傳染性胰臟壞死病毒的快速檢測試劑盒及其檢測方法
2023-06-17 01:30:31 1
專利名稱：傳染性胰臟壞死病毒的快速檢測試劑盒及其檢測方法
傳染幽離壞死病毒的艦微繊l戱離測方法
獄領域
本發明屬於水產動物病原的檢測技術，具體是一種^環介導^^擴增fe^:對魚類傳染Wffi壞死 病毒進行艦檢測的試劑盒及離測方法。 背景獄
傳染l4Mfll主壞死病毒(Infectious pancreatic necrosis virus，簡稱IPNV)屬於雙片段RNA病^4、水 ^^m殺RNA病毒屬'可以引起鮭科 ^苗和幼魚的急性傳染病，是研^S早的^i毒病。IPNV 対7K產辭1^^了嚴重的危害，目前魏到加拿大、智利、艘、英國、法國、德國、義大利、日本、 南韓、挪威、勞將蘭、瑞典、美國、中國等國家。易/ife^包括虹鱒、大西洋鮭、五條鯽、大,、歐 洲黃蓋鰈、離業大西洋鱈等十餘種常見辭直魚類。患病魚遊動異常、體腿黑、目艮突出、腹部腫脹，腹 部包括JH奮出血.、鰓發白，有l彌iLE門^^長的、白色的術世物，內臟器官多處出現點狀出血或 發白，腸道內無內含物。鑑於IPNV的嚴重危害性，世界動jtJ衛趙且織淑定其為必報樹離。中國國家質 翻督檢驗鵬總局與韓國海洋水/^於2005年發布加仲韓進出口活水生動t^驗驗協議》中規定， 我國和韓國進出口的的艫魚、真鋼、Mit、都漁、大^l平、牙鄰等必須進行傳染牲皿i^E病毒的檢驗檢爽。
目前fe^毒的檢測方法主要包鄉胞學診斷技術、免疫學診斷技術、肝生物學診斷技術三大類。 細胞學診斷財主要包^g細胞歸分離病毒、組彌娜片及電鄉察，其操^M，翻啁帳， 且靈鵬低；免疫學診斷辦主要包括免疫螢光檢測、免疫點被，其方法具有特異性強、敏離高的 優點，但方法相當繁瑣，不適宜X才大量樣品進行檢測；^T生物學診斷技術主要包括聚合酶鏈式反應 (PCR)，比較鵬、靈敏，但是需要昂貴的PCR儀器，另夕卜需要瓊脂糖)鵬電泳，溴化乙錠^^見察 結果，溴化乙錠題癌物，對人術卩環趟有危害，^X汙染問題比琉^重。
環介導#^顯擴增(Loq>MediatedIso1heimalAmpMcation, Mf爾LAMP)技術，是一種 性高、特 異性強的耙DNA快速檢測方法，不需要昂貴的儀器，樣品中含有少量的病原就能檢出。環介導^T
增目前已Mra^月於檢測水產動物病原，如魚對離毒(魚1#血慰舞毒、傳對Mft壞夕滿毒、傳染性
itlfiL器官壞死病毒、錦魚腕疹病毒)、X抓卜'病毒(《抓卩白斑it^魏毒、黃彌毒)、細菌(遲鈍愛德華
氏菌)等。據驗，目前尚未MOT環介導^a擴增技術對傳染性f繊i^E病^a行^i檢測附隨。
發明內容
本發明的目的;l^f共一種利用環介導^r增技微測傳染腳^ffi壞鄉毒的檢測淑!l盒，3￡1野見
有技術的不足，以滿足5砂湯即H^t測的要求。
本發明的另一目的^if共這^^則i^U盒的樹則方法，以方便 ￡*產#5趙^和國際 貿易中對傳
染l4^fli壞死病Mi行'I^I檢測中的細。
本發明的主要原理為LAMP S^:^f吏核IiM^，環境中的循環置對廣增實J股將Em列的放 大，從而超ij樹則的目的。基本禾Mm敲f對耙基因的6個區域，設計2X報異性引物，同時可以設計l-2條環引物以加快反應速度，利用一種鏈置換脫氧核糖核酸聚合酶(Bacillus stearothomophilus DNA polymerase'簡禾爾B欲DNA ^^S|)，在恆溫65。C左右SjS^勺lh。 BstDNA^^^f^^性 一是具 有5'-3'聚儒活性，能在傲g狀態下擴增DNA核酸；二是BstDNA聚^H具有鏈置換活性，能將新合 成的核酸單1|/人新 的DNA雙鏈上置樹取代)下來，形成兩斜拉的核酸單鏈以開啟下^6的DNA 核酸洽成，進而免去了每次擴增前的DNA變性環節。LAMP反;翅:程中， 一對弓嫩的5'端含有一段 與下^T增產物互補的序列，因此，劍弓l物的單敏，多鹹可形成'個類似觀鈴狀的迴文結構，這種結 構正好為下一^a置^T增i^Z樹共了一個可柳哥而復始嘲用的徽反，Bst DNA聚合酶^f鏈置換活 性，後階段退火的引物置換前面引物所形成的鏈，從而保證了擴增的#^進行。LAMPHiS^成一系列 不同長度的具W^環結構的DNA產物，可OT3t熒^^料進行檢測。 本發明的絲方案如下
