Csf2rb基因在前列腺癌骨轉移中的應用的製作方法

2023-06-03 02:05:26 2

Csf2rb基因在前列腺癌骨轉移中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種人CSF2RB蛋白及其應用，用於製備前列腺癌骨轉移診斷及治療的產品。本發明的CSF2RB蛋白可作為診斷前列腺癌骨轉移的特異性標誌蛋白，使前列腺癌骨轉移的診斷更加準確、快速；本發明的CSF2RB蛋白還可作為製備治療前列腺癌骨轉移的分子藥物，提供新的前列腺癌骨轉移的治療途徑。
【專利說明】CSF2RB基因在前列腺癌骨轉移中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於蛋白治療和診斷【技術領域】，特別是涉及一種CSF2RB蛋白在前列腺癌骨轉移的早期診斷和治療中的應用。
【背景技術】
[0002]前列腺癌(Prostate Cancer, PCa)是男性泌尿生殖系統最常見的惡性腫瘤之一，在我國超過80%的前列腺癌患者在確診時已經發生骨轉移，而骨轉移是導致前列腺癌患者死亡的重要原因。所以，前列腺癌骨轉移的診斷，尤其對骨轉移的早期診斷，是臨床診療和預後的關鍵。
[0003]目前前列腺癌骨轉移的診斷方法主要包括放射性核素全身骨顯像、前列腺特異性抗原及骨標誌物檢測這三種手段。但放射性核素全身骨顯像是針對已經出現了骨轉移病灶的患者而言，要想在患者一開始發生成熟的骨質溶解破壞之時甚至之前就發現骨轉移趨勢，特異性骨標記物的檢測無非是一個很好的選擇。
[0004]目前廣泛應用的前列腺特異性抗原(PSA)在前列腺癌和前列腺增生症(BPH)患者血清中均可增高，所以它對前列腺癌骨轉移的篩選診斷來說，特異性仍不高，它只是監測前列腺癌預後的一個重要標記物。除外PSA，近年來關注的骨形成標誌物鹼性磷酸酶(ALP)、骨吸收標誌物抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b)與I型膠原吡啶交聯終肽(ICTP)標記物，在診斷前列腺癌骨轉移中的敏感性分別為59.3 %、37.0 %、59.3%，特異性則為96.7 %、80.0%,76.7% ;PSA、TRACP5b、ALP、ICTP診斷前列腺癌骨轉移的價值相當，聯合檢測並動態觀察可能有利於前列腺癌骨轉移的早期診斷，但它們的敏感性和特異性均不令人滿意。所以早期診斷骨轉移和指導個性化治療的分子分型診斷仍是我們面臨的極大挑戰，而發現靈敏度和特異性更高的新的腫瘤標誌物，是提高前列腺癌骨轉移早期診斷水平的關鍵。
[0005]目前，對於中晚期前列腺癌患者，手術治療的效果差，大多數採用藥物治療。根據不同的病情可以採用化學藥物治療、外放射治療、放射性核素內放射治療以及各種療法的綜合應用等。然而，放化療藥物不僅作用於腫瘤，還可以作用於腫瘤周圍健康的組織，因而在殺傷腫瘤的同時，也給機體帶來了很大的副作用，最終影響對腫瘤的治療效果。
[0006]因此，本領域迫切需要開發早期判斷前列腺癌骨轉移的特異性標誌物，並開發前列腺癌骨轉移的靶向藥物。

【發明內容】

[0007]本發明提供了 CSF2RB基因或其蛋白在預測或診斷前列腺癌骨轉移的應用，本發明還提供了 CSF2RB能夠有效抑制前列腺癌的骨轉移或前列腺癌細胞的骨轉移。
[0008]本發明第一方面，提供了一種集落刺激因子2受體β (Colony StimulatingFactor2Receptor, Beta, CSF2RB)基因或其蛋白的用途，用於製備預測或檢測前列腺癌骨轉移的試劑或試劑盒。
[0009]在另一優選例中，所述CSF2RB基因來自哺乳動物，較佳地，來自齧齒動物(小鼠或大鼠)或靈長動物(例如人)；更佳地，來源於人。
[0010]在另一優選例中，所述CSF2RB基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.:1所示，其編碼的蛋白序列如SEQ ID N0.:2所示。
[0011]在另一優選例中，所述的試劑包括CSF2RB的特異性引物、特異性抗體、探針和/或
[0012]在另一優選例中，所述的檢測CSF2RB蛋白或mRNA的檢測試劑包括:
[0013](a).抗CSF2RB蛋白的特異性抗體；和/或
[0014](b).特異性擴增CSF2RB的mRNA或cDNA的特異性引物。
[0015]在另一優選例中，所述的檢測包括酶聯免疫反應法(ELISA法)檢測或時間分辨免疫螢光法(TRFDWi)檢測。
[0016]在另一優選例中，所述的CSF2RB蛋白或其特異性抗體偶聯有或帶有可檢測標記。
[0017]在另一優選例中，所述可檢測標記選自下組:生色團、化學發光基團、螢光團、同位素或酶。
[0018]在另一優選例中，所述CSF2RB的特異性抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。
[0019]在另一優選例中，所述檢測是測定組織樣品。
[0020]在另一優選例中，所述的組織樣品包括前列腺癌組織和癌旁組織。
[0021]在另一優選例中，所述的癌旁組織為正常組織。
[0022]本發明第二方面，提供了一種用於檢測前列腺癌骨轉移的診斷試劑盒，所述的試劑盒含有一容器，所述容器中含有檢測CSF2RB蛋白或mRNA的檢測試劑；以及標籤或說明書，所述標籤或說明書註明所述試劑盒用於檢測前列腺癌骨轉移。
[0023]在另一優選例中，所述的檢測前列腺癌骨轉移指判斷前列腺癌骨轉移是否發生，和/或判斷發生前列腺癌骨轉移的可能性(易感性)大小。
[0024]在另一優選例中，所述的檢測包括臨床檢測、輔助檢測或早期檢測。
[0025]在另一優選例中，所述判斷包括預先判斷(預測)。
[0026]在另一優選例中，所述的檢測CSF2RB蛋白或mRNA的檢測試劑包括:
