枳實總黃酮及其製劑的製備方法和質量控制方法

2023-06-02 08:47:06

專利名稱：枳實總黃酮及其製劑的製備方法和質量控制方法
技術領域：
本發明涉及一種單味中藥有效部位及其製劑的製備方法和質量控制方法，特別是涉及枳實總黃酮及其製劑的製備方法和質量控制方法，屬醫藥技術領域。
背景技術：
消化不良包括功能性和器質性消化不良兩類。無組織結構和生化改變的消化不良可以認為是功能性消化不良，臨床表現可見到上腹不適、飽脹、隱痛、燒心、噯氣、早飽或餐後飽脹加重等，症狀持續時間超過4周。消化不良在成年人很常見，且嚴重影響患者的生活質量，患者常多次就診，耗費巨大，在國、內外均已引起密切關注。各國報導的消化不良的患病率在20％～49％之間。目前，促動力藥是主要的治療藥物。其中，除多潘立酮外，其餘的藥物均因存在的副作用而使其使用受到限制。
近年來，中藥治療功能性消化不良的研究報導甚多，顯示了中藥對該病良好的治療效果，而且通過對枳實消痞丸進行實驗研究，發現體現消導之法的藥物(枳實、厚樸、麥芽)促進胃排空的作用最為明顯。通過查閱《中華人民共和國藥典》2000年版一部、原衛生部藥品標準中藥成方製劑1～20冊、新藥轉正標準1～16冊和《中華人民共和國藥典》1995年版增補本、國家藥品監督管理局藥品審評中心編輯的新藥資料庫，有132種用於消化不良的中成藥，但未見有明確用於功能性消化不良的中成藥。而且，市售的枳實藥材質量優劣的評價標準為柚皮苷含量的高低，無法保證枳實藥材中新橙皮苷有較高含量。
因此，從枳實中提取得到枳實總苷並製成臨床可接受的劑型，並提供能保證有效成分含量更高的質量控制方法，用於運動障礙型功能性消化不良的治療，可以填補這個空白，具有有良好的開發前景。

發明內容
本發明的目的在於提供一種枳實總黃酮的製備方法；本發明的第二個目的在於提供一種枳實總黃酮的質量控制方法；本發明的第三個目的在於提供一種枳實總黃酮片劑的製備方法；本發明的第四個目的在於提供一種枳實總黃酮在促進胃腸動力方面的用途。
本發明目的是通過如下技術方案實現的。
枳實總黃酮的製備方法為取枳實做成枳實藥材粗粉，加5～7倍量60％～80％的乙醇，回流提取2～4次，每次1～3小時；醇溶液濾過，合併濾液，回收乙醇並進一步濃縮、減壓乾燥至幹，幹膏粉碎成細粉，加入5～8倍量水，充分攪拌溶散，加入1/5水量的食鹽，充分攪拌，冷藏靜置24小時；棄去上清液，取沉澱，加入6～8倍量95％～100％的乙醇，回流提取2小時，靜置，取上清液，回收乙醇並進一步濃縮、減壓乾燥至幹，幹膏粉碎成細粉，加入4～10倍量水，充分攪拌溶散，靜置過夜，棄去上清液，取沉澱，減壓乾燥至幹，即得枳實總黃酮原料。
本發明枳實總黃酮的含量測定方法為A.照紫外分光光度法(中國藥典2000年版一部附錄VA)測定。
對照品溶液的製備取柚皮苷對照品，加甲醇製成每1ml含0.5mg的溶液，搖勻，即得；供試品溶液的製備稱取枳實總黃酮細粉20mg，置100ml容量瓶中，加甲醇至刻度，超聲20分鐘，搖勻，過濾，精密吸取續濾液1ml，置10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液；測定法取供試品溶液，以甲醇為空白，在283nm的波長處測定吸收度，計算，即得；枳實總黃酮原料含總黃酮以柚皮苷計，應在60％～80％間。
B.照高效液相色譜法(中國藥典2000年版一部附錄VID)測定。
用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；30～40∶60～70的甲醇-水為流動相；檢測波長為285nm；理論塔板數按柚皮苷峰計算應不低於1500，按新橙皮苷峰計算應不低於1500；對照品溶液的製備稱取在五氧化二磷減壓乾燥器中乾燥36小時的柚皮苷和新橙皮苷對照品，加甲醇製成對照品混合溶液，濃度分別為0.1mg/ml和0.3mg/ml；供試品溶液的製備稱取枳實總黃酮細粉0.02g，置具塞錐形瓶中，加入甲醇25ml，超聲處理20分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，取續濾液，即得；測定法分別吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，即得；枳實總黃酮原料柚皮苷含量應在10％～13％範圍內。
按藥劑學方法，可將本發明枳實總黃酮作為原料，按常規藥劑學方法，製備成各種臨床可接受的劑型，包括但不限於如下劑型當中的一種片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、混懸劑、滴丸、口服液體製劑等。
取枳實總黃酮原料細粉，加入適量低取代羥丙基纖維素、可溶性澱粉，混勻，60％～80％乙醇制粒，乾燥，過篩，加入1％硬脂酸鎂，壓片，薄膜包衣，即得本發明片劑，0.3克/片，每日三次，每次兩片。
用本發明枳實總黃酮製成的各種製劑如片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、混懸劑、滴丸、口服液體製劑等，可按如上所述枳實總黃酮原料的含量測定方法對枳實總黃酮各種製劑進行測定，樣品量可按本發明片劑的日服用量折合為其他製劑的日服用量取樣。經測定，本發明片劑總黃酮含量以柚皮苷計，為135～150mg/片；本發明片劑柚皮苷為18～22mg/片。
已有報導中，枳實有效部位總提物的含量在30％左右，還沒有針對本發明中主要兩個黃酮成分柚皮苷、新橙皮苷的提取工藝報導，我們對本發明工藝進行了進一步水洗-醇沉純化，新橙皮苷含量可以達到90％純度，本發明製劑採用了兩種方法測量總黃酮紫外分光光度法、高效液相色譜法測定柚皮苷、新橙皮苷，含量均在50％以上，可控性好。
而且，枳實總黃酮的製備工藝簡單，適合大生產，每噸加工成本(包括藥材)僅為2萬元，所用試劑還可回收，所用標準品已有成熟的製備方法。而且本發明枳實總黃酮的質量控制方法，把枳實總黃酮原料中枳實總黃酮含量控制在60％～80％間，柚皮苷含量控制在10％～13％間，新橙皮苷含量控制在50％～70％範圍內，使枳實總黃酮原料的質量標準具備了可控性。
由本發明枳實總黃酮製備而成的片劑，其服藥量較一般的複方製劑要少，服用方便，而且能嚴格地控制產品質量。再加之患病人群之眾，當有良好的市場前景，不僅可帶來經濟效益，而且通過改善症狀，提高患者的生活質量而能發揮出一定的社會效益。
同時，採用室溫條件下留樣觀察的方法，對按本發明製備工藝製備的三批枳實總黃酮原料，三批本發明枳實總黃酮片劑進行穩定性考察，結果表明本發明原料和製劑均質量穩定，基本無變化。
經藥效學試驗，本發明枳實總黃酮能提高小鼠小腸推進率，促進正常小鼠小腸運動及拮抗阿託品所致的小鼠小腸運動功能的抑制，對新斯的明所致的小鼠小腸運動亢進無明顯的影響；枳實總黃酮能明顯促進胃的排空。枳實總黃酮高、低劑量對0.6％醋酸所致小鼠扭體反應無明顯影響，說明其無明顯的鎮痛作用；枳實總黃酮低、高劑量對於胃酸、胃蛋白酶的影響不明顯；對於25％乙醇+20mmol/L水楊酸所致的大鼠實驗性胃炎無明顯的影響；枳實總黃酮對於家兔離體腸平滑肌的收縮有抑制作用，可明顯減少其收縮力，既能使乙醯膽鹼所致過度亢進的兔腸肌抑制，又能使阿託品所致過度抑制的兔腸肌興奮，說明其有雙向調節作用。
下面實驗例用於進一步說明本發明但不限於本發明。
實驗例1枳實總黃酮提取純化工藝技術條件優選研究(1)乙醇濃度初選 濃度分別為50％、60％、70％、80％，提取2次，2小時/次。藥液經紗布過濾，合併濾液，減壓回收乙醇並濃縮成稠膏，減壓真空乾燥。比較其出膏率和有效成分的提取率(以新橙皮苷和柚皮苷總量為指標)的影響，結果見表1。
表1不同濃度乙醇提取結果

