與癌症幹細胞相關的方法和組合物的製作方法

2023-05-27 17:22:31 2

專利名稱：與癌症幹細胞相關的方法和組合物的製作方法
與癌症幹細胞相關的方法和組合物政府權利本發明在NIH國立癌症研究(NIH National Cancer Institute)所授予合同 CA104987的政府支持下取得。政府對本發明享有一定權利。
背景技術：
乳腺癌是美國婦女中最常見的惡性腫瘤。雖然目前可採用的治療法能縮小轉移， 但這些作用是暫時的，絕大多數4期乳腺癌患者死於轉移。包括放療、化療和激素治療在內 的傳統治療方法雖有用，但出現了對治療有耐受性的癌細胞使其受限。需要新的方法來檢 測和治療乳腺癌。與許多其它類型實體瘤相似，死亡率的主要原因是癌症從原發部位擴散至遠端器 官和組織。這是癌細胞從初始腫瘤入侵周圍乳腺組織以及淋巴組織和血管所致。入侵的癌 細胞然後形成新腫瘤，最終損傷了癌症所擴散的關鍵器官，例如肝、肺或腦的功能，最終導 致患者死亡。由於乳腺癌死亡率的主要原因是癌症播散至其它器官，為改善存活必須既要 防止腫瘤細胞擴散又需根除遠端腫瘤。腫瘤可視作通過突變積累而獲得無限增殖能力的致瘤性癌細胞所產生的異常器 官。在將腫瘤視作異常器官的此種觀點中，應用正常幹細胞的生物學原理可更好地理解腫 瘤如何產生和播散。許多觀察提示正常幹細胞與致瘤性細胞之間有相似性是合適的。正常 幹細胞和致瘤性細胞均具有廣泛的增殖潛力以及產生新(正常或異常)組織的能力。致瘤 性細胞可視作經歷器官發生異常和不佳調控過程的癌症幹細胞(CSC)，與正常幹細胞的經 歷相似。腫瘤和正常組織均由表型特徵不同和增殖潛力不同的異質細胞組合構成。發現急性髓性白血病中只有一個小亞組的癌細胞有引發腫瘤的潛能和維持自我 更新的能力。由於白血病細胞中集落生成的差異反映了正常造血細胞中集落生成的差異， 故可將集落生成性白血病細胞描述為白血病幹細胞。實體瘤還顯示細胞表型為異質性，只 有少部分細胞有致瘤性能在體內自我更新。與白血病幹細胞的情況一樣，這些觀察導致上 皮腫瘤中只存在稀少幹細胞這一假設。還可根據細胞表達的表面標記分離致瘤性和非致瘤性乳腺癌細胞群。在許多乳腺 癌病例中，只有一個小細胞亞群能形成新腫瘤。許多患者的乳腺癌腫瘤含有能在免疫缺陷 小鼠中形成腫瘤的癌細胞亞群，而其它癌細胞則不能。注射免疫缺陷小鼠時，最少100個致 瘤性癌細胞即能形成腫瘤，所產生的腫瘤含有在患者的原始腫瘤中發現的表型異質的致瘤 性和非致瘤性癌細胞群。在中樞神經系統(CNS)惡性腫瘤中發現了實體瘤中存在CSC的進一步證據。採用 類似於培養正常神經元幹細胞所用的培養技術，已證明神經元CNS惡性腫瘤含有一小群在 體外具有集落生成活性在體內能引發腫瘤的癌細胞，而腫瘤中的其餘細胞沒有這些特性。 重要的是，幹細胞生物學的原理極其適用於理解乳腺癌腫瘤生物學。癌症幹細胞的存在對癌症治療有深遠影響。目前，對腫瘤中表型相異癌細胞的所 有治療仿佛將它們看成均具有無限增殖潛力和獲得轉移的能力。然而，多年來已認識到，在 從未表現出轉移性疾病的患者中距原發性腫瘤遠處部位可檢測到少量播散的癌細胞。一種
4可能性是大多數癌細胞缺乏形成新腫瘤的能力，因此只有稀少癌症幹細胞的播散才能導致 轉移性疾病。因此，治療的目的必須是鑑定和殺傷此類癌症幹細胞群。已開發的現有療法很大程度上是針對腫瘤細胞大群(bulk population)，因為是 通過能否縮小腫瘤塊來鑑定這些療法。然而，由於癌症的大多數細胞增殖潛力有限，能否縮 小腫瘤主要反映了能否殺傷這些細胞。專門針對癌症幹細胞的治療可能產生更持久的反應 並治癒轉移性腫瘤。MiRNA是小的非編碼調節性RNA，通過抑制核糖體功能、使5』帽結構脫帽、使多聚 腺苷酸尾脫腺苷化和降解靶mRNA而調節mRNA翻譯。MiRNA能同時調節數百種mRNA的表達， 因此能調控各種細胞功能，包括細胞增殖、幹細胞維持和分化。已充分研究的miRNA之一為 秀麗線蟲(Caenorhabditiselegan)let-7，最初是通過遺傳分析發育期缺陷的突變體得以 鑑定。隨後，將Dicer 1鑑定為miRNA加工和功能中的關鍵酶；Dicer 1無效突變可導致胚胎 死亡和幹細胞消除。此外，組織特異性缺失Dicer會影響到胚胎幹細胞的自我更新，B淋巴 細胞譜系細胞的發育和組織形態發生。在皮膚中，miR-203對發育至關重要。缺失miRNA 加工的另一種關鍵酶DGCR8也會改變胚胎幹細胞分化中自我更新基因的沉默。這些發現證 明miRNA是組織維持和分化的關鍵調節劑。近年研究顯示，癌症中所見的許多共同染色體 擴增和缺失含有miRNA編碼序列，一些miRNA起著癌基因或腫瘤抑制基因的作用。例如， miR-17-92簇失調可誘生B-細胞淋巴瘤，let-7下調與肺癌患者的腫瘤發展和預後差相關。 在體內異種移植腫瘤試驗中，表達let-7也能防止乳腺細胞系形成腫瘤球(tumorsphere) 和抑制其致瘤性。本發明涉及檢測和操縱癌症幹細胞的微小RNA。預計若能夠鑑定幹細胞豐富的細 胞群，將得以研究這些細胞，從而獲得關鍵的幹細胞功能分子調節劑線索。癌症幹細胞的描述，例如可參見Pardal等，(2003)Nat Rev Cancer 3,895-902 ； Reya 等，(2001)Nature 414，105-11 ;Bonnet 和 Dick(1997)Nat Med3，730-7 ;Al_Hajj 等， (2003)Proc Natl Acad Sci U S A 100，3983-8 ;Dontu 等，(2004)Breast Cancer Res 6， R605-15 ;Singh 等，(2004)Nature 432,396-401。發明概述本文提供了乳腺癌幹細胞(BCSC)的微小RNA標記。與正常對應細胞相比和與腺 癌中發現的非致瘤性細胞相比，這些標記是在BCSC中差別表達的多核苷酸。採用此類標記 物包括將其用作治療性幹預的靶標；藥物開發的靶標和涉及乳腺癌和BCSC細胞群的診斷 或預後方法。本發明的一些實施方式提供治療乳腺癌的方法，該方法包括提供微小RNA活性， 例如通過引入表達載體或向BCSC直接提供微小RNA。在本文中，用於上調的感興趣微小 RNA 顯示在 BCSC 中下調，包括但不限於 200c-141 簇(miR200c,miR141) ；200b-200a_429 簇 (miR200b, miR200a, miR429)；和 182-96-183 簇(miR182, miR96, miR183)中的微小 RNA。其它實施方式提供治療乳腺癌的方法，該方法中下調微小RNA的表達。用於下 的調感興趣微小 RNA 包括但不限於miR214 ；miR-127 ；miR142_3p ；miR-199a ；miRl_125b ； miR-146b ；miR199b 和 miR-222。本發明的一些實施方式提供癌症分類或臨床分期的方法，其中BCSC數量越多表 明癌症表型的侵襲性更強。分期可用於預後和治療。在本發明的一些實施方式中，用包括免疫組化方法、原位雜交等組織化學方法分析腫瘤樣品中是否存在本文鑑定的miRNA表達降 低細胞。存在此類細胞表明存在BCSC，從而能明確原發腫瘤中的BCSC微域(microdomain) 以及淋巴結或遠端轉移灶中的細胞。通過BSCS的獨特表型鑑定它們從而提供比常規治療 更有特異性的靶標。此外，實施本發明的一種方式還提供預測疾病發展、復發和產生藥物耐 受性的方法。在本發明的另一實施方式中，miRNA或它們的靶標可用於，例如能增加此類miRNA 在癌症幹細胞中表達或降低它們的靶蛋白表達的化合物的篩選方法。該方法包括混合該化 合物與miRNA表達低的細胞群，然後測定該化合物產生的調節作用。這可包括檢測細胞活 性，或檢測某些靶蛋白質、活力、毒性、代謝變化或對細胞功能的影響。還提供給予治療劑的 方法，所述治療劑靶向與本文所述miRNA的功能相關的癌症幹細胞。附圖簡述

圖1.人乳腺癌幹細胞miRNA表達概況(A)乳腺癌miRNA篩選。顯示了用於鑑定 CD44+CD24_/<S譜系_致瘤性癌細胞(TG細胞)和其餘譜系-非致瘤性癌細胞(NTG細胞)差 別表達的37種miRNA的篩選細節。(B)致瘤性人乳腺癌細胞中37種miRNA的表達概況。 採用流式細胞術分離11份人乳腺癌樣品(BC1-BC11)中的TG細胞和NTG細胞。用多重定 量實時PCR分析100個分選癌細胞中的miRNA表達量(Ct值)。數值代表從TG細胞和NTG 細胞獲得的Ct值的差別(ACt)。(C)在致瘤性人乳腺癌細胞中下調的3種miRNA簇的示意 圖。具有相同種子序列(seed sequence) (2-7個鹼基對)的miRNA用同一顏色標註。(D) 與人乳腺癌細胞相比，Tera-2胚胎癌細胞中的miRNA表達。用多重定量實時PCR比較100 個Tera-2細胞中miRNA表達的強度與100個人乳腺癌TG和NTG細胞(BC1-BC11)中miRNA 表達。對11組乳腺癌TG和NTG細胞的Ct值取平均值。數值表示為從Tera-2細胞獲得的 Ct值與NTG細胞相比的差別(A Ct)。圖2.正常和惡性乳腺幹細胞之間共有的miRNA下調概況。㈧， ⑶45TD31TD140a-Terll9-小鼠乳腺細胞依據它們⑶24和⑶49f表達的分布情況。MRU是 富含乳腺幹細胞的細胞群。MaCFC是在體內不能再生乳腺的祖細胞。⑶與MaCFC相比，MRU 中miRNA的表達。分析了用流式細胞術分離正常小鼠乳房脂肪墊的MRU和MaCFC中，致瘤 性人乳腺癌細胞的miRNA表達下調。