[0027](a).抗CSF2RB蛋白的特異性抗體；和/或
[0028](b).特異性擴增CSF2RB的mRNA或cDNA的特異性引物。
[0029]在另一優選例中，所述的標籤或說明書中註明以下內容:
[0030]當檢測對象的前列腺癌細胞或組織中CSF2RB表達量El與正常前列腺細胞或組織的CSF2RB表達量E2之比> 2，則提示該檢測對象前列腺癌骨轉移的機率高於普通人群。
[0031]在另一優選例中，所述的E2是正常人群的正常前列腺細胞或組織的CSF2RB表達量。
[0032]在另一優選例中，所述的正常前列腺細胞或組織包括癌旁的前列腺細胞或組織。
[0033]在另一優選例中，所述的表達量是相對於對照基因(如β -肌動蛋白)的相對表達量。
[0034]本發明第三方面，提供了一種CSF2RB抑制劑的用途，用於製備預防或治療前列腺癌骨轉移的藥物組合物。
[0035]在另一優選例中，所述CSF2RB基因來自哺乳動物，較佳地，來自齧齒動物(小鼠或大鼠)或靈長動物(例如人)；更佳地，來源於人。[0036]在另一優選例中，所述CSF2RB基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.:1所示，其編碼的蛋白序列如SEQ ID N0.:2所示。
[0037]在另一優選例中，所述的抑制劑包括:CSF2RB的抗體、CSF2RB核酸的反義RNA、microRNA、siRNA、shRNA 以及 CSF2RB 的活性抑制劑。
[0038]在另一優選例中，所述的siRNA序列如SEQ ID N0.:7和SEQ ID N0.:8所示。
[0039]在另一優選例中，所述的shRNA序列如SEQ ID N0.:9和SEQ ID N0.: 10所示。
[0040]在另一優選例中，所述的藥物組合物包括CSF2RB抑制劑作為活性成分，和藥學上可接受的載體。
[0041]在另一優選例中，所述的藥物通過選自下組的用藥方式進行給藥:口服、靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、直腸灌注、鼻腔噴霧、口腔噴霧、皮膚局部或全身經皮用藥。
[0042]在另一優選例中，所述的藥物的製劑選自下組:片劑、膠囊劑、注射劑、顆粒劑、噴霧劑。
[0043]在另一優選例中，所述的CSF2RB抑制劑以0.01_20mg/kg體重的劑量(每次或每天)施用於哺乳動物。
[0044]在另一優選例中，所述的哺乳動物包括人、小鼠、大鼠，更佳地，為人。
[0045]本發明第四方面，提供了一種體外非治療性抑制前列腺癌遷移的方法，包括步驟:在CSF2RB抑制劑存在下，培養前列腺癌細胞，從而抑制前列腺癌細胞遷移。
[0046]在另一優選例中，所述的方法包括向前列腺癌細胞的培養體系中添加CSF2RB抑制劑，從而抑制癌細胞遷移。
[0047]在另一優選例中，所述的CSF2RB抑制劑的濃度為0.5_5mg/mL。
[0048]本發明第五方面，提供了一種篩選用於抑制前列腺癌骨轉移或前列腺癌細胞遷移的化合物的方法，包括步驟:
[0049](a)測試組中，在前列腺癌細胞的培養體系中添加測試化合物，並觀察所述測試組的細胞中CSF2RB的表達量和/或活性；在對照組中，在相同細胞的培養體系中不添加測試化合物，並觀察對照組的所述細胞中CSF2RB的表達量和/或活性；
[0050]其中，如果測試組中細胞的CSF2RB的表達量和/或活性小於對照組，就表明該測試化合物是對CSF2RB的表達和/或活性有抑制作用的治療前列腺癌骨轉移或前列腺癌細胞遷移的化合物；和/或
[0051] (b)對於步驟(a)中獲得的候選化合物，測試所述候選化合物對前列癌細胞骨轉移或前列腺癌細胞遷移的抑制作用。
[0052]在另一優選例中，在步驟(b)中包括步驟:向測試組前列腺癌細胞的培養體系中添加測試化合物，並觀察前列腺癌細胞移動的距離的數量和/或侵襲情況；向對照組前列腺癌細胞的培養體系中不添加測試化合物，並觀察前列腺癌細胞移動的距離的數量和/或侵襲情況；其中，如果測試組中前列腺癌細胞的遷移距離或侵襲數量顯著小於對照組，就表明該測試化合物是對前列腺癌骨轉移前列腺癌細胞遷移有抑制作用的化合物。
[0053]本發明第六方面，提供了一種預測或診斷前列腺癌骨轉移的方法，包括步驟:
[0054](i).準備受試者測試樣品；
[0055](ii).檢測測試樣品中CSF2RB相對於對照基因(如β -肌動蛋白)的mRNA表達量E1，與正常前列腺細胞或組織的CSF2RB表達量E2 (即參比值)，當其比值> 2則提示該檢測對象腫瘤骨轉移的機率高於普通人群。
[0056]在另一優選例中，所述測試樣品為組織樣品。
[0057]在另一優選例中，所述參比值為非腫瘤樣品中CSF2RB的表達量。
[0058]在另一優選例中，所述檢測步驟(ii)包括檢測CSF2RB mRNA的量，或CSF2RBcDNA的量；和/或檢測CSF2RB蛋白的量。
[0059]在另一優選例中，所述檢測步驟(ii)包括通過RT-PCR或PCR方法進行檢測。
[0060]在另一優選例中，所述的檢測步驟(ii)包括使用抗CSF2RB蛋白的抗體進行檢測。
[0061]本發明第七方面，提供了一種抑制前列腺癌骨轉移或前列腺癌細胞遷移的方法，包括步驟:給需要治 療的對象(哺乳動物)施用安全有效量的CSF2RB抑制劑。
[0062]在另一優選例中，所述的抑制劑包括:CSF2RB的抗體、CSF2RB核酸的反義RNA、microRNA、siRNA、shRNA 以及 CSF2RB 的活性抑制劑。
[0063]應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限於篇幅，在
此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0064]圖1A顯示了正常前列腺組織；圖1B前列腺組織腺細胞團經雷射顯微切割後，HE染色的照片(XlOO)0
