含人參皂甙Re組分的藥物組合物,其製備方法及應用的製作方法
2023-06-04 17:15:31 4
專利名稱：含人參皂甙Re組分的藥物組合物,其製備方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及含有人參皂甙Re組分的藥物組合物，其製備方法以及在治療或預防組織缺血性損傷中的應用。
人參(panax gingseng)、西洋參(panax quinguefolium)和三七(panax notoginseng)等五加科人參屬植物的幾乎所有部分，例如根、根莖、莖葉、花和果實均含有豐富的人參皂甙。
近二十年來，已對人參屬植物的皂甙進行了十分深入地研究，相繼分離並純化了近20種人參屬皂甙單體，並對這些單體和/或含有這些單體的組分進行了廣泛的生物學活性和藥理學作用研究。
人們通常是使用矽膠薄層層析技術，依據總人參皂甙中各組分的荷電性和其極性的不同，在矽膠極上分離出不同的單體成分。並且，一般說來，基於矽膠薄層層析的結果，可將人參總皂甙分為兩個不同的組分，其中Rf值在人參皂甙單體Re的Rf值以下的為極性較大的組分1,Rf值在Re處及其以上的為極性較小組分11。組分1主要由人參皂甙-Ro、-Rb1、-Rb2、-Rb3、-Rc及-Rd中的任何幾種或所有單體組成，而組分11則主要由人參皂甙-Re、-Rf、-RF11、-Rg1、-Rg2、-Rg3、-RT5，以及極微量的-Rh1和-Rh2中的任何幾種或所有單體組成。
因此，在人參皂甙的研究與生產實踐中，常常將人參皂甙單體Re作為鑑定人參的品質和檢測人參皂甙或製劑中皂甙含量的標準對照物。
人參皂甙是最早鑑定並分離的，並且是性質最明確的人參皂甙單體之一。現已知道，人參皂甙-Re在結構上為一種屬於達瑪烷型20(s)原人參三醇型的四環三萜化合物。進一步的結構分析證實，其為20(s)-原人參三醇-6-
-20-0-β-D葡萄糖苷。
人參皂甙-Re廣泛存在於五加科人參屬植物中，例如人參的根、莖葉、花蕾、果實中，三七的根、根莖、蘆頭中，以及西洋參的根、葉、果實中。其中人參果實、花和花蕾中含量較高，分別為大約6％和大約2.94％。
從人參皂甙的化學和藥理學研究角度來說，一般可從上述的不同天然來源製備人參總皂甙，然後再進一步從中分離和純化人參皂甙單體成分。然而，從醫藥工業的生產實踐角度看，與其以高成本低收率刻意製備醫藥上有用的人參皂甙單體成分，倒不如以相對較為簡便的方法和相對較低的成本製備主要含有某種單體，並且含有少量其他單體或其混合物的組合物，條件是所說的其他單體成分或其混合物對所說組合物中的主要單體成分的理化性質和/或藥理學活性沒有任何不利影響，並且最好它們之間還具有某些協同或輔助作用。
例如，本發明人的待批中國專利申請98100070號和98100068號分別公開了改良的製備和分離原人參二醇組和原人參三醇組皂甙的方法，以及含有原人參二醇組和三醇組皂甙的藥物組合物及其應用。使用這些專利申請中公開的製備方法，可明顯地提高從人參總皂甙中分離和製備原人參二醇組皂甙和三醇組皂甙的產物回收率，大大簡化生產步驟並降低生產成本。從藥物應用角度來看，雖然原人參二醇組和三醇組各自均由六種或六種以上的單體組成，但由於所說的兩個組分中的各單體成員在化學結構和物理學性質上的相似性，從而決定了它們各自在藥理學和生物學活性上的相近性。例如，大量的藥理學研究表明，原人參二醇組皂甙主要具有抗突變、抗自由基、抗氧化及保護生物膜和細胞結構的功能，而原人參三醇組皂甙則主要具有抗輻射和促進合成代謝及抗組織損傷的作用。因此，可在不必分離和純化單體化合物的情況下，將按所述方法製備的原人參二醇組或原人參三醇組皂甙混合物，加入適當的藥學上可接受的載體或賦形劑，以及一種或多種天然或合成的其他活性成分製成用於特定治療或預防目的的藥物組合物。
