穩定的α螺旋肽及其用途的製作方法

2023-06-02 17:29:11

專利名稱：穩定的α螺旋肽及其用途的製作方法
優先權的請求本申請在35USC§119(e)下要求於2003年11月5日提交的U.S.專利申請系列號60/517,848和於2004年7月27日提交的U.S.專利申請系列號60/591,548的優先權，其每個申請的全部內容在此併入作為參考。
背景細胞凋亡或程序性細胞死亡在所有的多細胞生物體的內環境穩定的發展和保持中發揮重要的作用。對細胞凋亡的敏感性在細胞當中是顯著不同的，並且受外部和內部細胞事件的影響。已經定義了介導細胞命運的正反調節蛋白質，並且已經在廣譜的人類疾病，包括各種癌症的發病中證明了這些蛋白質信號網絡的失調。BCL-2是這個細胞凋亡蛋白質家族的基本成員，並且首先在t(14；18)(q32；q21)淋巴瘤的染色體斷裂點被鑑定出來(Bakhashi et al.1985 Cell 41899；Cleary et al.1985 Proc.Nat』l.Acad.Sci.USA827439)。
基因重排將BCL-2置於免疫球蛋白重鏈基因座的轉錄調控下，產生BCL-2的不適當高水平且導致病理性細胞存活。已經在淋巴細胞和粒細胞性白血病和許多其他的惡性腫瘤的細胞凋亡中鑑定出這種失常，並且它已經與腫瘤進展和對化療-誘導的細胞凋亡的獲得性耐受力有關。BCL-2家族的蛋白質已有相當多的闡述，並且包括提供控制細胞死亡敏感性的制約與平衡的促-和抗-細胞凋亡分子(

圖1)。不會令人驚訝地，細胞凋亡蛋白質已經成為開發防止細胞損失疾病中突然的細胞死亡並且活化惡性腫瘤中細胞死亡通路的治療劑的關鍵靶物。
BCL-2家族被定義為存在多達四個命名為BH1、BH2、BH3、和BH4的保守的「BCL-2同源」(BH)結構域，其都包括α-螺旋節段(Chittenden etal.1995 EMBO 145589；Wang et al.1996 Genes Dev.102859)。抗-細胞凋亡蛋白質，例如BCL-2和BCL-XL，在所有的BH結構域顯示序列保守性。促-細胞凋亡蛋白質被分為在BH1、BH2和BH3結構域中具有同源性的「多結構域」成員(例如BAK、BAX)，和包含專門在BH3兩親性的α-螺旋節段中的序列同源性的「只有BH3-結構域」成員(例如BID、BAD、BIM、BIK、NOXA、PUMA)。BCL-2家族成員具有形成同型和雜二聚物的能力，表明在促-和抗-細胞凋亡蛋白水平之間的競爭性結合和比例支配了對死亡刺激的敏感性。抗-細胞凋亡蛋白質能夠保護細胞避免促-細胞凋亡過量，即過度的程序性細胞死亡。附加的「安全」測量包括調節促-細胞凋亡蛋白質的轉錄並保持他們為非活化的構象體，其需要蛋白水解的活化、去磷酸化、或配體-誘導的構象變化來活化促-死亡功能。在某些細胞類型中，在質膜收到的死亡信號通過線粒體途徑觸發細胞凋亡(圖2)。線粒體可通過隔離細胞色素c，這一活化胱冬蛋白酶9而導致致命的下遊蛋白水解事件的細胞溶質複合物的關鍵成分來作為細胞死亡的看門者發揮作用。多結構域蛋白質，例如BCL-2/BCL-XL和BAK/BAX在線粒體膜發揮保護者和執行者的作用，其活性進一步受到上遊BH3-BCL-2家族的唯一成員的調節。例如，BID是促-細胞凋亡蛋白質的「只有BH3-結構域」子集中的成員，並且傳輸在質膜收到的死亡信號至在線粒體膜的效應物促-細胞凋亡蛋白質。BID具有與促-和抗-細胞凋亡蛋白質相互作用的獨特能力，並且當受到胱冬蛋白酶8的活化時，觸發細胞色素c釋放和線粒體的細胞凋亡。缺失和誘變研究確定促細胞凋亡家族成員的兩親性α-螺旋BH3節段起死亡結構域的作用，並且因此表現出與多結構域細胞凋亡蛋白質相互作用的決定性結構基序。結構研究已經證明BH3螺旋通過插入由BH1、2和3結構域的接觸面形成的疏水性溝槽而與抗-細胞凋亡蛋白質相互作用。活化的BID可被抗-細胞凋亡蛋白質結合和隔離(例如，BCL-2和BCL-XL)並且可觸發促-細胞凋亡蛋白質BAX和BAK的活化，導致細胞色素c釋放和線粒體的細胞凋亡程序。
BAD也是「只有BH3-結構域」(BH3-domain only)的促-細胞凋亡家族成員，其表達同樣觸發BAX/BAK的活化。然而與BID相反，BAD顯示優先結合抗-細胞凋亡成員，BCL-2和BCL-XL。儘管BAD BH3結構域顯示高親合力結合BCL-2，BAD BH3肽不能體外活化細胞色素c從線粒體釋放，表明BAD不是BAX/BAK的直接活化劑。過表達BCL-2的線粒體抗BID-誘導細胞色素c釋放，但與BAD的共同治療可恢復BID靈敏性。由BAD誘導的線粒體的細胞凋亡看來似乎是由於(1)BAX/BAK活化劑，例如BID和BID-樣的蛋白質從BCL-2/BCL-XL結合袋的置換(displacement)，或(2)BCL-2/BCL-XL結合袋被BAD選擇性佔據而阻止BID-樣蛋白質被抗-細胞凋亡蛋白質螯合分離。因此，已經出現兩種類型的「只有BH3-結構域」的蛋白質，BID-樣蛋白質直接活化線粒體的細胞凋亡，而BAD-樣蛋白質具有敏化線粒體為被多結構域抗-細胞凋亡蛋白質的結合袋佔據的BID-樣促-細胞凋亡的能力。
已經對鑑定或產生小分子以體外探測細胞凋亡蛋白質功能並且在體內特異控制細胞凋亡途徑的目的提出挑戰。高流通量篩選已經鑑定了抑制BAK BH3結構域與BCL-XL微摩爾親合力的相互作用的若干分子。除鑑定低親合力化合物的潛在缺陷之外，該技術在產生適合蛋白質家族個別成員的精細結合特異性的化合物控制板的其能力方面受到限制。控制細胞凋亡途徑的備選途徑來源於肽工程化，該技術使用非特異的肽序列來產生具有所需要三維結構的化合物。這種技術的一個應用涉及產生由用於通過破裂線粒體膜來誘導細胞死亡的非特異性肽序列組成的「促-細胞凋亡」α-螺旋。
α-螺旋是蛋白質的主要結構成份之一併且經常在蛋白質接觸界面被發現，其參與多種分子間的生物學識別事件。理論上，螺旋肽，例如BH3螺旋，可用於有選擇地幹擾或穩定蛋白質-蛋白質相互作用，由此控制生理學過程。然而，當從全長蛋白質的範圍內取出並被放入溶液中時，蛋白質內的生物學活化的螺旋基序一般具有很少的結構。因此，蛋白質肽片段已經由於二級結構螺旋的損失損害了其作為體內反應物的效力，其對蛋白水解的敏感性退化，並且不能透入完整細胞。儘管已經報導了共價螺旋穩定化的若干方法，大多數方法論涉及極化和/或不穩定的交聯(Phelan et al.1997 J.Am.Chem.Soc.119455；Leuc et al.2003 Proc.Nat』l.Acad.Sci.USA 10011273；Bracken et al.，1994 J.Am.Chem.Soc.1166432；Yan et al.2004 Bioorg.Med.Chem.141403)。隨後，Verdine及其同事開發了備選的基於置換的方法，其使用包含烷基栓鏈(tethers)的α，α-二取代的非天然胺基酸(Schafmeister et al.，2000 J.Am.Chem.Soc.1225891；Blackwell et al.1994 Angew Chem.Int.Ed.373281)。
概述本發明部分地基於具有至少兩個改變胺基酸(定義為「烴環鉤」(hydrocarbon stapling)方法)的穩定交聯的多肽可幫助構象地賦予該多肽天然二級結構的發現。例如，使傾向於具有α-螺旋二級結構的多肽交聯可約束該多肽至其天然的α-螺旋構象。被約束的二級結構可增加該多肽對蛋白水解切割的耐受性並且也增加疏水性。令人驚訝地，在有些情況下，該多肽可透過細胞膜(例如，通過能量-依賴的轉運機制，例如胞飲作用)。因此，在此描述的交聯多肽可相對於相應的未交聯多肽具有改善的生物活性。例如該交聯的多肽可包括BCL-2家族成員多肽的α-螺旋結構域(例如，BID-BH3結構域)，其可結合BAK/BAX和/或BCL-2/BCL-XL以在受試體中促進細胞凋亡。在有些情況下，該交聯的多肽可用於抑制細胞凋亡。可治療性地使用該在此所描述的交聯多肽，例如，在受試體中用於治療癌症。
在一個方面，本發明描述了通式(I)的多肽， 通式(I)其中；每個R1和R2獨立地是H、或C1至C10烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環烷基烷基、雜芳基烷基、或雜環基烷基；R3是烷基、烯基、炔基；[R4-K-R4]n；其每個用0-6個R5取代；R4是烷基、烯基、或炔基；R5是滷素、烷基、OR6、N(R6)2、SR6、SOR6、SO2R6、CO2R6、R6、螢光部分、或放射性同位素；K是O、S、SO、SO2、CO、CO2、CONR6、或 R6是H、烷基、或治療劑；n是1-4的整數；x是2-10的整數；每個y獨立地是0-100的整數；z是1-10的整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)；以及每個Xaa獨立地是胺基酸。
在一些實例中，該多肽結合BCL-2家族蛋白質。該多肽可結合抗-細胞凋亡蛋白質。該多肽可結合原-細胞凋亡蛋白質。該多肽可結合和活化BAX或BAK。在一些實例中，該多肽結合BH1、BH2和/或BH3結構域。
在一些實例中，該多肽活化細胞死亡，例如該多肽可觸發細胞色素c釋放並活化線粒體的細胞死亡。
在另外的實例中，該多肽可抑制細胞死亡。
在一些實例中，該多肽包括BH3結構域。
在一些實例中，x是2、3、或6。
在一些實例中，每個y獨立地是3和15之間的整數。
在一些實例中，R1和R2各自獨立地是H或C1-C6烷基。
在一些實例中，R1和R2各自獨立地是C1-C3烷基。
在一些實例中，R1和R2中的至少一個是甲基。例如R1和R2都是甲基。
在一些實例中，R3是烷基(例如，C8烷基)並且x是3。
在一些實例中，R3是C11烷基並且x是6。
在一些實例中，R3是烯基(例如，C8烯基)並且x是3。
在一些實例中，x是6並且R3是C11烯基。
在一些實例中，R3是直鏈烷基、烯基、或炔基。
在一些實例中，R3是-CH2-CH2-CH2-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-。
在某些實施方案中，兩個α，α二取代的立構中心都是R構型或S構型(例如，i，i+4交聯)，或一個立構中心是R而另一個是S(例如，i，i+7交聯)。因此，其中通式I描述為 C』和C」二取代的立構中心可以都是R構型或它們可以都是S構型，例如當X是3。當x是6時，C』二取代的立構中心可以是R構型而C」二取代的立構中心可以是S構型。
R3雙鍵可以是E或Z立體化學構型(configuration)。
在一些實例中，R3是[R4-K-R4]n；而R4是直鏈烷基、烯基、或炔基。
在一些實例中，該多肽包括與EDIIRNI*RHL*QVGDSNLDRSIW(SEQID NO112)的胺基酸序列至少大約60％(70％、80％、85％、90％、95％或98％)相同的胺基酸序列，其中*是栓鏈胺基酸。例如，可存在1、2、3、4、5個以上的胺基酸替換，例如保守替換。
該栓鏈(tether)可包括烷基、烯基、或炔基部分(例如，C5、C8或C11烷基或C5、C8或C11烯基，或C5、C8或C11炔基)。該栓鏈胺基酸可以是α二取代的(例如，C1-C3或甲基)。在一些實例中，該多肽可包括與EDIIRNIARHLA*VGD*NLDRSIW(SEQ ID NO110)的胺基酸序列至少大約60％(70％、80％、85％、90％、95％或98％)相同的胺基酸序列，其中*是栓鏈胺基酸。例如，可存在1、2、3、4、5個以上的胺基酸替換，例如保守替換。在一些實例中，多肽轉運通過細胞膜(例如，通過主動轉運或胞吞機制或通過被動轉運)。在某些實施方案中該多肽不包括Cys或Met。
在一些實施方案中，該多肽包括BCL-2或BCL-2樣結構域的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、或更多個連續胺基酸，例如BH3結構域或BH3-樣結構域，例如，圖5a、5b和28a-28h中任何所描繪的多肽。每個[Xaa]y是可獨立地包括BCL-2或BCL-2樣結構域的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或更多個連續胺基酸，例如BH3結構域或BH3-樣結構域，例如圖5a、5b和28a-28h中任何所描繪的多肽的肽。[Xaa]x是可包括BCL-2或BCL-2樣結構域的3或6個連續胺基酸，例如BH3結構域或BH3-樣結構域，例如圖5a、5b和28a-28h中任何所描繪的多肽的肽。
該多肽可包括BCL-2或BCL-2樣結構域的8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50個連續胺基酸，例如BH3結構域或BH3-樣結構域，例如圖5a、5b和28a-28h中任何所描繪的多肽(SEQ ID Nos)，其中被三個胺基酸(或六個胺基酸)分隔開的兩個胺基酸由通過R3連接的胺基酸取代物替代。因此，至少兩個胺基酸可被栓鏈胺基酸或栓鏈胺基酸取代物替代。因此，其中通式I描述為 y』和[Xaa]y」可各自包括來自相同或不同BCL-2或BCL-2樣結構域的連續多肽序列。