[0065]圖2SDS-PAGE分離人正常前列腺細胞、PC-3細胞中的膜蛋白，並將每個泳道的凝膠平分為8段。
[0066]圖3A CSF2RB蛋白的總離子流圖；圖3B CSF2RB蛋白的二級質譜圖；圖3CS0SH網站查詢CSF2RB蛋白的跨膜區域(TMD)，提示CSF2RB為具有2個跨膜區的膜蛋白。
[0067]圖4顯示了 CSF2RB基因在三種細胞中表達情況，RT-PCR結果顯示該基因在骨轉移來源的PC-3細胞中表達，在人正常前列腺上皮細胞(RWPE-1)及腦轉移來源的前列腺癌DU-145細胞中不表達。
[0068]圖5的Western-blot實驗顯示CSF2RB蛋白在人正常前列腺細胞及三種不同轉移潛能前列腺癌細胞中的表達情況。CSF2RB在人正常前列腺上皮細胞RWPE-1中幾乎未檢測到表達；在淋巴轉移來源的LNcap細胞及腦轉移來源的DU145細胞中均未檢測到表達；在骨轉移來源的PC-3細胞中表達量較高。
[0069]圖6免疫組化實驗示CSF2RB蛋白在人前列腺正常組織、前列腺癌組織中的表達情況。A.人正常前列腺組織(N):CSF2RB在N中幾乎未檢測到表達；B.人前列腺癌組織:CSF2RB在前列腺癌組織中呈弱棕黃色表達(弱陽性)；C.人前列腺癌骨轉移組織:CSF2RB在人前列腺癌骨轉移組織中呈強棕黃色表達(強陽性)；D.人前列腺癌腹壁轉移組織:CSF2RB在人前列腺癌腹壁轉移組織中呈弱棕黃色表達(弱陽性)。
[0070]圖 7CSF2RB-siRNA 下調 PC-3 細胞 CSF2RB mRNA 表達的 real-time PCR 結果，CSF2RBmRNA 基因下調 70% -75%。
[0071]圖8A.細胞劃痕實驗觀察CSF2RB mRNA下調前後細胞遷移情況(第一排從左至右分別為Oh陰性對照及兩條CSF2RB-shRNA下調PC-3細胞CSF2RB mRNA基因前，第二排從左至右分別為24h陰性對照及兩條CSF2RB-shRNA下調PC-3細胞CSF2RBmRNA後)；CSF2RB下調後可見細胞遷移能力較對照組明顯減弱。B.用公式計算抑制CSF2RB後PC-3細胞的相對遷移距離明顯下降，*P<0.05。C.Boyden小室觀察CSF2RB_shRNA下調PC-3細胞CSF2RBmRNA基因前後PC-3細胞侵襲能力(sh_NC陰性對照，下調前；CSF2RB_shl、CSF2RB_sh2分別為下調PC-3細胞CSF2RB mRNA基因後)，CSF2RB下調後，PC-3細胞數量明顯減少，說明PC-3細胞的侵襲能力較對照組明顯減弱。D.與對照組相比，CSF2RB下調組侵襲細胞數量平均值明顯減少，*P〈0.05。
[0072]圖9CSF2RB-shRNA下調PC-3細胞CSF2RB mRNA表達，PC-3細胞生長速度明顯減慢。
[0073]圖1OWestern-Blot實驗檢測PC-3中CSF2RB下調前後，其下遊通路蛋白T-AKT (總AKT) ,ρ-ΑΚΤ (磷酸化 AKT)及 mTOR 的變化。PC_3Sramble 為 CSF2RB 下調前，PC_3sh_CSF2RB為CSF2RB下調後；可見CSF2RB下調後p_AKT、mTOR在PC-3細胞中有不同程度的下調。
[0074]圖llWestern-blot檢測DU145細胞中過表達CSF2RB對PI3K/Akt信號通路和MAPK信號通路的影響。如圖所示，經CSF2RB的受體GM-CSF因子刺激/非刺激DU145細胞後，過表達CSF2RB均促進Akt和Erkl/2磷酸化；此外過表達CSF2RB在GM-CSF刺激後降低了遷移抑制蛋白E_cadherin( 鈣黏蛋白)的表達。
【具體實施方式】
[0075]本發明人經過廣泛而深入的研究，通過大量篩選並通過細胞生物學的研究，首次證明CSF2RB蛋白促進前列腺癌細胞的增殖，是一個前列腺癌轉移的促進因子，具體地，本發明通過從一株骨轉移來源的細胞系中，篩選出與已知前列腺癌骨轉移因子(趨化因子CXCL12的受體CXCR4)不同的新的相關蛋白CSF2RB蛋白。基於本發明，將CSF2RB蛋白首次作為診斷前列腺癌轉移尤其是骨轉移的特異性標誌蛋白，可使得前列腺癌骨轉移診斷更準確、快速。此外，本發明CSF2RB蛋白的抑制劑或拮抗劑，可作為製備預防或治療前列腺癌轉移的分子藥物，提供新的治療途徑。在此基礎上完成了本發明。
[0076]CSF2RB蛋白和多核苷酸
[0077]在本發明中，「本發明蛋白」、「本發明多肽」、「 CSF2RB蛋白」可互換使用，指集落刺激因子 2 受體 β 蛋白，(Colony Stimulating Factor2Receptor, Beta, CSF2RB)。應理解，所述術語還包括CSF2RB的活性片段和衍生物。
[0078]在本發明中，「本發明基因」、「本發明多核苷酸」指編碼CSF2RB蛋白或其活性片段和衍生物的核苷酸序列，包括正義和反義核酸。
[0079]在本發明中，術語「CSF2RB蛋白」或「CSF2RB多肽」可互換使用，都指具有人蛋白CSF2RB胺基酸序列的蛋白或多肽。
[0080]集落刺激因子2 受體 β (Colony Stimulating Factor2Receptor, Beta, CSF2RB)是具有2個跨膜結構的膜蛋白，以β鏈的形式構成細胞因子IL-3、IL-5和GM-CSF受體的側鏈。共同β鏈(hi3c)，即CSF2RB，在高親和的配體結合及信號轉導中是必需的。研究發現，CSF2RB主要在血液系統疾病中研究較多，既促進造血細胞增殖又促進分化，在維持造血細胞增殖、分化、自我更新的平衡中具有重要作用。
[0081]一種優選的CSF2RB基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.:1所示；其編碼的CSF2RB蛋白序列如SEQ ID N0.:2所示。