同眾所周知的許多天然藥物一樣，從包括人參屬植物在內的天然植物、動物和礦物及微生物材料中提取的單體化合物的活性常常是與某些相關的次要或輔助成分協同作用並進而聯合對靶組織或器官發揮其生物學功能的。因此，在許多情況下，為了更好地保留有效成分的生物學活性，降低天然藥物的生產成本，簡化生產工藝，常常是將其作為天然藥物來源的某些組分，或某個組分或其亞組分，得到與單體化合物有相同或更好的藥理學活性的藥物組合物，所說的組合物中可以另外加入一種或多種天然或合成的其他活性成分或其混合物。
中國專利申請87108992號(申請日1987年11月24日)公開了從人參果汁中製備人參皂甙-Re單體的方法，該方法包括用乙醇沉澱人參果汁的濃縮溶液後回收乙醇，並用乙醚萃取所得到Re單體粗製品。然後，用矽膠G柱進一步純化並從甲醇/水(1∶1)中重結晶，得到基本上純的人參皂甙-Re單體化合物。另外，日本專利申請特開平7-89863號(申請日1993年9月24日)公開了從人參根、葉或花蕾中製備人參皂甙-Re的方法及按所述方法製得的人參甙-Re或其藥物組合物在治療心律不齊中的應用。該專利申請中描述的製備人參皂甙的方法包括濃縮所述藥用植物的含水甲醇或含水乙醇或水提取物，將該提取物過柱(D101)並用含水甲醇或乙醇洗脫。將所得洗脫液減壓濃縮後得到粗結晶。然後用70％甲醇水溶液重結晶得到人參皂甙-Re純品。但該專利申請並沒有明確說明產物的純度。
本發明的一個目的是提供一種基本上由人參皂甙-Re組分和醫藥上可接受的載體和/或賦形劑組成的藥物組合物。
根據本發明這一目的的一個優選實施方案，所說的人參皂甙-Re組分含有約佔總人參皂甙重量至少80％的人參皂甙Re單體，並且所說的組分中另外含有約佔組合物中總人參皂甙重量10％的人參皂甙-Rg2。
根據本發明這一目的的一個優選實施方案，其中所說的組合物還含有或不含有一種或多種天然或合成的其他與人參皂甙-Re有協同或輔助作用的活性成分。
本發明的另一個目的是提供一種製備如上文限定的藥物組合物的方法，該方法包括提供基本上由人參皂甙-Re和人參皂甙-Rg2組成的人參皂甙-Re組分；然後將所說的人參皂甙-Re組分與一種或多種醫藥上可接受的載體和/或賦形劑相混合。
根據本發明這一目的的一個優選實施方案，其中所說人參皂甙-Re組分的製備方法包括將作為原材料的人參屬植物或其部分在低級烷基醇的水溶液中浸提12-72小時；過濾並濃縮所說的浸提液後，用鹼金屬氫氧化物和適當的吸附材料除去其中的雜質及色素，用高濃度乙醇水溶液沉澱以除去糖和蛋白質，過濾後用適當的有機溶劑萃取並經重結晶後得到所需的人參皂甙-Re組分。
根據本發明的這一優選實施方案，其中所說的人參屬植物是人參，且其中所說的植物部分是人參果實。
根據本發明的這一優選實施方案，其中省略重結晶前用有機溶劑萃取的步驟。
根據本發明的這一優選實施方案，其中所說的鹼金屬氫氧化物是CaOH2或生石灰水溶液(石灰乳)；且其中所說的吸附材料可選自活性碳、硅藻土、高嶺土、漂白土及活性氧化鉛。
根據本發明的這一優選實施方案，其中所說的用於萃取結晶態人參皂甙-Re組分的有機溶劑可選自乙酸乙酯、二氯甲烷和乙醚，但優選的是乙醇乙酯。
根據本發明的這一優選實施方案，其中所說的用於浸泡人參屬植物或其部分的低級烷基醇選自甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇和正丁醇。
本發明的再一個目的是提供含有人參皂甙-Re組分的藥物組合物在治療或預防全身或局部組織缺血性損傷中的應用。
根據本發明的這一目的的一個優選實施方案，其中所說的組織包括腦組織、心肌組織、腎組織和四肢組織。
本發明涉及以人參屬植物，特別是人參或其部分，如植物的根、莖葉、花蕾和果實為原料，提取並分離人參皂甙-Re組分的方法、含有作為基本活性成分的所說的人參皂甙-Re組分的藥物組合物，以及所說的藥物組合物在治療或預防全身或局部組織缺血性損傷中的應用。
本文所使用的術語「人參皂甙Re組分」，是指含有50至95％人參皂甙Re，以及其他極性相關的人參皂甙單體的混合物。根據本發明的一個優選實施方案，其中人參皂甙Re單體含量最好為80％以上，且其中所含有的其他單體選自人參皂甙Rg1、Rg2、Rg3、RT5，以及Rh1和Rh2。