本發明描繪了包括BCL-2或BCL-2樣結構域的10(11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50或更多個)連續胺基酸，例如BH3結構域或BH3-樣結構域，例如圖5a、5b(SEQID Nos84-114)和28a-28h(SEQ ID Nos1-83)中任何所描繪的多肽的交聯多肽，其中被三個胺基酸(或六個胺基酸)分隔開的兩個胺基酸的α碳通過R3連接，兩個α碳中的一個被R1取代而另一個被R2取代，並且每個通過肽鍵連接至附加的胺基酸。
在一些實施方案中，該多肽具有細胞凋亡活性。
在一些實例中，該多肽也包括螢光部分或放射性同位素。
在一些實例中，該多肽包括23個胺基酸；R1和R2是甲基；R3是C8烷基，C11烷基，C8烯基，C11烯基，C8炔基，或C11炔基；以及x是2、3或6。
在一些實例中，該多肽包括親合標記、靶向部分、和/或生物素部分。
在一些實例中，該多肽是選自圖28a-h(SEQ ID NOS1-83)和5a-b(SEQID NOS84-114)中所描繪多肽的多肽。在另外的方面，本發明描繪了製備通式(III)的多肽的方法，包括提供通式(II)的多肽；以及 通式(II)用催化劑處理通式(II)的化合物以促進環閉合置換作用(methathesis)，由此提供通式(III)的化合物 通式(III)
其中每個R1和R2獨立地是H，烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環烷基烷基；雜芳基烷基；或雜環基烷基；每個n獨立地是1-15的整數；x是2、3或6每個y獨立地是0-100的整數；z是1-10的整數(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)；以及每個Xaa獨立地是胺基酸。
在一些實例中，該多肽結合BCL-2家族成員蛋白質。
在一些實例中，該催化劑是釕催化劑。
在一些實例中，該方法也包括在環閉合置換作用之後提供還原劑或氧化劑。
在一些實例中，該還原劑是H2或氧化劑是四氧化鋨(osmium tetroxide)。
在一些實例中，本發明描述了治療受試體的方法，包括將在此描述的任何化合物施用於該受試體。在一些實例中，該方法也包括施用附加的治療劑。
在一些實例中，本發明描述了在受試體中治療癌症的方法，包括將在此描述的任何化合物施用於該受試體。在一些實例中，該方法也包括施用附加的治療劑。
在一些實例中，本發明描述了在此所描述的化合物的文庫。
在一些實例中，本發明描述了鑑定用於促進細胞凋亡的候選化合物的方法，包括；提供線粒體；使該線粒體與在此所描述的化合物接觸；測量細胞色素c釋放；以及與缺少該化合物時的細胞色素c釋放比較在存在該化合物時的細胞色素c釋放，其中在存在通式1的化合物時細胞色素c釋放增加則鑑定該化合物為用於促進細胞凋亡的候選化合物。
在一些實例中，本發明描述了通式(IV)的多肽，
其中；每個R1和R2獨立地是H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環烷基烷基，雜芳基烷基，或雜環基烷基；R3是烷基、烯基、炔基；[R4-K-R4]n或天然存在的胺基酸側鏈；其中每個用0-6個R5取代；R4是烷基、烯基或炔基；；R5是滷素、烷基、OR6、N(R6)2、SR6、SOR6、SO2R6、CO2R6、R6、螢光部分或放射性同位素；K是O、S、SO、SO2、CO、CO2、CONR6、或 R6是H、烷基、或治療劑；R7是烷基、烯基、炔基；[R4-K-R4]n或天然存在的胺基酸側鏈；其中每個用0-6個R5取代；n是1-4的整數；x是2-10的整數；每個y獨立地是0-100的整數；z是1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)的整數；以及每個Xaa獨立地是胺基酸。
在一些實例中，本發明描述了通式(I)的多肽， 通式(I)其中；每個R1和R2獨立地是H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環烷基烷基，雜芳基烷基，或雜環基烷基；
R3是烷基、烯基、炔基；[R4-K-R4]n；其中每個用0-6個R5取代；R4是烷基、炔基(烯基)或炔基；；R5是滷素、烷基、OR6、N(R6)2、SR6、SOR6、SO2R6、CO2R6、R6、螢光部分或放射性同位素；K是O、S、SO、SO2、CO、CO2、CONR6、或 R6是H、烷基、或治療劑；n是1-4的整數；x是2-10的整數；每個y獨立地是0-100的整數；z是1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)的整數；以及每個Xaa獨立地是胺基酸；其中，通過圓二色光譜測定該多肽在含水溶液中具有至少5％的α螺旋度。
在一些實例中，通過圓二色光譜測定該多肽具有至少15％、至少35％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％的α螺旋度。
在一些實例中，本發明描述了通式(I)的多肽， 通式(I)其中；每個R1和R2獨立地是H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環烷基烷基，雜芳基烷基，或雜環基烷基；R3是烷基、烯基、炔基；[R4-K-R4]n；其中每個用0-6個R5取代；R4是烷基、炔基(烯基)或炔基；R5是滷素、烷基、OR6、N(R6)2、SR6、SOR6、SO2R6、CO2R6、R6、螢光部分或放射性同位素；K是O、S、SO、SO2、CO、CO2、CONR6、或 R6是H、烷基、或治療劑；n是1-4的整數；x是2-10的整數；
每個y獨立地是0-100的整數；z是1-10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)的整數；以及每個Xaa獨立地是胺基酸；其中通過圓二色光譜測定該多肽與通式(IV)的多肽相比具有至少1.25-倍的α螺旋增加 通式(IV)其中R1、R2、Xaa、x、y、和z都如對於上述通式(I)所定義的。
在一些實例中，通過圓二色光譜測定該多肽與通式(IV)的多肽相比具有至少1.5-倍、至少1.75-倍、至少2.0-倍、至少2.5-倍、至少3-倍、至少4-倍的α螺旋度增加。
在一些實例中，本發明描述了鑑定用於抑制細胞凋亡的候選化合物的方法，包括；提供線粒體；使該線粒體與在此所描述的化合物接觸；測量細胞色素c釋放；以及與缺少在此所描述的化合物時的細胞色素c釋放比較在存在在此所描述的化合物時的細胞色素c釋放，其中在存在在此所描述的化合物時細胞色素c釋放降低則鑑定在此所描述的該化合物為用於抑制細胞凋亡的候選化合物。
取代基的組合和本發明可預見的變化只是導致形成穩定化合物的那些。術語「穩定的」，如在此所使用的，是指具有足夠容許製造的穩定性和維持該化合物足夠時段的完整性以用於在此詳細描述的目的(例如，治療性施用於受試體或生成反應物以研究或發現體外或體內的生物學途徑)的化合物。
本發明的化合物可包含一個或多個不對稱中心，因此以消旋體和外消旋混合物、單對映異構體、單獨的非對映異構體和非對映體混合物的形式存在。這些化合物的所有這些同分異構形式明確地包括在本發明之內。本發明的化合物也可以多重互變異構形式出現，在這種情況下，本發明明確地包括在此描述的化合物的全部互變異構形式(例如，環狀系統的烷基化可導致在多重位點的烷基化，本發明明確地包括所有這些反應產物)。這些化合物的所有這些同分異構形式明確地包括在本發明之內。在此描述的化合物的所有晶體形式明確地包括在本發明之內。
術語「胺基酸」是指含有氨基和羧基的分子。適當的胺基酸不加限制地包括，在肽中發現的20個普遍天然存在的D-和L-異構體(例如，A，R、N、C、D、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V(如由一個字母縮寫所表示的))以及通過有機合成或其他代謝途徑製備的天然存在和非天然存在的胺基酸。
″非必需的″胺基酸殘基是可從多肽的野生型序列(例如，BH3結構域)被改變而不消除或基本上不改變其活性的殘基。″必需的″胺基酸殘基是可當從多肽的野生型序列被改變時，導致消除或基本上消除該多肽活性的殘基。
″保守胺基酸取代″是其中該胺基酸殘基被替換為具有相似側鏈的胺基酸殘基的取代。本領域中已經定義了具有相似側鏈的胺基酸殘基家族。這些家族包括具有鹼性側鏈(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈(例如，天冬氨酸、穀氨酸)、非電荷極化側鏈(例如，甘氨酸、天門冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支側鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側鏈(例如，酪氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的胺基酸。因此，在BH3多肽中預測的非必需胺基酸殘基例如優選被替換為來自相同側鏈家族的另一個胺基酸殘基。
符號 當用作分子結構的一部分時，是指單鍵或反式或順式雙鍵。
術語「胺基酸側鏈」是指附著於胺基酸中α-碳的部分。例如，丙氨酸的胺基酸側鏈是甲基，苯丙氨酸的胺基酸側鏈是苯基甲基，半胱氨酸的胺基酸側鏈是硫甲基，天冬氨酸的胺基酸側鏈是羧甲基，酪氨酸的胺基酸側鏈是4-羥苯甲基等。其他非天然存在的胺基酸側鏈也包括例如天然存在的胺基酸側鏈(例如，胺基酸代謝產物)或合成製備的胺基酸側鏈(例如，α二-取代胺基酸)。
術語多肽包括通過共價鍵(例如醯胺鍵)連接的兩個或多個天然存在或合成的胺基酸。如在此描述的多肽包括全長蛋白質(例如，充分加工的蛋白質)以及更短的胺基酸序列(例如，天然存在的蛋白質的片段或合成的多肽片段)。
術語「滷素」是指氟、氯、溴或碘的任何基團。術語「烷基」是指可能是直鏈或支鏈，包含指定數目的碳原子的碳氫鏈。例如，C1-C10表明該基團中可具有1至10個(包括在內的)碳原子。當缺少任何數值標識時，「烷基」是其中具有1至20個(包括在內的)碳原子的鏈(直的或分支的)。術語「亞烷基」是指二價的烷基(即，-R-)。
術語「烯基」是指可能是直鏈或支鏈，具有一個或多個碳-碳雙鍵的碳氫鏈。烯基部分包含指定數目的碳原子。例如，C2-C10表明該基團中可具有2至20個(包括在內的)碳原子。術語「更低烯基」是指C2-C8烯基鏈。當缺少任何數值標識時，「烯基」是其中具有2至20個(包括在內的)碳原子的鏈(直的或分支的)。
術語「炔基」是指可能是直鏈或支鏈，具有一個或多個碳-碳三鍵的碳氫鏈。炔基部分包含指定數目的碳原子。例如，C2-C10表明該基團中可具有2至20個(包括在內的)碳原子。術語「更低炔基」是指C2-C8炔基鏈。當缺少任何數值標識時，「炔基」是其中具有2至20個(包括在內的)碳原子的鏈(直的或分支的)。
術語「芳基」是指6-碳單環的或10-碳二環的芳香環系統，其中每個環的0、1、2、3、或4個原子可被取代基取代。芳基基團的實例包括苯基、萘基等。術語「芳基烷基」或術語「芳烷基」是指用芳基取代的烷基。術語「芳烷氧基」是指用芳基取代的烷氧基。
術語「環烷基」如在此所使用的，包括飽和和部分不飽和的環烴基團，其具有3至12個碳，優選3至8個碳，更優選3至6個碳，其中附加地環烷基基團可任選地被取代。優選的環烷基基團不加限制地包括，環丙基、環丁基、環戊烯基、環己基、環己烯基、環庚基和環辛基。
術語「雜芳基」是指芳香的5-8元單環的、8-12元二環的、或11-14元三環核系統(membered tricyclic ring system)，其如果是單環的具有1-3個雜原子，如果是二環的具有1-6個雜原子，或如果是三環的具有1-9個雜原子，所述的雜原子選自O、N、或S(例如，碳原子和如果是單環的、二環的、或三環的分別為1-3、1-6、或1-9個雜原子的N、O、或S)，其中每個環的0、1、2、3或4個原子可由取代基取代。雜芳基基團的實例包括吡啶基、呋喃基或furanyl、咪唑基、苯並咪唑基、嘧啶基、苯硫基或噻吩基、喹啉基、吲哚基、噻唑基等。術語「雜芳基烷基」或術語「雜芳烷基」是指用雜芳基取代的烷基。術語「雜芳基烷氧基」是指用雜芳基取代的烷氧基。
術語「雜環基」是指非芳香性的5-8元單環的、8-12元二環的、或11-14元三環核系統，其如果是單環的具有1-3個雜原子，如果是二環的具有1-6個雜原子，或如果是三環的具有1-9個雜原子，所述的雜原子選自O、N、或S(例如，碳原子和如果是單環的、二環的、或三環的分別為1-3、1-6、或1-9個雜原子的N、O、或S)，其中每個環的0、1、2或3個原子可被取代基取代。雜環基團的實例包括哌嗪基、吡咯烷基、二噁烷基、嗎啉基、四氫呋喃基等。
術語「取代基」是指在烷基、環烷基、芳基、雜環、或雜芳基基團上的該基團的任何原子進行「取代」的基團。合適的取代基沒有限制地包括滷素、羥基、巰基、氧代、硝基、滷烷基、烷基、烷芳基、芳基、芳代脂烷基、烷氧基、硫烷氧基、芳氧基、氨基、烷氧羰基、醯胺基、羧基、鏈烷磺醯基、烷基羰基和氰基基團。
本發明的一個或多個實施方案的詳述在下文的附圖和說明中闡述。本發明的其他特徵、目的和優點將由說明書和附圖以及權利要求所表現。