用定量實時PCR檢測了 100個MRU和MaCFC中miRNA 的表達水平。採用衍生自獨立分離的MRU和MaCFC細胞群兩組樣品重複分析兩次。數值代 表從MRU和MaCFC獲得的Ct值的差別。圖 3. MiR-200c 的靶標 S0X2。(A) S0X2 的 3，UTR 內 miR_200bc/429 靶序列的示意 圖。在S0X2的3，UTR中有兩個核苷酸(對應於miR-200bc/429的核苷酸6和8)發生突 變。數字表示參比野生型序列(匪003106)中該核苷酸的位置。(B)與S0X2的3，UTR相 連的螢光素酶基因的活性。將含S0X2野生型或突變型3』UTR序列的pGL3螢火蟲螢光素酶 報導基因質粒與用於標準化的Renilla螢光素酶報導基因一起瞬時轉染入HEK293T細胞。 48小時後檢測螢光素酶活性。將pGL3對照載體轉染細胞結果的平均值設為100%。數據 是分別不同轉染(n = 4)的平均值和S. D.。(C)胚胎癌細胞的S0X2蛋白表達。感染6天 後用流式細胞術收集被表達所示miRNA慢病毒感染的Tera-2胚胎癌細胞。將被對照慢病 毒或被表達所示miRNA慢病毒感染的30，000個分選Tera-2細胞的裂解液加載於各泳道， 用蛋白質印跡分析S0X2表達。用肌動蛋白的表達作為對照。(D)從原代人乳腺癌樣品分離的TG和NTG癌細胞中S0X2蛋白的差別表達。解離原代人乳腺癌樣品，通過流式細胞 術收集CD44+CD24" 譜系_致瘤性癌細胞和其餘非致瘤性譜系-癌細胞。將6，000個分選 細胞的裂解液加載於各泳道，用蛋白質印跡分析S0X2表達。用肌動蛋白的表達作為對 照。圖4. miR-200c和miR-183抑制胚胎癌細胞的生長。(A)表達miRNA的胚胎癌細胞 的圖像。感染4天後，用流式細胞術收集被表達所示miRNA慢病毒感染的Tera-2細胞。收集 Tera-2細胞19天，用姬姆薩懷特(Giemsa Wright)染色液染色。(B)miR_200c和miR-183 增強了胚胎癌細胞的分化。用針對早期有絲分裂後神經元標記Tuj 1的第一抗體，然後用 Alexa-488標記的第二抗體染色如(A)所述被感染和收集的Tera-2細胞。用DAPI復染細 胞。(C)miR-200c和miR-183抑制了體外胚胎癌細胞的生長。如(A)所述收集表達對照 miRNA或所示miRNA的3000個Tera_2細胞在96-孔板中培養。計數7、12和19天時的細 胞總數。結果為3個獨立孔的平均值和S. D.。圖5. miR-200c和miR-183對MMTV-Wnt_l鼠乳腺癌細胞集落生成的影響。(A)表 達miR-200c和miR-183的MMTV-Wnt_l乳腺癌細胞形成集落的發生率。解離MMTV-Wnt_l乳 腺癌細胞，用流式細胞術去除譜系陽性細胞。用表達所示miRNA的慢病毒感染15，000個乳 腺癌細胞，在含經輻照的3T3飼養細胞層的24-孔板中培養。培育6天後，計數含10個以上 GFP陽性細胞的集落數。結果顯示為4個獨立孔的平均值和S. D.。(B)用細胞角蛋白14、 19和8/19的抗體染色集落的免疫螢光圖像。用抗細胞角蛋白第一抗體，然後用Alexa-488 和Alexa-594標記的第二抗體，標記和染色GFP陽性集落。用DAPI復染細胞。圖6.體內表達miR-200c和miR-183的胚胎癌細胞的腫瘤生長。(A)注射了 Tera_2 胚胎癌細胞小鼠中的代表性腫瘤。用流式細胞術收集被表達所示miRNA慢病毒感染的 Tera-2細胞和表達GFP的細胞。將被所示慢病毒感染的50，000個GFP+Tera-2細胞皮下注 射入免疫缺陷N0D/SCID小鼠中。注射後監測腫瘤生長3個月。通過實時PCR分析證實被感 染的Tera-2細胞表達了 miRNA。(B)表達miRNA的Tera-2細胞的腫瘤發生率。3個月後， 3個被對照慢病毒感染的Tera-2細胞均產生了腫瘤。表達miR-200c或miR-183的Tera-2 細胞不形成腫瘤。結果是3次獨立腫瘤注射實驗的小結。圖7. miRNA表達對乳腺過度生長(mammary outgrowth)的作用。實施方式詳述在進一步描述本發明之前，應理解本發明不限於以下所述的本發明具體實施方 式，可對具體實施方式
作出某些改變但而仍屬於本發明權利要求的範圍內。還應理解所用 術語目的是描述特定的實施方式，並非限制。本發明的範圍是由所附權利要求書所確定。除 非文中另有明確表述，本說明書和隨附的權利要求書中，單數形式「一」、「一個」和「該」包 括複數形式。提供數值範圍時，除非文中另有明確說明，應理解該範圍上限和下限之間的各插 入值(至下限的十分之一單位)和所述範圍內的任何其它所述值或插入值都包括在本發明 中。這些較小範圍的上限和下限可獨立地包含在該較小範圍內，也包括在本發明中，包括所 述範圍中任何專門排除的界限。當所述範圍包括上限和下限之一或二者時，不包括所述上 限或下限之一或二者的範圍也包括在本發明中。除非另有定義，本文所用的技術和科學術語具有與本發明所屬領域普通技術人員共同理解的相同含義。雖然可採用與本文所述相似或等價的方法、裝置和材料來實施或檢 驗本發明，但是本文描述的是優選的方法、裝置和材料。本文述及的所有出版物通過引用納入本文，目的是描述和公開這些出版物中所述 的本發明組分，這些組分可與當前描述的本發明聯用。如上所述，本發明涉及癌症分類的方法以及用於實施本發明方法的試劑和試劑 盒。所述方法也可測定治療具體癌症的合適水平。還提供了優化治療的方法，先分類，根據分類信息選擇合適的療法、劑量、治療方 式等，從而優化將抗增殖治療遞送給不需要的靶細胞之間的差異，同時最大程度降低有害 毒性。通過選擇最大程度降低有害毒性同時提供有效的抗增殖活性而優化治療。本發明可用於癌症，例如乳腺癌的預防、治療、檢測或研究。癌症是包含上皮來 源贅生細胞的癌症。上皮細胞覆蓋了機體外表面，形成內腔和腺體組織的襯裡。在成人 中，癌症是最常見的癌形式。癌症包括各種腺癌，例如前列腺癌、肺癌等等；腎上腺皮質癌 (adernocartical carcinoma)；肝細胞癌；腎細胞癌、卵巢癌、原位癌、導管癌、乳腺癌、基底 細胞癌；鱗狀細胞癌；移行細胞癌；結腸癌；鼻咽癌；多房囊性腎細胞癌；燕麥細胞癌、大細 胞肺癌；小細胞肺癌等等。癌症可見於前列腺、胰腺、結腸、腦(通常作為繼發性轉移)、肺、 乳腺、皮膚等等。本領域已描述了癌幹細胞的某些表型屬性，包括諸如⑶44、⑶133、⑶24、⑶49f ； ESA;⑶166和譜系組(lineage panel)等標記。具體標記組合和表型的例子描述可參見， 例如 Al-Hajj 等 (2003) Prospective identification oftumorigenie breast cancer cells (致瘤性乳腺癌細胞的預期鑑定).Proc NatlAcad Sci U S A 100,3983-8 ；Singh 等 (2004) Identification of human braintumour initiating cells (人腦月中瘤弓| 發 iffllfiW^^ ). Nature 432,396-401 ；Dalerba ^ . (2007)Phenotypic characterization of human colorectal cancerstem cells (人結腸直腸癌幹細胞的表型表徵) Proc Natl Acad Sci U S A 104，10158—63 ;0 ' Brien 等.(2006)A human colon cancer cell capable of initiatingtumour growth in immunodef icient mice (能在免疫缺 陷小鼠中引發腫瘤生長的人結腸癌細胞).Nature ；Prince等 (2007) Identification of a subpopulationof cells with cancer stem cell properties in head and neck squamous cellcarcinoma(在頭和頸鱗狀細胞癌中鑑定到具有癌症幹細胞特性的細胞亞 群).Proc Natl Acad Sci U S A，各篇文獻通過引用納入本文說明癌症幹細胞的標記表型。 本發明的一些實施方式聯用此類表型鑑定和微小RNA檢測。本文定義的術語「癌症幹細胞」指具有自我更新和分化能力的致瘤性癌細胞亞群。 這些致瘤性細胞負責維持腫瘤，也能產生大量非致瘤性的異常分化後代。與CD44陰性腫瘤 細胞相比，這些細胞在約102個細胞、約5X102個細胞、約103個細胞的劑量時能引發腫瘤 生長，提供至少100倍的腫瘤引發潛能增長。細胞膜CD44染色陽性能確定原發腫瘤中的癌 症幹細胞微域。存在此類微域可用於診斷原發和轉移部位的癌細胞，此類微域數增加表明 腫瘤具有更高的腫瘤發生能力。這些細胞能在體內形成腫瘤，自我更新產生致瘤性後代 』產 生異常分化的非致瘤性後代並差別表達至少一種幹細胞相關基因。可通過選擇表達細胞表 面標記CD44的細胞來富集癌症幹細胞群。以乳腺癌為例，在功能試驗中，CD44+CD24_/<S譜 系群的細胞具有癌症幹細胞自我更新和分化的癌症幹細胞獨特特性，能形成有助於癌症診斷的獨特組織學微域。與其它癌症細胞亞組，如採用小鼠異種移植試驗所示的相比，該群細 胞的致瘤能力更高。這種譜系組通常包括正常白細胞、成纖維細胞、內皮細胞、間充質細胞 等標記的特異性試劑。本文所指的「微小RNA(miRNA) 」是一類豐富的非編碼RNA，認為其通過調節基因表 達在許多生物學過程中起著至關重要的作用。