一種新的焦磷酸合成酶編碼序列、其編碼的多肽及製備方法
2023-06-02 15:03:41 3
專利名稱：一種新的焦磷酸合成酶編碼序列、其編碼的多肽及製備方法
技術領域：
本發明涉及一種新的人多核苷酸，由該多核苷酸編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產方法。更具體地說，本發明涉及牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶(Geranylgeranyl diphosphate synthase，簡稱為GGPPS)家族中的一個新成員。本發明的多肽是果蠅GGPPS基因的同系物。
GGPPS是辣椒中發現的一個基因，其在植物中被研究得較多。而後，人們發現不僅在植物中有GGPPS基因，動物中也同樣存在GGPPS基因，其在高等動物的腦中高表達，並與腦中蛋白的異戊二烯化作用有關。這一基因的表達失常，可能會引發早老性痴呆症等疾病。Kuntz等人首先於1992年從辣椒細胞cDNA文庫中克隆得到一個GGPPS基因(Plant J 225-34，1992)。同年，Math等人也從歐氏桿菌屬中分離得到了GGPPS基因(Proc Natl Acad Sci USA 1992，896761-6764)。隨後，人們又從牛腦中分離得到了GGPPS基因(J.Nurochem 1995，2299-2306)，這一基因與辣椒及歐氏桿菌屬中的GGPPS有較高的同源性。這三個基因被認為與蛋白的異戊二烯化過程有關。最近，果蠅GGPPS基因也被發表。但在本發明之前，沒有發現或發表過人的GGPPS基因。
本發明的一個目的是提供一種新的多核苷酸序列，該多核苷酸序列編碼與果蠅GGPPS基因同源的人的基因，本發明的人的與果蠅GGPPS同源的基因被命名為GGPPS。
本發明的另一個目的是提供一種新的與果蠅GGPPS同源的人的蛋白，命名為人GGPPS。
本發明的再一個目的是提供一種利用重組技術生產所述的GGPPS蛋白的方法。
本發明還涉及這種人GGPPS編碼序列和多肽的應用。
在本發明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人GGPPS蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸54-953位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸54-953位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.3中核苷酸54-953位的序列。
在本發明的另一方面，提供了一種分離的GGPPS蛋白多肽，它包括具有SEQID NO.4胺基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本發明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發明的另一方面，提供了一種所述載體轉化的宿主細胞。
在本發明的另一方面，提供了一種產生具有GGPPS蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有GGPPS蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連於表達調控序列，形成GGPPS蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸54-953位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成GGPPS蛋白的重組細胞；(c)在適合表達GGPPS蛋白多肽的條件下，培養步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有GGPPS蛋白活性的多肽。
在本發明的一個具體實施方案中，本發明的分離的多核苷酸全長為1218個核苷酸，其詳細序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位於54-953位核苷酸。
在本發明中，「分離的」、「純化的」或「基本純的」DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態下位於其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組份分開，而且已經與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。
在本發明中，術語「GGPPS蛋白(或多肽)編碼序列」指編碼具有GGPPS蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中54-953位核苷酸序列及其簡併序列。該簡併序列是指，位於SEQ ID NO.3序列的編碼框54-953位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同胺基酸的簡併密碼子所取代後而產生的序列。由於密碼子的簡併性，所以與SEQ ID NO.3中54-953位核苷酸序列同源性低至約70％的簡併序列也能編碼出SEQ ID NO.4所述的序列。該術語還包括能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸54-953位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。更佳地，包括在高度嚴緊的條件下能與SEQ ID NO.3中從核苷酸54-953位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。此外該術語還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸54-953位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術語還包括能編碼具有與人GGPPS相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.3序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5』和/或3』端添加數個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。