附圖簡述圖1描繪了具有一個或多個保守的BCL-2同源(BH)結構域的BCL-2家族成員。
圖2描繪了BID-介導的線粒體細胞凋亡的模型。TNF-RI/Fas誘導移位至線粒體並觸發細胞凋亡的BID切割。
圖3描繪了用於生成包含烯鍵側鏈的手性α，α-二取代的非天然胺基酸的合成策略。
圖4a描繪了某些非天然胺基酸的化學結構。
圖4b描繪了通過鏈烯置換合成胺基酸在i和i+4以及i+7位的交聯。
圖5a描繪了通過非天然胺基酸的取代和鏈烯置換產生的SAHB3化合物(分別為SEQ ID NOs 84-108)。
圖5b描繪了用於在此所描述的研究的某些交聯的肽(分別為SEQ IDNOs 109-114)。
圖6描繪的研究結果顯示所選擇的BCL-2家族成員的BH3結構域α-螺旋的程度。
圖7描繪的研究結果顯示與未改變的BID BH3肽相比，化學交聯增強SAHB3BID化合物的α螺旋。
圖8描繪的研究結果顯示SAHB3BIDA多肽的gly→glu突變體與包含相應gly的多肽顯示相似的螺旋接觸。
圖9描繪的研究結果顯示23-mer SABH3BIDB(「SAHB3b」)至16-mer的截短導致α-螺旋的損失。
圖10a描繪的研究結果顯示體外胰蛋白酶蛋白水解的動力學被SABH3BIDA交聯延遲3.5-倍。
圖10b描繪了肽的自體內(Ex vivo)血清穩定性研究的結果，證明與未改變的肽相比交聯肽的半衰期增加10倍。
圖10c描繪的體內試驗結果顯示與BID BH3肽相比SAHB3BIDA隨時間維持更高的血清濃度。
圖11a描繪的研究結果顯示SAHB3BID肽在螢光偏振競爭結合分析中顯示以高親合力結合GST-BCL2。
圖11b描繪的研究結果顯示SAHB3BIDA和B的陰性對照Gly至Glu的點突變是相對弱的結合物。
圖11c描繪的研究結果顯示SAHB3BIDB從23-mer至16-mer的截短導致Ki降低大於6倍，與截短化合物的螺旋百分比顯著降低相一致。
圖11d描繪了BCL-2螢光偏振直接結合分析的結果，證明SAHB3BIDA與未改變的BID BH3相比結合親和力增強大於6倍。
圖11e描繪了BAX螢光偏振直接結合分析的結果證明交聯的摻入導致SAHB3BIDA和SAHB3BID(G→E)A與多結構域促-細胞凋亡BCL-2家族成員的可測量結合。未改變的BID BH3肽顯示沒有結合。
圖11f描繪了證明SAHB3BIDA結合時15N-標記的BCL-XL中構象變化的HSQC光譜，這與BID BH3結合時所觀察到的相似，證實SAHB3BIDA結合BCL-XL的限定的疏水袋。
圖12a和12b描繪的研究結果顯示了從純化的小鼠肝線粒體通過SAHB3BID化合物釋放細胞色素c的百分比。
圖13a和13b描繪的研究結果顯示SAHB3BIDA-和SAHB3BIDB-誘導的細胞色素釋放比未改變的肽更快和更有效。
圖14描繪的研究結果顯示SAHB3BIDA的Gly至Glu突變體有選擇地消除Bak-依賴的細胞色素釋放，強調了圖13中所示的SAHB3BIDA-誘導細胞色素c釋放作用的特異性。
圖15描繪的研究結果顯示Jurkat T-細胞白血病細胞在暴露於FITC-BIDBH3和FITC-BID螺旋6時，缺乏螢光標記，而Jurkat T-細胞白血病細胞在暴露於FITC-SAHB3BID時指示陽性FITC信號，並且這些結果不受到細胞胰蛋白酶處理的顯著改變。
圖16a描繪的研究結果顯示暴露於交聯肽FITC-SAHB3BIDA和SAHB3BID(G→E)A的Jurkat T-細胞指示螢光標記，而暴露於未改變的BH3肽FITC-BID和FITC-BID(G→S)的Jurkat T-細胞沒有指示。
圖16b描繪的研究結果顯示如FACS分析所評估的，FITC-SAHB3BIDA的細胞輸入在37℃是時間依賴的。
圖17a和17b描繪了顯示用FITC肽在4℃和37℃處理的Jurkat T-細胞的研究結果。圖17a顯示FITC-BID BH3不在任何溫度標記細胞，而FITC-SAHB3BIDA在37℃而非4℃標記細胞。圖17b顯示FITC-BID螺旋6以不依賴溫度的方式標記並且也透化細胞。然而相比之下，FITC-SAHB3BIDA只在37℃標記細胞並且沒有細胞透化，這與通過胞吞途徑的SAHB3BIDA的主動轉運相一致。
圖17c描繪的研究結果顯示當用FITC-肽處理後，在有或沒有疊氮化鈉和2-脫氧葡萄糖預培養時，Jurkat T-細胞顯示在FITC-BID BH3多肽的任何狀況下沒有標記。在疊氮化鈉和2-脫氧葡萄糖條件下該細胞對於FITC-SAHB3BIDA顯示標記減少，並且在兩個條件下使用FITC-BID螺旋6都顯示有標記。這些結果與對SAHB3BID轉運的ATP-依賴的細胞攝取相一致(例如，胞吞途徑)。
圖18描繪的研究結果顯示FITC-SAHB3BIDA攝取不受到氨基多糖肝素細胞處理的抑制，表明了FITC-SAHB3BIDA與其他的細胞穿透肽(CPPs)，例如HIV TAT和Antennapedia(控制觸角基因)肽相比其結合和攝取機制之間的區別。
圖19描繪的研究結果顯示FITC-SAHB3BIDA化合物顯示了Jurkat T-細胞中囊泡狀分布的細胞質標記，而質膜螢光不明顯。另一方面，FITC-BIDBH3顯示沒有細胞的細胞標記並且FITC-BID螺旋6廣泛地標記細胞並導致顯著的結構破壞。
圖20描繪了顯示Jurkat T-細胞中FITC-SAHB3BIDA與線粒體膜標記的共標記的研究結果。
圖21a和圖21b描繪的研究結果顯示FITC-SAHB3BIDA在具有葡聚糖標記的內涵體而不是轉移標記的內涵體的BCL-2過表達的活的Jurkat T-細胞中共標記，表明FITC-SAHB3BIDA通過液相胞飲作用被運入細胞。
圖21c描繪的研究結果顯示處理後24小時，FITC-SAHB3BIDA在具有由Mito Tracker標記的線粒體的活細胞中共標記。
圖22a、22b和22c描繪的研究結果顯示SAHB3BIDA在測試的白血病細胞系中以劑量應答的方式觸發代謝停滯，而BID BH3和SAHB3BID(G→E)A在這個劑量範圍中基本上無效。
圖23描繪的研究結果顯示SAHB3BIDA和SAHB3BIDB在10μM誘導達到50％的完整Jurka T-細胞的細胞凋亡，該效應受到BCL-2過表達的特異抑制(黑條)。根據與非處理對照的比較，未改變的BID BH3肽和gly至glu的突變體沒有影響。
圖24描繪了顯示用SAHB3BIDA、SAHB3BID(G→E)和SAHB3BID(G→S)A處理的Jurkat BCL-2過表達細胞的劑量應答的研究結果。儘管SAHB3BIDA和SAHB3BID(G→S)A可在這個劑量範圍內克服細胞凋亡的BCL-2抑制，但gly至glu的點突變沒有影響。
圖25描繪的研究結果顯示SAHB3BIDA處理的白血病細胞系REH、MV4；11和SEMK2經歷特異的細胞凋亡誘導，而gly至glu的點突變SAHB3BID(G→E)A對細胞沒有影響。
圖26a和26b描繪的研究結果顯示SAHB3BIDA和SAHB3BID(G→S)A抑制NOD-SCID小鼠中SEMK2白血病的生長，證明SAHB3BID(G→S)A比SAHB3BIDA更為有效。
圖27a和FIG.27b描繪的研究結果顯示SAHB3BIDA相對於載體鈍化了NOD-SCID小鼠中SEMK2白血病的進展。圖27a中註明了劑量反應效果。
圖27c、27d、27e描繪的研究結果顯示SAHB3BIDA相對於載體抑制SCID beige小鼠中RS4；11白血病的生長，與載體對照象比在SAHB3BIDA-處理的小鼠中，具有統計上顯著的存活延長。
圖27f描繪的動物研究結果再次顯示與被證明白血病有進展的SAHB3HID(G→E)A-和載體-處理的小鼠相比，SAHB3BIDA導致SCID beige小鼠中RS4；11白血病的退化。
圖28a-28h描繪了受交聯作用的BCL-2家族成員蛋白質的多種α螺旋結構域(分別為SEQ ID NOs 1-83)的實施例。
發明詳述本發明部分基於BCL-2家族蛋白質的交聯α螺旋結構域多肽相對於他們的未交聯配對物(例如，增加的疏水性、對蛋白水解切割的耐受性、結合親合力、體外和體內生物活性)具有改善的藥理學性質的發現。此外，已經令人驚訝地發現交聯的多肽可通過溫度-和能量-依賴的運輸機制(例如，胞吞作用、特異的液相胞飲作用)穿透細胞膜。該多肽包括兩個非天然胺基酸之間的栓鏈，其中該栓鏈顯著增強該多肽的α螺旋二級結構。一般地，該栓鏈延伸跨越一個或兩個螺旋迴轉(turn)的長度(即，大約3.4或大約7個胺基酸)。因此，位於i和i+3；i和i+4；或i和i+7的胺基酸是用於化學修飾和交聯的理想候選物。因此，例如，當肽具有序列...Xaa1，Xaa2，Xaa3，Xaa4，Xaa5，Xaa6，Xaa7，Xaa8，Xaa9...，在Xaa1和Xaa4之間，或Xaa1和Xaa5之間，或Xaa1和Xaa8之間的交聯與Xaa2和Xaa5之間，或Xaa2和Xaa6之間，或Xaa2和Xaa9之間等的交聯一樣有用。此外，通過整合兩組交聯，一組位於Xaa1和Xaa5之間而另一組位於Xaa9和Xaa13之間來製備模型多肽。通過雙鍵置換反應的精細立體化學控制獲得雙交聯。因此，本發明包括在多肽序列內整合一個以上交聯以進一步穩定該序列或促進較長多肽伸展的穩定化。如果該多肽太長而不能容易地合而為一(in one part)，可通過稱為天然化學綁紮的技術使獨立合成的交聯肽連接在一起。(Bang，et al.，J.Am.ChemSoc.1261377).
該新的交聯多肽可用於例如模擬或研究具有一個或多個α-螺旋結構域的蛋白質或多肽。其中家族成員具有至少一個α螺旋結構域的一個家族蛋白質是BCL-2家族的蛋白質。這些蛋白質涉及細胞凋亡途徑。一些BCL-2家族成員具有促-細胞凋亡功能，其它的具有抗-細胞凋亡功能，另外一些隨細胞狀況變化而變化功能。因此，需要製備模擬BCL-2家族成員的一個或多個基序的穩定多肽來調節各種BCL-2相關活性。
SAHB3BID化合物系列的化學合成根據圖3中的圖解合成包含不同長度烯族側鏈的α，α-二取代的非天然胺基酸(Williams et a1.，1991 J.Am.Chem.Soc.1139276；Schafmeister et al.，2000 J.Am.Chem Soc.1225891)。通過用相應合成的胺基酸替換兩個或四個天然存在的胺基酸設計化學交聯的BID BH3肽(圖4a)。在離散的位置，即「i，和i+4位」或「i，和i+7位」進行取代作用，其通過將活性殘基置於α-螺旋的相同平面上來促進交聯化學(圖4b)。細胞凋亡蛋白質中高度保守的胺基酸，除根據X-射線結晶學和NMR研究發現在蛋白質-蛋白質相互作用中重要的那些序列外，(Muchmore et al.，1996 Nature 381335；Sattler et al.，1997 Science 275983)，在某些環境中沒有被特異替換，保守的胺基酸可被其他胺基酸(例如，合成的非天然存在的胺基酸)替代以增強活性(這個效應可在在此所描述的SAHB3BID突變體中觀察到)。通過固相肽合成，然後是合成胺基酸通過其含有鏈烯的側鏈的基於鏈烯置換的交聯來產生SAHB3BID化合物。圖5a中說明了產生的SAHB3BID化合物的變化。也構建整合入已知改變BID功能的特異突變(Wang et al.1996 Genes Dev.102859)的SAHB3BID(SAHBA)變體以用作生物學實驗中的陰性對照(圖5a)。進一步用異硫氰酸螢光素(FITC)或生物素共軛的-賴氨酸衍生化所選擇化合物的氨基末端以產生標記的SAHB3BID化合物分別用於細胞透性研究和生化分析(圖5a)。在幾個合成中，將C-末端色氨酸加入序列用作純化和濃度測定目的的UV標記；幾個肽中的N-末端穀氨酸被消除以增加該化合物可能促進細胞穿透的總pI(參見下文)。容易地將該置換方法應用於產生備選的SAHB3s，包括SAHB3BAD和SAHB3BIM(圖5a)。
非天然胺基酸(5-碳烯族胺基酸的R和S對映異構體和8-碳烯族胺基酸的S對映異構體)通過核磁共振(NMR)光譜學(Varian Mercury 400)和質譜分析法(Micromass LCT)表徵。人工地或在自動肽合成儀上(AppliedBiosystems，模型433A)，利用固相條件，rink醯胺AM樹脂(Novabiochem)，和Fmoc主鏈保護基團化學進行肽合成。對於天然Fmoc-保護的胺基酸(Novabiochem)的偶聯，使用10等量的胺基酸和1∶1∶2摩爾比的偶聯反應物HBTU/HOBt(Novabiochem)/DIEA。非天然的胺基酸(4當量)與1∶1∶2摩爾比的HATU(Applied Biosystems)/HOBt/DIEA偶聯。在固相中利用溶於脫氣二氯甲烷的10mM Grubbs催化劑(Blackewell et al.1994上文)(StremChemicals)並在室溫下反應2小時來進行鏈烯置換。進一步用b-丙氨酸和異硫氰酸螢光素(FITC[Sigma]/DMF/DIEA)衍生化所選擇化合物的氨基末端以產生螢光標記化合物。摻入C-末端色氨酸作為用於純化和濃度測定目的的UV標籤；也合成沒有C-末端色氨酸和N-末端穀氨酸的SAHBA化合物，進行後者的修飾以增加該分子的總pI。通過三氟乙酸-介導的去保護和切割、乙醚沉澱產生粗製品，以及反相C18柱(Varian)上的高效液相色譜法(HPLC)(Varian ProStar)以產生純化合物來獲得置換化合物的分離。通過LC/MS質譜分析法(與Agilent 1100HPLC系統對接的Micromass LCT)和胺基酸分析(Applied Biosystems，模型420A)確認純產品的化學組成。