它們是長度約20-25個核苷酸，例如約21-24 個核苷酸，例如22或23個核苷酸的單鏈RNA分子。這些非編碼RNA能使蛋白質編碼基因 的信息靶向從而切斷或抑制生產性翻譯從而在發育中起著關鍵作用。人類有200-255種編 碼miRNA的基因，豐度對應於大約1 %的蛋白質編碼基因。miRNA是長度約20-25個核苷酸， 例如約21-24個核苷酸，如22或23個核苷酸的單鏈RNA分子。在一些實施方式中，miRNA標記差別表達，其水平低於相當的非致瘤性細胞，可低 於至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少10倍或更多。本發明提供採用本文所述標記，診斷癌症、分類和治療癌症，特別是癌瘤的方法。 可用這些方法特徵鑑定CSC、有利於診斷對象癌症的嚴重程度(例如，腫瘤等級、腫瘤負荷 等)、有利於測定對象的預後和評估對象對治療的反應。可在體外或體內，可對分離的細胞， 或完整組織或體液，例如血液、淋巴結活檢樣品等實施本發明的檢測方法。本文所用的術語「在癌症幹細胞中差別表達的miRNA」和「在癌症幹細胞中差別表 達的多核苷酸」在本文中可互換使用，通常指代表或對應於在癌症幹細胞中與同一細胞類 型的非致瘤性細胞相比差別表達的miRNA的多核苷酸，例如發現mRNA水平有至少約25%、 至少約50% -75%、至少約90%、至少約1. 5-倍、至少約2-倍、至少約3-倍、至少約5-倍、 至少約10-倍、或至少約50-倍或更多的差別表達。可通過某多核苷酸「鑑定」所述miRNA，如果該多核苷酸對應於或代表該miRNA的 話，其中「可鑑定性序列」是某序列中唯一可鑑定或確定某多核苷酸序列或其互補序列的連 續核苷酸小片段。術語「生物學樣品」包括獲自生物體的各種類型樣品，可用於診斷或監測試驗。該 術語包括生物學來源的血液和其它液體樣品、實體組織樣品，例如活檢樣本或組織培養物 或其衍生的細胞及其後代。該術語包括獲取後以任何方式處理的樣品，例如用試劑處理、溶 解或富集某些組分。該術語包括臨床樣品，還包括細胞培養物中的細胞、細胞懸液、細胞裂 解液、血清、血漿、生物學液體和組織樣品。本發明方法所用的臨床樣品可得自各種來源，特別是活檢樣品，但是在一些例子 中，可採用諸如血液、骨髓、淋巴液、腦脊液、滑膜液等樣品。可先通過離心、淘選、密度梯度 分離、血漿分離置換、親和選擇、淘洗、FACS、泛影葡胺(Hypaque)離心等分離此類樣品再分 析。一旦獲得樣品，可直接使用，冷凍，或短時維持在合適的培養基中。可採用各種培養基 維持細胞。可用任何常規方法，例如抽血、靜脈穿刺、活檢等獲得樣品。樣品通常包含至少 約102個細胞，更常至少約103個細胞，優選104、105或更多細胞。樣品通常獲自人患者，雖 然可採用動物模型，例如馬、牛、豬、犬、貓、嚙齒類如小鼠、大鼠、倉鼠，靈長類動物等。可採用合適的溶液製備細胞樣品的分散液或懸浮液。此類溶液通常是平衡鹽溶 液，例如生理鹽水、PBS、漢克平衡鹽溶液等，可方便地添加了胎牛血清或其它天然因子，連 用低濃度的通常5-25mM的可接受緩衝液。方便的緩衝液包括HEPES、磷酸緩衝鹽水、乳酸鹽 緩衝液等。
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可用常規方法分析細胞染色。精確計數的技術包括複雜程度不同，例如多色通道 (multiple color channel)、低角度和鈍角光散射檢測通道、阻抗通道等螢光活化細胞分 選術。可採用死細胞相關染料(例如，碘化丙啶)選出死細胞。特別感興趣的是採用抗體作為親和試劑。這些抗體可方便地偶聯於標記物用於分 離。標記物包括用於直接分離的磁珠，可用結合於支持物的親和素或鏈黴親和素來除去生 物素，可利用螢光分選螢光活化的細胞等等，而易於分離特定類型的細胞。可用的螢光染料 包括藻膽蛋白，例如藻紅蛋白和別藻藍蛋白、螢光素和德克薩斯紅。通常用不同的螢光染料 標記各抗體，從而能獨立分選各標記(細胞)。將抗體加入細胞懸液並培育足夠時間使之結合細胞表面可用的抗原。通常培育至 少約5分鐘，常常少於約30分鐘。反應混合物中宜含有足夠濃度的抗體，從而不會因缺乏 抗體而限制分離效率。可通過滴定確定合適的濃度。分離細胞的培養基可以是能維持細胞 活力的任何培養基。優選的培養基是含有0.1-0. 5% BSA的磷酸緩衝鹽水。可商品化購得 和按照細胞的性質使用各種培養基，包括Dulbecco改進Eagle培養基(dMEM)、漢克基礎鹽 溶液(HBSS) .Dulbecco 磷酸緩衝鹽水(dPBS)、RPMI、Iscove 培養基、含 5mM EDTA 的 PBS 等， 常補加胎牛血清、BSA、HAS等。然後如前文所述定量測定表達細胞表面標記的細胞。本文所用的「診斷」通常包括測定對象對某疾病或病症的易感性，測定對象目前是 否受某疾病或病症的影響，預後患某疾病或病症的對象(例如，鑑定癌性狀態、癌症階段或 癌症對治療的反應)和可用的治療方法(therametrics)(例如，監測對象的狀況從而提供 治療作用或效果的信息)。本文所用的術語「治療」、「處理」等通常指獲得所需的藥理學和/或生理學作用。 這種作用可以是預防性的完全或部分阻止疾病或其症狀的發生，和/或可以是治療性的部 分或完全穩定或治癒疾病和/或該疾病所致的不良作用。本文所用的「治療」包括治療哺 乳動物，特別是人的疾病，包括(a)預防易感該疾病或症狀但尚未作出該疾病或症狀診斷 的對象產生該疾病或症狀；(b)抑制疾病症狀，即停止其發展；或(c)減輕疾病症狀，即導致 該疾病或症狀消退。術語「個體」、「對象」、「宿主」和「患者」在本文中可互換使用，指需要診斷、處理或 治療的任何哺乳動物對象，特別是人。本文所用的「宿主細胞」指培養成單細胞實體的微生物或真核細胞或細胞系，可用 作或已用作重組載體或其它轉移多核苷酸的受者，包括經過轉染的原始細胞的後代。應理 解，由於天然、偶然或特意的突變，單細胞的後代在形態或基因組或總DNA互補上不一定與 原始親代完全相同。「治療靶標」指調節其活性後(例如，通過調節表達、生物學活性等)，基因或基因 產物可調節癌症的表型。通篇使用的「調節」表示所示現象的增加或降低(例如，調節生物 學活性指生物學活性增加或生物學活性降低)。乳腺細胞癌乳腺癌是美國婦女中最常見的惡性腫瘤，有八分之一的婦女在其一生中受該病影 響。某些病例，例如攜帶突變型BRCA1或BRCA2基因而具有遺傳傾向者產生乳腺癌的風險 增加。「乳腺癌癌瘤」本文指細胞襯裡導管或小葉產生的上皮腫瘤。它們的來源還常是腺 體。癌症分成原位癌和侵襲癌。
原位癌是癌細胞在導管或小葉內增殖但不侵入基質組織。然而，原位癌也可能變 得具有侵襲性。乳腺癌局部侵入和擴散最初通過局部淋巴結、血流或二者。轉移性乳腺癌 可影響體內的幾乎任何器官，最常見為肺、肝、腦和皮膚。可能的乳腺惡性腫瘤症狀包括纖維變性改變、存在團塊和不正常排出物。如果產 生此類症狀，需要檢驗以區分良性病損與癌症。懷疑晚期癌症時，通常先進行活檢。活檢可 以是針刺(如果腫瘤小的話)或切開式活檢或者切除活檢。對於大多數患者，初步治療是外科手術，常聯用放療。也可根據腫瘤和患者特徵採 用化療、激素治療或二者。對於炎性或晚期乳腺癌，初步治療是全身性治療，對於炎性乳腺 癌，隨後進行外科手術和放療；外科手術通常對晚期癌症無幫助。對於侵入性癌症患者，通常在外科手術後不久開始化療或激素治療，持續數月或 數年；這些治療能延遲或阻止幾乎所有患者的復發並延長一些患者的存活。組合化療方案 (例如，環磷醯胺、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶；阿黴素加環磷醯胺)常比單一藥物更有效。癌症轉移時，治療僅延長中值存活3-6個月，雖然毒性較大的治療(如化療)可緩 解症狀並提高生活質量。治療的選擇取決於腫瘤的激素-受體狀態、無病間隔的長度(從 診斷到出現轉移)、轉移部位和受影響器官的數量和患者的絕經期狀態。可用全身性激素治 療或化療治療具有轉移疾病症狀的大多數患者。治療轉移性乳腺癌的一些細胞毒性藥物是 卡培他濱、阿黴素(包括其脂質體製劑)、吉西他濱和紫杉烷類(紫杉醇、多西他賽和長春瑞 濱)。微小RNA探針和癌幹細胞中的靶標在一些實施方式中，用於本發明方法的微小RNA(miRNA)包括相對於非治療性細 胞可在BCSC中差別表達的那些miRNA。微小RNA能使蛋白質編碼基因的信息靶向從而切 斷或抑制生產性翻譯在調節細胞基本功能中起著重要作用。在某些實施方式中，顯示感 興趣的miRNA通常在BCSC中下調。一個感興趣的人miRNA亞組的核苷酸序列見表1。其 它感興趣序列列於圖 1B 中，這些 miRNA 包括 miR-214 ；miR-127 ；miR-142_3p ；miR-199a ； miR-409-3p ；miR_125b ；miR_146b；miR_199b ；miR-222 ；miR-299_5p ；miR-132 ；miR-221 ； miR-31 ；miR-432 ；miR-495；miR-150 ；miR-155 ；miR-338 ；miR_34b ；miR-212 ；miR_146a ； miR-126 ；miR-223 ；miR-130b ；miR-196b ；miR-521 ；miR-429 ；miR-193b ；miR-183 ；miR-96 ； miR-200a ；miR-200c ；miR-141 ；miR-182 ；miR-200a ;miR—200b。