傳染14KDK^1^毒的環介導^^廣增快速檢測微U盒，包括提供切5^領的BstDNA聚鋪、逆 轉錄酶、Si^緩衝液、環介導等溫擴增混合液、引物混合液和熒^M色劑，以i^ii乓-種^f頓該微嗆 檢測魚，品中傳染腳，壞夕摘'毒的方怯，以實3^傳染ffiKlt壞死病毒^I檢測的標難化，為 傳染F鵬頓病毒的檢測提供一種'腿、簡便、高效、實用的翻施。。
本發明的傳染幽瓣￡^毒的環介導等溫擴增|^1檢測試齊瞼的配方如下
淑[JA: BstDNA聚娜(8U/mL);
淑UB:逆轉鵬(200U/nL);
淑U C: SlS緩衝液，樹共Bst DNA聚^SIftam^;^對乍用所必須的物質，其中含有200 mmol/L pH8.8的三羥基甲基氨基甲垸-鹽酸(Tris-HCl)、 100 mmol/L氯化鉀(KC1)、 100 mmol/L硫酸銨 ((NH4》S04)、 80mmol/L硫酸雙(MgS04)和1X曲拉通X-100 (TritonX陽100);
試劑D:環介導等溫擴增混合液，其中含有4.0ML2.5mmo]/LdNTP、 2.0nL10mol/L舌甘菜鹼、0.5jjL 200U/hLRNA ,制剤和5-6mL針生物學MM7K;
i敘'J E:弓l物混合液，其中含有2 pL20 Mmol/L正向內弓物、220 ^mol/L反向內弓物、1 5Mmol/L 正向夕卜弓嫩、lML5Mmol/L反向外引物和lML20Mmol/L環引物；其中引物序列分別如下 正向內弓嫩5'- GGCCCCGTTCAITGACTGGArnTGACAAGCCATACGTCCGC -3'; 反向內弓嫩5'- CGGAGGTACGAGATCGACCTCCnTTCCCTCGTAGAGAGTGGTGAG -3'; 正向夕卜弓l物5'- CCAAAGGAGTCACAGTCCTG -3'; 反向外引物5'-GTTGACGATGTCGGCGTT-3'; 環引物5'-TGGGGTGTCTCGTCCTCTA-3'。
淑1JF:熒M色劑，成分為醇的螢光染料SYBRGREENI 。 採用傳染蹈劍主壞歹膽毒的環介導等顯擴堪葉ifcii齒則試劑盒的檢測方法如下
(1) 待檢樣品的RNA的提取.-用商業化的試劑盒或者傳統的方^I取待檢樣品的RNA，用核酸分析儀測定RNA，保證其ODW
OD280在1.7-2.0範圍內，調整^ 度在100-200ng/^L之間。
(2) 進行傳染幽鵬諷病毒的環介導等尉廣增鵬取一個0.2mL的聚丙烯塑料管，力口入1-2mL的歩驟(1)提取的待測樣品的RNA，再加入lpL試 劑A,卞L試劑B， 2.5ML試劑C， 11.5-12.5pL試劑D， 8pL淑UE，使得切立&#|只為25pL。其中引 物序列分別如下
正向內弓l物5'- GGCCCCGTTCAITGACTGGArnTGACAAGCCArACGTCCGC -3'; 反向內引物5'-CGGAGGTACGAGATCGACCTCCnTTCCCTCGTAGAGAGTGGTGAG-3'; 正向夕卜弓l物5'- CCAAAGGAGTCACAGTCCTG -3'; 反向外引物5'-GTTGACGATGTCGGCGTT-3'; 環弓(物5'- TGGGGTGTCTCGTCCTCTA-3'。
將戰塑料管置於60^5'C的恆澄o7K鵬中，放置40"60min進fi環介導樂融"增腿；之後將水溫 再調到80-95。C，放置3-5min以終ih^應，取出含擴增產吻的塑料管待檢。 (3)擴增產物的檢測