圖5b大略地描繪了圖5a中的肽的子集，包括烯族胺基酸的立體化學(5-碳烯族胺基酸的R和S對映異構體和8-碳烯族胺基酸的S對映異構體)。
SAHB3BID化合物顯示增強的α-螺旋我們研究了促-細胞凋亡BH3結構域的螺旋百分比，並且發現這些未改變的肽在溶液中顯著地是隨機盤繞的，其α-螺旋含量全部在25％下(圖6)。簡要地，化合物溶於含水的50mM磷酸鉀溶液pH 7至濃度為25-50mM。在Jasco J-710分光偏振儀上於20℃，利用下列標準測量參數獲得圓二色性譜波長，190-260nm；分級解析度，0.5nm；速度，20nm/sec；累加，10；反應，1秒；帶寬，1nm；徑長，0.1cm。通過將模型螺旋十肽的平均剩餘橢圓率[]222obs除以所報導的[]計算每個肽的α-螺旋含量(Yang et al.1986 MethodsEnzymol.130208))。
在所有情況下，化學交聯增加了BID’s BH3結構域的α-螺旋百分比，其中SAHB3BIDA和B獲得大於5-倍的增強(圖7)。SAHB3BID(G→E)A，SAHB3BIDA的陰性對照Gly至Glu點突變體，顯示與SAHB3BIDA相似的螺旋含量(圖8)。因此，全部的-烴交聯可將在含水溶液中基本上隨機捲曲的細胞凋亡肽轉換成結構為顯著α-螺旋的肽。令人感興趣的是，通過當SAHB3BIDB 23-mer被截短為16-mer，SAHB3BID(tr)B時觀察到的螺旋減少強調了第四個螺旋迴轉在穩定BID BH3肽中的重要性(圖9)。
全部的-烴交聯增加SAHB3BID化合物的蛋白酶耐受性肽骨架的醯胺鍵對蛋白酶水解敏感，由此使得肽化合物易受體內快速降解損傷。然而肽螺旋形成隱藏醯胺骨架並因此保護其免於蛋白水解切割。SAHB3BIDA經受體外胰蛋白酶蛋白水解以評估與未改變的BID BH3肽相比任何降解速率的變化。用胰蛋白酶瓊脂糖孵育SAHB3BIDA和未改變的肽，通過離心作用在不同時間點猝滅反應，隨後進行HPLC注射通過在280nm處的紫外線吸收測定剩餘的底物。簡要地，用胰蛋白酶瓊脂糖(Pierce)(S/E～125)孵育BID BH3和SAHB3BIDA化合物(5mcg)0、10、20、90和180分鐘。通過以高速桌面離心作用猝滅反應；通過基於HPLC的220nm處峰值檢測定量分離上清液中的剩餘底物。蛋白水解反應顯示了根據ln[S]對時間作圖(k＝-1×斜率)測定的一級動力學和速率常量，k(圖10a)。該實驗一式三份地進行，證明與未改變的肽相比SAHB3BIDA的胰蛋白酶耐受性增強3.5-倍。因此，通過將其隱藏在α-螺旋的核心胰蛋白酶-敏感的醯胺鍵的增強保護提供了更穩定的肽化合物，並且因此可使得這種化合物在血清中特別穩定。
對於自體內血清穩定性研究，用新鮮的小鼠血清(20mL)在37℃孵育FITC-共軛的肽BID BH3和SAHB3BIDA(2.5mcg)0、1、2、4、8和24小時。通過在液氮中快速冷凍血清樣品、凍幹、在含有0.1％三氟乙酸的50∶50乙腈/水中萃取，然後是利用設置在495/530nm處的激發/發射螢光檢測的基於HPLC的定量來確定完整FITC-化合物的水平。這個分析的結果顯示在圖10b中。
為了研究SAHB3BIDA的體內穩定性，將10mg/kg FITC-共軛的BID BH3肽和SAHB3BIDA注射到NOD-SCID小鼠中，並且在注射後0、1、4和22小時採取血液樣本。然後測量25μL新鮮血清中完整FITC-化合物的水平。這個分析的結果描繪在圖10c中，顯示經過22小時時段SAHB3BIDA可容易地被檢測出來，其在22小時仍具有13％的可測量度。相比之下，注射後一個小時只可檢測出12％的BID BH3。
SAHB3BID化合物保持高親合力的抗-細胞凋亡結合全部的烴交聯被有選擇地置於BID BH3兩親螺旋的電荷平面以免幹擾多結構域細胞凋亡蛋白質的結合袋和BID BH3螺旋疏水殘基之間的決定性的相互作用。進行螢光偏振競爭結合實驗以評估SAHB3BID化合物在與FITC-標記的未改變BID BH3肽競爭結合GST-BCL-2中的效力。全部的SAHB3BID化合物證明高親合力結合GST-BCL2，SAHB3BIDA和B兩個化合物具有最大的螺旋百分比，同樣顯示最高的親合力結合(圖11a)。值得注意的，SAHB3BIDA和B的Gly至Glu突變體正如同從上述研究所預測的消除了高親合力結合(圖11b)。我們另外測定SAHB3BIDA的Gly至Ser突變體在這個分析中消除了BCL-2結合(資料未顯示)。23-mer SAHB3BIDB至16-mer的截短導致BCL-2結合親合力的損失，這與如上所述α-螺旋的減少相符合(圖11c)。
FITC-標記的BID BH3肽以220nM的KD結合BCL-2，並且一旦結合，以838nM的IC50發生經未標記BID BH3的這種相互作用的易位。這支持了其中BH3結合BCL-2觸發總的構象變化促成相互作用，導致需要過量的未標記肽來置換預結合的FITC-標記的BID BH3的模型。我們已經進一步表明BAD BH3結構域對BCL-2結合具有41nM的增強KD，而且它可以173nM的IC50置換預結合的FITC-BID BH3。在類似的實驗中，發現SAHB3BIDA以62nM的IC50從BCL-2置換FITC-BID BH3，與未改變的BID BH3肽相比反映出易位效力有大於13-倍的增加。這些數據證實SAHB3BIDA與未改變的BH3肽相比以增強的親合力結合BCL-2，並且表明通過化學交聯預組成的α-螺旋結構為靶結合提供動力學益處。
通過螢光偏振的直接結合分析證明將交聯摻入BID BH3肽導致SAHB3BIDA與未改變的BID BH3肽相比對BCL-2，抗-細胞凋亡多結構域蛋白質和BAX，促-細胞凋亡多結構域蛋白質的結合親合力都增強(圖11d和lle)。直接的BCL-2螢光偏振結合分析證明SAHB3BIDA的BCL-2結合親合力(KD，38.8nm)與未改變的BID BH3肽(KD，269nM)相比增強6倍(圖1ld)。Gly至Glu的突變體，SAHBA(G→E)(KD，483nM)消除了高親合力結合併且用作有用的對照(圖11d)。簡要地，使包含編碼C-末端缺失的GST-BCL-2的質粒的大腸桿菌BL21(DE3)培養在包含氨苄青黴素的LuriaBroth中並且用0.1mM IPTG誘導。將細菌顆粒重懸浮在裂解緩衝液中(在PBS中的1mg/ml溶菌酶，1％Triton X-100，0.1mg/ml PMSF，2μg/ml抑蛋白酶肽(aprotinin)，2μg/ml抑蛋白酶醛肽(leupeptine)，1μg/ml抑胃肽(pepstatin)A)並且超聲處理。在20,000×g離心20min後，將上清液施加到穀胱甘肽-瓊脂糖珠的柱子上(Sigma)。用PBS洗滌珠子並且用50mM穀胱甘肽，50mM Tris-HCl(pH 8.0)處理以洗提蛋白質，然後對結合分析緩衝液(140mM NaCl，50mM Tris-HCl[pH 7.4])透析。在結合緩衝液中在室溫下氟化螢光素的化合物(25nM)與GST-BCL2(25nM-1000nM)孵育。通過Perkin-Elmer LS50B發光分光光度計上的螢光偏振測量結合活性。利用Prism軟體(Graphpad)通過非線性回歸分析確定KD值。如先前描述(Suzukiet al，Cell，103645)製備全長的BAX蛋白質並如上所述進行螢光偏振分析。
SAHB3BIDA結合BCL-XL為了確定SAHB3BIDA是否特異地與抗細胞凋亡多結構域蛋白質的限定結合溝槽相互作用，記錄SAHB3BIDA加入前後15N-標記的BCL-XL的二維15N/1H雜環單量子相關(HSQC)光譜並且與相應的BID BH3/15N-BCL-XL光譜相比較。簡要地，使包含編碼C-末端缺失的BCL-XL的質粒的大腸桿菌BL21(DE3)培養在包含15NH4Cl(Cambridge Isotope Laboratories)M9-基本培養基中以相同地產生15N-標記的蛋白質。從細菌分離重組蛋白質。產生未標記的SAHB3BIDA和BID BH3肽並且如上所述進行純化。在50mM磷酸鉀(pH 7)，50mM氯化鈉中製備0.1mM的下列1∶1複合物，在D2O或H2O/D2O中的5％DMSO(95∶5)15N-BCL-XL/未標記的BID BH3，15N--XL/未標記的SAHB3BIDA。對於兩個複合物記錄二維15N/1H雜環單量子光譜並且分析配體結合共振中的變化。
HSQC光譜的總體相似度表明加入SAHB3BIDA後BCL-XL中存在的結構變化幾乎與BID BH3肽中所觀察到的相同(圖11f)。
SAHB3BID化合物觸發快速和特異的線粒體細胞色素c釋放為了評估SAHB3BID化合物的體外生物活性，利用純化的小鼠肝線粒體進行細胞色素c釋放分析。使線粒體(0.5mg/mL)與1μM和100nM的SAHB3BID化合物孵育40分鐘，然後分離上清液和線粒體部分並經受細胞色素c ELISA分析。對於每個樣品從總釋放量減去背景的細胞色素c釋放(10-15％)，測定實際的細胞色素c釋放百分比(圖12)。對從Bak-/-小鼠分離的小鼠肝線粒體同時進行相同的實驗，其應答BID-BH3活化而不釋放線粒體細胞色素c；因此將來自BAK-/-線粒體的數據用作應答SAHB3BID處理的BAK-介導的細胞色素c釋放的陰性對照。在各個情況下，除雙交聯的SAHB3BIDE(其可以缺乏對生物活性決定性的胺基酸或，在這種情況下，被二交聯過度束縛)外，與未改變的肽相比存在應答1μM SAHB3BID化合物的大約兩倍的細胞色素c釋放(圖12a)。在使用SAHB3BIDA、B以及特別是D的這個劑量觀察到BAK-非依賴的細胞色素c釋放。儘管這種細胞色素c釋放可表現為α-螺旋非特異性的膜擾動作用，SAHB3BID-誘導的、細胞色素c釋放的BAK-非依賴成分的作用值得進一步研究。有趣地，誘導最顯著水平的BAK-非依賴的細胞色素c釋放的SAHB3BID化合物，SAHB3BIDD，也是最疏水性的SAHB3BID化合物；與以50-75％乙腈洗提的另外的SAHB3BID化合物相比，從反相C18柱以95％/5％水洗提SAHB3BIDD。具有缺陷的BH3結構域的BID突變體可促進BAK-非依賴的細胞色素c轉移(Scorrano et al，Dev Cell，255)，並且高度疏水性的BID螺旋6已經與這種活性相關(L.Scorrano，S.J.Korsmeyer，結果未公開)。似乎合理的是SAHB3BIDD顯示通過模擬BID螺旋3和6特徵的BAK依賴的和非依賴的細胞色素c釋放。低十倍劑量的SAHB3BIDA和B保持選擇性的BAK-依賴的細胞色素c釋放活性(圖12b)。SAHB3BIDB的效力，與最大限度活化的肉豆蔻醯化的BID蛋白質比較特別有利，後者在30nM的劑量在這些條件下釋放大約65％的細胞色素c。
大多數活化的SAHB3BID化合物，A和B進一步受到動力學研究以確定螺旋預組成與未改變的肽相比可觸發更快速的細胞色素c釋放。類似於上述的實驗，使來自野生型和Bak-/-小鼠的小鼠肝線粒體暴露於不同濃度的化合物並且在10和40分鐘間隔分析細胞色素c釋放。儘管在10分鐘未改變的肽在測試的最高劑量(1μM)導致小於10％的釋放，在這個時間點的僅僅400nM以下具有的EC50釋放為幾乎最大的1μM細胞色素釋放(圖13a)。同樣地，SAHB3BIDA在10分鐘時間間隔觸發顯著的細胞色素c釋放。對於未改變的肽在40分鐘的細胞色素c釋放EC50是2.9μM，而對於SAHB3BIDA和B分別是310和110nM(圖13b)。因此，SAHB3BIDA和B在40分鐘時間點顯示10-25倍增強的細胞色素c釋放活性。儘管BAK-依賴的細胞色素c釋放隨時間增加，BAK-非依賴的釋放在10和40分鐘時間點之間不變化，表明這個明顯的釋放發生很早並且在10分鐘內最大限度地獲得這個釋放。值得注意的，SAHB3BIDA的陰性對照Gly至Glu點突變體，SAHB3BID(G→E)A，只產生Bak-非依賴的細胞色素c釋放，證實通過Bak-依賴的線粒體細胞凋亡途徑的SAHB3BIDA功能(圖14)。總之，這些細胞色素c釋放數據表明SAHB3BIDA和B能夠特異地誘導BAK-依賴的細胞色素c釋放，其與未改變的肽相比具有顯著增強的效力和動力學。