表1 在致瘤性與非致瘤性乳腺癌細胞中差別表達的微小RNA的部分列表表 ImiRNA 序列莖環序列成熟序列miR-200aSEQ ID NO:l ccgggccccugugagcaucuuaccggacagugcuggauuucc cagcuugacucuaacacugucugguaacgauguucaaaggug acccgcSEQ ID NO:2 uaacacugucugguaacga ugumiR-141SEQ ID NO:3 cggccggcccuggguccaucuuccaguacaguguuggauggu cuaauugugaagcuccuaacacugucugguaaagauggcucc cggguggguucSEQ ID NO:4 uaacacugucugguaaaga uggmiR-200bSEQ ID NO : 5 ccagcucgggcagccguggccaucuuacugggcagcauugga uggagucaggucucuaauacugccugguaaugaugacggcgg agcccugcacgSEQ ID NO:6 uaauacugccugguaaug augamiR-200cSEQ ID NO:6 cccucgucuuacccagcaguguuugggugcgguugggaguc ucuaauacugccggguaaugauggaggSEQ ID NO:7 uaauacugccggguaaug auggamiR-429SEQ ID NO:8 cgccggccgaugggcgucuuaccagacaugguuagaccuggc ccucugucuaauacugucugguaaaaccguccauccgcugcSEQ ID NO:9 uaauacugucugguaaaac cgumiR-182SEQ ID NO: 10 gagcugcuugccuccccccguuuuuggcaaugguagaacuca cacuggugagguaacaggauccggugguucuagacuugccaa cuauggggcgaggacucagccggcacSEQ ID NO: 11 uuuggcaaugguagaacu cacacumiR-96SEQ ID NO: 12 uggccgauuuuggcacuagcacauuuuugcuugugucucuc cgcucugagcaaucaugugcagugccaauaugggaaaSEQ ID NO: 13 uuuggcacuagcacauuu uugcumiR-183SEQ ID NO: 14 ccgcagagugugacuccuguucuguguauggcacugguagaa uucacugugaacagucucagucagugaauuaccgaagggcca uaaacagagcagagacagauccacgaSEQ ID NO: 15 uauggcacugguagaauu cacu所述miRNA包括序列與公開的核酸不相同的那些序列及其變體。變體序列可包含 核苷酸取代、添加或缺失。在一些實施方式中，提供表達和調節受上述miRNA下調影響的靶蛋白用於本發明 方法。該組蛋白包括抗凋亡蛋白例如BCL-2家族成員、轉錄調節物、原癌基因、癌基因和參 與自我更新過程的其它蛋白質。下文更詳細地描述了一些靶蛋白。ZFHX1B是通過調節E-鈣粘蛋白參與TGF0信號轉導途徑和上皮-間充質過渡 (EMT)過程的轉錄阻抑物。ZFHX1B和miR-200b在成年小鼠腦中局部共表達。miR_200b過 表達導致內源性ZFHX1B阻遏，抑制miR-200b可緩解ZFHX1B阻遏。發現E-鈣粘蛋白啟動 子的活性受miR-200b和miR_200c調節。BCL-2家族成員既能促進促凋亡過程又能促進抗凋亡過程。參與抗凋亡的成員包 括Bcl-2、Bcl-XL、BCl-W、MCl-l和A1。已知它們能通過線粒體膜的滲透性調節凋亡。該蛋 白質家族的高水平表達參與致癌作用和正常幹細胞的自我更新。作為所公開的miRNA靶標的另一組蛋白是polycomb-組蛋白。屬於該家族的蛋白 能重塑染色質，作轉錄因子不能結合DNA中的啟動子序列。Polycomb家族蛋白能調節經歷 更新或衰老的細胞的關鍵事件。此類家族的一個成員是BMI1，其mRNA靶序列在物種之間高
12度保守。發現BMI1在非致瘤性癌細胞中下調。miRNA的其它靶標包括造血細胞系和組織中表達的MYB原癌基因家族成員，認為 它們與增殖和分化的調節相關。Myc-家族蛋白參與腫瘤發生和幹細胞基因調節(例如，NMYC)。還發現胰島素樣 生長因子結合蛋白，例如IGFBP1與某些癌症有關，也受miRNA的調節。miRNA可調節的另一蛋白質家族是癌基因的Ras家族。Ras癌基因能調節信號轉 導和細胞增殖。在許多癌病例中，K-ras蛋白的累積與潛在的K-ras基因突變相關。叉頭盒OIA(FOXOIA)是參與細胞分化和細胞融合早期步驟的一種必需轉錄因子。 它在幹細胞維持中也起著重要作用。miRNA調節的另一靶標是轉錄因子的SRY-相關HMG-盒(S0X)家族。該家族參與胚 胎發育的調節和決定細胞命運。與其它蛋白形成蛋白質複合物後，該家族的成員S0X2-起 著轉錄活化劑的作用。它在細胞修復和DNA重組中也有作用。這些多核苷酸、多肽及其片段的用途包括但不限於本文所述的作為探針和引物 起始材料的診斷探針和引物，用作癌症診斷和治療抗體的免疫原等。核酸組合物包含片段和引物，至少長約15bp、至少長約30bp、至少長約50bp、至少 約lOObp、、至少長約200bp、至少長約300bp、至少長約500bp、至少長約800bp、至少長約 lkb、至少長約2. Okb、至少長約3. Okb、至少長約5kb、至少長約10kb、至少長約50kb，長度通 常少於約200kb。在一些實施方式中，多核苷酸片段是多核苷酸的編碼序列。還包括本文所 提供序列的變體或簡併變體。本文提供的多核苷酸的變體具有與所提供序列相同大小的片 段相比，通過牛津分子公司(Oxford Molecular)的MPSRCH程序執行Smith-Waterman同源 性檢索算法測定的序列相同性高於至少約65%、高於至少約70%、高於至少約75%、高於 至少約80 %、高於至少約85 %、或高於至少約90 %、95 %、96 %、97 %、98 %、99 %或更高(即 100% )的片段。可通過在低嚴謹性條件下-例如50°C和10XSSC(0. 9M鹽水/0. 09M檸檬酸 鈉)_雜交來檢測具有序列相似性的核酸，該核酸在55°C，1XSSC中洗滌時維持結合。可通 過在高嚴謹性條件下_例如50°C或更高和0. 1XSSC (9mM鹽水/0. 9mM檸檬酸鈉)-雜交來檢 測序列相同性。雜交方法和條件是本領域熟知的，參見，例如美國專利號5，707，829。與所 提供多核苷酸序列基本上相同的核酸，例如等位基因變體(該基因的遺傳改變形式)在嚴 謹性雜交條件下能結合所提供的多核苷酸序列。可利用本文所述多核苷酸序列產生本文所述miRNA的特異性探針。探針通常是本 文提供的多核苷酸序列的片段。可化學合成或用限制性酶從較長的多核苷酸產生所述探 針。例如，可用放射性、生物素化的或螢光標籤標記探針。優選根據本文提供的多核苷酸序 列之任一種鑑定的序列設計探針。癌幹細胞的特徵在癌症中，特徵分析癌症幹細胞能開發專門靶向該關鍵細胞群，特別是它們自我 更新能力的新治療方法，從而獲得更有效的治療。在人類癌症中，致瘤性癌細胞亞群具有自我更新和分化能力。這些致瘤性細胞負 責腫瘤維持，還產生大量非致瘤性的異常分化後代，因此符合癌症幹細胞的標準。所有致瘤 潛能(細胞)包括在癌細胞的⑶44+譜系-亞群中。這些細胞在約103個細胞、約5X103個 細胞、約104個細胞劑量下能弓|發腫瘤生長，與之相比，腫瘤懸液需要約106個細胞劑量才能形成腫瘤，CD44—譜系-細胞在高得多的劑量下也不能形成腫瘤。乳腺癌幹細胞(BCSC)可通過它們特定標記的表型和/或它們的功能表型鑑定。在 一些實施方式中，通過在例如有或沒有特定miRNA存在下使該細胞與感興趣標記的特異性 試劑結合，來鑑定和/或分離BCSC。待分析的細胞最初可以是活細胞，或者可以是固定或包 埋的細胞。在一個實施方式中，採用實時PCR分析來分析miRNA表達。表1所列miRNA的 高水平表明該細胞是非致瘤性或非侵入性細胞，而低水平表明為CSC細胞。可根據表1所列miRNA表達水平來鑑定和/或特徵分析BCSC。表達水平低或不可 檢測表明存在癌症幹細胞。比較miRNA或蛋白質的表達水平時，可用正常乳腺上皮細胞或 非致瘤性癌細胞作為對照。在一些實施方式中，感興趣標記的特異性試劑是可直接或間接標記的抗體或多核 苷酸。在某些情況中，抗體可特異性結合受所公開的特異性miRNA調節的靶蛋白質，例如 S0X2。上文所述的蛋白質或多核苷酸探針可用於，例如測定樣品中是否存在任一種本文 提供的多核苷酸或其變體。下文更詳細描述了這些和其它應用。用本文公開的各種標記染色或與之雜交還能測定原發腫瘤中的癌症幹細胞微域。 存在此類微域可用於診斷原發和轉移部位的鱗狀細胞癌，此類微域數量增加表明腫瘤具有 更高的致瘤性能。差別細胞分析患者樣品中存在BCSC可表明癌的階段或等級。知曉癌細胞亞型和BCSC的位置對 診斷和治療極有幫助。此外，可利用檢測BCSC來監測對治療的反應並有助於預後。預後因 素有助於確定治療方案和強度；具有強陰性預後特徵的患者通常給予更強形式的治療，因 為認為其潛在的效益能彌補治療毒性的增加。可定量測定具有本文所述幹細胞表型的細胞來測定BCSC是否存在。除細胞表面 表型鑑定外，可用於定量測定樣品中具有「幹細胞」特徵的細胞，可通過特定基因的表達概 況、所提供miRNA和靶蛋白的表達或通過功能標準，例如自我更新、體內產生腫瘤的能力來 測定，例如採用異種移植模型等等。可採用的一種方法是本文公開的miRNA種類原位雜交。考慮到miRNA片段的長度 短，可採用鎖定核酸(LNA)作為探針，考慮到其解鏈溫度高以及已知道各miRNA的陽性和陰 性對照。可在較寬範圍內改變解鏈溫度以確定最佳的探針標記條件。還可採用含1、2、3或 4個錯配的錯配LNA探針構成陰性對照。本文所述miRNA的檢測(水平)低或檢測不到是 BCSC的標誌之一。測定是否存在miRNA種類以供診斷或預後的另一方法是聯用RT-PCR與雷射捕獲 顯微解剖。可用多重RT_PCR(逆轉錄-PCR)測定組織樣品中是否存在miRNA種類。也可用任何已知方法進行檢測，包括但不限於採用合適標記的多核苷酸進行原位 雜交、PCR(聚合酶鏈式反應)和「Northern」或RNA印跡、陣列、微陣列等或此類技術的組 合。在本發明測定方法中可採用本領域已知的多核苷酸的各種標記物和標記方法。採用合適的演繹方案、AI系統、統計學比較等，可比較獲自患者樣品的差別祖細胞 分析和參比樣品的差別祖細胞分析。與正常細胞、患相似疾病組織的細胞等參比組織分析 進行比較，能表明疾病的階段。可編輯參比組織分析的資料庫。本發明方法可檢測臨床症