如前所述，包括人參、西洋參和三七在內的五加科人參屬植物的根、根莖、莖葉、花和花蕾，以及果實中均含有豐富的人參皂甙，特別是達瑪烷型皂甙。目前，已從這些植物或其部分中分離並鑑定了近二十種達瑪烷型四環三萜單體化合物，並已對它們的化學結構、理化性質及生物學功能進行了廣泛深入地研究。根據這些化合物在矽膠薄層層析(TLC)中的遷移行為(Rf值)，用適當的洗脫劑展開後，可將人參總甙中的單體分離成原人參二醇組和原人參三醇組兩大組分。用於區分原人參二醇組分和三醇組分的移行分界點正是人參皂甙-Re在矽膠板上泳動後所處的位置。
人參皂甙-Re最初是由Sanata等人從人參根中分離並進行結構和性質鑑定的(Chem,Pharma,Bult.22,2407-14(1974))。因為該人參皂甙單體在矽膠薄層層析(TLC)平板上經用有機溶劑展開並遷移後，基本上是處於平板的中間位置(由其分子大小和荷電性所決定的)，所以根據其遷移位置前後的人參皂甙單體成分的遷移率的不同，將總人參皂甙大致分為原人參二醇組皂甙和原人參三醇組皂甙兩個大的組分。在本發明人於1998年1月22日提交的中國專利申請No.98100070.3中，詳細描述了以人參總皂甙為起始材料，製備原人參二醇組和三醇組皂甙的方法。自Sanata等人首先分離並純化人參皂甙-Re單體化合物以來，人們已用各種不同的方法分離純化了人參皂甙-Re。特別是近年來對人參皂甙-Re的生物學活性和臨床應用價值進行了比較深入地研究，例如裴玉萍等發現並報導了人參皂甙的抗心律不齊作用(JP特開昭7-89863)，從而進一步激發人們對分離和純化人參皂甙-Re及相關研究的興趣。然而，包括本發明人的中國專利申請87108002號和日本專利申請特開昭平7-89863號在內的現有技術文獻中公開的人參皂甙-Re分離與純化方法均為比較普遍使用的常規方法。例如，這些方法除包括甲醇或乙醇提取、重結晶步驟外，大多還包括矽膠柱或樹脂柱層析地步驟。雖然樹脂(例如D101)層析相對於矽膠柱層析來說可構成一個明顯地技術進步，例如使用樹脂柱在處理上較為簡便，且成本較低等，但從工業化大規模生產角度看，仍存在須使用大量的溶劑和時間處理層析柱的問題。
另一方面，儘管日本專利申請特開昭平7-89863中聲稱可用其公開的方法製得高純度的人參皂甙-Re單體化合物，並且可能有較高的收率(佔原料重量的約0.76％)，但我們的重複實驗和比較實驗結果表明，其中所述方法很難以獲得足夠的再現性和高的產物收率與純度，並且也難以實現大規模工業化生產。特別是如前所述，從工業化生產角度看，按實驗室方法製備有很高純度，例如純度為95％或以上特別是達到光譜分析純的人參皂甙-Re，並不一定具有相應提高的產業上的價值。相反，如果將人參皂甙-Re作為人參總皂甙中的一個組分或亞組分，例如作為原人參三醇組皂甙的亞組分來製備，則可能具有更大的應用價值和工業化生產上的可行性。
因此，本發明的一個目的是提供人參皂甙-Re組分，其特徵在於其中人參皂甙-Re的含量(重量比)不少於大約80％，並且所說的組分中還含有大約10％(w/w)的人參皂甙-Rg2，以及大約3-5％(w/w)的人參皂甙-Rg1。
我們的研究結果表明，在按本發明的方法製備的人參皂甙-Re組分中，儘管存在少量(例如約10％)人參皂甙-Rg2，以及更少量的人參皂甙-Rg1、-Rh1和-Rh2，但它們對人參皂甙Re的生物學活性沒有任何不利影響，相反，這些單體與-Re之間還可能存在一定的協同或輔助作用(數據未示出)。因此，從經濟和實際應用角度，以本發明提供的相對簡單而有效的方法，從人參屬植物或其部分中製備所說的人參皂甙-Re組分，並以該Re組分為基本活性成分，加入一種或多種醫藥上可接受的載體和/或賦形劑，製成適於臨床應用的各種不同劑型的藥物組合物，是完全可行並且有價值的。
因此，本發明的另一個目的是提供生產上述人參皂甙-Re組分的方法，該方法包括
將作為原料的人參屬植物或其部分在低級烷基醇的水溶液中浸泡12-72小時；過濾並濃縮後，用鹼金屬氫氧化物和適當的吸附材料除去雜質和色素，然後用無水乙醇或高濃度乙醇水溶液沉澱以除去糖和蛋白質，過濾後經用適當的有機溶劑萃取並重結晶，得到所需的人參皂甙-Re組分。