SAHB3BID化合物穿透完整細胞使螢光素-衍生化的SAHB3BID化合物、BID BH3肽和BID螺旋6肽與培養4-24小時的Jurkat T-細胞白血病細胞一起培養，並且隨後進行FACS分揀來確定白血病細胞的標記百分比。為了避免由細胞-表面結合化合物引起的混淆，徹底洗滌JurkaT-細胞並且根據最近的報導經受胰蛋白酶過消化。對於測試的每個化合物，胰蛋白酶消化後在FITC信號圖譜中沒有顯著的變化，表明就這些肽來說，很少至沒有FITC-標記的化合物是表面結合的(圖15)。儘管BID BH3-處理的細胞是FITC-陰性的，如通過FITC信號的右傾(rightward)轉移所表明的，FITC-SAHB3BIDA-和FITC-SAHB3BID(G→E)A-處理的細胞是FITC-陽性的(圖16a)。這些細胞透性研究中FITC-SAHB3BIDA和FITC-SAHB3BID(G→E)A的相似圖譜是特別重要的，給出了點突變體化合物作為生物學實驗中陰性對照的用途。使用BID螺旋6，細胞可滲透和膜擾亂的肽在這些實驗中作為FITC-標記的陽性對照。
令人驚訝地，發現FITC-SAHB3BIDA看來似乎通過胞吞作用，溫度-和能量-依賴的運輸途徑進入細胞。FITC-SAHB3BIDA的細胞輸入以時間依賴的方式發生(圖16b)。當通過在4℃(圖17a，17b)或通過用能量毒物疊氮化鈉和2-脫氧葡萄糖(圖17c)處理進行實驗抑制細胞胞吞作用時，分別抑制細胞標記或顯著減弱細胞標記。值得注意的，通過FITC-SAHB3BIDA在37℃標記的JurkaT-細胞是碘化丙啶(PI)陰性的，證實交聯的肽不僅僅起透化試劑的作用(圖17b)；相比之下，FITC-BID螺旋6如PI陽性的程度所證明的在兩個溫度都容易有效地穿透透化細胞(圖17b)。這些數據支持SAHB3BID化合物進入的內吞機制，這與引證細胞表面粘附然後是胞吞作用來作為其他穿透細胞的肽(CPPs)，例如HIV轉錄反式作用子(TAT)機制的最近報導相符。儘管強鹼性的CPPs，例如TAT和Antennapedia，被認為通過粘附至帶負電荷的氨基多糖而集結在細胞表面，SAHB3BIDA輸入沒有受到肝素的劑量-應答方式的抑制(圖18)。SAHB3BID兩親的α-螺旋的生物物理學性質可通過靜電和/或類脂膜相互作用促進不同的細胞接觸。
為了確定SAHB3BIDA的胞內定位，使用共聚焦顯微術實驗。如上所述與FITC-標記的化合物一起培養Jurkat T-細胞白血病細胞，或在4小時用血清替換，然後在37℃另外培養16小時，用PBS洗滌兩次後在超冷凍(superfrost plus)的正載玻片(Fisher)上，以600RPM細胞旋轉5分鐘。然後將細胞固定在4％多聚甲醛中，用PBS洗滌，與TO-PRO-3碘化物(100nM)(Molecular Probes)一起培養至復染核，用Vectashield固定介質(Vector)處理，然後通過共聚焦顯微術成像(BioRad 1024)。對於雙標記實驗，與TOM20的第一抗體一起另外培養固定細胞，並在TOPRO-3復染前與若丹明-共軛的第二抗體培養。對於有生命的共聚焦顯微術，用FITC-SAHBA(10μM)和MitoTracker(100nM，Molecular Probes)，四甲基若丹明異硫氰酸鹽(TRITC)-葡聚糖4.4kD或70kD(25mcg/mL，Molecular Probes)，或Alexa Fluor 594-轉鐵蛋白(25mcg/mL，Molecular Probes)進行JurkaT-細胞的雙標記4小時(葡聚糖和轉鐵蛋白)或24小時(Mito Tracker)。由於光漂白的限制，使用過表達BCL-2的Jurka細胞用於有生命的(live)共聚焦顯微術以使FITC成像最優化。線粒體的FITC-SAHBA標記在BCL-2過表達的Jurkats(符合SAHB活性的機制)中是更明亮的，因此利用這些細胞捕獲圖像更為便利。洗滌處理的Jurkats兩次，然後重懸在PBS中並且用BioRad1024(Beth Israel/Deaconess Center for Advanced Microscopy)或ZeissLSM510雷射掃描共聚焦顯微鏡(Children’s Hospital Boston Imaging Core)分析溼潤的固定制品。
在固定切片中，SAHB3BIDA化合物定位於白血病細胞的細胞質邊緣，沒有質膜或表面螢光昭顯；螢光的囊泡狀圖案表明細胞器特異的定位(圖19a和19b)。與FACS數據一致，用FITC-BID BH3處理的JurkaT-細胞顯示沒有螢光標記(圖19c)。儘管FITC-SAHB3BIDA-處理的細胞顯示選擇性的胞內螢光並且維持它們的細胞結構(圖19a)，FITC-BID螺旋6-處理的細胞被廣泛標記並且證明具有破裂的細胞形態(圖19d)。利用FITC-SAHB3BIDA和線粒體膜蛋白質Tom20的抗體的共區域化研究證明SAHB3BIDA螢光與線粒體，SAHB3BID的分子靶物的預期位點廣泛重疊(圖20)。
SAHB處理後4hr進行活細胞成像證明FITC-SAHBA與葡聚糖(4.4kD或70kD)-標記吞飲泡(圖21a)，而不是轉鐵蛋白-標記的吞飲泡(圖21b)的最初共區域化，這與通過液相胞飲作用(手稿參考27)的細胞攝取，對TAT和Antp肽(手稿參考28)所確定的內吞途徑一致。在24hr時間點，胞內的FITC-SAHBA顯示在活細胞中與MitoTracker-標記的線粒體共區域化增加(圖21c)，這與在固定細胞中利用Tom20抗體，線粒體外膜蛋白質所觀察到的線粒體共區域化一致(圖20)。總之，FACS數據和共聚焦成像證明全部的烴交聯使得SAHB3BIDA化合物能夠通過完整細胞被輸入(例如，通過胞吞機制)。
SAHB3BID化合物觸發B-、T-、和混合譜系白血病(MLL)細胞的細胞凋亡為了評估SAHB3BID化合物是否可阻止培養中增殖的白血病細胞的生長，對培養中的T-細胞(Jurkat)、B-細胞(REH)、和混合譜系白血病(MLL)-細胞MV4；11、SEMK2、RS4；11)利用連續稀釋的SAHB3BIDA進行3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)2，5-聯苯四唑溴化物，MTT分析。SAHB3BIDA以2.2(Jurkat)、10.2(REH)、4.7(MV4；11)、1.6(SEMK2)和2.7(RS4；11)μM的IC50s抑制白血病細胞(圖22a)。BID BH3肽和SAHBA(G→E)點突變體在這個劑量範圍中都不具有作用(圖22b，22c)。
為了評估這個代謝是否停滯表現細胞凋亡誘導，用10μM SAHB3BIDA和B、SAHB3BID(G→E)A和B以及未改變的BID BH3肽在無血清的培養基中處理Jurkat白血病細胞4小時，然後在包含血清的培養基中培養16小時(即，最終的肽濃度為5μM)，然後通過膜聯蛋白V-處理細胞的流式細胞計數檢測分析細胞凋亡。處理後20小時SAHB3BIDA和B證明40-60％之間的膜聯蛋白V陽性，而未改變的肽和SAHB3BID點突變體沒有影響(圖23a和23b)。使用具有載體反應劑的未改變的BH3肽或具有非特異性線粒體擾動作用的工程化螺旋的比較研究需要200-300μM的劑量來活化細胞凋亡。隨後利用工程化的過表達BCL-2的JurkaT-細胞的附加對照實驗來評估是否可通過過量的BCL-2減少SAHB3BID-誘導的細胞凋亡，其表明該化合物在細胞內通過線粒體細胞凋亡途徑特異地發揮作用。實際上，在BCL-2過表達細胞中消除了10μM SAHB3BIDA和B對「野生型″Jurkars的促細胞凋亡作用。然而這個保護作用可通過SAHB3BIDA而不是SAHB3BID(G→E)A的劑量提高而克服；此外，不顯示BCL-2結合親和力(參見上面)的SAHB3BIDA的gly至ser點突變體(SAHB3BID(G→S)A)，與「野生型」和BCL-2Jurkat細胞中的促細胞凋亡是同樣有效的(圖24)。在具有相似結果的REH、MV4；11和SEMK2細胞系中另外進行利用SAHB3BIDA和SAHB3BID(G→E)A的細胞凋亡誘導分析(圖25)。總之，這些數據表明SAHB3BID化合物可穿透和殺死增殖的白血病細胞。可通過SAHB3BIDA的gly至glu突變體和過表達BCL-2的細胞有選擇地消除所觀察到的促細胞凋亡作用，該發現強調了SAHB3BID化合物通過限定的線粒體細胞凋亡途徑起作用。
SAHB3BIDA和SAHB3BIDG--SA證明體內的白血病抑制使NOD-SCID小鼠經受300cGy全身照射，然後是顯示穩定螢光素酶表達的4×106個SEMK2-M1白血病細胞的靜脈注射。利用腹腔內注射D-螢光素後測定全身螢光的體內成像系統(IVIS，Xenogen)每周監測小鼠的白血病移植物移入。在第0天，對白血病的小鼠成像，然後在第1、2、3、5、6天用10mg/kg的SAHB3BIDA、SAHB3BIDG--SA靜脈內處理或沒有注射。在第4和7天測量全身螢光。關於圖26a，與未處理的對照小鼠相比該小組中腫瘤負重的分析證明了經SAHB3BIDA和SAHB3BID(G--S)A的白血病抑制。關於圖26b，全身螢光成像與證明低水平和更局部化疾病的SAHB3BIDA-處理的小鼠相比，證明了第7天未處理組中進一步發展的白血病(可在遍及骨骼系統中觀察到表現高水平白血病的紅色緻密度)。有趣地，不能被BCL-2螯合的G--S突變體似乎比母體化合物SAHB3BIDA在抑制白血病生長中是更有效的。
在進一步的動物試驗中，在第0天對白血病的小鼠(如上產生)成像，然後在第1、2、3、6和7天用10mg/kg SAHB3BIDA、5mg/kg SAHB3BIDA或載體對照(在D5W中的5％DMSO)靜脈內處理。在第4和8天測量全身螢光。關於圖27a，與未處理的對照小鼠相比該小組中腫瘤負重的分析證明了經SAHB3BIDA的劑量依賴方式的白血病抑制。關於圖27b，全身螢光成像與其白血病進展明顯減弱的SAHB3BIDA-處理的小鼠相比，證明了第8天未處理組中進一步發展的白血病(表現高水平白血病的紅色緻密度)。
在代替使用SCID beige小鼠和RS4；11白血病細胞的附加動物試驗中，SAHB3BIDA處理不斷地體內抑制白血病生長。對於體內白血病成像，用吸入異氟烷(Abbott Laboratories)麻醉小鼠，伴隨地用腹腔內注射D-螢光素(60mg/kg)(Promega)進行治療。利用體內成像系統(Xenogen)成像光電子發射並通過光電子流的整合定量全身生物發光(光子/sec)(LivingImage Software，Xenogen)。在實驗的第1天開始，小鼠接受每日的尾部靜脈注射SAHB3BIDA(10mg/kg)或載體(在D5W中的5％DMSO)七天。在第1、3和5天對小鼠成像並且在實驗的整個時段內每日監視存活率。利用Kaplan-Meier方法測定SAHB3BIDA和載體處理小鼠的存活率分布並利用log-rank檢驗比較。使用Fisher’s Exact檢驗比較在第3和5天之間處理失敗的小鼠的比例，其中處理失敗被定義為發展或死亡，而處理成功被定義為疾病穩定或退化。期滿的小鼠經受屍體解剖(Rodent Histopathology Core，DF/HCC)。
對照小鼠如通過從第1-5天的生物發光流增加所測定的證明了白血病生長的累進加速(圖27c)。3天後SAHB3BIDA處理抑制白血病擴展，第5天觀察到腫瘤退化。代表性的小鼠圖像證明了小鼠中脾和肝中累進的白血病浸潤，但在SAHBA-處理的小鼠中處理第5天在這些解剖位點證明了疾病退化(圖27d)。在這個群組中死亡的中值時間對於對照動物是5天，而在七天處理時期內SAHBA-處理的動物中沒有一個死去，並且代之以倖存時間為11天的中值(FIG 27e)。SAHBA-處理小鼠的組織學檢查顯示該化合物對正常的組織沒有明顯的毒性。在比較SAHB3BIDA-和SAHB3BID(G→E)A處理小鼠的附加研究中，接受點突變體SAHB的動物沒有顯示腫瘤退化(圖27f)，突出了SAHB3BIDA的抗白血病活性的體內特異性。
多肽在一些實例中，可進一步控制在此所描述的烴栓鏈(即，交聯)。在一個情況中，烴烯基栓鏈的雙鍵，(例如，如利用釕-催化的環閉合置換(RCM)合成的)可以被氧化(例如，通過環氧化作用或二羥基化)以提供下列化合物中的一個。
該環氧化物部分或游離羥基部分中的一個可進一步被功能化。例如，可用提供可用於例如，附加標記(例如，放射性同位素或螢光標記)的附加功能的親核試劑處理該環氧化物。該標記可用於幫助指導該化合物至機體內的所需要的位置(例如，當使用碘標記時，指導該化合物至甲狀腺)或追蹤該化合物在機體內的位置。備選地，附加治療劑可化學地附著於功能化的栓鏈(例如，抗癌症試劑，例如雷帕黴素(rapamycin)、長春花鹼(vinblastine)、紅豆杉醇(taxol)等)。這種衍生物可備選地通過合成操作多肽的氨基或羧基末端或通過胺基酸側鏈而獲得。
雖然已經描述了烴類栓鏈，其他的栓鏈也是可預見的。例如，該栓鏈可包括一個或多個乙醚、硫醚、酯、胺或醯胺部分。有時，可將天然存在的胺基酸側鏈整合入該栓鏈。例如，栓鏈可與官能團偶聯，例如絲氨酸中的羥基，半胱氨酸中的硫醇，賴氨酸中的伯胺，天冬氨酸或穀氨酸中的酸，或天門冬醯胺或穀氨醯胺中的醯胺。因此，有可能利用天然存在的胺基酸而不是利用通過兩個非天然存在的胺基酸偶聯製備的栓鏈來產生栓鏈。也可能使用與天然存在的胺基酸一起的單個非天然存在的胺基酸。
進一步預見栓鏈的長度可以是不同的。例如，當需要對仲α-螺旋結構提供相對高程度的約束時，可使用較短長度的栓鏈，而在有些情況下，需要對仲α-螺旋結構提供較少的約束，因此可能需要較長的栓鏈。