在步驟(2)的待,料管中加入lMLi敘UF，混合均勻，卿歐見察產物的鵬。如果為鄉絶，則 判定待檢樣品含有傳染幽M^死病毒；如果為m，貝(J判定待檢樣品不含有傳染(Wi壞夕満毒。 本發明建立的傳染鵬鄉壞死病毒的環介導織擴增纖,敘翻施，可卿各種fe^別題 鮃、大,、艫魚、真鯛等祥品進行'Kii檢測。 與現有技^ffl比，本發明的有益^S包括
第一，本發明不需要g^的儀器，不需^lt^i式劑，只需一直定S^就能Si立，能滿足救湯及, 測的要求，操作簡單簡便。
第二本發明包括DNA提取、環介導^a擴增Si^、 ；^tJ^測3 4^:程，在不到3小時內即可完 成，檢測時間短。
第三，本發明的擴增模教可僅為10拷貝甚至更少，產量可達到10^101個拷貝，靈鵬高。 第四，本發明擴增tim列的六個區段，並5i^個區段,imfe有規定，因此具有高度特異性。 第五，本發明的LAMP的擴增產物可以與熒^^料結合，卿歐見察就可以謝彌果判定，簡便高效。
下面結合具體實施例對本發明{鵬一步怖詳細說明，但不作為對本發明的限制。 織例l
按照下歹鵬己方製作傳染幽鄉壞夕滿-毒的環介導等sr增tfei檢領賦齊i傖。
鄉A: l単BstDNA聚鏑(8U4iL); 淑[]B: 1.0nL逆lf^ (200U/mL);
試劑C: 2.5pL反應緩衝液，其中含有200mmol/LpH8.8的三!速甲基賨謹甲烷-鹽酸(Tris-HCl)、 10Ommol/L氯化鉀(KC1)、 10Ommol/L硫,((NH4》s04)、 80mmol/L硫ltf美(MgS04)禾口1%曲拉 通X掘(TritonX-100);
i^UD: 不介導^a擴i曾 昆^"液，其中^W4.0nL2.5mmol/LdNTP、 2.0ML10mol/LSt皿、0.5^L 200U爾L膽,塘擠闢口5pL好生物學繊脈，共計ll單；試劑E:弓l物混合液，其中含有2 mL20 Mmol/L正向內弓胸、2 mL 20 pnol/L反向內引物、1 pL 5Mmol/L 正向夕卜弓物、iiL5nmo]/L反向外引物和lML20Mmol/L環引慨共討'7^L。其中引物序列分別如下 正向內弓胸5'- GGCCCCGTTCATTGACTGGATnTGACAAGCCArACGTCCGC -3'; 反向內弓l物5'-CGGAGGTACGAGATCGACCTCCinTCCCTCGTAGAGAGTGGTGAG-3'; 正向夕卜弓l物5'- CCAAAGGAGTCACAGTCCTG -3'; 反向外引物5'-GTTGACGATGTCGGCGTT-3'; 環弓l物5'- TGGGGTGTCTCGTCCTCTA-3'。
試劑F: 1.0pL熒;)t顯色劑，成分為100x的螢光染料SYBRGREENI。
按照以下辦謝灘測
(1) 待檢樣品脆的提恥
待檢樣品為某翁直場謝!^M專染性MffiiPE病毒的虹鱒，魚#^異常、體色發黑、目艮突出、腹部
月中脹，Jt部包括職耆出血、鰓發白。
^ffl^S生物Xg公司的核^i取試劑盒，按照說明書進行樣品RNA的提取。用核,析儀測 定虹f辭羊品的RNA OEWOD28o為1.8，調整RNA,為100ng/^L。
(2) 進份專染,主艦病毒的環介導等溫擴增鵬 首先取一個0.21111的聚丙烯塑料管，力口A^驟(1)提取的虹鱒樣品的RNA2.0ML，再加入lnL試
劑A， lpL試劑B， 2.5pL試劑C， 11.5pL試劑D， 7pL試劑E，使得SR^^只為25nL。
將，塑料管置於6CTC盼恆澄jJC^中，放置401^謝罰^導等溫擴增皿；之後將水^^源搜 再調到8(TC， ^C置5min以終jbg應，取出含擴增 ^的塑料管待檢。
(3) 擴增產物的雖
在步驟(2)的待檢的塑料管中力口入1mL i敘U F，混合均勻，卿歐見察產物的Mfe。鵬^物顏色 為ftfe，據此判定該待檢樣品虹鱒中含有傳染ffiKffi壞死病毒。 鄉例2
按照下列配方製作傳染Mft頓病毒的環介導等溫廣增鵬檢測試齊瞼。 試劑A、 i敘ijB、 i敘(JC、試劑E同實施例1。