在本發明中，「基本純的」蛋白質或多肽是指其至少佔樣品總物質的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按乾重或溼重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度。基本純的多肽基本上不含天然狀態下的伴隨其的組分。
在本發明中，術語「GGPPS蛋白多肽」指具有GGPPS蛋白活性的SEQ ID NO.4序列的多肽。該術語還包括具有與GGPPS相同功能的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括GGPPS蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹度條件下能與GGPPS DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗GGPPS多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含GGPPS多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括GGPPS多肽的可溶性片段。通常，該片段具有GGPPS多肽序列的至少約10個連續胺基酸，通常至少約30個連續胺基酸，較佳地至少約50個連續胺基酸，更佳地至少約80個連續胺基酸，最佳地至少約100個連續胺基酸。
發明還提供GGPPS蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然GGPPS多肽的差別可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露於誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同於天然L-胺基酸的殘基(如D-胺基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的胺基酸(如β、γ-胺基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽並不限於上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙醯化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露於進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
本發明還包括GGPPS多肽編碼序列的反義序列。這種反義序列可用於抑制細胞內GGPPS的表達。
本發明還包括一種探針分子，該分子通常具有GGPPS多肽編碼序列的8-100個，較佳地15-50個連續核苷酸。該探針可用於檢測樣品中是否存在編碼GGPPS的核酸分子。
本發明還包括檢測GGPPS核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然後檢測探針是否發生了結合。較佳地，該樣品是PCR擴增後的產物，其中PCR擴增引物對應於GGPPS多肽的編碼序列，並可位於該編碼序列的兩側或中間。引物長度一般為20-50個核苷酸。
在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體。
在本發明中，術語「宿主細胞」包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如CHO細胞、COS細胞等。
另一方面，本發明還包括對GGPPSDNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這裡，「特異性」是指抗體能結合於GGPPS基因產物或片段。較佳地，指那些能與GGPPS基因產物或片段結合但不識別和結合於其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合併抑制GGPPS蛋白的分子，也包括那些並不影響GGPPS蛋白功能的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的GGPPS基因產物結合的抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行製備。例如，純化的GGPPS基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用於動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達GGPPS或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來製備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511.1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發明的抗體包括能阻斷GGPPS功能的抗體以及不影響GGPPS功能的抗體。本發明的各類抗體可以利用GGPPS基因產物的片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法製備或利用多肽合成儀合成。與GGPPS基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯後修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
在本發明的一個實施方案中，本發明的多核苷酸全長為1218個核苷酸，其詳細序列見SEQ ID NO3，其中開放讀框位於54-953位核苷酸。該多核苷酸是如此獲得的，以人腦λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，合成正向引物A15′-GCGTGAAAAGTCGTGATATCATCG-3′、和反向引物A25′-TTGGTGGCAATGTCCTGTCACTGC-3′，進行PCR，獲得1218bp(A1A2)的目的片段。測序後得到SEQ ID NO3的全長cDNA序列。