14狀發作前對更具侵襲性腫瘤生長的易感性，因此能進行早期治療幹預，例如啟動化療、提高 化療劑量、改變化療藥物的選擇等。在某些實施方式中，乳腺癌的診斷和預後可包括組織樣品的細胞染色。在某些病 例中，細胞染色有助於描繪腫瘤內的癌細胞亞型和侵襲性癌細胞定位。可採用本領域已知 的常規方法通過細胞染色進行分析。精確計數的技術包括共聚焦顯微術、螢光顯微術、複雜 程度不同的，例如多色通道、低角度和鈍角光散射檢測通道、阻抗通道等螢光活化細胞分選 術。可採用死細胞相關染料(例如碘化丙啶)選出死細胞。抗體試劑可以是miRNA靶向蛋白的特異性抗體，或者也可採用miRNA本身的特異 性多核苷酸探針。與正常細胞或非致瘤性對照相比，miRNA靶標的高表達或miRNA低表達 表明存在BCSC。抗體可以是單克隆或多克隆抗體，可用轉基因動物、經免疫的動物、無限增 殖的人或動物B-細胞、編碼該抗體或T細胞受體的DNA載體轉染的細胞等產生。製備抗體 和它們用作特異性結合成員是否適合的細節是本領域技術人員熟知的。可依據原位雜交分析或抗體結合於組織切片進行分析。此類分析能鑑定腫瘤塊 中組織學不同的細胞並鑑定此類細胞表達的基因。雜交切片可包含一個或多個實體瘤樣 品，例如利用組織微陣列(參見，例如West和van de Riin(2006)Histopathology 48(1) 22-31 ；禾口 Montgomery 等.(2005) Appllmmunohistochem Mol Morphol. 13(1) :80_4)。組織 微陣列(TMA)包含多張切片。可用本領域已知的方法標記選擇的探針，例如感興趣標記的 特異性抗體使之結合於組織切片。染色可與其它組織化學或免疫組織化學方法聯用。所選 基因在腫瘤基質組分中表達就能根據與軟組織腫瘤相關基質細胞的相似性特徵鑑定細胞。篩選試驗在本發明的某些實施方式中，可將miRNA或它們的靶標用於可能有助於研究或藥 物開發的化合物的篩選方法中。在一些實施方式中，進行篩選以發現能提高所提供miRNA 的表達或降低其靶蛋白質在癌症幹細胞中表達的化合物或細胞因子。這包括混合候選藥物 與miRNA表達量低或不表達的細胞群，例如幹細胞或癌症幹細胞群，然後測定候選藥物產 生的任何調節作用。這還包括測定細胞的活性或檢測某些靶蛋白、活力、毒性、代謝改變或 對細胞功能的影響。尤其感興趣的是對人細胞有活性藥物的篩選試驗。為此目的可採用各種試驗，包 括結合miRNA的靶蛋白的免疫試驗；測定細胞生長、分化和功能活性；產生的因子等等。具 體地說，試驗包括分析本文鑑定的受miRNA調節的蛋白質的表達。可採用體外培養的細胞、新鮮分離的細胞、遺傳改變的細胞或動物、純化的miRNA、 純化的miRNA調節的蛋白質等進行篩選。在一個實施方式中，進行篩選以測定能減弱miRNA 靶蛋白活性的候選藥物活性。可通過使純化蛋白質與候選藥物接觸來測試此類藥物。或者， 可將細胞與候選物質接觸以調節這些蛋白質各自的轉錄或翻譯。在此類試驗中，本文公開 的miRNA可用作協調調節這些蛋白質表達的陽性對照。化合物篩選可鑑定到能調節miRNA 調節蛋白的活性或miRNA本身的藥物。能提高特定miRNA活性或表達的候選化合物，可進 一步了解癌症的生物學對開發癌症治療劑至關重要。尤其感興趣的是對人細胞毒性低藥物 的篩選試驗。本文所用的術語「藥物」描述了能改變或模擬與缺血相關基因對應的缺血相關激 酶生理功能的任何分子，例如蛋白質或藥物。通常可採用不同的藥物濃度平行運作多個試驗混合物以獲得對各種濃度的不同反應。通常取這些濃度之一，即零濃度或檢測水平以下 濃度作為陰性對照。候選藥物包括許多化學類別，雖然它們通常是有機分子，但優選分子量大於50而 小於約2，500道爾頓的小有機化合物。候選藥物包含能與蛋白質結構上相互作用的官能 團，特別是氫鍵，通常包含至少一個胺基、羰基、羥基或羧基，優選至少兩個化學官能基團。 候選藥物常包含一個或多個被以上官能團取代的碳環結構或雜環結構和/或芳族或多聚 芳族結構。也可在生物分子中尋找候選藥物，包括肽、糖、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶、它們 的衍生物、結構類似物或組合。從各種來源獲得候選藥物，包括合成或天然化合物的文庫。例如，可採用已有的許 多方法隨機和直接合成各種有機化合物和生物分子，包括表達隨機化的寡核苷酸和寡肽。 或者，可獲得或不難製備細菌、真菌、植物和動物提取物形式的天然化合物文庫。此外，不難 通過常規的化學、物理和生物化學方法修飾天然或合成產生的文庫和化合物，可利於產生 組合文庫。可對已知的藥物進行直接或隨機的化學修飾，例如醯化、烷化、酯化、醯胺化等以 產生結構類似物。可從文庫，例如天然產物文庫或組合文庫獲得測試藥物。許多不同類型 的組合文庫和製備此類文庫方法的描述可參見，例如各自通過引用納入本文的PCT出版物 WO 93/0612UW0 95/12608, W0 95/35503, W0 94/08051 和 W0 95/30642。各種其它試劑可包括在篩選試驗中。這些試劑包括鹽、天然蛋白質(如白蛋白)， 用於促進最佳蛋白質_蛋白質結合和/或降低非特異性或背景相互作用的洗滌劑等試劑。 可採用能改進試驗效率的試劑，例如蛋白酶抑制劑、核酸酶抑制劑、抗微生物劑等。可以任 何順序加入各組分的混合物以提供所需的結合。可在任何合適溫度，通常4-40°C下培育。選 擇(達到)最佳活性的培育時間，但也可優化培育時間以促進快速高通量篩選。通常0. 1-1 小時足夠了。某些篩選方法包括篩選能調節miRNA靶蛋白，例如ZFHX1B、MYB原癌基因和IGFBP1 表達的化合物。此類方法通常包括進行細胞試驗，使測試化合物與表達靶蛋白的一種或多 種細胞接觸，然後檢測靶蛋白的表達水平變化。用富含致瘤性或非致瘤特性的細胞進行一 些試驗。可採用多種不同方法檢測表達。可用能與基因轉錄物(或其衍生的互補核酸)特 異性雜交的探針，檢測細胞中表達的mRNA來測定細胞中基因的表達水平。可裂解細胞進行 Northern印跡，或不裂解細胞而用原位雜交技術進行檢測。或者，可用免疫學方法檢測蛋 白，其中用能特異性結合該蛋白的抗體檢測細胞裂解物。其它細胞試驗是報導試驗。用操作性連接於編碼可檢測產物的報導基因的異源核 酸構建物進行某種這些試驗。可採用許多不同的報導基因。一些報導物本身可檢測。此類 報導物的一個例子是發射可用螢光檢測器檢測螢光的綠色螢光蛋白。其它報導物產生可檢 測產物。此類報導物常常是酶。示範性酶報導物包括但不限於葡糖醛酸酶、CAT(氯黴 素乙醯轉移酶；Alton和Vapnek (1979) Nature 282 :864_869)、螢光素酶、0 _半乳糖苷酶和 鹼性磷酸酶(Toh 等，(1980)Eur. J. Biochem. 182 :231_238 ；和 Hall 等.(1983) J. Mol. Appl. Gen. 2 101)。在這些試驗中，使含報導構建物的細胞與測試化合物接觸。能結合啟動子使之活 化或觸發產生感興趣的miRNA級聯反應的測試化合物將導致可檢測報導基因的表達。某些