另外，雖然已經描述了跨度為從胺基酸i至i+3，i至i+4；和i至i+7的栓鏈實例，以提供主要在α螺旋的單平面上的栓鏈，可合成該栓鏈以跨越任何數目組合的胺基酸。
在有些情況下，在多肽中使用α二取代的胺基酸以提高α螺旋二級結構的穩定性。然而，不需要α二取代的胺基酸，並且也預見利用單-α取代基(例如，在栓鏈的胺基酸中)的情況。
如熟練的技術人員可認識到的，在此描述的合成化合物的方法對於本領域的普通技術人員來說是明顯的。另外，可以備選的順序或次序進行不同的合成步驟以產生所需要的化合物。可用於合成在此所描述的化合物的合成化學轉化和保護基方法論(保護和去保護)是本領域已知的，並且包括例如，在R.Larock，Comprehensive Organic Transformations，VCHPublishers(1989)；T.W.Greene and P.G.M.Wuts，Protective Groups in OrganicSynthesis，2d.Ed.，John Wiley and Sons(1991)；L.Fieser and M.Fieser，Fieserand Fieser′s Reagents for Organic Synthesis，John Wiley and Sons(1994)；and L.Paquette，ed.，Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis，John Wiley andSons(1995)，及其隨後的版本中所描述的方法。
本發明的肽可通過普通技術人員已知的化學合成方法製備。參見例如，Fields et al.，Chapter 3 in Synthetic PeptidesA User′s Guide，ed.Grant，W.H.Freeman Co.，New York，N.Y.，1992，p.77.Hence，可利用在例如AppliedBiosystems肽合成儀模型430A或431上通過利用側鏈保護胺基酸的t-Boc或F-moc化學保護的α-NH2的固相合成的自動Merrifield技術合成肽。
製備在此描述的肽的一個方式是利用固相肽合成(SPPS)。該C-末端胺基酸通過具有接頭分子的酸不穩定鍵附著於交聯聚苯乙烯樹脂。這種樹脂在用於合成的溶劑中是不溶的，這使得它相對簡單和快速以洗去過量的反應物和副產品。用在酸中穩定，但可通過鹼除去的Fmoc基團保護N-末端。用鹼穩定的、酸不穩定的基團保護任何側鏈官能團。
可通過利用天然的化學連接結合單獨的合成肽製備較長的肽。備選地，可通過已知的重組DNA技術合成更長的合成肽。在已知的標準手冊中提供了這種技術的詳細方案。為了構建編碼本發明肽的基因，逆翻譯胺基酸序列以獲得編碼該胺基酸序列的核酸序列，優選使用對其中將表達該基因的生物體最優化的密碼子。其次，一般通過合成編碼肽以及如有必要編碼任何調節元件的寡核苷酸來製備合成基因。將合成基因插入合適的克隆載體並轉染進入宿主細胞。然後在適於所選擇表達系統和宿主的適宜條件下表達該肽。純化該肽並通過標準方法表徵。
利用從Advanced Chemtech可獲得的高通量多通道的組合合成儀，以高通量、組合的方式來製備該肽。
圖28a-28f描繪了包括可用於產生交聯肽的結構域的各種肽。
治療方法本發明提供治療處於(或容易受到)病症危險之中或具有與異常的(例如，不足或過度的)BCL-2家族成員表達或活性(例如，外在的或固有的細胞凋亡途徑異常)相關病症的受試者的預防和治療方法。如在此使用的，術語「治療」定義為將治療劑應用或施用於患者，或將治療劑應用或施用於來自患者的分離組織或細胞系，其中該患者患有疾病、具有疾病症狀或患有疾病的傾向，其目的是為了治癒、恢復、緩和、減輕、改變、補救、改進、改善或影響該疾病、病症或對疾病的傾向。治療劑包括但不限於小分子、肽、抗體、核糖酶和反義寡核苷酸。
有可能通過一個或多個BCL-2家族成員的異常水平(例如，過或低表達)，或通過一個或多個顯示異常活性的BCL-2家族成員的存在至少部分地導致一些BCL-2類型病症。因而，BCL-2家族成員水平和/或活性的降低或BCL-2家族成員水平和/或活性的增強將導致病症症狀的改善。
本發明的多肽可用於治療、預防、和/或診斷癌症和腫瘤狀況。如在此使用的，術語「癌症」、″高增殖″和″腫瘤″是指具有自發生長能力的細胞，即以快速增殖的細胞生長為特徵的異常狀態或狀況。高增殖和腫瘤疾病狀態可被分類為病理的，即表徵或組成疾病狀態，或可被分類為非病理的，即與正常的不符合然而並非與疾病狀態相關。該術語是指包括所有類型的癌性生長或致癌過程，轉移性的組織或惡性轉化的細胞、組織或器官，而與組織病理學類型或侵入的階段無關。″病理性的高增殖″細胞發生在以惡性腫瘤生長為特徵的疾病狀態。非病理性的高增殖細胞的實例包括與創傷修復相關的細胞的增殖。
細胞增殖和/或分化病症的實例包括癌症，例如癌瘤、肉瘤或轉移性的病症。該化合物(即，多肽)可起用於控制乳腺癌(breast cancer)、卵巢癌、結腸癌、肺癌、這種癌症的轉移等的新治療劑的作用。轉移性腫瘤可能起因於大量的原發腫瘤類型，包括但不限於乳腺、肺、肝、結腸和卵巢起源的腫瘤。
癌症或腫瘤狀況的實例包括但不限於，纖維肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮細胞瘤(mesothelioma)、Ewing’s腫瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、胃癌、食道癌、直腸癌、胰腺癌(pancreatic cancer)、卵巢癌、前列腺癌、子宮癌、頭頸部癌、皮膚癌、腦瘤(brain cancer)、鱗狀細胞癌、皮脂腺癌瘤(sebaceous gland carcinoma)、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌瘤、肝癌、膽管癌瘤(bile duct carcinoma)、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、Wilm’s腫瘤、子宮頸癌、睪丸癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、星形細胞瘤、成神經管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經瘤、少突神經膠質細胞瘤、腦膜瘤、黑素瘤、成神經細胞瘤、成視網膜細胞瘤、白血病、淋巴瘤或Kaposi肉瘤。
增殖病症的實例包括造血腫瘤病症。如在此使用的，術語「造血腫瘤病症」包括涉及造血起源，例如產生自脊髓、淋巴或紅細胞系統、或其前身細胞的增生性/贅生性細胞的疾病。優選的，該疾病起因於分化不良的急性白血病，例如成紅血球細胞的白血病和髓母細胞性白血病。另外的例證性的脊髓病症包括但不限於，急性前髓細胞性白血病(APML)、急性髓細胞性白血病(AML)和慢性髓細胞性白血病(CML)(參見Vaickus，L.(1991)Crit Rev.in Oncol./Hemotol.11267-97)；淋巴惡性腫瘤包括但不限於，急性成淋巴細胞性白血病(ALL)，其包括B-譜系ALL和T-譜系ALL、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、前淋巴細胞白血病(PLL)、毛細胞白血病(HLL)和Waldenstrom′s巨球蛋白血症(WM)。惡性淋巴瘤的另外形式包括但不限於非-Hodgkin淋巴瘤及其變體、外周的T-細胞淋巴瘤、成人T-細胞白血病/淋巴瘤(ATL)、皮膚的T-細胞淋巴瘤(CTCL)、大的粒狀淋巴細胞白血症(LGF)、Hodgkin′s疾病和Reed-Sternberg疾病。
乳腺(breast)的細胞增殖和/或分化病症的實例包括但不限於，增生性的乳腺疾病包括，例如上皮細胞增生、硬化的腺病和小管乳頭狀瘤；腫瘤，例如，基質腫瘤，例如纖維性瘤、葉狀腫瘤，和肉瘤，以及上皮腫瘤，例如大管乳頭狀瘤；乳腺的癌瘤包括原位(非擴散的)癌瘤，其包括導管原位癌(包括Paget’s疾病)和小葉原位癌，以及侵入性的(浸潤)癌瘤包括但不限於，侵入性的導管癌瘤、侵入性的小葉癌瘤、髓樣癌、膠質(粘質)癌瘤、管狀癌瘤、和侵入性的乳頭狀癌、以及混雜的(miscellaneous)惡性腫瘤。男性乳腺中的病症包括但不限於男子女性型乳房症和癌瘤。
肺的細胞增生性和/或分化病症的實例包括但不限於，支氣管癌，包括瘤外伴隨綜合症、細支氣管肺泡癌瘤、神經內分泌腫瘤，例如支氣管的良性腫瘤、混雜的腫瘤、和轉移性腫瘤；胸膜的病變，包括炎性胸膜積液、非炎性的胸膜積液、氣胸和胸膜腫瘤，包括單發性纖維腫瘤(胸膜纖維瘤)和惡性間皮瘤。
結腸的細胞增生性和/或分化病症的實例包括但不限於，非腫瘤息肉、腺瘤、家族綜合症、結腸直腸癌的發生、結腸直腸的癌瘤和良性腫瘤。
肝的細胞增生性和/或分化病症的實例包括但不限於，結節性增生、腺瘤和惡性腫瘤，包括肝的原發癌和轉移性腫瘤。
卵巢的細胞增生性和/或分化病症的實例包括但不限於，卵巢腫瘤，例如體腔上皮的腫瘤、血漿(serous)腫瘤、粘質腫瘤、子宮內膜(endometeriod)腫瘤、透明細胞腺癌(clear cell adenocarcinoma)、囊腺纖維瘤、卵巢纖維上皮(brenner)瘤、表面上皮細胞瘤；生殖細胞腫瘤，例如成熟(良性)的畸胎瘤、單層畸胎瘤(teratomas)、未成熟的惡性畸胎瘤、無性細胞瘤、內胚竇(sinus)瘤、絨毛膜瘤；生殖索-孔腫瘤(sex cord-stomaltumors)，例如，粒層泡膜(granulosa-theca)細胞瘤、泡膜細胞瘤(thecoma)-纖維瘤、睪丸足細胞瘤(androblastomas)、丘細胞(hillcell)腫瘤和性腺胚細胞瘤(gonadoblastoma)；和轉移性(metastatic)腫瘤，例如Krukenberg腫瘤。
在此描述的多肽也可用於治療、預防或診斷其特徵在於過度活化的細胞死亡或由於生理損傷造成細胞死亡的狀況。以早熟或不必要細胞的死亡為特徵的狀況的一些實例是備選不需要的或過度的細胞增殖，包括但不限於細胞過少/發育不全、非細胞/再生障礙、或細胞過多/增生性的狀況。一些實例包括血液學病症，包括但不限於fanconi貧血症、再生障礙性貧血、地中海貧血(thalaessemia)、先天性中性粒細胞減少、脊髓發育不良。
本發明的起減少細胞凋亡作用的多肽可用於治療與不合需要的細胞死亡水平相關的病症。因此，本發明的抗細胞凋亡肽可用於治療例如導致與病毒感染有關的細胞死亡的病症，例如與用愛滋病毒(HIV)感染有關的侵染。多種神經學疾病的特點在於特定組神經元的逐步損失，並且抗細胞凋亡肽的感染可用於治療這些病症。這種病症包括阿爾茨海默氏病；帕金森氏症、肌萎縮性側索硬化(ALS)視網膜色素變性(amyotrophic lateral sclerosisretinitis pigmentosa)、脊髓性肌萎縮和各種形式的小腦(cerebellar)變性。這些疾病中的細胞損失不誘導炎性反應，並且細胞凋亡似乎是細胞死亡的機制。此外，許多血液學疾病與血細胞的產生減少有關。這些病症包括與慢性疾病有關的貧血症、再生障礙性貧血、慢性中性粒細胞減少和脊髓發育不良綜合症。血細胞產生的病症，例如脊髓發育不良綜合症和一些形式的再生障礙性貧血與骨髓內細胞凋亡的細胞死亡增加有關。這些病症可以由促進細胞凋亡的基因的活化、基質細胞或造血存活因子的獲得性缺陷、或毒素的直接作用和免疫應答的媒介引起。與細胞死亡有關的兩種常見病症是心肌梗塞和中風。在兩種病症中，在血流急劇損失的事件中產生的缺血中心區內的細胞看來似乎由於壞死的快速死亡。然而，中心缺血區域外的細胞經過更延長的時間段死亡並且在形態學上看來似乎死於細胞凋亡。本發明的抗細胞凋亡肽可用於治療所有這類與不合需要的細胞死亡有關的病症。
可用在此描述的多肽治療的免疫學病症的一些實例包括但不限於器官移植排異、關節炎、狼瘡、IBD、crone’s疾病、哮喘、多發性硬化、糖尿病等。
可用在此描述的多肽治療的神經病學病症的一些實例包括但不限於，Alzheimer’s疾病、Down’s綜合症、Dutch型遺傳的腦出血澱粉樣變性、活性的澱粉樣變性、伴隨蕁麻疹和耳聾(urticaria and deafness)的家族性澱粉狀蛋白腎病、Muckle-Wells綜合症、自發的骨髓瘤；巨球蛋白血症-相關的骨髓瘤、家族性澱粉狀蛋白多發性神經病、家族性澱粉狀蛋白心肌炎、分離的心臟澱粉狀蛋白、全身性老年澱粉樣變性、成人發病的糖尿病、胰島瘤、分離的前房澱粉狀蛋白、甲狀腺髓樣癌、家族性澱粉樣變性、伴隨澱粉樣變性的遺傳性腦出血、家族性澱粉樣變性多發性神經病、瘋羊病、Creutzfeldt-Jacob疾病、Gerstmann Straussler-Scheinker綜合症、牛海綿狀腦炎、朊病毒介導的疾病、和Huntington’s疾病。
可用在此描述的多肽治療的內分泌學病症的一些實例包括但不限於糖尿病、甲狀腺功能減退(hypthyroidism)、hyopituitarism、甲狀旁腺機能減退、性腺機能減退(hypogonadism)等。