根據上述結果，選用較高濃度的乙醇提取，其浸膏黃酮苷含量較高，易於淨化處理。
(2)醇提工藝優選為了研究枳實醇提的最佳工藝，我們對醇提工藝採用正交試驗法，在藥材等量的前提下，以乙醇為溶媒，提取淨化工藝以多提取、少破壞、時間短、消耗小、質量好為原則進行優選，比較其不同加醇量、回流時間、回流次數以及不同的醇提濃度對其出膏率和有效成份(以新橙皮苷和柚皮苷總量為指標)提取率的影響。
根據初步實驗結果，用正交實驗法優選提取工藝，以不同加醇量、回流時間、回流次數、醇提濃度4因素3水平，採用L9(34)正交表，進行正交試驗見表2～表6。
表2醇提工藝正交試驗因素水平設計

按照L9(34)正交表安排9次試驗，結果見表3表3醇提工藝正交試驗、L9(34)計算表

表4方差分析表

F1-0.01(2，∞)＝4.61 F1-0.05(2，∞)＝3.0 F1-0.10(2，∞)＝2.3從試驗結果和方差分析表上看，因素D、B、A對結果有非常顯著的影響，C對結果影響較小，影響順序為D＞B＞A＞C。
表5、L9(34)計算表

表6方差分析表

F1-0.01(2，∞)＝4.61 F1-0.05(2，∞)＝3.0 F1-0.10(2，∞)＝2.3從試驗結果和方差分析表上看，因素A、D對結果有非常顯著的影響，B和C對結果有一定影響，影響順序為D＞A＞B＞C。
由上述兩方差結果可以看出，提取次數和醇濃度為出膏量及總苷提取量的主要影響因素，取其最佳條件為60％乙醇，提取時間、乙醇用量在設定選擇範圍內，影響較小，考慮到實際生產的需要，選擇加醇量6倍，每次2小時。
在其他最佳工藝條件基礎上，進一步考察提取次數(1、2、3、4)，確立最佳提取次數，見表7。
表7醇提工藝最佳提取次數考察

由上表可見，在醇濃度、醇用量、提取時間最佳工藝條件下，提取2次，黃酮苷提取轉移率已達到92.8％，從節能角度考慮，選擇提取次數為2次。綜合考慮，選擇最後的最佳工藝為A1B2C2D2。
(3)黃酮類的分離純化根據枳實黃酮類成分水溶性較小的特點，採用水沉(第一次)-高濃度醇提-水沉工藝(第二次)去除水溶性較大的雜質成分，並分別採用稠膏直接加水沉澱(I)、稠膏加澱粉-乾燥-水洗(II)、稠膏加微粉矽膠-乾燥-水洗(III)、稠膏加水分散-食鹽鹽析(IV)、幹膏細粉直接水洗(V)、幹膏細粉水分散-食鹽鹽析(VI)、稠膏鹼溶-酸沉(VII)等純化工藝進行了比較，以去除藥材殘渣和水溶性雜質，其工藝優選結果見表8。
表8枳實醇提取物純化工藝研究

研究表明，由於枳實中含有大量的果膠，使得第一次水沉工藝(果膠含量高時)易產生沉澱溶膠分散現象，黃酮類成分不易下沉，給生產帶來困難。通過採用工藝VII，沉澱明顯，易工業化生產，且食鹽可回收，經兩次水洗，沉澱物中黃酮即可達到新藥要求，且除去了食鹽，操作步驟簡單。
在此基礎上，對工藝VII進行了優化篩選1.水沉鹽析工藝稀醇提取後的幹膏，其中含有大量的水溶性雜質成分，其總黃酮苷含量約為10％，沒有達到技術要求，因此採取水洗沉方法去除水溶性雜質。不同加水量試驗結果如下表9表9第一次水沉工藝考察

考慮到黃酮苷有一定的水溶性，為了在保證溶解、淨化的基礎上，儘量減少黃酮苷的損失，而且在後面還有一步水洗除鹽、淨化過程，因此在第一次水沉時，在保證乾粉充分溶散的基礎上，儘量減少加水量，故選用加5倍量的水洗沉。
經實驗，常溫條件下，在水中加入1/5重量的的食鹽即能出現飽和現象(20℃時氯化鈉固體在水中的溶解度36g)，考慮到水沉液密度較大，且為了方便後續鹽的淨化，不宜在鹽析時沉澱過多的鹽，因此確立該工藝的加鹽量為水量的1/5。通過鹽析來減小枳實黃酮的溶解度、加快沉降過程。
2.醇提淨化工藝2.1乙醇濃度選擇20℃時氯化鈉固體在100％乙醇中的溶解度為0.07g。
100℃時氯化鈉固體在水中的溶解度為40g。
因此選用高濃度的乙醇(95％)提取作為除鹽的第一道工序，並實現了第二步純化。
2.2乙醇用量比較取等量的鹽析後稠膏100ml，分別加入6倍、8倍量的95％乙醇回流2小時，結果提取後的幹膏量分別為18.5g、19.4g，從省時、節能考慮，選用加入6倍量95％乙醇。
3.水沉工藝在經過前兩步次的淨化後，仍有少量食鹽未除去，需進一步純化處理，因此增加第二次水洗沉工藝，並對加水量進行了考察，結果如下表所示表10第二次水沉工藝考察

上述結果顯示，經前兩次純化後，黃酮苷在第二次水洗時易沉降。經10倍量水洗沉，黃酮苷含量達到了中藥新藥的要求，有效部位含量大於50％，因此第二次水洗沉選用加入10倍量水。
實驗例2枳實總黃酮苷紫外分光光度法測定的方法學考察精密稱取柚皮苷2.47mg，用甲醇超聲定容於5ml容量瓶中，即得0.494mg/ml的對照品儲備液。
取枳實總黃酮20mg精密稱定，置100ml容量瓶中，加甲醇至刻度，超聲20分鐘，搖勻，過濾，精密吸取續濾液1ml，置10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。
準確量取0.10，0.20，0.30，0.40，0.50ml對照品儲備液分別置於10ml容量瓶中，甲醇定容至刻度，即得系列對照品溶液。以甲醇為空白，照分光光度法(中國藥典2000版一部附錄VA)在283nm處測定吸收度，以濃度為橫坐標，吸收度為縱坐標，繪製標準工作曲線(見