通過同源檢索發現本發明的cDNA序列與已發表的果蠅的GGPPS基因同源，屬於蛋白異戊二烯化酶家族，因而被確認為人的GGPPS基因。GGPPS編碼的蛋白已被證實與蛋白的異戊二烯化過程有關，這是生物蛋白調控的一種手段。尤其是在高等生物中，蛋白質的翻譯後調控，對於繁重的生物體內代謝調節過程起著極為重要的作用。實驗發現，該同源基因在腦組織中高表達。它被認為可能與腦中的蛋白異戊二烯化作用有關。GGPPS催化蛋白異戊二烯化的作用可能與腦的正常代謝調控有關。若腦中的這一基因出現問題，很可能會導致腦無法正常指揮人體的正常工作，有資料證明其可能與老年痴呆症等疾病的發生有關(Runquist.M1995，J.Neurochem 65(5)2299-2306)。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1GGPPS的cDNA序列的克隆和測定1.引物擴增以人腦λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對寡核苷酸為引物——A15′-GCGTGAAAGTCGTGATATCATCG-3′(SEQ ID NO1)為正向引物，寡核苷酸A25′-TTGGTGGCAATGTCCTGTCACTGC-3』(SEQ ID NO2)為反向引物，進行PCR。A1、A2引物對的PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、68℃1分鐘和72℃1分鐘進行35個循環，最後72℃延伸5分鐘。電泳檢測用A1、A2進行PCR擴增得到的產物，擴增片段的長度為1603bp的。
2.PCR產物的測序將上述步驟獲得PCR擴增產物與pGEM-TTM載體(Promega)連接，轉化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對插入片段進行定向系列缺失，然後用PCR對缺失子進行快速鑑定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對依次截短的缺失子進行測序，最後用電腦軟體拼接順序，獲得全長cDNA序列，共1218bp，詳細序列見SEQ ID NO3，其中開放讀框位於54-953位核苷酸。
根據得到的全長cDNA序列推導出GGPPS的胺基酸序列，共300個胺基酸殘基，其胺基酸序列詳見SEQ ID NO4。
實施例2同源比較用GGPPS的全長cDNA序列及其編碼蛋白在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB資料庫中用BLAST進行同源檢索。結果發現它們與果蠅GGPPS基因及其編碼蛋白具有極高同源性，在核酸水平上相同性達到了72％；在蛋白水平上的相同性達到了58％，相似性達到了75％。
GGPPS被研究得較多的是在植物中，其被認為是植物類胡蘿蔔素合成的前體，而類胡蘿蔔素在植物光合作用中起著吸收並轉遞光合作用所需能量的重要作用。同時有實驗發現，GGPPS是維生素A合成的前體。其還可能在某些植物的生物代謝過程中起著重要的作用(FASEB.J 1996，10(2)，228-237)。
雖然GGPPS是在植物中發現的一種蛋白，但最近的研究發現，在動物中也同樣存在這一蛋白。人們首先在牛腦中分離得到了GGPPS，並發現該基因在腦組織中高表達。牛腦中，GGPPS的含量很高，而腦的不同區域GGPPS的含量又各不相同，在白質中含量最高。(Runquist.M 1995，J.Neurochem 65(5)2299-2306)。
GGPPS在動物中的研究還剛剛起步，其被認為可能與蛋白的異戊二烯化過程有關。蛋白的異戊二烯化過程是真核生物中普遍存在的現象，是生物蛋白調控的一種手段。尤其是在高等生物中，蛋白的翻譯後調控，對於繁重的生物體內代謝調節過程起著極為重要的作用(Runquist.M 1995，J.Neurochem 65(5)2299-2306)。
特別是在GGPPS的胺基酸序列中存在兩個分別由15和13個胺基酸組成的多聚異戊二烯合成酶的特徵性序列——(L/I/V/M/F/Y)GX2(F/Y/L)Q(L/I/V/M)XDD(L/I/V/M/F/Y)X(D/N/G)；(L/I/V/M)2XDDX(2，4)DX4RR(G/H)[注該序列中X為任意胺基酸，「2」等數字為胺基酸數目，「(L/I/V/M/F/Y)」表示從這6個胺基酸中任意選擇一個胺基酸]。在本發明的蛋白中符合上述模式的序列片段是LGLFFQIRDDYAN(SEQ ID NO.4中179-192位)，LLIDDIEDNSKLRRG(SEQ ID NO.4中61-75位)。這更證實了本發明的人的GGPPS與牛及其它物種的GGPPS屬於一個家族，而且同樣具有GGPPS家族的相關功能。其催化蛋白異戊二烯化的作用可能與對腦的正常代謝調控起著重要的作用。若腦中的這一基因出現問題，很可能會導致腦無法正常指揮人體的正常工作，從而引發早老性痴呆症等疾病，這將嚴重影響我們的正常生活(Runquist.M1995，J.Neurochem 65(5)2299-2306)。關於GGPPS在腦中影響早老性痴呆症及其他可能的疾病的產生及其作用機理，為我們有效地治療這些疾病提供了研究的方向與手段。
實施例3GGPPS在大腸桿菌中的表達在該實施例中，編碼GGPPS的cDNA序列用對應於該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，用人腦λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板進行擴增，以合成插入片段。
PCR反應中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-GGCCGGATCCATGGAGAAGACTCAAGAAA-3′(SEQ ID NO.5)，該引物含有BamH1限制性限制性內切酶的酶切位點，接之是由起始密碼子開始的GGPPS編碼序列的19個核苷酸；3′端引物序列為5』-ACACGGATCCTTATTCATTTTCTTCTTTG-3』(SEQ ID NO.6)