可用本發明的化合物和方法治療或預防的心血管病症(例如炎性病症)的實例包括但不限於，動脈粥樣硬化、心肌梗塞、中風、血栓形成、動脈瘤、心力衰竭、缺血性心臟病、心絞痛、心源性猝死、高血壓性心臟病；非冠狀血管疾病，例如小動脈硬化、小脈管疾病、腎病、高甘油三酯血症、高膽固醇血症、高脂血症、黃瘤病、哮喘、高血壓、肺氣腫和慢性肺病；或與介入方法(″程序性的血管創傷″)，例如血管成形術、放置旁路(placementof a shunt)、擴張、合成或天然的切除移植物、留置導管、活瓣(valve)或其他可植入裝置後的再狹窄有關的心血管狀況。優選的心血管病症包括動脈粥樣硬化、心肌梗塞、動脈瘤和中風。
藥物組合物和給藥途徑如在此使用的，本發明的化合物，包括在此描述的通式的化合物，被定義為包括其藥物學上可接受的衍生物或前體藥物。「藥物學上可接受的衍生物或前體藥物」是指當施用於受體時能夠(直接或間接地)提供本發明化合物的任何藥物學上可接受的本發明化合物的鹽、酯、酯的鹽、或其他衍生物。特別有利的衍生物和前體藥物是當這種化合物被施用於哺乳動物(例如，通過容許口服化合物以更容易地被吸收到血液中)時，增加本發明化合物的生物利用率，或相對於親本種增加母體化合物遞送至生物間隔(例如，腦或淋巴系統)的衍生物和前體藥物。優選的前體藥物包括的衍生物中增加通過腸管膜的水溶性或主動運輸的基團結合於在此所描述的通式的結構。
本發明的化合物可通過添加適當的功能以增加所選擇的生物特性而被改變。這種改變是本領域已知的，並且包括增加生物穿透進入給定生物間隔(例如，血液、淋巴系統、中樞神經系統)、增加口服可利用性、增加可溶性以容許通過注射給藥、改變新陳代謝和改變排洩速率的修飾。
本發明化合物的藥物學上可接受的鹽包括來源於藥物學上可接受的無機和有機酸和鹼的鹽。合適的酸性鹽的實例包括醋酸鹽、己二酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、二葡糖酸鹽(digluconate)、十二烷基硫酸鹽、甲酸鹽、富馬酸鹽(fumarate)、羥乙酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘化物、乳酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、硝酸鹽、palmoate、磷酸鹽、苦味酸鹽(picrate)、特戊酸鹽(pivalate)、丙酸鹽、水楊酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽(tartrate)、甲苯磺酸鹽(tosylate)和十一酸鹽。來源於適當的鹼的鹽包括，鹼金屬(例如鈉)、鹼土金屬(例如，鎂)、銨和N-(烷基)4+鹽。本發明也預見在此所公開的化合物的包含任何鹼性氮基團的季銨化作用。可通過這種季銨化作用獲得水或可溶於油的或可分散的產品。
在此描述的通式的化合物可例如通過注射、靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內、肌內注射或皮下地；或口服、頰部(buccally)、鼻部、轉化粘液質、局部地在眼製劑中、或通過吸入給藥，其劑量範圍為大約0.001至大約100mg/kg的體重，或根據特定藥物的需要量。在此該方法試圖施用有效量的化合物或化合物組合物以獲得所需要的或確定的效果。一般地，本發明的藥物組合物以每日大約1至大約6次或備選地作為連續的輸液進行給藥。這種給藥可用作慢性的或急性的治療。可與載體材料組合以產生單一劑型地活性成分的數量將依賴於待治療的宿主和給藥的特定方式而不同。典型的製劑將包含大約5％至大約95％的活性化合物(w/w)。備選地，這種製劑包含大約20％至大約80％的活性化合物。
可能需要比上述的劑量更低或更高的劑量。用於任何特定患者的指定劑量和治療方式將依賴於多種因素，包括所使用的指定化合物的活性、年齡、體重、全身健康狀態、性別、飲食、給藥時間、排洩速率、藥物組合、疾病的嚴重度和病程、狀況或症狀、患者對疾病、狀況或症狀的處置、以及治療醫師的判斷。
當改善患者狀況時，如有必要可施用維持劑量的化合物、組合物或本發明的組合。隨後，當對症狀起作用時，可減少給藥的劑量或頻率，或兩者都減少至保持改善的狀況的水平。然而當有任何病徵再發生時患者可能需要長期方式的間歇療法。
本發明的藥物組合物包括在此描述的通式的化合物或其藥物學上可接受的鹽；附加試劑包括例如，嗎啡或甲基嗎啡；以及任何藥物學上可接受的載體、佐劑或賦形劑。本發明的備選組合物包括在此描述的通式的化合物或其藥物學上可接受的鹽；以及藥物學上可接受的載體、佐劑或賦形劑。在此描繪的組合物包括在此描繪的通式的化合物，以及如果呈遞，包括用於獲得調節疾病或病徵，包括BCL-2家族成員介導的病症或其症狀的有效量的附加治療劑。
術語「藥物學上可接受的載體或佐劑」是指可與本發明的化合物一起施用於患者，並且不破壞其藥理學活性，以及當以足夠遞送治療數量的該化合物的劑量給藥時是無毒的載體或佐劑。
可用於本發明的藥物組合物的藥物學上可接受的載體、佐劑和賦形劑包括但不限於，離子交換劑、鋁礬土、硬脂酸鋁、卵磷脂、自乳化藥物遞送系統(SEDDS)，例如d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸鹽、用於藥物劑型地表面活性劑，例如Tweens或其他相似的聚合遞送基質，血清蛋白，例如人血清白蛋白，緩衝物質，例如磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的偏甘油酯(partial glyceride)混合物、水、鹽或電解質，例如硫酸魚精蛋白，磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠態氧化矽、三矽酸鎂、聚乙烯基吡咯烷酮、基於纖維素的物質、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯，蠟、聚乙烯-聚氧化丙烯-塊段(block)聚合體、聚乙二醇和羊毛脂。環糊精，例如α-、β-和γ-環糊精也可有利地用於增加遞送在此描述的通式的化合物。
本發明的藥物組合物可口服、腸胃外地、通過吸入噴霧、局部地、直腸、鼻部、頰部、陰道地或通過植入容器進行給藥，優選通過口服或通過注射給藥。本發明的藥物組合物可包含任何常規無毒的藥物學上-可接受的載體、佐劑或賦形劑。有時，可用藥物學上可接受的酸、鹼或緩衝液調節該製劑的pH以增加所配製化合物或其遞送形式的穩定性。如在此使用的術語腸胃外的，包括皮下、皮內、靜脈內、肌內、關節內、動脈內、滑膜內、胸骨內、鞘內、損害內(intralesional)和顱內(intracranial)的注射或輸液技術。
該藥物組合物可以是無菌可注射製劑的形式，例如無菌的可注射的含水或含油的懸浮液。這種懸浮液可利用合適的分散劑或溼潤劑(例如，Tween80)和懸浮劑根據本領域已知的技術配製。該無菌的可注射製劑也可以是在無毒的腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌的可注射溶液或懸浮液，例如作為在1，3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受的賦形劑和溶劑是甘露醇、水、Ringer’s溶液和等滲氯化鈉溶液。此外，通常使用無菌的固定油類作為溶劑或懸浮介質。為了這個目的，可使用任何溫和的固定油，包括合成的單-或二脂醯甘油脂。脂肪酸，例如油酸及其甘油酯衍生物可用於可注射的製劑，如天然的藥物學上可接受的油劑，例如橄欖油或蓖麻油，特別是其聚氧乙烯化的形式。這些油劑或懸浮液也可包含長鏈乙醇稀釋劑或分散劑，或羧甲基纖維素或相似的分散劑，其通常被用於藥物學上可接受劑型，例如乳劑和或懸浮液的配製。其他通常使用的表面活性劑，例如Tweens或Spans和/或其他相似的乳化劑或通常被用於製造藥物學上可接受的固體、液體或其他劑型的生物利用率增強劑也可用於該配製的目的。
本發明的藥物組合物可以任何口服可接受的劑型口服給藥，包括但不限於膠囊劑、片劑、乳劑和水懸劑、分散劑和液劑。就用於口服使用的片劑來說，通常使用的載體包括乳糖和玉米澱粉。一般也附加潤滑劑，例如硬脂酸鎂。對於膠囊劑形式的口服給藥，有用的稀釋劑包括乳糖和幹的玉米澱粉。當口服給藥水懸劑和/或乳劑時，活性成分可以懸浮或溶於油相而與乳化劑和/或懸浮劑化合。如果需要，可添加某些加甜味料和/或調味劑和/或著色劑。
本發明的藥物組合物也可以用於直腸給藥的栓劑形式給藥。可通過將本發明的化合物與在室溫下為固體但在直腸溫度下為液體並因此在直腸中溶化以釋放該活性成分的合適的無刺激性賦形劑混合來製備這些組合物。這種材料包括但不限於可可脂、蜂蠟和聚乙二醇。
本發明的藥物組合物可通過鼻的氣溶膠或吸入劑給藥。根據藥物配製領域已知的技術製備這種組合物，並且可製備為在鹽水中的溶液，其中使用苯甲醇或其他合適的防腐劑、吸收促進劑以增加生物利用率、氟碳化合物、和/或其他本領域已知的增溶劑或分散劑。
當本發明的組合物包括在此描述的通式的化合物的組合物和一種或多種附加治療劑或預防劑時，該化合物和附加試劑都應以大約1至100％之間的劑量水平存在，並且更優選通常在單治療方式中給藥的大約5至95％之間的劑量。該附加試劑可單獨給藥，作為來自本發明化合物的多劑量方式的一部分。備選地，那些試劑可以是在單組合物中與本發明化合物混合在一起的單劑型的一部分。
篩選分析本發明提供用於識別調節一個或多個BCL-2家族蛋白質或結合一個或多個BCL-2家族蛋白質(例如，具有至少一個BH同源性結構域的多肽)的多肽的方法(在此也相當於″篩選分析″)。
在此描述的多肽的結合親合力可利用例如滴定結合分析進行測定。BCL-2家族多肽或包括BH結構域(例如，BID、BAK、BAX等)的多肽可在存在例如包含多肽或其片段(例如BID、BAD、BAK、BAX等)的螢光標記的BH3的底物時，暴露於不同濃度的候選化合物(即，多肽)(例如，1nM，10nM，100nM，1μM，10μM，100μM，1mM和10mM)。然後分析候選化合物的各個濃度的作用以確定該候選化合物對不同濃度的BCL-2家族結合活性的作用，其可用於計算該候選化合物的Ki。該候選化合物可調節競爭或非競爭性方式的BCL-2類型活性。也可在BCL-2家族蛋白質和螢光標記的候選化合物之間進行直接的結合分析以確定結合相互作用的Kd。還可例如通過測量其在觸發來自純化線粒體的細胞色素c中的劑量-反應的效力來篩選候選化合物的體外生物活性。也預見細胞透性篩選分析，其中將螢光標記的候選化合物施用於完整細胞，然後通過顯微術或高通量的細胞螢光檢測來分析細胞螢光。
用單獨的候選化合物進行在此描述的分析或可用多元候選化合物進行這種分析。當用多元候選化合物進行該分析時，可利用候選化合物的混合物進行該分析或可以具有單候選化合物的各個反應進行平行反應。可利用本領域已知的組合文庫方法中的任何多種方法來獲得測試化合物或試劑。
在一個實施方案中，分析是基於細胞的分析，其中將表達BCL-2家族蛋白質或其生物活性部分的細胞與候選多肽接觸，並且測定該測試化合物調節BCL-2類型活性的能力(例如，在一些實例中通過固有的或外在的細胞死亡途徑，細胞凋亡增加，而在其他情況中，細胞凋亡減少)。測試化合物在細胞內調節BCL-2類型活性能力的測定可伴隨有監測例如，從線粒體釋放的細胞色素c或其他相關的生理讀數(例如，膜聯蛋白V染色、MTT分析、胱冬蛋白酶活性分析、TUNEL分析)。
在一個實施方案中，分析是生化分析，由此可將交聯的多肽與親合樹脂連接以純化或識別細胞凋亡途徑中新的或已知的相互作用伴侶。
在此引用的所有參考文獻，無論已出版的、電子的、電腦可讀存儲介質的或其他的形成，是全部明確地引入作為參考，包括但不限於摘要、論文、期刊、出版刊物、教科書、條約、國際互連網網點、資料庫、專利和專利公開物。
其他應用在此描述的肽的生物學上相關的應用如通過下列基於細胞隔室所表明的是數目眾多且容易表現的(1)細胞表面-表現HIV-1蛋白質gp41(例如，C-肽、T-20肽)的關鍵螺旋區的天然肽已經顯示防止病毒融合而因此防止HIV感染。參與融合機制的螺旋肽對許多病毒-宿主細胞感染範例是很重要的(例如，Dengue，Hepatitis C，Influenza)，因此，這些決定性的螺旋區域的烴類-鉤環類似物可通過抑制病毒的融合而起有效抗生素的作用。通常，利用螺旋接觸面以活化或抑制信號途徑的與細胞表面受體相互作用的配體表現了在此描述的多肽的附加應用。
(2)膜內-受體二聚作用和寡聚化是配體誘導的受體活化和信號傳遞的主要特徵。橫跨膜的螺旋結構域廣泛參與這種必要的寡聚化反應(例如，表皮生長因子受體[EGFR]家族)，並且特異的肽序列已經被定義為促進這些緻密的膜內螺旋締合的序列。這種受體通過寡聚化的異常活化涉及疾病致病原因(例如，erbB和腫癌症)。因此，在適當的環境中，橫跨膜的內螺旋相互作用的活化或抑制將具有治療學益處。