圖1)。
1.線性關係考察表11線性關係測定結果

其回歸方程為A＝34.995 Cx-1.17491 r＝0..99972.精密度的測定將同一濃度的柚皮苷標準溶液，用上述方法重複檢測5次。結果見表12表12精密度測定結果

3.再現性試驗將批號為20020523的枳實總黃酮樣品液用上述方法重複操作5次，並測定。結果見表13表13再現性測定結果

4.樣品穩定性試驗取批號為20020523的樣品溶液，放置3、6、9、12小時後，經分光光度法測定，其總黃酮含量變化不大，說明樣品溶液在12小時內穩定。結果見表14。
表14穩定性試驗結果

5.加樣回收率試驗取批號20020523樣品5份，每份2.5mg，用甲醇定容於25mL容量瓶中，超聲20min，搖勻，過濾，取續濾液1mL於10mL容量瓶中，加入對照品儲備液150μL，甲醇定容。按上述方法測定加樣回收率。結果見表15。
表15加樣回收率試驗測定結果

6.樣品測定取三批枳實總黃酮乾粉約20mg，精密稱定，按上述方法製備樣品液，將樣品液在283nm處測定吸收度，根據回歸方程計算枳實藥材中總黃酮含量。結果見表16。
表16樣品測定結果

根據以上測定結果，枳實總黃酮限度範圍確定為含總黃酮以柚皮苷計60％～80％。
實驗例3枳實總黃酮苷高效液相色譜法測定的方法學考察1、儀器和色譜條件及試藥1.1儀器 Waters 600 controller；KQ-500DB型數控超聲波清洗器(40KHz，500W)；UV-265紫外-可見分光光度計。
1.2色譜條件 色譜柱採用Kromasil C18(150×4.6mm，5um)，流動相為甲醇-水＝34∶66，檢測波長λ＝285nm，流速為1ml/min，柱溫為室溫，理論板數按柚皮苷峰計算應不低於1500，按新橙皮苷峰計算應不低於1500。
1.3試藥 柚皮苷對照品(中國藥品生物製品檢定所提供)，批號0722-9805新橙皮苷對照品(首都師範大學分析測試中心提供)所用試劑甲醇，韋斯實驗用品有限公司；水為超重過濾水。
1.4對照品來源及純度柚皮苷對照品購自中國藥品生物製品檢定所，供含量測定用，批號0722-9805。新橙皮苷對照品由首都師範大學分析測試中心提供，純度99.9％。
2、方法學考察2.1測定波長的選擇在參考文獻的基礎上，對柚皮苷和新橙皮苷對照品做了紫外掃描，從光譜圖可以看出柚皮苷和新橙皮苷在285處有最大吸收值，故選擇測定波長為285nm。
2.2提取溶劑的確定試驗中考察了提取溶劑的影響，用甲醇、50％甲醇及30％甲醇可以將柚皮苷和新橙皮苷從樣品中提取出來，但用50％甲醇及30％甲醇提取率低，故選擇提取溶劑為甲醇。
2.3提取時間的確定試驗中考察了提取時間的影響，精密稱取樣品0.01g，加入甲醇超聲處理，取不同時間段的提取液進行HPLC分析，記錄峰面積積分值。結果見表17表17提取時間考察結果

由測定數據看出，樣品超聲處理20分鐘，峰面積積分值已基本穩定，選擇超聲處理20分鐘。
2.4系統適應性試驗對照品溶液的製備 精密稱取柚皮苷對照品0.58mg，新橙皮苷對照品1.56mg，置5mL量瓶中，加甲醇溶解並稀釋至刻度，製成對照品混合溶液，分別為0.116mg/mL和0.312mg/mL。
供試品溶液的製備 取本品粉末，精密稱取約0.02g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，超聲處理(功率100W，頻率40KHZ)20分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，取續濾液，即得。
分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。
分析色譜圖可知對照品、供試品中柚皮苷和新橙皮苷峰的保留時間基本一致，理論板數按柚皮苷峰計算不少於1500，按新橙皮苷峰計算不少於1500。
2.5線性關係考察精密吸取上述對照品混合溶液4.0、8.0、12.0、16.0、20.0μL，進行HPLC測定，記錄色譜圖；以對照品的進樣量(μg)為橫坐標，以色譜峰面積值為縱坐標作標準曲線(見圖2、圖3)，並進行回歸，計算標準曲線的回歸方程。
表17-1柚皮苷線性關係考察結果

經計算，回歸方程為Y＝2212410X-45121.7 R＝0.99938；結果表明柚皮苷進樣量在0.464～2.320ug範圍內線性關係良好。
表17-2新橙皮苷線性關係考察結果

經計算，回歸方程為Y＝2122810X-64763.5 R＝0.99994；結果表明新橙皮苷進樣量在1.248～6.240ug範圍內線性關係良好。
2.6穩定性試驗取同一樣品，按供試品溶液製備方法製備後，分別在0、1、3、5、8小時測定，考察其穩定性，結果見表18表18穩定性試驗結果

由試驗結果知，在八小時之內信號基本穩定。
2.7精密度試驗取對照品混合溶液，照含量測定方法重複測定五次，數據見表19表19精密度試驗結果

試驗結果表明儀器精密度和操作精密度較好。
2.8重複性試驗精密稱取同一樣品(約0.01g)5份，按供試品溶液的製備方法製備後，進行HPLC測定，數據見表20表20重現性試驗結果(n＝5)

試驗結果表明，重複性良好。
2.9回收率試驗採用加樣回收法，精密稱取已知含量的同批號樣品5份，分別加入已知濃度的對照品混合溶液300ul(即含柚皮苷0.061mg、新橙皮苷0.154mg)，按供試品溶液製備方法製備後，照含量測定項下方法測定含量，以下式計算回收率，數據見表21、表22回收率％＝(測出總量-樣品中含量)×100％/加入對照品量表21柚皮苷回收率試驗結果

計算平均回收率為96.50％，RSD％＝1.402％表22新橙皮苷回收率試驗結果

計算平均回收率為97.59％，RSD％＝1.825％2.10樣品測定結果精密稱取三批樣品，每批3份，每份約0.01g，按供試品溶液的製備方法製備後，進行HPLC測定，記錄芍藥苷峰面積積分值，計算柚皮苷和新橙皮苷含量，結果見表23
表23樣品測定結果

根據上述測定結果和國家《藥品註冊管理辦法》中中藥、天然藥物第五類原料的有關規定，確立本原料總黃酮含量不得低於70％，柚皮苷含量不得低於12％，新橙皮苷含量不得低於38％。
實驗例4本發明片劑製備工藝的研究根據出膏率和製劑經驗，在本發明片劑成型工藝中，選用低取代羥丙基纖維素、可溶性澱粉(1∶1)作為輔料，對潤溼劑乙醇濃度(60％，70％，80％)進行了考察，結果表明，用70％溼潤(乾粉∶乙醇＝5∶1)，18目篩擠壓制粒，70℃烘1h，20目篩除去大顆粒，60目篩去小顆粒，整粒後，細粉少、顆粒整齊、硬度合適，成型後不易碎；加入1％硬脂酸鎂，壓片成型，其崩解時限在40分鐘左右，符合片劑要求。
實驗例5本發明片劑照紫外分光光度法測定的試驗條件及方法學考察1.空白試驗 按處方量比例稱取微晶纖維素和微粉矽膠，用甲醇溶解，用與原料總黃酮相同的測定方法測定其吸收度。
2.再現性試驗 以技術方案中所述的總黃酮測定方法對同一批樣品(批號20020620)進行再現性試驗，結果見表24。
表24再現性試驗測定結果