16其它報導試驗採用包含異源構建物的細胞進行，所述異源構建物包含能活化表達的轉錄調 控元件。在本文中，還可通過報導基因表達相關信號的產生，來鑑定能結合轉錄調控元件而 活化報導基因表達的，或觸發能與轉錄調控元件結合而活化報導基因表達的物質形成的藥 物。可將表達或活化水平與基線值比較。如上所述，基線值可以是對照樣品的數值或 代表對照群體(如健康個體)的統計學數值。還可測定不表達所提供的作為對照的多核苷 酸或蛋白質的細胞的表達水平。此類細胞在遺傳學上通常與測試細胞基本相同。報導試驗中可採用各種不同的細胞類型。可採用真核細胞，該細胞可以是通常用 於產生包含重組核酸構建物的細胞的任何細胞。示範性真核細胞包括但不限於酵母菌和 各種高等真核細胞，例如cos、CH0和HeLa細胞系。可實施各種對照以確保觀察到的活性真實，包括用缺乏報導構建物的細胞進行平 行反應或使含報導構建物的細胞與測試化合物不接觸。也可如下所述進一步驗證化合物。可進一步檢驗通過任何前述篩選方法初步鑑定到的化合物和細胞物質以驗證其 表觀活性。此類方法的基本形式包括將初步篩選鑑定到的候選物給予用作人模型的動物， 然後測定特定miRNA或靶蛋白的表達是否改變。用於驗證研究的動物模型通常是哺乳動 物。合適動物的具體例子包括但不限於靈長類、小鼠和大鼠。設計某些方法來不僅檢驗前導候選物能否改變模型動物的活性，而且可提供抗侵 襲性癌症的保護作用。在此類方法中，將前導化合物給予模型動物(即動物，通常是除人外 的哺乳動物)。該動物因其自身的遺傳組成或環境因素而易於產生侵襲性癌或已患有該癌。 能實現減少侵襲性癌症所需作用的化合物或蛋白物質是進一步研究的良好候選對象。本文所述篩選方法鑑定到的活性測試藥物可用作合成類似化合物的前導化合 物。通常合成的類似化合物具有類似於前導化合物的電子構型和分子構象。可採用例如自 洽場(self-consistent field SCF)分析、構型相互作用(CI)分析和簡正模式動態分析 (normal mode dynamics analysis)等技術鑑定類似化合物。可得到實施這些技術的計算 機程序。參見，例如 Rein 等，(1989)Computer-Assisted Modeling of Receptor-Ligand Interactions (受體-配體相互作用的計算機輔助建模)(Alan Liss,紐約)。癌症的治療本發明還提供降低癌細胞生長的方法。該方法能減少帶有本文提供的特異性標記 或組合標記的癌細胞數量，降低在癌細胞中差別表達基因的表達，改變miRNA表達水平，或 降低癌症相關多肽的水平和/或活性。該方法還包括引入可減少癌症(細胞)生長作用的 多核苷酸或多肽。例如，可將編碼表1所列miRNA的遺傳構建物引入癌症幹細胞以提高該 細胞的miRNA水平。術語miRNA指提供的任何序列，通常指提供的成熟序列。術語「微小RNA」的範圍 中包括活性與天然微小RNA基本上相同的合成分子，例如本領域已知的化學性質改變的合 成寡核苷酸。實施本發明方法時，將有效量的以下簇(但不限於)中的微小RNA的特異性miR 製劑:200c-141 簇(miR200c, miR141) ；200b-200a-429 簇(miR200b, miR200a, miR429)； 和182-96-183簇(miR182，miR96, miR183)引入靶細胞中，可採用任何方便的方法將該制 劑引入靶細胞中。靶細胞通常是癌，包括乳腺癌，更具體地說包括乳腺癌幹細胞，例如具有⑶44+CD24_〃s譜系_細胞表型的細胞。本發明方法可用於預防或治療目的。本文所用的術語「治療」用於指預防疾病和 治療已有的疾病。例如，可在疾病明顯發生前給予藥物來預防自身免疫疾病。尤其感興趣 的是治療現有疾病，即通過治療來穩定或改善患者的臨床症狀。如本領域所知，miRNA是長度約20_25個核苷酸，例如約21-24個核苷酸，例如22 或23個核苷酸的單鏈RNA分子。靶標miR181a可與或不與引入的miR181a製劑完全互補。 如果不完全互補，miRNA及其相應靶病毒基因組應至少基本上互補，這樣該miRNA長度上 (約20-25個核苷酸)的錯配數不超過約8個核苷酸，在某些實施方式中，不超過約6或5 個核苷酸，例如4個核苷酸、3個核苷酸、2個核苷酸或1個核苷酸。miRNA製劑可提高或降低靶miRNA在靶細胞內的水平。當該製劑是抑制性藥物時， 其通過降低靶細胞中miRNA的存在量而抑制靶miRNA的活性，所述靶細胞可以存在於體外 或體內。「降低含量」表示與對照，即未用本發明方法處理的相同靶細胞相比，靶細胞中的 靶miRNA水平或含量降低了至少約2-倍、通常至少約5-倍，例如10-倍、15-倍、20-倍、 50-倍、100-倍或更多。當miRNA製劑提高了細胞中的靶miRNA活性時，靶細胞中miRNA的含量提高，所 述靶細胞可以存在於體外或體內。「提高含量」表示與對照，即未用本發明方法處理的相 同靶細胞相比，靶細胞中的靶miRNA水平或含量提高至少約2-倍、通常至少約5-倍，例如 10-倍、15-倍、20-倍、50-倍、100-倍或更多。miRNA抑制製劑表示能抑制靶miRNA活性的製劑。抑制性製劑可通過各種不同的 機制抑制靶miRNA的活性。在某些實施方式中，抑制性製劑是能結合靶miRNA並藉此抑制 其活性的製劑。代表性miRNA抑制性藥物包括但不限於反義寡核苷酸等。其它感興趣的 藥物包括但不限於感興趣的天然產生或合成的小分子化合物，包括許多化學類別，雖然它 們通常是有機分子，但優選分子量大於50小於約2，500道爾頓的小有機化合物。候選藥物 包含有與蛋白質結構相互作用的官能團，特別是氫鍵，通常包含至少一個胺基、羰基、羥基 或羧基，優選至少兩個化學官能基團。候選藥物常常包含一個或多個以上官能團取代的碳 環或雜環結構和/或芳族或多聚芳族結構。還在生物分子中尋找候選藥物，包括肽、糖、脂 肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶、它們的衍生物、結構類似物或組合。可用合適的篩選方案鑑定此 類分子。反義試劑可以是反義寡核苷酸(0DN)，特別是含有化學修飾的天然核酸的合成 0DN，或表達此類反義分子的核酸構建物，例如RNA。反義序列與靶miRNA互補並抑制其表 達。可給予一種反義分子或反義分子的組合，所述組合可包含多個不同的序列。可通過表達合適載體中的所有或部分靶miRNA序列而產生反義分子，其中對轉錄 起始定向從而將反義鏈製備成RNA分子。或者，反義分子是合成的寡核苷酸。反義寡核苷 酸的長度通常至少約7個、通常至少約12個、更常至少約20個核苷酸，不超過約25個、通 常不超過約23-22個核苷酸，其中該長度受抑制效率、特異性(包括不存在交叉反應性)等 控制。可用本領域已知的方法化學合成反義寡核苷酸(參見Wagner等.(1993)同上和 Milligan等，同上)。優選的寡核苷酸含有化學修飾的天然磷酸二酯鍵結構以提高它們的 胞內穩定性和結合親和力。參考文獻中已描述了改變骨架、糖或雜環鹼基化學性質的許多此類修飾。骨架化學性質中有用的改變是硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯(其中兩個非橋連氧被 硫取代)；磷酸醯胺酯(phosphoroamidite)；烷基磷酸三酯和硼磷酸酯(boranophosphate) (鍵)。非手性磷酸酯衍生物包括3' -0' -5' -S-硫代磷酸酯、3' -S-5' -0-硫代磷酸 酯、3' -CH2-5' -0-磷酸酯和3' -NH-5' _0_氨基磷酸酯。肽核酸用肽鍵替代整個核糖磷 酸二酯骨架。也可採用糖修飾來增強穩定性和親和力。可採用脫氧核糖的a _端基異構體， 其中鹼基相對於天然的端基異構體是倒置的。可改變核糖的2' -0H以形成2' -0-甲 基或2' -0-烯丙基糖，從而提供對降解的抗性而不損害親和力。雜環鹼基的修飾必須維持 適當的鹼基配對。一些有用的取代包括脫氧尿苷取代脫氧胸苷；5-甲基-2'-脫氧胞苷和 5-溴-2'-脫氧胞苷取代脫氧胞苷。當分別取代脫氧胸苷和脫氧胞苷時，已證明5-丙炔 基-2'-脫氧尿苷和5-丙炔基-2'-脫氧胞苷能提高親和力和生物學活性。感興趣的反義分子包括拮抗性(antagomir)RNA，例如通過引用專門納入本文的 Krutzfeldt等(同上)所述。經工程改造使之具有某些「藥物-樣」特性，例如為穩定性而 作化學修飾和偶聯膽固醇以便遞送的小幹擾性雙鏈RNA(siRNA)已顯示在體內能實現內源 基因的治療性沉默。為開發體內沉默性miRNA的藥理學方法，開發了與miRNA互補的、經化 學修飾的偶聯膽固醇的單鏈RNA類似物，稱為「拮抗物」。可採用標準固相寡核苷酸合成方 案合成拮抗性RNA。將RNA偶聯於膽固醇，還可在一個或多個位置含有硫代磷酸酯骨架。某些實施方式感興趣的也是RNAi製劑。在代表性的實施方式中，RNAi製劑靶向 微小RNA的前體分子，稱為前-微小RNA分子。RNAi製劑指能通過RNA幹擾機制調節微小 RNA表達的製劑。本發明一個實施方式中採用的RNAi製劑是以雙鏈體結構存在的小核糖 核酸分子(本文也稱為幹擾性核糖核酸)，即寡核糖核苷酸，例如兩種不同的寡核糖核苷酸 彼此雜交或一種寡核糖核苷酸承擔形成小髮夾而產生雙鏈體結構。寡核糖核苷酸指長度 不超過約100個核苷酸的核糖核酸，通常長度不超過約75個核苷酸，在某些實施方式中長 度小於約70個核苷酸。當該RNA製劑是兩種不同核糖核酸彼此雜交形成的雙鏈體結構， 例如siRNA，該雙鏈體結構的長度通常約15-30bp，常見約15-29bp，在某些實施方式中，約 20-29bp長度，例如尤其感興趣21bp、22bp。當該RNA製劑是以髮夾形式存在的一種核糖 核酸的雙鏈體結構，即shRNA，髮夾雜交部分的長度通常與以上siRNA類型製劑所提供的相 同，或更長4-8個核苷酸。該實施方式的RNAi重量通常約為5，000道爾頓至約35，000道爾 頓，在許多實施方式中，至少約10，000道爾頓-小於約27，500道爾頓，常常小於約25，000 道爾頓。當需要提高細胞中miRNA表達，例如誘導分化，藥物可以是微小RNA本身，包括以 上關於反義所述的任何修飾的寡核苷酸，例如膽固醇偶聯物、硫代磷酸酯鍵連接等。或者， 可採用表達miRNA的載體，包括與靶向生物相關的前-miRNA(髮夾)序列。可利用表達載體將靶基因弓丨入細胞內。此類載體通常在啟動子序列附近含有方便 的限制性位點以供插入核酸序列。可製備包含轉錄起始區、靶基因或其片段和轉錄終止區 的轉錄盒。可將轉錄盒引入各種載體，例如質粒；逆轉錄病毒，例如慢病毒、腺病毒等中，所 述載體能在細胞中短暫或穩定維持，通常至少約1天，更常至少約數天到數周。表達盒通常採用外源性轉錄起始區，即除在正常產生的染色體中與T細胞受體結 合的啟動子外的啟動子。該啟動子在宿主細胞，特別是表達盒靶向的宿主細胞中具有功能。