用於製備人參皂甙-Re組分的原料可以是選自人參、西洋參和三七等的人參屬植物或其部分，例如這些植物的根、根莖、莖葉、花或花蕾，以及果實。在下文給出的實施例1中，使用人參果實，特別人參果渣作為製備人參皂甙-Re組分的原料。研究發現，人參果實中人參總皂甙的含量約為人參根中人參總皂甙含量的4倍。在我們利用人參果實製備人參果皂甙的實踐中發現，人參果實榨汁後殘留的人參果渣中仍含有較大量的人參皂甙。因此，為了充分利用人參屬植物例如人參資源，可從含有較豐富的人參皂甙的人參果實中榨取人參果汁，用於製備人參果實皂甙或其組分，然後收集榨汁後殘留的人參果實殘渣，用於製備人參皂甙-Re組分。
根據本發明，為了得到人參皂甙-Re組分，首先將人參屬植物如人參或其部分如根、根莖、莖葉、花或果實進行必須的預處理如清洗並切割成適當的碎塊或碎片後，浸入低級烷基醇的水溶液，例如含有1-5碳原子的低級烷基醇，如甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇或戊醇的水溶液中，但較好是在甲醇或乙醇的水溶液中，室溫浸泡12-72小時。然後收集所說的植物或其部分的醇浸提液，使用常規過濾裝置過濾後收集濾液，並加入適量的石灰乳(即氫氧化鈣在水中形成的乳狀懸浮液)將濾液的PH值調到大約10-13。靜止約30分鐘以除去浸提物中的雜質。然後向此鹼化的濾液中加入重量比約為0.3-1.0％的選自活性碳、高嶺土、硅藻土、漂白土和活性氧化鋁的一種或多種吸附劑，充分攪拌約30分鐘並放置12-48小時，以除去所說的浸提液中的色素。為了便於分離，用於本發明的吸附劑最好是活性碳。
然後過濾上述經用吸附劑處理的浸提液，收集濾液後，於強烈攪拌下向其中緩慢加入約4倍體積過量的，濃度≥95％的乙醇，以沉澱析出所說的浸提液中的糖、核酸及蛋白質類物質。靜止並析出沉澱後，過濾和/或離心收集上清液，減壓下抽吸濃縮濾液並回收乙醇。然後將所得濃縮溶液移入分液漏鬥中，向其中加入選自乙醇乙酯、二氯甲烷和乙醚的有機溶液，根據所需的人參皂甙-Re組分在水和這些有機溶劑之間的分配係數的不同，放置約12-48小時後，即可在有機相中析出所需人參皂甙-Re組分的結晶。必要時，可進一步將此結晶物重新溶解於甲醇/水(1∶1)中，重結晶後得到所說的人參皂甙-Re組分。
令人驚奇地是，本發明人在長期的研究實踐中發現，為了進一步簡化人參皂甙Re組分的分離和純化步驟，在經過醇浸提和吸附劑吸附，以及高濃度乙醇沉澱後，反覆重結晶而不必對所得上清作進一步地乙酸乙酯和乙醚等有機溶劑萃取，即可以足夠高的收率得到如上文定義的本發明的人參皂甙Re組分。
因此，根據本發明的一個實施方案，其中可以省略有機溶劑萃取步驟。即按照本發明的方法除初始步驟中使用乙醇浸泡外，繼後的步驟不需任何有機溶劑。
TCL分析結果顯示，按上述方法製備的本發明的人參皂甙-Re組分含有重量比約為80％的人參皂甙-Re單體，和重量比約為10％的人參皂甙-Rg2。其餘10％則主要由少量人參皂甙-Rg1，微量人參皂甙-Rh1和-Rh2，以及其他雜質組成。
與以前普遍使用的常規方法相比，本發明的從人參屬植物或其部分中分離製備人參皂甙-Re的方法的主要優點在於，該方法中省去柱層析的步驟，而代之以用石灰乳(氫氧化鈣的乳狀水懸浮液)和活性炭處理人參屬植物材料的浸提液，從而省去了需消耗較多溶劑和時間以處理層析柱的步驟。另外，根據本發明的方法，所需的人參皂甙並不是以完全純的唯一單體形式製備的，而是以至少包含80％(W/W)人參皂甙-Re單體的混合物的形式得到的。所說的混合物除含有至少80％(W/W)的人參皂甙-Re外，還含有大約10％(W/W)的-Rg2，以及另外約10％(W/W)的-Rg1、-Rh1、-Rh2及微量雜質。比較實驗結果證明，使用本發明的人參皂甙-Re組分治療實驗動物(小鼠)的心肌缺血一再灌注損傷，與純度約98％的人參皂甙-Re單體化合物具有幾乎完全相同的效果，而且在個別對照組中甚至可見有更好的治療效果(參見實驗實施例1-3)。