3.回收率試驗 取批號20020620樣品5份，每份15mg，用甲醇定容於100mL容量瓶中，超聲20min，搖勻，過濾，取續濾液1mL於10mL容量瓶中，加入對照品儲備液150μL，甲醇定容。按技術方案所述方法測定加樣回收率。結果見表25。
表25回收率試驗測定結果

4.樣品測定 取本發明片劑即理氣消痞片約30mg，精密稱定，按技術方案所述方法製備樣品液，將樣品液在283nm處測定吸收度，根據回歸方程計算枳實藥材中總黃酮含量。結果見表26。
表26樣品測定結果

根據以上測定結果，確定1片含總黃酮以柚皮苷計為105mg。
實驗例6本發明片劑照高效液相色譜法測定的方法學考察1.測定波長的選擇在參考文獻的基礎上，對柚皮苷和新橙皮苷對照品做了紫外掃描，從光譜圖可以看出柚皮苷和新橙皮苷在285處有最大吸收值，故選擇測定波長為285nm。
2.提取溶劑的確定試驗中考察了提取溶劑的影響，用甲醇、50％甲醇及30％甲醇可以將柚皮苷從樣品中提取出來，但用50％甲醇及30％甲醇提取率低，故選擇提取溶劑為甲醇。
3.提取時間的確定試驗中考察了提取時間的影響，精密稱取樣品0.015g，加入甲醇超聲處理，取不同時間段的提取液進行HPLC分析，記錄峰面積積分值。結果見表27表27提取時間考察結果

由測定數據看出，樣品超聲處理20分鐘，峰面積積分值已基本穩定，選擇超聲處理20分鐘。
4.系統適應性試驗對照品溶液的製備精密稱取柚皮苷對照品0.58mg，置5mL量瓶中，加甲醇溶解並稀釋至刻度，製成對照品混合溶液，分別為0.116mg/mL和0.312mg/mL。
供試品溶液的製備取本品20片，精密稱定，研細，混勻，取約0.015g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，超聲處理(功率100W，頻率40KHZ)20分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，取續濾液，即得。
分別吸取對照品溶液、供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。
分析色譜圖可知對照品、供試品柚皮苷的保留時間基本一致，理論塔板數按柚皮苷峰計算不得少於1500。
5.線性關係考察精密吸取上述對照品混合溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μL，進行HPLC測定，記錄色譜圖，結果見表28；以對照品的進樣量(μg)為橫坐標，以色譜峰面積值為縱坐標作標準曲線(見圖4)，並進行回歸，計算標準曲線的回歸方程。
表28柚皮苷線性關係考察結果

經計算，回歸方程為Y＝2231800X-44440.8 R＝0.99982；結果表明柚皮苷進樣量在0.232～1.160ug範圍內線性關係良好。
6.穩定性試驗取同一樣品，按供試品溶液製備方法製備後，分別在1、2、3、5、8小時測定，考察其穩定性，結果見表29表29穩定性試驗結果

由試驗結果知，在八小時之內信號基本穩定。
7.精密度試驗取處理後的同一樣品，照技術方案所述方法重複測定五次，數據見表30表30精密度試驗結果

試驗結果表明儀器精密度和操作精密度較好。
8.重現性試驗精密稱取同一樣品(約0.15g)5份，按供試品溶液的製備方法製備後，進行HPLC測定，數據見表31表31重現性試驗結果(n＝5)

試驗結果表明，重現性良好。
9.回收率試驗採用加樣回收法，精密稱取已知含量的同批號樣品5份，分別加入已知濃度的對照品混合溶液300ul(即含柚皮苷0.064mg)，按供試品溶液製備方法製備後，照技術方案所述方法測定含量，以下式計算回收率，數據見表32回收率％＝(測出總量-樣品中含量)×100％/加入對照品量表32柚皮苷回收率試驗結果

計算平均回收率為99.07％，RSD％＝0.908％10.樣品測定結果按技術方案所述方法測定，結果見表33表33樣品測定結果

根據上述三批中試產品的測定結果，確立本發明片劑中柚皮苷標示量，限度範圍為標示量的90％～110％。
實驗例7枳實總黃酮對小鼠小腸推進運動的影響(墨汁法)將小鼠按體重隨機分為8組，每組10隻，即枳實總黃酮多劑量組(4g/kg、2g/kg、1g/kg、0.5g/kg、0.2g/kg、0.1g/kg)，莫沙必利組和生理鹽水組。
取禁食24小時的小鼠分別灌服八種墨汁液混懸液20ml/kg，給藥後15分鐘脫頸椎處死，打開腹腔，分離腸繫膜，剪取上端至幽門，下端至回盲部，置於託盤上，輕輕將小腸拉成直線，測定總長度，量出從幽門至墨汁前沿的距離作為腸內推進距離。墨汁推進率＝墨汁在小腸中的推進距離/小腸全長×100％。結果見表34
表34枳實總黃酮對小鼠小腸推進運動的影響

採用t』檢驗，與生理鹽水組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001。
從表34可看出，與生理鹽水組比較，枳實總黃酮4g/kg、2g/kg、1g/kg、0.5g/kg、0.2g/kg組和莫沙必利組均能明顯提高小鼠小腸推進率，表明有促進小腸運動的作用。
實驗例8枳實總黃酮對阿託品所致小鼠腸道推進運動的影響將小鼠隨機分為9組，每組10隻，即枳實總黃酮多劑量組(4g/kg、2g/kg、1g/kg、0.5g/kg、0.2g/kg、0.1g/kg)，阿託品組(1.5mg/Kg)、莫沙必利組和生理鹽水組，以上藥物均含有10％炭末。
取禁食24小時的各組小鼠，空白組(生理鹽水組)、模型組灌胃給以生理鹽水、其餘分別灌服各不同濃度的藥物，給藥容量為20ml/Kg，給藥前10min空白組im生理鹽水、其餘各組分別im1.5mg/Kg硫酸阿託品注射液，給藥容量為5ml/Kg，給藥後15分鐘脫頸椎處死，立即打開腹腔，將消化道自幽門至直腸末端完整摘出，不加牽引平鋪於玻璃板上，測其全長並記錄炭末前沿互幽門的距離作為腸內推進距離。炭末推進率＝炭末在全腸中的推進距離/全腸總長×100％。結果見表35表35枳實總黃酮對阿託品所致小鼠小腸推進運動抑制的影響