該引物含有BamH1限制性限制性內切酶的酶切位點、一個翻譯終止子和GGPPS的編碼序列。
限制性內切酶的酶切位點對應於細菌表達載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內切酶酶切位點，該質粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個細菌複製起點(ori)、一個IPTG-可調啟動子/操縱子(P/O)、一個核糖體結合位點(RBS)、一個6-組氨酸標記物(6-His)以及限制性內切酶克隆位點。
用BamHI消化pQE-9載體，隨後將插入片段連接到pQE-9載體並保持開放讀框在細菌RBS起始。隨後用連接混合物轉化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質粒pREP4，其表達lacI阻遏物並攜帶卡那黴素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養皿上篩選轉化子，在補加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養基中過夜培養(O/N)含所需構建物的陽性轉化子克隆。抽提質粒，用PstI酶切鑑定插入片段大小及方向，測序驗證結果表明GGPPS的cDNA插入片段已正確裝入載體。
在補加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養基中過夜培養(O/N)含所需構建物的陽性轉化子克隆。過夜(O/N)培養物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然後接種到大體積培養基中，培養細胞生長至600光密度(OD600)達0.4-0.6時，加入IPTG(「異丙基-硫代-B-D-半乳糖苷」)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導啟動P/O導致基因表達水平提高。繼續培養細胞3-4小時，隨後離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細胞並將細胞沉澱溶於6M的鹽酸胍中。澄清後，通過在能使含6-His標記物蛋白緊密結合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的GGPPS。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫GGPPS。可用幾種方法從鹽酸胍中變性沉澱蛋白。或者，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出純化蛋白。純化後蛋白可以結合到第二個柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結合到該柱時蛋白質變性，隨後用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最後，將可溶的蛋白質用PBS進行透析，然後將蛋白質保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑑定表達蛋白的分子量大小為35KDa。
此外，用常規方法對表達蛋白的N端和C端各10個胺基酸長度的胺基酸進行測序，發現與SEQ ID NO4的序列一致。
實施例4GGPPS在真核細胞(CHO細胞株)中的表達在該實施例中，將編碼GGPPS的cDNA序列用對應於該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，用人腦λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板進行擴增，以合成插入片段。
PCR反應中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-GGCCGGATCCATGGAGAAGACTCAAGAAA-3′(SEQ ID NO.7)，該引物含有BamHI限制性限制性內切酶的酶切位點，接之是由起始密碼子開始的GGPPS編碼序列的19個核苷酸；3′端引物序列為5』-ACACGGATCCTTATTCATTTTCTTCTTTG-3』(SEQ ID NO.8)，該引物含有BamHI限制性限制性內切酶的酶切位點，一個翻譯終止子和GGPPS的編碼序列。
引物上的限制性內切酶的酶切位點對應於CHO細胞表達載體pcDNA3上的限制性內切酶酶切位點，該質粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個噬菌體複製起點(f1 ori)、一個病毒複製起點(SV40 ori)、一個T7啟動子、一個病毒啟動子(P-CMV)、一個Sp6啟動子、一個SV40啟動子、一個SV40加尾信號和相應的polyA順序、一個BGH加尾信號和相應的polyA順序、。
用BamHI消化pcDNA3載體，隨後將插入片段連接到pcDNA3載體。隨後用連接混合物轉化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養皿上篩選轉化子，在補加Amp(100μg/ml)的LB液體培養基中過夜培養(O/N)含所需構建物的克隆。抽提質粒，用EcoRV酶切鑑定插入片段大小及方向，測序驗證結果表明GGPPS的cDNA插入片段已正確裝入載體。
質粒轉染CHO細胞是用Lipofectin試劑盒(GiBcolife)用脂轉染法進行。轉染48小時後，經2-3周的持續G418加壓篩選，收集細胞及細胞上清測定表達蛋白酶活力。去G418，連續傳代培養；對混合克隆細胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細胞亞克隆。按常規方法大量培養上述陽性亞克隆。48小時後，開始收集細胞及上清，用超聲裂解方法破碎細胞。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經預平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然後以PBS(pH7.4)為透析液對表達蛋白溶液進行透析。最後凍幹保存。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑑定表達蛋白的分子量大小為35KDa。