本發明進一步提供以所說的人參皂甙-Re組分為基本活性成分，並含有一種或多種醫藥上可接受的載體和/或賦形劑的藥物組合物。
可以按照製藥工業中已知的方法將本發明的人參皂甙-Re組分與一種或多種醫藥上可接受的載體或賦形劑按適當比例混合，製成適於臨床上使用的不同劑型的藥物組合物。例如可將所說的組合物配製成可供靜脈內、肌肉內、腹腔內、皮下、腦脊髓腔內和眼內注射給藥的注射液，或者製成適於口服給藥的片劑、粉末劑、丸劑、膠囊劑和懸浮劑，以及適於局部給藥的噴霧劑、霜劑、軟膏、酏劑和栓劑。
為了製備適於胃腸道外途徑給藥的溶液劑，例如可使用蒸餾水、注射用水、等滲氯化鈉溶液或葡萄糖溶液，或者低濃度(例如1-100mM)磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)作為載體或賦形劑。可以在這些胃腸道外給藥的製劑中加入一種或多種其他輔助成分或添加劑，例如可使用抗壞血酸作為抗氧化劑，使用苯甲酸鈉或尼泊金甲酯作為防腐劑，使用二甲基亞碸作為吸收促進劑等。
為了製備適於口服給藥的片劑、粉末劑、懸浮劑或栓劑，可以使用蔗糖、半乳糖、玉米澱粉、明膠、脂質、微晶纖維素、滑石粉等作為載體或賦形劑。在這些適於口服給藥的製劑中，還可含有其他適當的添加劑，例如增溶劑、崩解劑、潤滑劑、吸收促進劑、分散劑、表面活性劑、香味劑或著色劑等。
本發明進一步提供了所說的人參皂甙-Re組分和含有所說的組分的藥物組合物在治療或預防局部或全身性組織缺氧或局部缺血性損傷中的應用。
在使用皮下注射異丙基腎上素造成的小鼠全身性缺氧動物試驗模型中，預先給小鼠腹腔內注射不同劑量(5,10和15mg/kg體重)的本發明的人參皂甙-Re組分，約15分鐘後，各實驗組小鼠皮下注射血管收縮藥異丙腎上腺素(20mg/kg體重)。使用只注射生理鹽水的動物作為陰性對照組，並分別使用注射β受體阻滯劑普萘洛爾和純度約98％的人參皂甙-Re單體化合物的動物作為陽性對照組。注射後，將動物置於密閉的缺氧環境下，觀察並記錄動物存活時間，藉以推測本發明的人參皂甙-Re組分對抗血管收縮藥誘導的全身性組織缺血一缺氧損傷的能力。實驗結果表明，預先腹腔內注射人參皂甙-Re組分，可顯著地增強動物對抗異丙腎上腺素所致的全身性組織缺血缺氧，延長動物在窒息環境下的存活時間(P＜0.01)。而且在使用較大劑量人參皂甙-Re組分的情況下，這種抗組織缺血缺氧的能力與注射β受體阻滯劑普萘洛爾的對照組差不多(P＜0.01)。
特別令人感興趣的是，將高劑量(20mg/kg體重)本發明的人參皂甙-Re組分與我們以前製備的純度約98％的人參皂甙-Re單化合物相比，在該實驗系統中人參皂甙-Re組分似乎表現有更強的抗全身性組織缺氧能力(參見實驗實施例1，表1)。
另外，我們還在使用實驗性大鼠急性心肌梗塞模型進行的實驗中，觀察了本發明的人參皂甙-Re組分對實驗性大鼠急性心肌梗塞範圍及動物血清磷酸肌酸激酶(CPK)和乳酸脫氫酶(LDH)活性的影響。簡單地說，將大鼠於麻醉下以冠狀動脈血管結紮法造成急性心肌梗塞模型，然後立即給動物靜脈注射不同劑量(5,10,20mg/kg體重)的本發明的人參皂甙-Re組分。以只注射生理鹽水的模型動物作為陰性對照組，並以注射我們以前製備的純度約為98％的人參皂甙-Re單體化合物和複方丹參注射液的動物作為陽性對照組。結紮冠狀動脈後24小時從動物體內採血測定CPK和LDH活性，並在處理動物後製備動物心肌組織切片(厚約3mm)，染色後以稱重法計算並比較各組動物的心肌梗塞面積。結果顯示，本發明的人參皂甙-Re組分可顯著地減小大鼠急性實驗性心肌梗塞的面積，並且觀察到急性心肌梗塞後24小時活體動物血清內CPK和LKH酶的活性(這些酶活性是急性心肌壞死的重要酶學指徵)明顯低於未處理的對照組動物(參見實驗實施例2，表2)，而血漿前列腺素E2(PGE2)的水平則明顯升高。與前述實驗結果相似，在該實驗系統中，本發明的人參皂甙-Re組分，似乎比純度約98％的人參皂甙-Re單體具有更好的抑制實驗性急性心肌梗塞的作用。