採用t』檢驗，與生理鹽水組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，▲▲▲P＜0.001；與模型組比較，△P＜0.05△△P＜0.01。
從表35可看出，與生理鹽水組比較，阿託品組小鼠腸推進率明顯減少(P＜0.001)，枳實總黃酮劑量4g/kg、2g/kg、1g/kg、0.5g/kg、0.2g/kg組均能明顯提高阿託品所至小鼠腸運動功能抑制推進率，表明對於阿託品所致的小鼠推進運動抑制有促進的作用。
實驗例9枳實總黃酮對新斯的明所致小鼠小腸推進功能亢進的影響將小鼠隨機分為8組，每組10隻，即枳實總黃酮多劑量組(4g/kg、2g/kg、1g/kg、0.5g/kg、0.2g/kg、0.1g/kg)，莫沙必利組、新期的明組(0.08mg/Kg)和生理鹽水組，以上藥物均含有10％炭末。
取禁食24小時的各組小鼠，空白組(生理鹽水組)、模型組灌胃給以生理鹽水、其餘分別灌服各不同濃度的藥物，給藥容量為20ml/Kg，給藥前10min空白組im生理鹽水、其餘各組分別im0.08mg/Kg甲基硫酸新斯的明注射液，給藥容量為5ml/Kg，給藥後15分鐘脫頸椎處死，立即打開腹腔，將消化道自幽門至小腸末端完整摘出，不加牽引平鋪於玻璃板上，測其全長並記錄炭末前沿互幽門的距離作為腸內推進距離。炭末推進率＝炭末在小腸中的推進距離/小腸全長×100％。結果見表36表36枳實總黃酮對新斯的明所致小鼠小腸推進運動亢進的影響

採用t』檢驗，與生理鹽水組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，▲▲▲P＜0.001；從表36可看出，與生理鹽水組比較，新斯的明組小腸推進率增加，說明新斯的明可促進小腸運動，而與新斯的明組比較，枳實總黃酮各組、莫沙必利組對小鼠小腸推進率無明顯差別，表明枳實總黃酮對新斯的明所致的小鼠小腸運動功能亢進無明顯的作用。
實驗例10枳實總黃酮對小鼠鎮痛作用(扭體法)將小鼠動物隨機分為9組，每組10隻，即枳實總黃酮各劑量組，杜冷丁組、模型組和對照組。
除杜冷丁組，各組均灌胃給藥，容量為20ml/Kg；杜冷丁組腹腔注射，給藥60分鐘後，各鼠均腹腔注射0.6％醋酸0.2ml，觀察10分鐘內各組出現扭體反應小鼠只數(腹部內凹、伸展後肢、臀部抬高)和次數，計算各藥鎮痛百分率，結果見表37。
表37枳實總黃酮對小鼠鎮痛百分率的影響

採用t』檢驗，與生理鹽水組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001。
從表37可看出，除杜冷丁組外，其他各藥對醋酸所致小鼠疼痛(扭體反應)無抑制效應。
實驗例11枳實總黃酮對大鼠胃酸、胃蛋白酶分泌的影響取SD大鼠50隻，單籠禁食24小時，自由飲水，隨機均分五組空白組、枳實總黃酮低劑量組(0.5g/kg)、枳實總黃酮中劑量組(1g/kg)、枳實總黃酮高劑量組(2g/kg)和雷尼替丁組(30mg/kg)。用乙醚輕度麻醉動物，剪去腹部的毛，常規消毒皮膚，於劍突下沿腹白線開一個約2.5cm長的切口，小心提起胃，在幽門與十二指腸結合部用縫線結紮，小心避開血管。立即十二指腸注入各對應不同濃度的藥液10ml/kg，空白組動物同法給予等容量的生理鹽水蒸氣溶液。縫合後送回籠中，術後禁食禁水，4小時後脫臼處死動物，取出胃，收集胃液於刻度離心管，以2000rpm離心10分鐘，吸取上清液計算胃液量，並進行胃液分析。
(1)胃酸測定①取清晰胃液2ml置小燒杯中，加入託佛氏及酚酞指示劑各2滴，含游離酸時呈櫻紅色，如呈黃色則指示無游離酸。②用滴定管慢慢用0.01mol/L氫氧化鈉滴定，同時不斷搖動，恰至紅色消失，出現薑黃色為止，即為游離酸滴定終點，記錄消耗0.01mol/L氫氧化鈉溶液的ml數。③繼續用氫氧化鈉滴定直至微紅色不退為止，即為總酸度滴定終點，記錄兩次滴定所消耗的0.02mol/L氫氧化鈉總毫升數。④結果計算游離酸(mEq/L)＝游離酸滴定終點消耗的氫氧化鈉溶液毫升數×10；總酸度(mEq/L)＝兩次滴定消耗的氫氧化鈉溶液毫升數×10；總酸排出量(μEq/h)＝總酸度×每小時的胃液量。
(2)胃蛋白酶測定採用麥特氏毛細玻管測定法，將內徑1～2mm粗細均勻的毛細玻管裁成10cm長，洗淨烤乾。用雞蛋一枚，取其蛋清充分打勻後用紗布過濾，將上述毛細玻管利用虹吸作用，灌滿蛋清(注意管內應無氣泡)。然後放在85℃熱水中使蛋白固定，貯冰箱中備用。試驗時取胃液1ml放入100ml的試劑瓶中，加0.05mol/L鹽酸溶液15ml搖勻，放進蛋白管二根，蓋好瓶口，在37℃恆溫箱中孵育24小時，取出蛋白管，用尺測量兩端透明部分的長度(mm)，以四端之值求其平均值。胃蛋白酶活性單位＝平均值2×16；胃蛋白酶排出量(活性單位/h)＝胃蛋白酶活性單位×每小時的胃液量。實驗結果見表38、39。
表38枳實總黃酮對大鼠胃酸的影響

採用t』檢驗，與生理鹽水組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001。
表39枳實總黃酮對大鼠胃蛋白酶的影響

採用t』檢驗，與生理鹽水組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001。
試驗結果顯示枳實總黃酮高、中、低劑量對於胃酸、胃蛋白酶無明顯的影響。
實驗例12枳實總黃酮對小鼠胃排空的影響取KM種小鼠80隻，雌雄各半，隨機均分八組即枳實總黃酮多個劑量組(4g/kg、2g/kg、1g/kg、0.5g/kg、0.2g/kg、0.1g/kg)，莫沙必利組和生理鹽水組。
空白組灌胃20ml/kg生理鹽水，其餘各組小鼠分別灌胃等容量各對應不同濃度的藥液，連續給藥兩次，末次給藥後40分鐘，每隻小鼠口服0.2ml0.1％的甲基橙溶液，20分鐘後脫臼處死小鼠，剖腹摘取胃置於小燒杯裡，加入10ml蒸餾水，用小剪刀沿胃大彎剪開胃，將胃內容物充分洗於蒸餾水中，用NaCO3溶液調節PH值至6.0～6.5，倒入刻度離心管，以2000rpm離心10分鐘，取上清液用721型分光光度計(波長420nm)比色，用蒸餾水調零，測量溶液的光密度，測得的光密度為胃中甲基橙光密度。並以0.1％甲基橙0.2ml加入10ml蒸餾水搖勻後測量其光密度作為基數甲基橙光密度，並按下列公式計算甲基橙胃殘留率。甲基橙胃殘留率的高低可反映胃排空的快慢。