[0082]如本文所用，「分離的」是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。
[0083]如本文所用，「分離的CSF2RB蛋白或多肽」是指CSF2RB蛋白基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化CSF2RB蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯醯胺凝膠上能產生單一的主帶。在本發明中，CSF2RB蛋白包括融合蛋白和非融合蛋白。
[0084]本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
[0085]本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。
[0086]編碼CSF2RB的成熟多肽的多核苷酸包括:只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。術語「編碼多肽的多核苷酸」可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
[0087]本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的胺基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼多肽的功能。
[0088]本發明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段，包括正義和反義的核酸片段。如本文所用，「核酸片段」的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用於核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼CSF2RB蛋白的多核苷酸。
[0089]本發明的人CSF2RB核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據已公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然後再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
[0090]一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。[0091 ] 此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。
[0092]應用PCR技術擴增DNA/RNA的方法被優選用於獲得本發明的基因。用於PCR的引物可根據本文所公開的本發明的序列信息適當地選擇，並可用常規方法合成。可用常規方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
[0093] 本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，以及用本發明的載體或CSF2RB蛋白編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述多肽的方法。[0094]通過常規的重組DNA技術，可利用本發明的多核苷酸序列可用來表達或生產重組的CSF2RB蛋白。一般來說有以下步驟:
[0095](I).用本發明的編碼人CSF2RB蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；
[0096](2).在合適的培養基中培養的宿主細胞；
[0097](3).從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。
[0098]本領域的技術人員熟知的方法能用於構建含人CSF2RB編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
[0099]此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用於選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新黴素抗性以及綠色螢光蛋白(GFP)，或用於大腸桿菌的四環素或氨苄青黴素抗性。
[0100]包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用於轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
[0101]宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺 乳動物細胞。代表性例子有:大腸桿菌，鏈黴菌屬的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CH0、COS、或293細胞的動物細胞等。
[0102]用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期後收穫，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法:磷酸鈣共沉澱法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。