19可用體外重組方法引入啟動子，或由合適宿主細胞對該序列作同源整合。該啟動子操作性 連接於自身抗原的編碼序列從而產生可翻譯的mRNA轉錄物。表達載體在啟動子序列附近 方便地含有限制性位點以利於自身抗原序列的插入。將表達盒製備成含有組成型或誘導型轉錄起始區、編碼自身抗原序列的基因和轉 錄終止區。可將表達盒弓|入各載體中。感興趣的啟動子可以是誘導型或組成型啟動子，通常 是組成型啟動子，可在疫苗接受細胞中提供高水平的轉錄。啟動子可以僅在接受細胞類型 中具有活性，或者可在許多不同細胞類型中具有廣泛活性。許多哺乳動物細胞的強啟動子 是本領域已知的，包括肌動蛋白啟動子、SV40早期和晚期啟動子、免疫球蛋白啟動子、 人巨細胞病毒啟動子、逆轉錄病毒LTR等等。啟動子可與增強子結合或不結合，其中增強子 可以天然與特定啟動子結合或與不同啟動子結合。在編碼區的3』端提供終止區，該終止區可以天然與可變區結構域結合或可衍生自 不同來源。可採用不會有害地影響表達的各種終止區。可在體外或可在合適的宿主細胞， 例如大腸桿菌中進行各種操作。各次操作後，可克隆所得的構建物，分離載體，篩選DNA或 測序以確保構建物的正確性。可通過限制性分析、測序等篩選序列。如上所示，可採用任何便利的方案將miRNA藥物引入靶細胞內，所述方案根據靶 細胞是在體外還是體內而有所不同。可採用許多選項將dsRNA遞送入細胞或細胞群，例如 細胞培養物、組織、器官或胚胎中。例如，可在胞內直接引入RNA。在此類情況中，通常採用各 種物理方法，例如顯微注射給予(參見，例如Zernicka-Goetz等，(1997)Development 124 1133-1137 ；和 Wianny 等，(1998) Chromosoma 107 :430_439)。細胞遞送的其它選擇包括在 dsRNA存在時滲透處理細胞膜和電穿孔、脂質體介導的轉染或用諸如磷酸鈣等化學物質轉 染。也可採用許多已建立的基因治療技術將dsRNA引入細胞內。例如，通過將病毒構建物 引入病毒顆粒內可實現將表達構建物有效引入細胞內以轉錄該構建物編碼的RNA。例如，可將抑制性藥物直接餵入、注射入含靶基因的宿主生物。可將該藥物直接引 入細胞內(即胞內)；或胞外引入體腔、細胞間隙，引入宿主的循環系統，口服引入等。口服 引入的方法包括直接混合RNA與生物體的食物。引入核酸的物理方法包括將RNA溶液直接 注射入細胞或胞外注射入生物體。該藥物的引入量應能遞送每個細胞至少一拷貝。該藥物 的更高劑量(例如，每個細胞至少5、10、100、500或1000個拷貝)可產生更有效的抑制；對 於具體應用，較低劑量也可能有用。採用脂質體時，可將能結合胞吞作用相關細胞表面膜蛋白的物質連接於脂質體使 脂質體靶向T細胞而促進攝取。可連接的蛋白質的例子包括能結合T細胞的衣殼蛋白或其 片段，能特異性結合循環性T細胞上經歷內化的表面蛋白的抗體和靶向T細胞內胞內定位 的蛋白質。基因標記和基因治療方案的綜述見Anderson等，(1992) Science 256 :808_813。在某些實施方式中，採用流體動力學核酸給予方案(hydrodynamic nucleicacid administration protocol)。當藥物是核糖核酸時，特別感興趣的是下文詳細描述的 流體動力學核糖核酸給予方案。當藥物是脫氧核糖核酸時，感興趣的是Chang等.， J.Virol. (2001)75 :3469_3473 ；Liu 等 ，Gene Ther. (1999)6 1258-1266 ；Wolff 等 ， Science (1990) 247 1465-1468 ；Zhang 等.，Hum. GeneTher. (1999) 10 1735-1737 ；和 Zhang 等.，Gene Ther. (1999) 7 1344-1349所述的流體動力學脫氧核糖核酸給予方案。其它感興趣的核酸遞送方案包括但不限於以下文獻所述的那些感興趣的美國專
20利包括5，985，847和5，922，687 (其內容通過引用納入本文)；W0/11092 ；Acsadi等.，New Biol. (1991)3 71-81 ；Hickman 等.，Hum. Gen. Ther. (1994)5 1477-1483 ；和 Wolff 等.， Science (1990) 247 1465-1468 等等。根據藥物的性質，可採用能在靶細胞中產生所需miRNA調節作用的任何方便方法 給予宿主活性藥物。因此，可將藥劑摻入各種製劑以便治療性給藥。更具體地說，可通過與 合適的藥學上可接受的運載體或稀釋劑混合將本發明的藥物配製成藥物組合物，可配製成 固體、半固體、液體或氣體形式的製品，例如片劑、膠囊、粉末、顆粒、軟膏、溶液、栓劑、注射 劑、吸入劑和氣溶膠。因此，可以各種方式給予該藥物，包括口服、口腔含化、直腸、胃腸外、 腹膜內、真皮內、透皮、鞘內等給予。本文所用的術語「單位劑型」指適合人和動物對象單位劑量的物理上不連續的單 位，每個單位含有經計算足以產生所需作用的預定量的本發明化合物以及藥學上可接受的 稀釋劑、運載體或載體。本發明新型單位劑型的規格取決於所用的特定化合物和要達到的 效果以及各化合物在宿主中的相關藥代動力學。藥學上可接受的賦形劑，例如載體、佐劑、運載體或稀釋劑不難公開獲得。而且，藥 學上可接受的輔助物質，例如PH調節劑和緩衝劑、張力調節劑、穩定劑、潤溼劑等不難公開獲得。本領域技術人員不難理解劑量水平可隨具體化合物的功能、遞送載體的性質等而 不同。本領域技術人員不難採用各種方式測定給定化合物的優選劑量。如上所述將有效量 的miRNA物質引入哺乳動物細胞內以調節靶基因的表達，導致修飾癌的致瘤活性，從而提 供用靶向癌症幹細胞的方法治療癌症的方式。「降低癌細胞生長」包括但不限於降低癌細胞增殖，降低非癌細胞變成癌細胞的 發生率。採用任何已知的試驗，包括但不限於[3H]_胸苷摻入，一段時期內的細胞計數；檢 測和/或測量BCSC相關標記等，不難測定是否實現了癌細胞生長的降低。本發明提供治療癌症的方法，通常包括給予有此需要的個體能降低癌細胞生長的 物質，給予量應足以降低癌細胞生長並治療癌症。可採用各種已知的癌症診斷試驗，包括但 不限於活檢、對比放射照相研究、CAT掃描和檢測個體血液中癌症相關的腫瘤標記，來評 估某物質或該物質的具體用量是否有效治療了癌症。可全身或局部，通常是全身給予該物 質。可使能降低癌細胞生長的藥物，例如化療藥物靶向癌細胞。因此，在一些實施方式 中，本發明提供將藥物遞送給癌細胞的方法，包括將藥物_多肽或藥物_多核苷酸複合物 給予對象，其中所述複合物對於miRNA-調節的多肽或miRNA本身具有特異性，所述藥物是 能降低癌細胞生長的藥物，各種藥物是本領域已知和上文討論過的。可通過將藥物偶聯於 (例如，共價或非共價直接連接或通過接頭分子連接，從而形成藥物_抗體複合物)miRNA的 特異性抗體或受miRNA調節的多肽來實現靶向。偶聯藥物形成複合物的方法是本領域熟知 的，本文無需贅述。本說明書述及的各出版物出於所有目的通過引用全部納入本文。應理解本發明不限於具體的方法、方案、細胞系、動物種或屬和所述的試劑，因為 這些均可改變。還應理解本文所用的術語目的只是描述特定的實施方式，不是要限制本發 明的範圍，本發明的範圍只由隨附的權利要求書限制。
除非文中另有明確表述，本文所用的單數形式「一」、「一個」和「該」包括複數形式。 因此，例如，述及「一個細胞」包括多個此類細胞，述及「該培養物」包括述及一個或多個培 養物和本領域技術人員已知的其等價形式，等等。除非另有表述，本文所用的所有技術和科 學術語具有與本發明所屬領域普通技術人員共同理解的相同含義。實驗實施例1鑑定乳腺癌幹細胞的基因標籤我們曾根據⑶44和⑶24表達將BCSC鑑定為⑶44+⑶24v<s譜系。將從三份乳腺還 原(breast reduction)樣品分離的正常乳腺上皮細胞以細胞表面標記的表達定義為ESA+ 譜系_ (⑶64_、CD31—、CD140b_、CD45_)。我們通過微陣列分析，尋找分離自6位患者(有原 發性惡性胸膜滲出的3個人和在免疫缺陷小鼠中乳腺腫瘤生長為實體瘤異種移植物的3 個人)的BCSC與3次還原乳房成形術(reduction mammoplasties)產生的正常人乳腺上 皮細胞之間差別表達的基因。根據表達水平有兩倍差異選出一組186種基因，所有樣品的 t-檢驗P值< 0. 005。用本-赫氏方法(Beniamini-Hochberg procedure)控制假髮現率 (FDR)。根據以上標準，清單中基因的FDR不到5%。如預計的那樣，作為癌症幹細胞基因 標籤的186種基因的基因表達模式足以鑑別乳腺癌幹細胞與正常乳腺上皮細胞。我們還 對3份異種移植物的BCSC樣品和1份正常乳腺上皮樣品中隨機選擇的14種基因進行實時 PCR來驗證這186種基因的差別表達。實時PCR所見的各腫瘤樣品中的基因表達模式在很 大程度上與微陣列數據觀察到的相一致在檢驗的3個腫瘤中，我們觀察到所有14種基因 的表達模式相一致，在第三個腫瘤中，14種基因中有9種表達模式與陣列數據相一致。