最後，還觀察了本發明的人參皂甙-Re組分對垂體後葉素誘導的急性心肌缺血大鼠之心電圖改變的影響。動物靜脈內注射不同劑量(5,10,20mg/kg體重)的人參皂甙-Re，約5分鐘後靜脈內注射垂體後葉素並監測動物在注射該血管收縮藥後20分鐘內的心電圖改變。結果發現，預先注射不同劑量本發明的人參皂甙-Re組分的動物在注射血管收縮藥垂體後葉素後，心肌缺血的典型心電圖改變(ST段升高和T波高聳)受到明顯抑制(參見實驗實施例3，表3)。
儘管有關人參皂甙-Re組分抑制全身組織，特別是心肌和腦組織局部缺血性損傷的作用機制目前尚不完全明了，但我們以前的另一項研究顯示，在結紮大鼠鎖骨下動脈造成的腦組織缺血動物模型中，投用人參皂甙-Re組分的實驗組動物的血清超氧化物歧化酶活性較對照組明顯升高，而脂質過氧化代謝產物丙二醛的水平則顯著降低，故推測人參皂甙-Re組分對大鼠腦組織缺氧血性損傷的保護作用可能與抑制氧自由基和脂質過氧化作用有關。另外，在大鼠心肌缺血模型中，觀察到未處理組動物血漿前列腺素E2(PGE2)水平明顯升高，而預先注射人參皂甙-Re組分的對照組則比PGE2水平升高受到顯著地抑制，表明人參皂甙-Re組分可能是通過抑制PGE2誘導的冠血管血容量減少、心肌細胞膜結構破壞及增加心肌細胞Ca2+負載和加速心肌細胞內蛋白質降解等病理性損傷作用而發揮其功能的。
值得進一步提到的是，鑑於本發明初步證明人參皂甙-Re組分與基本上純的人參皂甙-Re單體化合物相比具有更好的抗局部或全身性組織缺血一缺氧活性(參見下文實驗實施例1和2)，故可望使用人參皂甙-Re組分，而不是基本上純的人參皂甙-Re單體化合物作為基本活性成分，用於製備治療和預防腦、心臟、腎和肢體等組織局部缺血性損傷的藥物組合物，並可望用本發明的以人參皂甙-Re組分作為基本活性成分的藥物組合物代替目前臨床上普遍使用的某些天然藥物組合物，例如複方丹參注射液。儘管不拘泥於理論，但推測人參皂甙-Re組分的上述優點可能是由於人參皂甙-Re與所說的人參皂甙-Re組分中少量-Rg2和-Rg1等單體成分之間存在某些協同和/或輔助作用所致。
以下實施例旨在進一步舉例描述本發明，而不是以任何方式限制本發明待批權利要求的範圍。
製備實施例1以人參果渣為原料製備人參皂甙-Re組分本實施例描述以人參果為原料製備人參皂甙-Re組分的方法。首先在用於從人參果實中製備人參果皂甙後殘留的人參果實殘渣(約1000g)中加入適當量80％(V/V)乙醇，混勻後於室溫下浸泡約24小時。用常規過濾裝置抽吸過濾所得浸泡液以除去不溶物。在所得的澄清濾液中加入少量石灰乳(CaOH2含水懸浮液)將其PH調到大約12，然後加入活性碳(8.0g)，並充分攪拌10分鐘。將此混合物室溫放置24小時後用布氏漏鬥減壓過濾。收集濾液並在其中加入很少量6N鹽酸將濾液調至PH=7，然後減壓下抽吸回收乙醇並濃縮該濾液。持續攪拌下，向所得濃縮液中加入約4倍體積的95％乙醇，直到析出可見的沉澱物，並再次過濾(G4漏鬥)除去這些沉澱物。收集濾液並於減壓下濃縮後，將所得濃縮液加於分液漏鬥中，並在其中加入乙醇乙酯(20ml)。反覆振蕩所得混合物並放置約10分鐘，可見逐漸有白色結晶析出。過濾收集該結晶物並將其溶解於甲醇/水(1∶1)中，重結晶後得到3.2g人參皂甙-Re組分。
矽膠薄層層析結果顯示，按上述方法製得的人參皂甙-Re組分中含有人參皂甙-Re單體約80％，-Rg2單體約10％，-Rg1單體5％，其餘2％為很少量人參皂甙-Rh1、-Rh2及微量雜質。
製備實施例2以人參莖葉為原料製備人參皂甙-Re組分本實施例描述以人參植物的莖葉為原料，基本上按實施例1中所述的方法製備人參皂甙-Re組分。簡單地說，將新鮮人參莖葉洗淨並風乾後切成碎片(約1000g)，向其中加入90％(V/V)乙醇並於室溫下浸泡48小時。用常規過濾裝置過濾該浸泡液以除去植物殘渣及其他不溶物。向澄清的濾液內加入1N氫氧化鈉溶液，調至PH11。然後向濾液內加入約7.5g活性炭並攪拌15分鐘。將所得混合物室溫放置過夜後用G3漏鬥減壓過濾。收集濾液加入50％(V/V)鹽酸水溶液將濾液調至PH7.5。然後於減壓下抽吸回收乙醇得到濃縮液。持續攪拌下向所得濃縮液內加入約4倍體積的95％乙醇，以沉澱其中的糖和蛋白質。過濾除去沉澱物後，收集濾液並減壓濃縮。將此濃縮的溶液加於分液漏鬥中，並在其中加入約20ml乙醚，經強烈攪拌後逐漸析出結晶。將所得結晶物溶於甲醇/水(1∶1)中，重結晶得到約3.0g白色結晶狀人參皂甙-Re組分。