[0103]獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適於宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度後，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
[0104]在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但並不限於:常規的復性處理、用蛋白沉澱劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結
口 ο
[0105]抑制劑
[0106]利用本發明蛋白，通過各種常規篩選方法，可篩選出與CSF2RB蛋白發生相互作用的物質，尤其是抑制劑等。
[0107]本發明CSF2RB蛋白的抑制劑(包括抗體、反義核酸以及其他抑制劑)，當在治療上進行施用(給藥)時，可抑制CSF2RB蛋白的表達和/或活性，進而抑制前列腺癌的骨轉移或前列腺癌細胞的遷移。通常，可將這些物質配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8,較佳地pH約為6-8,儘管pH值可隨被配製物質的性質以及待治療的病症而有所變化。配製好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於):瘤內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、皮內、或局部給藥。
[0108]可用於本發明的抑制劑包括:CSF2RB的抗體、抑制性mRNA、CSF2RB核酸的反義RNA、microRNA (miRNA)、siRNA、shRNA 以及 CSF2RB 的活性抑制劑。其中，典型的 CSF2RB 抑制劑為抑制性miRNA、siRNA。
[0109]典型地，將CSF2RB基因作為製備預防或治療前列腺癌骨轉移或前列腺癌細胞遷移的藥物的靶點的技術方案包括以下方案:
[0110]1.化學合成雙鏈核糖核酸分子，其序列特異性針對CSF2RB基因序列，利用脂質體包裹遞送至腫瘤細胞內幹擾CSF2RB基因的表達，觀察軟瓊脂克隆形成能力、細胞遷移能力等細胞生物學特性的 改變。可利用本領域常規的方法來設計和合成特異性針對CSF2RB的核酸序列(如siRNA)。
[0111]2.利用各種載體，包括DNA載體、慢病毒載體來幹擾CSF2RB基因的表達，達到體內幹擾CSF2RB基因的效果，檢測它們對裸鼠瘤體腹腔擴散或骨轉移的治療效果，從而實現抑制前列腺癌骨轉移或癌細胞遷移的目的。
[0112]3.獲得能夠特異性抑制CSF2RB基因轉運活性的多肽、單克隆抗體，達到抑制CSF2RB活性的目的，從而現實抑制前列腺癌細胞骨轉移或癌細胞遷移的目的。
[0113]本發明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發明CSF2RB抑制劑(如抗體、反義序列(如siRNA)、或抑制劑)以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但並不限於):鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物製劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行製備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規方法進行製備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約I微克-10毫克/千克體重。
[0114]抗體
[0115]本發明還包括對人CSF2RB蛋白具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這裡，「特異性」是指抗體能結合於人CSF2RB基因產物或片段。較佳地，指那些能與人CSF2RB基因產物或片段結合但不識別和結合於其它非相關抗原分子的抗體。本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行製備。例如，將提純的人CSF2RB基因產物或它的抗原片段注射入動物體內以產生多克隆抗體。同樣，表達人CSF2RB蛋白或它的抗原的細胞也可以用來對動物致免疫而產生抗體。
[0116]本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab』或(Fab) 2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體。
[0117]本發明的抗體包括可以抑制CSF2RB功能的抗體，也可以是不影響人CSF2RB功能的抗體。每一類抗體都可以通過對人CSF2RB基因產物的片段或功能域致免疫而產生，而人CSF2RB基因產物及其片段可以用重組方法產生或用多肽合成儀進行合成。與非修飾形式的CSF2RB基因產物結合的抗體，可以利用在原核細胞(如E.coli)中產生的基因產物來免疫動物而得到。與翻譯後修飾形式如糖基化或磷酸化CSF2RB蛋白或多肽結合的抗體，可以利用在真核細胞如酵母或昆蟲細胞中產生的基因產物來免疫動物而得到。
[0118]可用於本發明的CSF2RB抗體可以是抗人CSF2RB蛋白抗體。本發明的抗人CSF2RB蛋白抗體可用於免疫組織化學技術中，檢測活檢標本中的人CSF2RB蛋白。
[0119]藥物組合物和給藥方式
[0120]本發明提供了含有活性成分(a)CSF2RB抑制劑；(b)藥學上可接受的載體。
[0121]在本發明的藥物組合物中，CSF2RB抑制劑CSF2RB抑制劑的含量沒有特別限制，通常為 0.01-95wt%，較佳地為 0.l-90wt%o
[0122]本發明的藥物組合物可以是單方製劑，也可以是複方製劑。