此外，用常規方法對表達蛋白的N端和C端各10個胺基酸長度的胺基酸進行測序，發現與SEQ ID NO4的序列一致。
實施例5製備抗體將實施例3或4中獲得的重組蛋白用來免疫動物以產生抗體，具體如下。重組分子用層析法進行分離備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，並用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內注射。14天後，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進行腹膜內注射以加強免疫。每隔14天進行一次加強免疫，至少進行三次。獲得的抗血清的特異反應活性用它在體外沉澱GGPPS基因翻譯產物的能力加以評估。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特徵(A)長度23鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO1GCGTGAAAGT CGTGATATCA TCG 23(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特徵(A)長度24鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2TTGGTGGCAA TGTCCTGTCA CTGC24(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特徵(A)長度1218bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO31 GCGTGAAAGTCGTGATATCATCGTTGAACTATTAGCTTTGAAGTTTAAATCCAATGGAGA61 AGACTCAAGAAACAGTCCAAAGAATTCTTCTAGAACCCTATAAATACTTACTTCAGTTAC121 CAGGTAAACAAGTGAGAACCAAACTTTCACAGGCATTTAATCATTGGCTGAAAGTTCCAG181 AGGACAAGCTACAGATTATTATTGAAGTGACAGAAATGTTGCATAATGCCAGTTTACTCA241 TCGATGATATTGAAGACAACTCAAAACTCCGACGTGGCTTTCCAGTGGCCCACAGCATCT301 ATGGAATCCCATCTGTCATCAATTCTGCCAATTACGTGTATTTCCTTGGCTTGGAGAAAG361 TCTTAACCCTTGATCACCCAGATGCAGTGAAGCTTTTTACCCGCCAGCTTTTGGAACTCC421 ATCAGGGACAAGGCCTAGATATTTACTGGAGGGATAATTACACTTGTCCCACTGAAGAAG481 AATATAAAGCTATGGTGCTGCAGAAAACAGGTGGACTGTTTGGATTAGCAGTAGGTCTCA541 TGCAGTTGTTCTCTGATTACAAAGAAGATTTAAAACCGCTACTTAATACACTTGGGCTCT601 TTTTCCAAATTAGGGATGATTATGCTAATCTACACTCCAAAGAATATAGTGAAACCAAAA661 GTTTTTGTGAAGATCTGACAGAGGGAAAGTTCTCATTTCCTACTATTCATGCTATTTGGT721 CAAGGCCTGAAAGCACCCAGGTGAAGAATATCTTGCGCCAGAGAACAGAAAACATAGATA781 TAAAAAAATACTGTGTACATTATCTTGAGGATGTAGGTTCTTTTGAATACACTCGTAATA841 CCCTTAAAGAGCTTGAAGCTAAAGCCTATAAACAGATTGATGCACGTGGTGGGAACCCTG901 AGCTAGTAGCCTTAGTAAAACACTTAAGTAAGATGTTCAAAGAAGAAAATGAATAATGTT961 AAGCCATTCTTGATTGGACCTCATAGCTTATTTTAGTTAATCTTTTTTTTGTCTTTTAGC1021 CTTACCACCTTTTAAAAAATTTGTTATTCTCCAGAAACAGTAAATAGGTGAGTAGGGGTG1081 GTGCCAGTGAATTCGTTTTCATTTAGAAGCCCCTCTGTACAGATAATCAAAATTCAAAGT1141 TGAAAGAATCAAAAGCAGCCACAGTTATGTAGGTCTGATTTGAATGTCATAATTGCAGTG1201 ACAGGACATTGCCACCAA(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特徵(A)長度300個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO41 Met Glu Lys Thr Gln Glu Thr Val Gln Arg Ile Leu Leu Glu Pro16 Tyr Lys Tyr Leu Leu Gln Leu Pro Gly Lys Gln Val Arg Thr Lys31 Leu Ser Gln Ala Phe Asn His Trp Leu Lys Val Pro Glu Asp Lys46 Leu Gln Ile Ile Ile Glu Val Thr Glu Met Leu His Asn Ala Ser61 Leu Leu Ile Asp Asp Ile Glu Asp Asn Ser Lys Leu Arg Arg Gly76 Phe Pro Val Ala His Ser Ile Tyr Gly Ile Pro Ser Val Ile Asn91 Ser Ala Asn Tyr Val Tyr Phe Leu Gly Leu Glu Lys Val Leu Thr106 Leu Asp His Pro Asp Ala Val Lys Leu Phe Thr Arg Gln Leu Leu121 