矽膠薄層層析分析結果顯示，按上述方法製得的人參皂甙-Re組分含有約82％的人參皂甙-Re，約10％的人參皂甙-Rg2，約5％的人參皂甙-Rg1，以及約3％的人參皂甙-Rh1、-Rh2及微量雜質。
製備實施例3以非溶劑萃取法從人參果渣中製備人參皂甙Re組分基本上按照實施例1中所述的方法，以人參果實榨葉後殘留的人參果實殘渣(1000g)中提取人參皂甙Re，但不同的是其中省略重結晶前用乙酸乙酯或乙醚萃取的步驟。
矽膠薄層層析結果顯示，按本實施例所述方法製得的人參皂甙Re組分含有人參皂甙Re單體約81％，-Rg2單體約為11％,-Rg1單體約為6％，-Rh1,-Rh2及其他雜質約為2％。
實驗實施例1人參皂甙-Re組分對異丙基腎上腺素誘導的小鼠全身性缺氧耐受能力的影響將70隻體重約19-21克的雄性小鼠隨機分為7組，每組各10隻。三個實驗組分別腹腔內注射本發明的人參皂甙-Re組分5,10和20mg/kg體重。空白對照組注射等體積(2ml)生理鹽水；同時兩個治療對照組分別腹腔內注射純度約98％的人參皂甙單體化合物20mg/kg體重和β受體阻滯劑普萘洛爾(propranolol)10mg/kg體重。給藥後15分鐘，除空白對照組外，其餘各組的動物均皮下注射異丙腎上腺素20mg/kg體重。再經15分鐘後，將各組動物幾乎於同一時間分別放入裝有鈉石灰(10g)的250ml密閉的廣口瓶內，立刻觀察並記錄動物的存活時間。結果如下列表1所示。結果以心肌梗塞面積(mm2)或血清酶濃度(單位/升)的平均值±標準差表示(n=8-10)。
表1人參皂甙-Re組分對異丙腎上腺素誘導的大鼠全身缺氧的影響
*與異丙腎上腺素組相比較P＜0.01從上列表1中可以看出，皮下注射異丙腎上腺素可顯著縮短小鼠在常壓缺氧環境下的存活時間，與只注射生理鹽水的陰性對照組相比，差異特別顯著(P＜0.01)。預先在小鼠體內注射本發明的人參皂甙-Re組分10或20mg/kg體重可有效地對抗繼後皮下注射異丙腎上腺素導致的動物全身性缺氧狀態，從而大大延長動物在常壓乏氧環境下的存活時間，與預先注射β受體阻滯劑普萘洛爾(10mg/kg體重)的對照相比，其作用十分相近，但注射低劑量人參皂甙-Re組分的實驗組所表現的治療作用並不明顯。另外，從表1所示的結果還可以看出，在同樣條件下，本發明的人參皂甙-Re組分的作用似乎優於基本上純的(純度約98％)人參皂甙Re單體化合物。
實驗實施例2人參皂甙-Re組分對實驗性大鼠急性心肌梗塞的保護作用將體重約250-300g的雄性大鼠70隻隨機分成7組，每組各10隻。按已知方法在乙醚麻醉下仰位固定於手術臺上，自左側3-4肋間開胸，暴露心臟，以0號線立即結紮冠脈左前降支。然後將心臟迅速送回胸腔，擠出胸腔內血液和氣體，並關閉胸腔。整個手術在1分鐘內完成。於結紮後分別舌下靜脈注射人參皂甙Re單體5、10、20mg/kg及本發明的人參皂甙-Re組分(20mg/kg)和複方丹參注射液(2g/kg)，12小時後再給藥1次。待結紮冠脈24小時後，以戊巴比妥鈉30mg/kg(ip)麻醉，腹主動脈採血，並測定血清CK和LDH。同時取出心臟，生理鹽水衝洗後將左室肌橫切3-4薄片，切片用氯化硝基四氮唑蘭(N-BT)染色，並計算壞死心肌佔心室溼重百分率，計算梗塞面積(％)。結果如下列表2所示。
表2人參皂甙-Re組分對大鼠急性心肌梗塞的保護作用