試劑d:環介導^Sf增混合液，其中含有4.0ML2.5mmol/LdNTP、 2.0& 10mo]/Lffl^ 、 0.5mL 200 U /mLRNA Hfflr製劑禾口 6pL分子生物學M^foK;共計12.5 ^l。 i翁ljE:同實施例l。 按照以Tf呈序進行德 (1)樣品RNA的提取
樣品為/媒國進口的大,樣品，夕卜觀正常。
禾傭傳統的TRlZOL方iSa行大^f樣品的RNA的提取，參照肝克隆實驗指南(第二版)。具體 步驟為取50mg大gif腦、腎、脾等組織逆行勻漿，加入600piLTRIZOLl^，顛倒混勻，再加入200 pL氯仿，混勻器上震蕩混勻5sec。於4。C 12000 ipm離心15min。吸取上清液500pL，力口入400iiiL異丙 醇，誦20。C驢30併中。12000 rpm離心15min，倒去上清；然後加入600 (xL75。/。乙醇，洗滌沉澱，於2000
6rpm離心5min，輕紐到去上清。將RNA沉澱室溫乾燥3min後，力口入20pL7乂，輕輕混勻，溶解管壁上 的RNA。 2000tpm離心5sec，在冰上保存備用。用核酸分析儀測定大穀平樣品的RNA ODWOQzs^J 2.0，調整RNA濃度為100ng/nL。
(2) 進行傳染,主壞死病毒的騎導等溫擴增鵬 首先取一個0.2mL的聚丙烯塑料管，力口Aii^驟(1)提取的大^I平樣品的RNA1.0ML，再加入1^L
鄉A， lpL試劑B， 2.5ML試劑C， 12早試劑D， 7fjL試劑E，使得鵷,只為25nL。
將上述塑料管置於63。C盼恆^7j^B咼中，放置60min謝fSf介導等顯擴增鵬；之後將水^^gj變 再調到85。C，放置3min以終止反應，取出含擴增，的塑料管待檢。
(3) 擴牆,的檢測
在步驟(2)的待檢塑料管中力口入lpLi敘ijF，混合均勻，肉B歡見察，的顏色。鵬產物鵬為 ，據此判定待檢樣品大^I平中不含有傳染幽MB^E病毒。 實施例3
按照同實施例2的配方製作傳染iWi壞死病毒的環介導等溫擴增Kii檢測試劑盒。
按照以下程細亍檢測
(1) 樣品RNA的提取
樣品為某^M場採集的魚盧魚，外觀正常。
取50mg艫Mf髒組織，樣品的RNA的提取方法同實施例2。用核酸^W斤儀測定艫魚樣品的RNA ODW OD280為1.8，調整RNA濃度為100 ng/pL。
(2) 進行傳染wi;頓病毒的環介導等顯擴增鵬
取一個0-2mL的聚丙烯塑料管，力口A^驟(1)提取的艫魚樣品的RNA1.(^L，再加入其它幼頓 分同實施例2。
將上述塑料管置於65。C盼度feK辦咼中，放置50min進稱介導魏擴增鵬之後將7jC,溫 度再調到82。C，放置3min以終止切歪，取出含擴增產物的塑料管待檢。
(3) 擴增產,的檢測
在步驟(2)的待檢塑料管中力U入lML試劑F，混合均勻，肉目歐見察;^tl的jm。 aSrtlMfe為
m，據此判定待檢樣品艫魚中不含有傳染性:MK^E^毒。核苷酸序列表
11.l東出入境檢驗^S^檢驗^g駄中心
傳染,主壞歹摘毒的鵬檢測試齊!1^微測施
5
1
42
DNA
AXiW!l
primer—bind
(1)...(42)
々23>根據環介導等顯擴增M^要求設計，用於擴增傳染幽M;^E病毒的正向內引物。
1
ggccccgttc attgactgga ttttgacaag ccatacgtcc gc 42
2 46 DNA Alff列
primer—bind (1)…(46)
臓環介導^T增幼歪要求設計，用於擴增傳染性MSi^毒的反向內引物。 2
cggaggtacg agatcgacct ccttttccct cgtag^agt ^tgag 46
3
20
〈12> DNA
^0列 primer—bind
(1)…(20)
l離環介導等溫擴增SiS要求設計，用於擴增傳染WKi^E病毒的正向外引物。
3
ccaaaggagt cacagtcctg 20
4
〈11> 18
DNA 人工序列
(1)…(18)
《23> 根據環介導等顯擴增i^應要求設i卜，用於擴增傳染性^te^E病毒的反向外引物。