Glu Leu His Gln Gly Gln Gly Leu Asp Ile Tyr Trp Arg Asp Asn136 Tyr Thr Cys Pro Thr Glu Glu Glu Tyr Lys Ala Met Val Leu Gln151 Lys Thr Gly Gly Leu Phe Gly Leu Ala Val Gly Leu Met Gln Leu166 Phe Ser Asp Tyr Lys Glu Asp Leu Lys Pro Leu Leu Asn Thr Leu181 Gly Leu Phe Phe Gln Ile Arg Asp Asp Tyr Ala Asn Leu His Ser196 Lys Glu Tyr Ser Glu Thr Lys Ser Phe Cys Glu Asp Leu Thr Glu211 Gly Lys Phe Ser Phe Pro Thr Ile His Ala Ile Trp Ser Arg Pro226 Glu Ser Thr Gln Val Lys Asn Ile Leu Arg Gln Arg Thr Glu Asn241 Ile Asp Ile Lys Lys Tyr Cys Val His Tyr Leu Glu Asp Val Gly256 Ser Phe Glu Tyr Thr Arg Asn Thr Leu Lys Glu Leu Glu Ala Lys271 Ala Tyr Lys Gln Ile Asp Ala Arg Gly Gly Asn Pro Glu Leu Val286 Ala Leu Val Lys His Leu Ser Lys Met Phe Lys Glu Glu Asn Glu(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特徵(A)長度29鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5GGCCGGATCC ATGGAGAAGA CTCAAGAAA 29(2)SEQ ID NO6信息(i)序列特徵(A)長度29鹼基(B)類型核酸
(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO6ACACGGATCC TTATTCATTT TCTTCTTTG29(2)SEQ ID NO7信息(i)序列特徵(A)長度29鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO7GGCCGGATCC ATGGAGAAGA CTCAAGAAA 29(2)SEQ ID NO8信息(i)序列特徵(A)長度29鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO8ACACGGATCC TTATTCATTT TCTTCTTTG 29
權利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特徵在於，它包括編碼具有人GGPPS蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸54-953位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸54-953位的核苷酸序列雜交。
2.如權利要求1所述的DNA分子，其特徵在於，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如權利要求1所述的DNA分子，其特徵在於，該序列具有SEQ ID NO.3中核苷酸54-953位的序列。
4.一種分離的GGPPS蛋白多肽，其特徵在於，它包括具有SEQ ID NO.4胺基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權利要求4所述的多肽，其特徵在於，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一種載體，其特徵在於，它含有權利要求1所述的DNA。
7.一種用權利要求6所述載體轉化的宿主細胞。
8.如權利要求7所述的宿主細胞，其特徵在於，該細胞是大腸桿菌。
9.如權利要求7所述的宿主細胞，其特徵在於，該細胞是真核細胞。
10.一種產生具有GGPPS蛋白活性的多肽的方法，其特徵在於，該方法包括(a)將編碼具有GGPPS蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連於表達調控序列，形成GGPPS蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸54-953位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成GGPPS蛋白的重組細胞；(c)在適合表達GGPPS蛋白多肽的條件下，培養步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有GGPPS蛋白活性的多肽。
11.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，該序列為SEQ ID NO.3中從核苷酸54-953位。
12.一種能與權利要求4所述的GGPPS蛋白多肽特異性結合的抗體。
13.一種核苷酸分子，其特徵在於，它是權利要求1所述DNA分子的反義序列。
14.一種探針分子，其特徵在於，它含有權利要求1所述的DNA分子中約8-100個連續核苷酸。
全文摘要
本發明涉及一種新的人多核苷酸,更具體地涉及人GGPPS(Geranylgeranyl diphosphate synthase)編碼序列。本發明的多肽是果蠅GGPPS基因的同系物。本發明還涉及該多核苷酸編碼的多肽,這些多核苷酸和多肽的應用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生產方法。
文檔編號C07K16/40GK1246536SQ98111038
公開日2000年3月8日 申請日期1998年8月31日 優先權日1998年8月31日
發明者餘龍, 畢安定, 傅強, 趙勇, 趙壽元 申請人:上海新黃浦復旦基因工程有限公司