*與模型組比較*P＜0.05,P＜0.01料與空白對照組比較**P＜0.01從上表所示結果可以看出，人參皂甙-Re對實驗性急性心肌梗塞動物模型的心肌梗塞面積，以及作為心肌急性缺血性壞死生物化學指徵的CK和LDH酶活性均表現有明顯地抑制作用。另外，從表2所示結果還可以看出，人參皂甙Re無論是單化合物還是含有人參皂甙-Re及其他單體化合物的組合物，對急性心肌梗塞的保護作用均明顯好於傳統的中藥複方丹參注射液。還值得進一步提到的是，本發明的人參皂甙-Re組合物的上述作用似乎優於基本純(98％純度)的人參皂甙-Re單體化合物。
實驗實施例3人參皂甙-Re組分對大鼠的實驗性急性心缺血後心電圖變化的影響將平均體重約105g的雄性和雌性Wistar大鼠各25隻隨機分成5組，每組各10隻。三個實驗組分別經舌下靜脈注射本發明的人參皂甙-Re組分(5,10,20mg/kg體重)。陰性對照組注射等體積的生理鹽水(1ml)。陽性對照組注射抗心律失常藥維拉帕米(Verapamil)(10mg/kg)。5分鐘後，各組動物分別靜脈注射垂體後葉素(瀋陽生物化學製藥廠)(1單位/kg)，並以恆定速度於10秒鐘內注射完畢。於注射垂體後葉素後15秒、30秒和1、2、5、20分鐘描記動物的心電圖。下列表3中顯示了靜脈注射垂體後葉素後30秒鐘動物心電圖的ST段和T波變化。結果以心電毫伏(mV)數的平均值±標準差表示(n=10)。
表3人參皂甙-Re組分對垂體後葉素誘發的急性心肌缺血大鼠心電圖的影響
與對照組比較*p＜0.05,**p＜0 01,***p＜0.001從表3所示的結果可以看出，給動物投用本發明的人參皂甙-Re組分可明顯抑制繼後垂體後葉素誘發的大鼠急性心肌缺血性心電圖改變(ST段抬高和T波高聳)。即預先注射人參皂甙-Re組分後，可有效地抑制血管收縮劑引起的急性冠血管痙攣，進而緩解急性心肌缺血。
gua管收縮劑引起的急性冠血管痙攣，進而緩解急性心肌缺血。
權利要求
1.基本上由人參皂甙-Re組分和醫藥上可接受的載體和/或賦形劑組成的藥物組合物。
2.根據權利要求1的藥物組合物，其中所說的人參皂甙-Re組分含有佔組合物中人參皂甙總重量約50至95％的人參皂甙-Re單體，以及選自人參皂甙Rg1、Rg2、Rg3、RT5，以及Rh1和Rh2的一種或多種其他人參皂甙單體。
3.根據權利要求1的藥物組合物，其中還可含有一種或多種天然或合成的其他與人參皂甙-Re有協同或輔助作用的活性成分。
4.製備權利要求1至3中任何一項限定的藥物組合物的方法，該方法包括提供基本上由人參皂甙-Re和人參皂甙-Rg2及-Rg1組成的人參皂甙-Re組分，然後將所說的人參皂甙-Re組分與一種或多種醫藥上可接受的載體和/或賦形劑相混合。
5.根據權利要求4的方法，其中所說的人參皂甙-Re組分的製備方法包括將作為原材料的人參屬植物或其部分在低級烷基醇的水溶液中浸提12-72小時；過濾並濃縮所說的浸提液後，用鹼金屬氫氧化物和適當的吸附材料除去其中的雜質及色素，用高濃度乙醇水溶液沉澱以除去糖和蛋白質；過濾後用適當的有機溶劑萃取並經重結晶後得到所需的人參皂甙-Re組分。
6.根據權利要求5的方法，其中所說的人參屬植物是人參且其中所說的植物部分是人參果實。
7.根據權利要求5的方法，其中所說的鹼金屬氫氧化物是CaOH2或生石灰的水溶液，且其中所說的吸附劑選自活性碳、硅藻土、高嶺土、漂白土及活性氧化鋁。
8.根據權利要求5的方法，其中用於萃取結晶態人參皂甙-Re組分的有機溶劑選自乙酸乙酯、二氯甲烷和乙醚。
9.根據權利要求5的方法，其中所選的方法可省略重結晶前用有機溶劑萃取的步驟。
10.根據權利要求1至3中任何一項所限定的藥物組合物在治療或預防全身或局部組織缺血性損傷中的應用。
全文摘要
本發明公開了含有人參皂甙－Re組分和一種或多種醫藥上可接受的載體和/或賦形劑的藥物組合物,其製備方法及在預防和治療全身或局部缺血性損傷中的應用。根據本發明的一個優選實施方案,其中所說的人參皂甙－Re組分基本上由佔組合物中總人參皂甙含量80%的人參皂甙－Re、10%的人參皂甙－Rg
文檔編號A61P9/10GK1209996SQ98117830
公開日1999年3月10日 申請日期1998年8月28日 優先權日1998年8月28日
發明者馬興元, 尹立籤, 張益勝 申請人:吉林省集安製藥有限公司