4
gttgacgatg teggcgtt
〈10> 5
〈11> 19
々12> DNA 人工序列
primer_bind
(1)…(19)
根據環介導等溫擴增鵬要求設計，
,0> 5
tggggtgtct cgtccteta
18
用於擴增傳對^UK^t毒的環弓卿。
19
權利要求
1. 一種傳染性胰臟壞死病毒的快速檢測試劑盒，其特徵在於試劑盒中包括試劑A-F試劑ABstDNA聚合酶，8U/μL；試劑B逆轉錄酶，200U/μL；試劑C反應緩衝液，其中含有200mmol/LpH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、100mmol/L氯化鉀、100mmol/L硫酸銨、80mmol/L硫酸鎂和1％曲拉通X-100；試劑D環介導等溫擴增混合液，其中含有4.0μL2.5mmol/LdNTP、2.0μL10mol/L甜菜鹼、0.5μL200U/μLRNA酶抑制劑和5-6μL分子生物學級超純水；試劑E引物混合液，其中含有2μL20μmol/L正向內引物、2μL20μmol/L反向內引物、1μL5μmol/L正向外引物、1μL5μmol/L反向外引物和1μL20μmol/L環引物；其中引物序列分別如下正向內引物5′-GGCCCCGTTCATTGACTGGATTTTGACAAGCCATACGTCCGC-3′；反向內引物5′-CGGAGGTACGAGATCGACCTCCTTTTCCCTCGTAGAGAGTGGTGAG-3′；正向外引物5′-CCAAAGGAGTCACAGTCCTG-3′；反向外引物5′-GTTGACGATGTCGGCGTT-3′；環引物5′-TGGGGTGTCTCGTCCTCTA-3′。試劑F螢光顯色劑，成分為100×的螢光染料SYBR GREENI。
2.利用權利要求l中戶脫的'I^I檢測微!J^4行傳染WK:^E病毒的樹則方法，辦徵在於檢測 辦如下(1) 待檢樣品的RNA的提取提取待檢樣品的RNA，保i正RNAOEWOD28o在1.8-2.0範圍內，調整^g在100-200ng/nL之間；(2) 謝亍傳染TOlfti^毒的環介導離擴增鵬首先取一個0.2mL的聚丙烯塑料管，加入1-2ML的步驟(1)提取的待測樣品的RNA，再加入1mL 縱IJA， lpL試劑b， 2.5nL試劑C， 11.5-12,5nL試劑d， 7^L試劑E，使得Si^^、^f只為25mL。然後 將戰塑料管置於60必。C的恆^7K鵬中，方燈40"60min;之後將水溫再調到80-95°C，方燈3-5min 以終ib^，取出含擴增產物的塑料管待檢。(3) 擴增^l的衞則在步驟(2)的待,料管中力口入1mL微U F，混合均勻，肉目歐見察，的Mfe，如果為鄉絶，則 判定待檢樣品含有傳染!4^li^E病毒；如果為m，貝,定待檢樣品不含有傳染幽^ffii^E病毒。
全文摘要
本發明公開一種傳染性胰臟壞死病毒的快速檢測試劑盒及其檢測方法。本發明包括由Bst DNA聚合酶、逆轉錄酶、反應緩衝液、環介導等溫擴增混合液、引物混合液和螢光顯色劑共6種試劑組成的試劑盒，以及使用該試劑盒檢測魚類樣品中傳染性胰臟壞死病毒的一套檢測操作程序，以實現對傳染性胰臟壞死病毒快速檢測的標準化，為魚類的健康養殖和國際魚類貿易的發展提供科學依據。本發明具有特異性好、靈敏度高、操作簡便、高效等優點，可廣泛的應用於水產養殖場以及進出口魚類貿易中的現場即時檢測，並可以為相關基礎研究提供技術支持，具有廣泛應用前景。
文檔編號C12Q1/70GK101457260SQ20081016060
公開日2009年6月17日 申請日期2008年11月19日 優先權日2008年11月19日
發明者凌宗帥, 葒 劉, 嶽志芹, 健 張, 張太翔, 朱來華, 瓊 李, 梁成珠, 肖西志, 辛學謙, 鄧明俊, 鄭小龍 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心