基數甲基橙光密度為0.256
表40枳實總黃酮對小鼠胃排空作用的影響

採用t檢驗，與生理鹽水組比較，△P＜0.05。
試驗結果顯示枳實總黃酮0.5g/kg、1.0g/kg、2.0g/kg均明顯促進胃的排空，與空白組比較，均有顯著性差異。
實驗例13對乙醇加水楊酸所致胃炎模型的影響取SD小鼠50隻，雌雄各半，隨機均分五組即枳實總黃酮組(4g/kg、2g/kg、1g/kg、0.5g/kg)，雷尼替丁組和模型組。
模型組ig生理鹽水、枳實總黃酮組ig枳實總黃酮溶液，雷尼替丁組動物ig30mg/ml雷尼替丁10ml/kg，30分鐘後各組分別灌胃乙醇+水楊酸溶液1ml/100g，拉脫頸椎處死大鼠，3.45mmlo/L甲醛固定15分鐘後取胃，肉眼觀察胃炎的發生情況，結果見表41。
病變判斷標準如下「-」無胃炎發生；「+」局部充血，輕度炎症充血；「++」局部炎症明顯；「+++」全胃瀰漫性炎症表41枳實總黃酮對小鼠胃排空作用的影響

採用t檢驗，與模型組比較，P＞0.05；採用卡方檢驗，與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001。
從上表可看出，枳實總黃酮對大鼠實驗性胃炎無明顯作用，既不能減輕炎症症狀，對於胃潰瘍也無改善作用。
實驗例14枳實總黃酮對正常離體兔腸平滑肌的影響藥物及製劑枳實總黃酮混懸液1號20g浸膏加臺氏液至20ml(1g/ml)；2號10g浸膏加臺氏液至20ml(0.5g/ml)；3號5g浸膏加臺氏液至20ml(0.25g/ml)；4號2.5g浸膏加臺氏液至20ml(0.125g/ml)；5號1.25g浸膏加臺氏液至20ml(0.0625g/ml)；6號0.625g浸膏加臺氏液至20ml(0.0313g/ml)；7號0.313g浸膏加臺氏液至20ml(0.0156g/ml)；8號0.156g浸膏加臺氏液至20ml(0.0078g/ml)；9號0.078g浸膏加臺氏液至20ml(0.0039g/ml)；10號0.039g浸膏加臺氏液至20ml(0.00195g/ml)；試驗方法與結果(1)調節電子水浴鍋，保持恆溫，麥氏浴槽內的臺氏液30ml，保持37±0.5℃；(2)調整張力換能器，氧氣發生器、BL-410生物信號採集處理系統；(3)離體腸平滑肌的製備取2Kg左右的家兔一隻，用空氣栓塞處死，立即剖開腹腔，取出迴腸，置入盛有冷的臺式液中。沿腸壁分離腸繫膜，用臺式液將腸內容物衝洗乾淨，將腸管剪成2-2.5cm的腸段。將腸管兩端穿線結紮，一端繫於通氣鉤上，另一端繫於肌張力換能器上，連接記錄儀。通氣調節速度為1-2個氣泡/s，不能影響腸肌的自主舒縮運動；(4)觀察正常腸肌運動，待舒縮穩定後，描記一段腸肌的正常曲線，然後依次向浴槽中加入各種藥液0.3ml。每次加藥液前均不衝洗而計算累積藥物濃度，描記舒縮曲線；(5)藥液由低到高累加，枳實總黃酮組做10個標本，全部加完後再衝洗一次，觀察腸肌能否恢復到給藥前，電腦自動分析結果，並列印出描記曲線；
(6)結果見表42表42枳實總黃酮混懸液對離體腸平滑肌的影響

結果採用t檢驗，與給藥前組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001。
從上表可看出，隨著藥物濃度的遞增，對離體腸平滑肌收縮頻率明顯增加，林0.6028g/L開始，作用有顯著性差異；而枳實總黃酮在收縮力方面，隨著濃度增加，最大收縮力明顯降低，從0.1365g開始，收縮力的降低呈現出顯著性差異；在最大舒張力方面，枳實總黃酮從0.1365g開始呈增加的趨勢，但經檢驗無顯著性差異。
實驗例15枳實總黃酮對乙醯膽鹼和阿託品所致離體兔腸平滑肌的影響藥物及製劑枳實總黃酮混懸液1號1.25g浸膏加臺氏液至20ml(0.0625g/ml)；2號0.625g浸膏加臺氏液至20ml(0.0313g/ml)；3號0.313g浸膏加臺氏液至20ml(0.0156g/ml)；4號0.156g浸膏加臺氏液至20ml(0.0078g/ml)；5號0.078g浸膏加臺氏液至20ml(0.0039g/ml)；6號0.039g浸膏加臺氏液至20ml(0.00195g/ml)；試驗方法與結果
(1)試驗方法同上，待舒縮穩定後，描記一段腸肌的正常曲線，然後依次向浴槽中加入乙醯膽鹼或阿託品，描記舒縮曲線。再依次向浴槽中加入各種藥液0.3ml。每次加藥液前均不衝洗而計算累積藥物濃度，描記舒縮曲線；(2)藥液由低到高累加，每組做6個標本，全部加完後再衝洗一次，觀察腸肌能否恢復到給藥前，電腦自動分析結果，並列印出描記曲線；(3)結果見表43、44表43枳實總黃酮混懸液對乙醯膽鹼所致離體腸平滑肌亢進的影響

結果採用t檢驗，與空白組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001。與乙醯膽鹼組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，▲▲▲P＜0.001；表44枳實總黃酮混懸液對阿託品所致離體腸平滑肌抑制的影響

