分能很好的分離，分離度均大於1.5，實現了多指標控制丹綠補腎膠囊的質量，且操作簡單，快捷，易於掌握；且在前處理過程中，減少了有機試劑的用量。為了使次野鳶尾黃素與胡椒鹼很好的分離，流動相中有機相比例下降，使本發明的分析時間比現有技術略長。而現有技術只有一項含量測定。