[0123]在複方製劑中，除了含有CSF2RB抑制劑之外，還可包含其他抗腫瘤化合物，例如化療劑。代表性的化療劑包括(但並不限於):烷化劑、抗代謝物、葉酸類似物、嘧啶類似物、嘌呤類似物以及相關抑制劑、長春花鹼類、epipodopyvllotoxins、抗生素、L 一天冬酞胺酶、拓撲異構酶抑制劑、幹擾素、鉬配位複合物、大黃素取代的脲、甲基肼衍生物、腎上腺皮質抑制劑、腎上腺皮質類固醇、孕激素、雌激素、抗雌激素、雄激素、抗雄激素以及促性腺激素-釋放激素類似物。優選的化療劑包括:5—氟尿嘧啶(5-FU)、甲醯四氫葉酸、伊立替康、奧沙利鉬、卡培他濱、紫杉醇和多西紫衫醇。
[0124]本發明的藥物組合物的劑型和製備方法沒有特別限制，可用本領域常規通用的製法製成片劑、膠囊、顆粒劑、緩釋劑、注射劑等各種劑型。優選的劑型是口服製劑(如片劑)和注射劑。
[0125]在本發明中，CSF2RB抑制劑或含CSF2RB抑制劑的藥物製劑可用於預防和治療前列腺癌骨轉移或前列腺癌細胞遷移。
[0126]在本發明中，給藥方式沒有特別限制，可以通過口服、靜脈內、肌內、腹腔內或皮下等途徑給藥。
[0127]本發明製劑可以每天服用或給藥一次或兩次、或多次，或者以緩釋方式給藥。優選的方式是每天服藥一次，因為這樣便於病人堅持，從而顯著提高病人服藥的順應性。
[0128]服用時，極大多數病例一般每天應用的總劑量為每人Img~200g，較佳地為IOmg ~100g0
[0129]篩選方法
[0130]本發明還提供了基於CSF2RB進行藥物篩選的方法。一種方法是先篩選影響(抑制)CSF2RB表達或活性的化合物，然後對篩選出的化合物進一步測試其對前列腺癌細胞的抑制作用。
[0131]本發明提供的篩選預防或治療前列腺癌骨轉移、前列腺癌細胞遷移的候選化合物的方法，基於該化合物對CSF2RB的表達量和/或活性的影響，一種典型的篩選方法包括步驟:
[0132](a )測試組中，在前列腺癌細胞的培養體系中添加測試化合物，並觀察所述測試組的細胞中CSF2RB的表達量和/或活性；在對照組中，在相同細胞的培養體系中不添加測試化合物，並觀察對照組的所述細胞中CSF2RB的表達量和/或活性；
[0133]其中，如果測試組中細胞的CSF2RB的表達量和/或活性小於對照組，就表明該測試化合物是對CSF2RB的表達和/或活性有抑制作用的預防或治療前列腺癌骨轉移的候選化合物。和/或[0134](b)對於步驟(a)中獲得的候選化合物，進一步測試其對前列腺癌細胞骨轉移或遷移的抑制作用。如，在測試組中，前列腺癌細胞的培養體系中添加測試化合物，並觀察癌細胞移動的距離的數量和/或侵襲情況；在對照組中，在前列腺癌細胞的培養體系中不添加測試化合物，並觀察癌細胞移動的距離的數量和/或侵襲情況；其中，如果測試組中癌細胞的遷移距離或侵襲數量顯著小於對照組，就表明該測試化合物是對前列腺癌骨轉移細胞或前列腺癌細胞遷移有抑制作用的預防或治療前列腺癌的候選化合物。
[0135]檢測方法和試劑盒
[0136]本發明涉及定量和定位檢測人CSF2RB蛋白水平或mRNA水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的。試驗中所檢測的人CSF2RB蛋白水平，可以用於診斷前列腺癌的骨轉移或前列腺癌細胞的遷移。
[0137]一種檢測樣品中是否存在CSF2RB蛋白的方法是利用CSF2RB蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括:將樣品與CSF2RB蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體複合物，形成了抗體複合物就表示樣品中存在CSF2RB蛋白。
[0138]CSF2RB蛋白或其多核苷酸可用於CSF2RB蛋白相關疾病的診斷和治療。本發明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列或DNA晶片上，用於分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。抗CSF2RB的抗體可以固定在蛋白質晶片上，用於檢測樣品中的CSF2RB 蛋白。
[0139]本發明還提供了一種檢測前列腺癌是否有骨轉移的試劑盒，它含有特異性擴增CSF2RB的引物對和/或CSF2RB特異性抗體以及標籤或說明書。
[0140]其中，所述的標籤或說明書註明以下內容:當檢測對象的CSF2RB相對-肌動蛋白的mRNA表達量與非癌症組織的CSF2RB相對-肌動蛋白的mRNA表達量之比>2，則提示該檢測對象前列腺癌骨轉移的機率高於普通人群。
[0141]一種典型的本發明的試劑盒可用於檢測人前列腺組織樣品。
[0142]本發明還包括一種抑制前列腺癌骨轉移或前列腺癌細胞遷移的方法，包括步驟:給需要治療的對象(哺乳動物)施用安全有效量的CSF2RB抑制劑。
[0143]本發明的有益效果
[0144]1.本發明CSF2RB基因或蛋白可以用於作為診斷或預測前列腺癌骨轉移的特異性標誌物，即CSF2RB高表達者前列腺癌骨轉移的機率更大。
[0145]2.本發明CSF2RB抑制劑可以有效地抑制前列腺癌的骨轉移或前列腺癌細胞的遷移，可作為預防或治療前列腺癌骨轉移或前列腺癌細胞遷移的藥物。
[0146]3.本發明的CSF2RB抑制劑還可以用作藥物的篩選，從而篩選出對能夠有效抑制前列腺癌骨轉移或前列腺癌細胞遷移的藥物。
[0147]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人,分子克隆:實驗室手冊(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數是重量百分比和重量份數。
[0148]通用方法:
[0149](I)雷射顯微切割(LCM)獲取正常前列腺上皮細胞[0150]由於前列腺外周區腺體豐富，佔前列腺腺體體積的70%，且為前列腺癌的好發區，故該區為正常前列腺與前列腺癌對比分析蛋白表達譜的最佳選擇區。取10例無前列腺病史的屍檢人前列腺組織標本，取其外周區部分製備IOum厚度冰凍切片；改良HE染色；用LCM選擇性獲取腺上皮細胞團，並收集至收集管中。
[0151](2)前列腺癌細胞的培養
[0152]PC-3細胞培養於F12培養基中，培養基中含10%新生胎牛血清、I % L-穀氨醯胺、100U.mL-Ι青黴素、IOOmg.L-1鏈黴素。於37°C、5% C02孵箱中培養，選用對數生長期細胞進行實驗。
[0153](3)膜蛋白的樣品製備及定量
[0154]3.1膜蛋白的樣品製備
[0155](I)首先收集50mg用LCM獲取的人正常前列腺細胞團，然後用細胞刮刀收集細胞培養瓶中的PC-3細胞3-5 X I O6。
[0156](2)用試劑盒中2ml冷洗液洗三種細胞，各兩遍。
[0157](3)每種細胞中均加入IOul蛋白酶抑制劑，並快速加入2ml蛋白提取液1，充分混勻後，4°C搖床孵育lOmin。
[0158](4)4°C，16000g離心 15min後，得到的上清即為胞漿蛋白。
[0159](5)將上清儘量吸乾淨，加入5μ I蛋白酶抑制劑，然後迅速加入1ml蛋白提取液2，充分混勻後，4°C搖床孵育30min。
[0160](6)4°C，16000g離心15min後，得到的上清即為膜蛋白。
[0161](7)將上清移到另一離心管中，並於_80°C冰箱備用。
[0162]3.2BCA蛋白定量
[0163](I)以牛血清白蛋白(BSA)為標準品，按BCA蛋白檢測試劑盒說明書將A液與B液按50:1的體積比混合為工作液。
[0164](2)在96孔板中分別加入25 μ I的標準品和/或待測樣本，每個樣本設3復孔。
[0165](3)各孔中加入200 μ I工作液，混勻，37°C孵育30min。
[0166](4)用酶標儀於562nm波長處測定各孔的OD值，參照標準品繪製標準曲線，計算各待測樣品的蛋白濃度。
[0167](4) SDS-PAGE
[0168]兩組樣品，每組各IOOug膜蛋白在分離膠為13%、濃縮膠為5%的SDS-PAGE膠上進行分離，起始電流15mA、15min,然後加大電流至30mA, 40min,直至溴酹蘭到凝膠底端,停止電泳。電泳結束後用HSC固定液固定I小時，然後進行膠體考馬斯亮藍染色I小時，最後脫色。
[0169](5)膠內酶解及質譜分析
[0170]考馬斯亮藍染色後，每個樣品的整個泳道均被平分為8份凝膠，進行膠內酶解，然後使用IDLC-LTQ進行分析，C18柱(0.15mm直徑，15cm長)，上樣為自動進樣器，上樣後樣品經過C18Trap柱脫鹽，然後在C18柱上進行分離(A相為0.1 % FA的Millpore水，B相為
0.1 % FA84%乙腈水溶液，梯度為2小時內從4%的B相上升到50%的B相)，質譜設備為LTQ(Thermo), Metal needle 電噴霧。
[0171](6)資料庫查詢[0172]對串聯質譜的原始數據使用BioWorkSTM3.0軟體中的Turbo SEQUEST程序搜索IPI Human V3.15.1的資料庫，最後得到鑑定的蛋白質結果。可被承認的SEQUEST搜索結果必須是DelCN ^0.1(無論電荷什麼狀態)。帶一個電荷的肽必須是胰蛋白酶肽，且相關得分(Xcorr)不得少於1.9，帶2個電荷的胰蛋白酶肽或部分胰蛋白酶肽的相關得分不得少於2.2分，帶3個電荷的胰蛋白酶肽或部分胰蛋白酶肽的相關得分不得少於3.75分。
[0173](7)蛋白質信息匯總及生物信息學查詢
[0174]使用Buildsummary軟體合併每個組的所有條帶查庫結果輸出鑑定蛋白質列表。用GOA(http://www.eb1.ac.uk/GOA/)對質譜鑑定後的蛋白質按照細胞組分、功能、生物學途徑進行分類；對比人正常前列腺細胞、PC-3細胞中的蛋白在IPI中的資料庫號獲得兩者的差異膜蛋白質後，找出正常細胞中沒有僅存在於PC-3細胞中的差異膜蛋白質，並通過(http:1Iwm.psort.0rg/)查詢蛋白的亞細胞定位情況。然後用SOSUI (http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/)網站查詢膜蛋白的跨膜區域(TMD),在蛋白的基序內預測跨膜螺旋。
[0175](8)前列腺癌骨轉移侯選靶標蛋白的選擇標準
[0176]為了選出新的前列腺癌骨轉移的侯選標誌蛋白，應用了下面的選擇標準:
[0177](I)沒有在前列腺癌中研究過的新蛋白；
[0178](2)被選出 的蛋白要滿足SEQUEST程序搜索結果的過濾參數(當Charge+1，Xcorr ^ 1.9 ;當 Charge+2, Xcorr > 2.2 ;當 Charge+3, Xcorr ^ 3.75 ;其中 DelCN ^ 0.1)
[0179](3)質譜鑑定結果中:理論譜與實驗譜的離子匹配數/理論譜中離子數> 50% ；
[0180](4)蛋白的二級質譜圖在基線噪聲以上應該是清楚的，b、y離子應該是連續的。
[0181]上述4個條件同時滿足說明蛋白可以作為目標侯選蛋白。
[0182](9)CSF2RB在基因及蛋白水平的表達情況
[0183]9.1半定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)
[0184]①實驗用引物:
[0185]CSF2RB 上遊引物:5』-GCCATAGCAATCAGCAGAACG-3』 (SEQ ID N0.:3)
[0186]下遊引物:5』-GATGAGAAGAGGACCCCCTAAT-3』(SEQ ID N0.:4)