結果採用t檢驗，與空白組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001。與阿託品組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，▲▲▲P＜0.001；從表43、表44可看出，乙醯膽鹼對兔離體腸平滑肌有明顯的興奮作用，收縮頻率非常明顯加快，腸肌處於收縮痙攣狀態，而枳實總黃酮在較低劑量時能抑制乙醯膽鹼的作用，使收縮痙攣的腸肌收縮頻率和幅度均明顯下降；阿託品對兔離體腸平滑肌有明顯的抑制作用，腸肌最大收縮力明顯下降，以上說明枳實總黃酮對兔離體腸肌有雙向調節作用，既能使過度亢進的腸肌抑制，又能使過度抑制的腸肌興奮。
說明書附1柚皮苷標準曲線圖2柚皮苷標準曲線圖3新橙皮苷標準曲線圖4柚皮苷標準曲線實施例1枳實總黃酮的製備取枳實33kg做成粗粉，加6倍量60％的乙醇，回流提取2次，每次2小時；醇溶液濾過，合併濾液，回收乙醇並進一步濃縮、60℃(0.1mpa)減壓乾燥12小時至幹，幹膏粉碎成細粉，加入5倍量水，充分攪拌溶散，加入1/5水量的食鹽，充分攪拌，冷藏靜置24小時；棄去上清液，取沉澱，加入6倍量95％的乙醇，回流提取2小時，靜置，取上清液，回收乙醇並進一步濃縮、65℃(0.1mpa)減壓乾燥8小時至幹，幹膏粉碎成細粉，加入10倍量水，充分攪拌溶散，靜置過夜，棄去上清液，取沉澱，70℃(0.1mpa)減壓乾燥4小時至幹，即得枳實總黃酮。
實施例2本發明片劑(理氣消痞片)的製備取枳實60kg，按實施例1製備枳實總黃酮，加入輔料低取代羥丙基纖維素0.5kg和可溶性澱粉0.5kg，混勻，用70％乙醇(乾粉∶乙醇＝5∶1)溼潤，18目篩擠壓制粒，70℃烘1小時，20目篩除去大顆粒，60目篩除去小顆粒，加入1％硬脂酸鎂0.03kg，壓片，薄膜包衣，得9615片，0.3克/片，每日三次，每次兩片。
實施例3本發明枳實總黃酮的質量控制方法含量測定A.紫外分光光度法(中國藥典2000年版一部附錄VA)測定；對照品溶液的製備取柚皮苷對照品，加甲醇製成每1ml含0.5mg的溶液，搖勻，即得；供試品溶液的製備取枳實總黃酮20mg精密稱定，置100ml容量瓶中，加甲醇至刻度，超聲20分鐘，搖勻，過濾，精密吸取續濾液1ml，置10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液；測定法取枳實總黃酮20mg，置100ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，超聲處理20分鐘，搖勻，濾過，精密吸取續濾液1ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，以甲醇為空白，在283nm的波長處測定吸收度，計算，即得；
枳實總黃酮原料含總黃酮以柚皮苷計，應在60％～80％間；B.照高效液相色譜法(中國藥典2000年版一部附錄VID)測定。
色譜條件與系統適用性試驗用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；34∶66的甲醇-水為流動相；檢測波長為285nm；理論塔板數按柚皮苷峰計算應不低於1500，按新橙皮苷峰計算應不低於1500；對照品溶液的製備精密稱取在五氧化二磷減壓乾燥器中乾燥36小時的柚皮苷和新橙皮苷對照品適量，加甲醇適量製成對照品混合溶液，濃度分別為0.1mg/mL和0.3mg/mL；供試品溶液的製備取枳實總黃酮約0.02g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，以功率100W，頻率40KHZ的超聲處理20分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，取續濾液，即得；測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，即得；枳實總黃酮原料柚皮苷含量應在10％～13％範圍內。
實施例4本發明片劑(理氣消痞片)的質量控制方法含量測定A.照紫外分光光度法(中國藥典2000年版一部附錄VA)測定；對照品溶液的製備取柚皮苷對照品，加甲醇製成每1ml含0.5mg的溶液，搖勻，即得；供試品溶液的製備取本發明片劑20mg精密稱定，置100ml容量瓶中，加甲醇至刻度，超聲20分鐘，搖勻，過濾，精密吸取續濾液1ml，置10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液；測定法取本發明片劑20mg，置100ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，超聲處理20分鐘，搖勻，濾過，精密吸取續濾液1ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，以甲醇為空白，在283nm的波長處測定吸收度，計算，即得；本發明片劑總黃酮含量以柚皮苷計，標示量為150mg/片，限度範圍為標示量的90％～110％；
B.照高效液相色譜法(中國藥典2000年版一部附錄VID)測定；色譜條件與系統適用性試驗用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；以34∶66甲醇-水為流動相；檢測波長為285nm；理論塔板數按柚皮苷峰計算應不低於1500；對照品溶液的製備精密稱取在五氧化二磷減壓乾燥器中乾燥36小時的柚皮苷和新橙皮苷對照品適量，加甲醇適量製成對照品混合溶液，濃度分別為0.1mg/mL和0.3mg/Ml；供試品溶液的製備取本發明片劑約0.015g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，以功率100W，頻率40KHZ的超聲處理20分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，取續濾液，即得；測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，即得；本發明片劑柚皮苷標示量為20mg/片，限度範圍為標示量的90％～110％。
實施例5枳實總黃酮的製備取枳實50kg做成枳實藥材粗粉，加5倍量80％的乙醇，回流提取4次，每次1小時；醇溶液濾過，合併濾液，回收乙醇並進一步濃縮、減壓乾燥至幹，幹膏粉碎成細粉，加入8倍量水，充分攪拌溶散，加入1/5水量的食鹽，充分攪拌，冷藏靜置24小時；棄去上清液，取沉澱，加入8倍量95％的乙醇，回流提取4小時，靜置，取上清液，回收乙醇並進一步濃縮、減壓乾燥至幹，幹膏粉碎成細粉，加入4倍量水，充分攪拌溶散，靜置過夜，棄去上清液，取沉澱，減壓乾燥至幹，即得枳實總黃酮。
按實施例3所述的含量測定方法進行測定，測得含總黃酮72.28％，含柚皮苷12.49％。
實施例6枳實總黃酮的製備取枳實70kg做成枳實藥材粗粉，加7倍量75％的乙醇，回流提取2次，每次3小時；醇溶液濾過，合併濾液，回收乙醇並進一步濃縮、減壓乾燥至幹，幹膏粉碎成細粉，加入6倍量水，充分攪拌溶散，加入1/5水量的食鹽，充分攪拌，冷藏靜置36小時；棄去上清液，取沉澱，加入7倍量100％的乙醇，回流提取3小時，靜置，取上清液，回收乙醇並進一步濃縮、減壓乾燥至幹，幹膏粉碎成細粉，加入8倍量水，充分攪拌溶散，靜置過夜，棄去上清液，取沉澱，減壓乾燥至幹，即得枳實總黃酮。
按實施例3所述的含量測定方法進行測定，測得含總黃酮72.35％，含柚皮苷12.89％。
實施例7理氣消痞片的製備取按實施例2製備的枳實總黃酮原料細粉70g，加入低取代羥丙基纖維素、可溶性澱粉，二者比例為1∶1，混勻，80％乙醇制粒，乾燥，過篩，加入1％硬脂酸鎂，壓片，薄膜包衣，得500片，0.3克/片，每日三次，每次兩片。
按實施例4所述的含量測定方法進行測定，測得含總黃酮為154.55mg/片，含柚皮苷為21.72mg/片。
實施例8理氣消痞片的製備取按實施例3製備的枳實總黃酮原料細粉140g，加入低取代羥丙基纖維素、可溶性澱粉，混勻，60％乙醇制粒，乾燥，過篩，加入1％硬脂酸鎂，壓片，薄膜包衣，得1000片，0.3克/片，每日三次，每次兩片。