(3)細胞溶質的-細胞溶質的靶包括可溶蛋白質靶和與特異的內細胞溶質的細胞器有關的靶，包括線粒體、內質網、Golgi網絡、溶酶體和過氧物酶體。在細胞凋亡的領域內，存在針對烴類-鉤環BCL-2家族結構域的多種細胞溶質和線粒體細胞凋亡蛋白質靶。在促細胞凋亡蛋白質的只有BH3-亞組內，已經鑑定了BH3結構域的兩個主要子集(1)BID-樣BH3s(例如，BIM)，其是細胞凋亡「激活子，在線粒體誘導BAK寡聚化和細胞色素c釋放以及(2)BAD-樣BH3s，其是細胞凋亡「敏感子」，有選擇地靶向抗細胞凋亡多結構域蛋白質，啟動活化結構域的閾下水平至最大限度的有效性。除只有BH3的蛋白質對促對比抗細胞凋亡多結構域家族成員的不同結合外，BH3結構域在抗細胞凋亡蛋白質當中顯示有差別的結合。例如，已經證明BAD優選地結合抗細胞凋亡BCL-2，而BIM靶向抗細胞凋亡MCL-1。鑑定和研究這些選擇性的相互作用是極其重要的，因為不同的BCL-2家族成員涉及不同類型的腫瘤。例如，BCL-2過表達一般引起濾泡性淋巴瘤和化療耐受性(resistance)的發展，而MCL-1被認為在多發性骨髓瘤的發病機理中扮演重要角色。使許多BH3結構域轉化為結構穩定的能力和細胞可滲透反應劑將為研究和區別調控癌細胞中的細胞凋亡途徑提供重要的時機。進一步靶向胞液中或在細胞溶質的細胞器中的螺旋依賴的相互作用或是可預見的。
(4)核-核轉錄因子及其調節蛋白驅動大量生理過程以與核蛋白和核酸相互作用的肽螺旋為基礎。最近我們已經通過合成一系列與MDM2以皮摩爾親合力相互作用的烴類-鉤環(stapled)p53肽證明了產生烴類-鉤環肽以參加核相互作用的可能性。除調節核內的蛋白質-蛋白質相互作用外，蛋白質-核酸的相互作用也是顯而易見的目標。多重轉錄因子家族，例如同源結構域、基本的螺旋-環-螺旋、核受體和包含鋅指的蛋白質，通過其肽螺旋直接與DNA相互作用來活化或抑制基因轉錄。舉例來說，同源結構域蛋白質是調節極度的多細胞機體中的生長和分化遺傳程序的必要轉錄因子家族。這些蛋白質共享包含60個胺基酸長的肽，形成三個α-螺旋，稱為同源結構域的保守的DNA結合基序，其中第三個α螺旋與DNA的寬(major)溝直接接觸。類似於細胞凋亡蛋白質的BH3結構域，同源結構域是在同系物當中具有足夠變化的決定性的效應物基序，其促進有差異的結合特異性和生理活性。蛋白質-DNA相互作用可以是複雜的和廣泛的，由此為了研究和有選擇地調節翻譯事件的目的而提供對小分子開發的挑戰。在高等生物體中，同源結構域蛋白質在發育、確定機體計劃和支配組織分化期間高度表達。特異的同源異型蛋白(例如，CDX4)的過表達可活化導致例如來自小鼠胚胎幹細胞的血液形成的組織-特異分化程序。同源異型基因表達的異常調節，例如一般在未分化細胞中表達的同源結構域蛋白質的異常上調或通常在分化細胞中表達的這種蛋白質的不適當下調可促進腫瘤的發展和維持。例如，在小兒的腺泡狀橫紋肌肉瘤(pediatric alveolar rhabdomy osarcoma)中，PAX3或PAX 7DNA結合結構域與forkhead的轉活化結構域的融合已經涉及細胞轉化；涉及幾個HOX基因的DNA-結合結構域的易位已經涉及白血病的發病機理。因此，化學穩定轉錄因子螺旋，例如同源結構域肽用於細胞遞送的能力對產生用於研究和調節各種對健康和疾病中大量的生物過程負責的轉錄程序的化學工具盒具有潛能。
已經描述了本發明的許多實施方案。然而，可以理解可製備各種改變而不背離本發明的精神和範圍。因此，其他的實施方案在下列權利要求的範圍之內。
權利要求
1.通式(I)的多肽， 通式(I)其中；每個R1和R2獨立地是H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環烷基烷基、雜芳基烷基、或雜環基烷基；R3是烷基、烯基、炔基；[R4-K-R4]n；其每個用0-6個R5取代；R4是烷基、烯基、或炔基；R5是滷素、烷基、OR6、N(R6)2、SR6、SOR6、SO2R6、CO2R6、R6、螢光部分、或放射性同位素；K是O、S、SO、SO2、CO、CO2、CONR6、或 R6是H、烷基、或治療劑；n是1-4的整數；x是2-10的整數；每個y獨立地是0-100的整數；z是1-10的整數；以及每個Xaa獨立地是胺基酸；其中該多肽在含水溶液中具有基本的α螺旋二級結構。
2.權利要求1的多肽，其中該多肽結合BCL-2家族多肽。
3.權利要求1的多肽，其中該多肽結合抗-細胞凋亡多肽。
4.權利要求1的多肽，其中該多肽結合BH1、BH2或BH3結構域。
5.權利要求1的多肽，其中該多肽活化線粒體的細胞死亡。
6.權利要求1的多肽，其中該多肽活化細胞死亡。
7.權利要求1的多肽，其中該多肽抑制細胞死亡。
8.權利要求1的多肽，其中該多肽包括BH3結構域。
9.權利要求1的多肽，其中x是2、3、或6。
10.權利要求1的多肽，其中每個y獨立地是3和15之間的整數。
11.權利要求1的多肽，其中R1和R2各自獨立地是H或C1-C6烷基。
12.權利要求1的多肽，其中R1和R2各自獨立地是C1-C3烷基。
13.權利要求11的多肽，其中R1和R2中的至少一個是甲基。
14.權利要求12的多肽，其中R1和R2是甲基。
15.權利要求1的多肽，其中R3是烷基。
16.權利要求14的多肽，其中x是3。
17.權利要求15的多肽，其中R3是C8烷基。
18.權利要求14的多肽，其中x是6。
19.權利要求17的多肽，其中R3是C11烷基。
20.權利要求1的多肽，其中R3是烯基。
21.權利要求18的多肽，其中x是3。
22.權利要求20的多肽，其中R3是C8烯基。
23.權利要求19的多肽，其中x是6。
24.權利要求19的多肽，其中R3是C11烯基。
25.權利要求1的多肽，其中R3是直鏈烷基、烯基、或炔基。
26.權利要求1的多肽，其中R3是[R4-K-R4]；以及R4是直鏈烷基、烯基、或炔基。
27.權利要求1的多肽，該多肽包括與SEQ ID NO1的胺基酸序列至少大約60％同一性的胺基酸序列。
28.權利要求15的多肽，其中R3是烷基或烯基。
29.權利要求15的多肽，其中R1或R2中的至少一個是烷基。
30.權利要求11的多肽，其中每個R1和R2獨立地是H或C1-C3烷基。
31.權利要求1的多肽，其中R1和R2是甲基。
32.權利要求1的多肽，其中x是3或7以及z是0。
33.權利要求1的多肽，其中R3是C8或C11烷基或烯基。
34.權利要求1的多肽，該多肽包括與SEQ ID NO2的胺基酸序列至少大約80％同一性的胺基酸序列。
35.權利要求1的多肽，其中該多肽轉運通過細胞膜。
36.權利要求1的多肽，其中該多肽主動轉運通過細胞膜。
37.權利要求1的多肽，進一步包括螢光部分或放射性同位素。
38.權利要求1的多肽，其中該多肽包括23個胺基酸；R1和R2是甲基；R3是C8烷基、C11烷基、C8烯基或C11烯基；以及X是2、3或6。
39.權利要求1的多肽，進一步包括親和標記。
40.權利要求1的多肽，進一步包括靶部分。
41.權利要求1的多肽，進一步包括生物素部分。
42.權利要求1的多肽，其中該多肽是選自圖5所示多肽的多肽。
43.製備通式(III)的多肽的方法，包括提供通式(II)的多肽；以及 通式(II)用催化劑處理通式(II)的化合物以促進環閉合置換作用，由此提供通式(III)的化合物 通式(III)其中每個R1和R2獨立地是H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環烷基烷基；雜芳基烷基；或雜環基烷基；每個n獨立地是1-15的整數；x是2、3或6每個y獨立地是0-100的整數；z是1-3的整數；以及每個Xaa獨立地是胺基酸；以及其中該多肽在含水溶液中包括α螺旋結構。
44.權利要求43的方法，其中該多肽結合BCL-2家族成員多肽。
45.權利要求43的方法，其中該催化劑是釕催化劑。
46.權利要求43的方法，進一步包括在環閉合置換作用之後提供還原劑或氧化劑。
47.權利要求46的方法，其中該還原劑是H2或氧化劑是四氧化鋨
48.治療受試體的方法，包括將權利要求1的化合物施用於該受試體。
49.權利要求48的方法，進一步包括施用附加的治療劑。
50.在受試體中治療癌症的方法，包括將權利要求1的化合物施用於該受試體。
51.權利要求45的方法，進一步包括施用附加的治療劑。
52.權利要求1，通式(I)的化合物的文庫。
53.鑑定用於促進細胞凋亡的候選化合物的方法，包括；提供線粒體；使該線粒體與權利要求1的化合物接觸；測量細胞色素c釋放；以及與缺少權利要求1的化合物時的細胞色素c釋放比較在存在權利要求1的化合物時的細胞色素c釋放，其中在存在權利要求1的化合物時細胞色素c釋放增加則鑑定該權利要求1的化合物為用於促進細胞凋亡的候選化合物。
54.通式(IV)的多肽， 其中；每個R1和R2獨立地是H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環烷基烷基，雜芳基烷基，或雜環基烷基；R3是烷基、烯基、炔基；[R4-K-R4]n或天然存在的胺基酸側鏈；其中每個用0-6個R5取代；R4是烷基、炔基或炔基；；R5是滷素、烷基、OR6、N(R6)2、SR6、SOR6、SO2R6、CO2R6、R6、螢光部分或放射性同位素；K是O、S、SO、SO2、CO、CO2、CONR6、或 R6是H、烷基、或治療劑；R7是烷基、烯基、炔基；[R4-K-R4]n或天然存在的胺基酸側鏈；其中每個用0-6個R5取代；n是1-4的整數；x是2-10的整數；每個y獨立地是0-100的整數；z是1-3的整數；以及每個Xaa獨立地是胺基酸；以及其中該多肽在含水溶液中具有基本的α螺旋二級結構。
55.通式(I)的多肽， 通式(I)其中；每個R1和R2獨立地是H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環烷基烷基，雜芳基烷基，或雜環基烷基；R3是烷基、烯基、炔基；[R4-K-R4]n；其中每個用0-6個R5取代；R4是烷基、炔基或炔基；；R5是滷素、烷基、OR6、N(R6)2、SR6、SOR6、SO2R6、CO2R6、R6、螢光部分或放射性同位素；K是O、S、SO、SO2、CO、CO2、CONR6、或 R6是H、烷基、或治療劑；n是1-4的整數；x是2-10的整數；每個y獨立地是0-100的整數；z是1-3的整數；以及每個Xaa獨立地是胺基酸；其中通過圓二色光譜測定該多肽在含水溶液中具有至少5％的α螺旋。
56.權利要求55的多肽，其中通過圓二色光譜測定該多肽具有至少35％的α螺旋度。
57.權利要求55的多肽，其中通過圓二色光譜測定該多肽具有至少50％的α螺旋度。
58.權利要求55的多肽，其中通過圓二色光譜測定該多肽具有至少60％的α螺旋度。
59.權利要求55的多肽，其中通過圓二色光譜測定該多肽具有至少70％的α螺旋度。
60.權利要求55的多肽，其中通過圓二色光譜測定該多肽具有至少80％的α螺旋度。
61.權利要求55的多肽，其中通過圓二色光譜測定該多肽具有至少90％的α螺旋度。
62.通式(I)的多肽， 通式(I)其中；每個R1和R2獨立地是H、烷基、烯基、炔基、芳基烷基、環烷基烷基，雜芳基烷基，或雜環基烷基；R3是烷基、烯基、炔基；[R4-K-R4]n；其中每個用0-6個R5取代；R4是烷基、炔基或炔基；；R5是滷素、烷基、OR6、N(R6)2、SR6、SOR6、SO2R6、CO2R6、R6、螢光部分或放射性同位素；K是O、S、SO、SO2、CO、CO2、CONR6、或 R6是H、烷基、或治療劑；n是1-4的整數；x是2-10的整數；每個y獨立地是0-100的整數；z是1-3的整數；以及每個Xaa獨立地是胺基酸；其中通過圓二色光譜測定該多肽與通式(IV)的多肽相比具有至少1.25倍的α螺旋度增加 通式(IV)其中R1、R2、Xaa、x、y、和z都如對於上述通式(I)所定義的。
63.權利要求62，通式(I)的多肽，其中通過圓二色光譜測定該多肽與通式(IV)的多肽相比具有至少1.5倍的α螺旋度增加。
64.權利要求62，通式(I)的多肽，其中通過圓二色光譜測定該多肽與通式(IV)的多肽相比具有至少1.75倍的α螺旋度增加。
65.權利要求62，通式(I)的多肽，其中通過圓二色光譜測定該多肽與通式(IV)的多肽相比具有至少2.0倍的α螺旋度增加。
66.權利要求62，通式(I)的多肽，其中通過圓二色光譜測定該多肽與通式(IV)的多肽相比具有至少2.5倍的α螺旋度增加。
67.權利要求62，通式(I)的多肽，其中通過圓二色光譜測定該多肽與通式(IV)的多肽相比具有至少3倍的α螺旋度增加。
68.權利要求62，通式(I)的多肽，其中通過圓二色光譜測定該多肽與通式(IV)的多肽相比具有至少4倍的α螺旋度增加。
69.鑑定用於抑制細胞凋亡的候選化合物的方法，包括；提供線粒體；使該線粒體與權利要求1的化合物接觸；測量細胞色素c釋放；以及與缺少權利要求1的化合物時的細胞色素c釋放比較在存在權利要求1的化合物時的細胞色素c釋放，其中在存在權利要求1的化合物時細胞色素c釋放降低則鑑定該權利要求1的化合物為用於抑制細胞凋亡的候選化合物。
全文摘要
在此描述了新的多肽及其製備方法和用途。該多肽包括交聯的(「烴環鉤」)部分以在兩個胺基酸部分之間提供限制該多肽二級結構的栓鏈。在此描述的多肽可用於治療以過度的或不適當的細胞死亡為特徵的疾病。
文檔編號C07K14/00GK1906209SQ200480039945
公開日2007年1月31日 申請日期2004年11月5日 優先權日2003年11月5日
發明者洛倫·D·沃倫斯基, 斯坦利·J·科斯邁耶, 格雷戈裡·弗迪恩 申請人:達納-法伯癌症研究所股份有限公司