[0187]β-actin 上遊引物:5』-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3』 (SEQ ID N0.:5)
[0188]下遊引物:5』-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3』(SEQ ID N0.:6)
[0189]②實驗流程
[0190]I)常規培養PC-3細胞及RWPE-1細胞，各收集1.5 X IO6個細胞，加ImLTrizol吹打，
[0191]室溫5分鐘。
[0192]2)加氯仿1/5體積(0.2ml)，顛倒混勻10下，室溫5分鐘。4°C，離心
[0193]12000g，15 分鐘。
[0194]3)轉上層水相(約400 μ I)於另一 1.5mlEP管中加等體積異丙醇(約400
[0195]μ I)，混勻室溫10分鐘，4°C，離心12000g, 10分鐘。
[0196]4)棄上清，加冰預冷的75%乙醇(用DEPC水配)lml，4°C離心7500g，
[0197]5 分鐘。
[0198]5)棄上清，空氣乾燥5-10分鐘，溶於DEPC水中至20 μ I (10 μ 1-20 μ I)。[0199]6) RNA分析:在260nm和280nm測定樣品的吸收值，確定RNA質量。
[0200]IOD260 = 40 μ g RNA,計算 RNA 產率。OD260/OD280 = 1.8 ~2.0 之間，說明 RNA 純度高。變性瓊脂糖凝膠電泳，確定抽提RNA完整性和DNA汙染情況。
[0201]7)按下述方法進行逆轉錄:
[0202]I反應體系
MgCI1.2 μ I
[0203]10XRXA PCR BufferI μ I
RNase Free dH23.75 μ I
dXTP MixtureImI
RXase Inhibitor0.25 μ I
AMV Reverse Transcriptase 0.5 u I
[0204]
Oiigo dT-Adaptor Primer 0, 5 μ I
Sample RNAI μ I
Total10 μ I
[0205]II反應條件
[0206]42 °C 30 分鐘
[0207]99 °C5 分鐘
[0208]5 °C5 分鐘
[0209]8)按下述方法進行PCR
[0210]I反應體系
[0211]
5 X PCR Buffer10 μ I
火菌蒸餾水8.75 P I
TaKaRa EX Taq0.25 P I
上遊特異性PCR引物 0.5μ.1
下遊特異性PCR引物 0.5μ I
Total40 P I
[0212]II把8) —①的反應液加入到7)-②的逆轉錄反應結束後的PCR反應管中，輕輕混勻。
[0213]③反應條件
[0214]
【權利要求】
1.一種集落刺激因子 2 受體 β (Colony Stimulating Factor2Receptor, Beta,CSF2RB)基因或其蛋白的用途，其特徵在於，用於製備預測或檢測前列腺癌骨轉移的試劑或試劑盒。
2.如權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述的試劑包括CSF2RB的特異性引物、特異性抗體、探針和/或晶片。
3.如權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述檢測是測定組織樣品。
4.一種用於檢測前列腺癌骨轉移的診斷 試劑盒，所述的試劑盒含有一容器，所述容器中含有檢測CSF2RB蛋白或mRNA的檢測試劑；以及標籤或說明書，所述標籤或說明書註明所述試劑盒用於檢測前列腺癌骨轉移。
5.一種CSF2RB抑制劑的用途，其特徵在於，用於製備預防或治療前列腺癌骨轉移的藥物組合物。
6.如權利要求5所述的用途，其特徵在於，所述的抑制劑包括:CSF2RB的抗體、CSF2RB核酸的反義RNA、microRNA、siRNA、shRNA以及CSF2RB的活性抑制劑。
7.如權利要求5所述的用途，其特徵在於，所述的藥物組合物包括CSF2RB抑制劑作為活性成分，和藥學上可接受的載體。
8.—種體外非治療性抑制前列腺癌遷移的方法，包括步驟:在CSF2RB抑制劑存在下，培養前列腺癌細胞，從而抑制前列腺癌細胞遷移。
9.一種篩選用於抑制前列腺癌骨轉移或前列腺癌細胞遷移的化合物的方法，其特徵在於，包括步驟: (a)測試組中，在前列腺癌細胞的培養體系中添加測試化合物，並觀察所述測試組的細胞中CSF2RB的表達量和/或活性；在對照組中，在相同細胞的培養體系中不添加測試化合物，並觀察對照組的所述細胞中CSF2RB的表達量和/或活性； 其中，如果測試組中細胞的CSF2RB的表達量和/或活性小於對照組，就表明該測試化合物是對CSF2RB的表達和/或活性有抑制作用的治療前列腺癌骨轉移或前列腺癌細胞遷移的化合物；和/或 (b)對於步驟(a)中獲得的候選化合物，測試所述候選化合物對前列癌細胞骨轉移或前列腺癌細胞遷移的抑制作用。
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，在步驟(b)中包括步驟:向測試組前列腺癌細胞的培養體系中添加測試化合物，並觀察前列腺癌細胞移動的距離的數量和/或侵襲情況；向對照組前列腺癌細胞的培養體系中不添加測試化合物，並觀察前列腺癌細胞移動的距離的數量和/或侵襲情況；其中，如果測試組中前列腺癌細胞的遷移距離或侵襲數量顯著小於對照組，就表明該測試化合物是對前列腺癌骨轉移前列腺癌細胞遷移有抑制作用的化合物。
【文檔編號】C12Q1/68GK103966334SQ201410216106
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月20日 優先權日:2014年5月20日
【發明者】李群, 李玉林, 李一雷, 高勇 申請人:李群