按實施例4所述的含量測定方法進行測定，測得含總黃酮為154.56mg/片，含柚皮苷為21.54mg/片。
實施例9本發明片劑的製備取枳實總黃酮原料細粉140g，加入輔料，按常規製備方法，製成1000片，0.3克/片，3次/日，2片/次。
按實施例4所述的含量測定方法進行測定，測得含總黃酮為154.50mg/片，含柚皮苷為21.56mg/片。
實施例10本發明膠囊劑的製備取枳實總黃酮原料細粉1400克，加入1/3糊精輔料，按常規製備方法，製成膠囊劑。
實施例11本發明丸劑的製備取枳實總黃酮原料細粉1000克，加入輔料，按常規製備方法，製成丸劑。
實施例12本發明顆粒劑的製備取枳實總黃酮原料細粉700克，加入糊精輔料，按常規製備方法，製成顆粒劑。
實施例13本發明滴丸的製備取枳實總黃酮原料細粉900克，加入輔料，按常規製備方法，製成滴丸。
實施例14本發明口服液體製劑的製備取枳實總黃酮原料細粉800克，加入輔料，按常規製備方法，製成口服液體製劑。
實施例15本發明混懸液的製備取枳實總黃酮原料細粉1200克，加入輔料，按常規製備方法，製成混懸液製劑。
權利要求
1.一種枳實總黃酮的製備方法，其特徵在於該方法為取枳實做成粗粉，加5～7倍量60％～80％的乙醇，回流提取2～4次，每次1～3小時；醇溶液濾過，合併濾液，回收乙醇並進一步濃縮、減壓乾燥至幹，幹膏粉碎成細粉，加入5～8倍量水，充分攪拌溶散，加入1/5水量的食鹽，充分攪拌，冷藏靜置24小時；棄去上清液，取沉澱，加入6～8倍量95％～100％的乙醇，回流提取2小時，靜置，取上清液，回收乙醇並進一步濃縮、減壓乾燥至幹，幹膏粉碎成細粉，加入4～10倍量水，充分攪拌溶散，靜置過夜，棄去上清液，取沉澱，減壓乾燥至幹，即得枳實總黃酮。
2.如權利要求1所述的枳實總黃酮的製備方法，其特徵在於該方法為取枳實做成粗粉，加6倍量60％的乙醇，回流提取2次，每次2小時；醇溶液濾過，合併濾液，回收乙醇並進一步濃縮、減壓乾燥至幹，幹膏粉碎成細粉，加入5倍量水，充分攪拌溶散，加入1/5水量的食鹽，充分攪拌，冷藏靜置24小時；棄去上清液，取沉澱，加入6倍量95％的乙醇，回流提取2小時，靜置，取上清液，回收乙醇並進一步濃縮、減壓乾燥至幹，幹膏粉碎成細粉，加入10倍量水，充分攪拌溶散，靜置過夜，棄去上清液，取沉澱，減壓乾燥至幹，即得枳實總黃酮。
3.如權利要求1所述的枳實總黃酮的製備方法，其特徵在於該方法為取枳實做成粗粉，加5倍量80％的乙醇，回流提取4次，每次1小時；醇溶液濾過，合併濾液，回收乙醇並進一步濃縮、減壓乾燥至幹，幹膏粉碎成細粉，加入8倍量水，充分攪拌溶散，加入1/5水量的食鹽，充分攪拌，冷藏靜置24小時；棄去上清液，取沉澱，加入8倍量95％的乙醇，回流提取4小時，靜置，取上清液，回收乙醇並進一步濃縮、減壓乾燥至幹，幹膏粉碎成細粉，加入4倍量水，充分攪拌溶散，靜置過夜，棄去上清液，取沉澱，減壓乾燥至幹，即得枳實總黃酮。
4.如權利要求1所述的枳實總黃酮的製備方法，其特徵在於該方法為取枳實做成粗粉，加7倍量75％的乙醇，回流提取2次，每次3小時；醇溶液濾過，合併濾液，回收乙醇並進一步濃縮、減壓乾燥至幹，幹膏粉碎成細粉，加入6倍量水，充分攪拌溶散，加入1/5水量的食鹽，充分攪拌，冷藏靜置36小時；棄去上清液，取沉澱，加入7倍量100％的乙醇，回流提取3小時，靜置，取上清液，回收乙醇並進一步濃縮、減壓乾燥至幹，幹膏粉碎成細粉，加入8倍量水，充分攪拌溶散，靜置過夜，棄去上清液，取沉澱，減壓乾燥至幹，即得枳實總黃酮。
5.一種枳實總黃酮的含量測定方法，其特徵在於該方法為如下方法中的一種或幾種A、照紫外分光光度法測定對照品溶液的製備取柚皮苷對照品，加甲醇製成每1ml含0.5mg的溶液，搖勻，即得；供試品溶液的製備稱取枳實總黃酮細粉20mg，置100ml容量瓶中，加甲醇至刻度，超聲20分鐘，搖勻，過濾，精密吸取續濾液1ml，置10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液；測定法取供試品溶液，以甲醇為空白，在283nm的波長處測定吸收度，計算，即得；枳實總黃酮原料含總黃酮以柚皮苷計，應在60％～80％間；B、照高效液相色譜法用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；30～40∶60～70的甲醇—水為流動相；檢測波長為285nm；理論塔板數按柚皮苷峰計算應不低於1500，按新橙皮苷峰計算應不低於1500；對照品溶液的製備稱取在五氧化二磷減壓乾燥器中乾燥36小時的柚皮苷和新橙皮苷對照品，加甲醇製成對照品混合溶液，濃度分別為0.1mg/ml和0.3mg/ml；供試品溶液的製備稱取枳實總黃酮細粉0.02g，置具塞錐形瓶中，加入甲醇25ml，超聲處理20分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，取續濾液，即得；測定法分別吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，即得；枳實總黃酮原料柚皮苷含量應在10％～13％範圍內。
6.如權利要求5所述的一種枳實總黃酮的含量測定方法，其特徵在於該方法為如下方法中的一種或幾種A、照紫外分光光度法測定對照品溶液的製備取柚皮苷對照品，加甲醇製成每1ml含0.5mg的溶液，搖勻，即得；供試品溶液的製備稱取枳實總黃酮細粉20mg，置100ml容量瓶中，加甲醇至刻度，超聲20分鐘，搖勻，過濾，精密吸取續濾液1ml，置10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液；測定法取供試品溶液，以甲醇為空白，在283nm的波長處測定吸收度，計算，即得；枳實總黃酮原料含總黃酮以柚皮苷計，應在60％～80％間；B、照高效液相色譜法用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑；34∶66的甲醇—水為流動相；檢測波長為285nm；理論塔板數按柚皮苷峰計算應不低於1500，按新橙皮苷峰計算應不低於1500；對照品溶液的製備稱取在五氧化二磷減壓乾燥器中乾燥36小時的柚皮苷和新橙皮苷對照品，加甲醇製成對照品混合溶液，濃度分別為0.1mg/ml和0.3mg/ml；供試品溶液的製備稱取枳實總黃酮細粉0.02g，置具塞錐形瓶中，加入甲醇25ml，超聲處理20分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，取續濾液，即得；測定法分別吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，即得；枳實總黃酮原料柚皮苷含量應在10％～13％範圍內。
7.一種枳實總黃酮片劑的製備方法，其特徵在於該方法為取枳實總黃酮原料細粉，加入輔料低取代羥丙基纖維素、可溶性澱粉，混勻，60％～80％乙醇制粒，乾燥，過篩，加入1％硬脂酸鎂，壓片，薄膜包衣，即得。
8.枳實總黃酮在製備具有促進胃腸動力作用的藥物中的應用。
9.如權利要求8所述的應用，其特徵在於所述的促進胃腸動力是指提高小腸推進率，促進小腸運動。
10.如權利要求8所述的應用，其特徵在於所述的促進胃腸動力是指促進胃的排空。
全文摘要
本發明公開了一種枳實總黃酮及其製劑的製備方法和質量控制方法，製備方法是將枳實藥材先經乙醇回流提取、減壓乾燥得幹膏細粉後，再經水沉鹽析工藝對黃酮類成分進行分離純化，再用高濃度的乙醇淨化、乾燥得到枳實總黃酮；然後以枳實總黃酮為原料按常規方法製備成臨床可接受的各種製劑。本發明所採用的質量控制方法是用照紫外分光光度法和照高效液相色譜法分別對枳實總黃酮原料及其製劑中的總黃酮、柚皮柑的含量進行測定。本發明還公開了枳實總黃酮具有促進胃腸動力方面的用途，可用於運動障礙型功能性消化不良的治療，具有有良好的開發前景。
文檔編號A61P1/00GK1748740SQ20041007790
公開日2006年3月22日 申請日期2004年9月17日 優先權日2004年9月17日
發明者王英鋒 申請人:王英鋒