(參 JAL Liu, M. F. Clarke, M. F. Association of a GeneSignature from Tumorigenie Breast Cancer Cells with Clinical Outcome (致瘤性乳腺癌細胞的基因標籤與臨床結果相關)， The New England Journal ofMedicine，356 :217_226，2007，通過引用專門納入本文)。用ABI陣列進一步篩選10個患者腫瘤的BCSC和非致瘤性癌細胞表達了 500種以 上的miRNA。用實時RT-PCR證實了這些結果(表2)。根據微小RNA表達的結果，發現miRNA在調節基本BCSC功能中起著重要作用。由 miR-182、miR-182、miR-200a、miR_200b、miR-200c 組成的一組 miRNA 在乳腺癌幹細胞中一 致下調。在胚胎癌細胞(EC細胞)中完全喪失所有5種miRNA的表達，但它們在正常胚胎 幹細胞(ES細胞)中表達。這些數據證明乳腺癌中存在具有幹細胞-樣特性的引發腫瘤的 細胞群，其miRNA可用作診斷或治療靶標。然後研究了這些miRNA的靶標。認為m200b和m200c具有相同的靶標。已經驗證 的m200b的一個靶標是抑制E-鈣粘蛋白表達並在正常幹細胞生物學和EMT中起作用的蛋 白質ZFHX1B。據報導，BCL-2家族中抗凋亡蛋白的多個成員也是靶標。BCL-2家族蛋白不 受控制的表達涉及正常幹細胞的致癌作用和自我更新。這些mRNA 中的四禾中(ml83, m200a, m200b, and m200c)可靶向 BMI1。BMI1 在許多 組織的正常幹細胞和至少一些癌症幹細胞自我更新中起作用。重要的是，我們發現BMI1蛋 白在許多患者的腫瘤中所見的非致瘤性癌細胞中下調。BMI1 mRNA中的靶序列在物種之間 高度保守，使它很可能成為真正的靶標，這些miRNA的其它感興趣靶標是MYB原癌基因、NMYC、IGFBP1、KRAS、F0X01A和Sox2。MYB和NMYC基因與正常和惡性幹細胞更新相關。近年(發現)MYB涉及乳腺癌的 腫瘤發生。F0X01A在幹細胞維持中起作用。CSC在微陣列上過表達了這些基因中的幾種。 Affymetrix陣列檢測到BCSC表達的這些基因中有幾種差別達2-14倍。實施例2依據福馬林固定的石蠟包埋(FFPE)腫瘤標本開發可用作預後和預測工具的標 記。利用本文鑑定的在BCSC中差別表達的序列產生標記(原位雜交探針)以測定福爾馬 林固定石蠟包埋(FFPE)組織中腫瘤幹細胞的數量和位置。通過組織學檢驗分析了所有乳 腺癌活檢和切片標本，該檢驗採用福馬林固定後石蠟包埋材料的薄切片。因此，全國外科 病理學部門檔案室中保存了大量收集的腫瘤標本，可用於組織學研究腫瘤幹細胞和它們在 臨床結果中所起的作用以及對輔助治療的反應。利用含有福馬林固定石蠟包埋(FFPE)的臨床結果已知的腫瘤標本的組織微陣 列(TMA)測定這些發現的臨床意義。測定了包括腫瘤中的正常基質細胞、乳腺CSC和其它 癌細胞的各腫瘤細胞群所表達的預後或預測標記。開發了原位雜交探針(ISH)以評價石蠟包埋組織中的基因表達。在約10天中產 生ISH探針。這些探針具有成功率。St Croix等和Iacobuzio-Donahue等描述了 ISH技 術。它採用長度為400-600個核苷酸的長RNA探針，依賴於信號的酪胺放大，然後用生色或 螢光底物顯色。這些試劑對石蠟包埋福馬林固定的組織工作得極好。ISH探針優於常規 抗血清或單克隆抗體在於其可包括有義鏈或錯義探針作為對照。對於所選擇的探針，對乳 腺癌冷凍標本的雷射捕獲解剖材料進行RT-PCR以驗證其表達模式。構建了含多達500個乳腺癌的TMA可用一個TMA模塊代表。乳腺的TMA包括1) 正常乳腺組織的微陣列；2)注釋乳腺癌組織的微陣列。將獲得這些病例的臨床隨訪報告。 3)為研究乳腺癌之間的變異性，具體地說是患者_特異性因素(與各腫瘤_特異性因素相 反)所確定的各癌症標本中腫瘤幹細胞存在數量的(變異)程度，用患者的2個獨立原發 乳腺癌(breast cancerprimary)的乳腺癌材料產生TMA。4)為研究轉移過程對乳腺癌中 腫瘤幹細胞數量的影響，產生了代表20位患者材料的組織微陣列。對於各患者，原發性乳 腺腫瘤用一個或多個淋巴結轉移灶和遠端部位，例如腦、肺或骨的轉移灶一起代表。5)還可 採用含有原發侵襲性乳腺癌標本的乳腺癌組織微陣列，可採用全部患者的結果數據，隨訪 中值為15. 4年(6. 3-26. 6年)。隨訪包括總存活數、疾病特異性存活數和首次復發時間。測定組織學切片中存在的miRNA種類.miRNA種類可用作腫瘤幹細胞的標記。採 用解鏈溫度遠高於RNA的鎖定核酸(LNA)進行miRNA種類的原位雜交。採用LNA探針和各miRNA種類的已知陽性和陰性對照檢查組織微陣列(由RT-PCR 驗證)，實驗方法的解鏈溫度變化範圍很大。採用含1、2、3或4個錯配的錯配LNA探針組成 的陰性對照。測定各種組分中(腫瘤細胞與基質細胞)是否存在miRNA種類的第二種方案聯用 RT-PCR與雷射捕獲顯微解剖。採用少至25個細胞，線性擴增後可產生足夠的材料以可靠地 定量測定約500種不同的miRNA。通過雷射捕獲顯微解剖不難獲得細胞數。用miRNA標記 分析這些乳腺癌TMA能測定最佳探針的回溯方式(retrospective manner)。實施例3賦予CSC對抗標準細胞毒性化療的靶途徑.採用外源性miRNA或合成shRNA靶向使CSC對抗治療的途徑。採用了以下三種不同的公布方法遞送shRNA:脂質體遞送(參見 Sorensen 等.(2003) J Mol Biol 327，761-6)、將 shRNA 與去端肽膠原(atellocolagen)偶 聯(參見 Takeshita 等.(2005) ProcNatl Acad Sci U S A 102,12177-82)和將 shRNA 與 單克隆抗體/魚精蛋白複合物偶聯(參見Song等.(2005)Nat Biotechnol 23, 709-17) 0 第三種方法採用能特異性靶向癌細胞的抗體。在後一情況中，檢驗了特異性結合CSC的抗 體或靶向所有癌細胞的抗體。用流式細胞術鑑定靶向特定異種移植腫瘤中CSC或所有癌細 胞的抗體。檢驗了 6位不同患者的腫瘤產生的異種移植腫瘤以確定全身遞送shRNA是否增 強了化療(環磷醯胺、紫杉醇和阿黴素)或放療效果。產生異種移植腫瘤，當它們達到 0. 5cm大小時，用一種細胞毒藥物和脂質體遞送的偶聯於去端肽膠原的實驗性shRNA或對 照shRNA，或一種單克隆抗體/魚精蛋白複合物治療小鼠。治療後繼續檢測腫瘤體積4個 月。各實驗組至少包括10隻小鼠，重複實驗3次。此外，取出用對照或實驗性shRNA治療 的5隻小鼠的腫瘤進行分析以確定shRNA在體內下調了感興趣蛋白的表達。遞送靶向諸如BMI1、MYB、PTEN、STAT等途徑(CSC差別表達的miRNA)和其它途徑 的shRNA以測定對乳腺癌幹細胞存活和自我更新的影響。如上所述進行這些實驗。例如全 身性遞送在CSC中低表達的miRNA以測定其治療潛力。實施例4下調微小RNA簇將正常與惡性乳腺幹細胞相聯繫人乳腺癌包含具有回憶正常成人和胚胎幹細胞特性的明顯癌症幹細胞群(BCSC)。 正常和惡性幹細胞共有的自我更新和分化的分子調節劑尚未見描述。我們發現BCSC和非 致瘤性癌細胞差別表達37種miRNA。在正常乳腺幹細胞、人乳腺癌幹細胞和胚胎癌細胞 中，-miR-200c-14UmiR-200b-200a-429 和 miR-183-96_182 三簇下調。miR_200c 可調節已 知的胚胎幹細胞自我更新和分化的調節劑S0X2的表達。此外，miR-200c和miR-183的表 達抑制了胚胎癌細胞的體外生長，消除了它們體內形成腫瘤的能力並抑制了乳腺癌細胞的 體外集落生成。這三簇miRNA的下調可提供聯繫乳腺癌幹細胞和正常幹細胞生物學的分子 連接。在本項研究中，我們鑑定到在正常小鼠乳腺幹細胞、人乳腺癌幹細胞和人胚胎癌 細胞中特異性下調的3簇miRNA。miR-200c和miR-183 (位於下調簇中2簇的miRNA)的表 達通過損傷幹細胞/祖細胞的維持而抑制胚胎癌細胞的體外生長，抑制了它們體內的致瘤 性並強烈抑制乳腺癌細胞的集落生成。我們的結果表明下調這三簇miRNA調節了正常和惡 性幹細胞的幹細胞自我更新途徑。結果人乳腺和胚胎幹細胞的MiRNA模式分析.由於miRNA是參與正常胚胎和組織幹細 胞自我更新和分化的關鍵調節劑，我們比較了人CD44+CD24_/<S譜系_乳腺癌細胞(TG細胞) 與其餘_非致瘤性乳腺癌細胞譜系(NTG細胞)之間的miRNA表達模式。在許多乳腺癌患 者中，與其餘譜系的乳腺癌細胞相比，小群CD44+CD24_/<S譜系_癌細胞在免疫缺陷小鼠中具 有高度致瘤性。CD44+CD24-/ 譜系_細胞具有幹細胞樣特性，例如自我更新和分化能力，可 從少至200個細胞產生原始腫瘤，而數萬個其餘譜系的非致瘤性癌細胞不能。採用多重實時PCR檢測了分離自3個人乳腺腫瘤的TG細胞和NTG細胞中460種
24miRNA的表達。我們發現在分析的所有3個樣品中，與NTG細胞相比，有37種miRNA在TG 細胞中上調或下調(圖1A)。然後檢測到總共11組人TG細胞和NTG細胞中有這37種差 別表達的miRNA表達，該分析證實這37種miRNA確實為差別表達(圖1B)。三簇miRNA 中，miRNA-200c-141簇位於染色體12pl3上，miR-200b-200a-429簇位於染色體lp36上和 miR-183-96-182簇位於染色體7q32上，在人乳腺癌TG細胞中均下調(圖1C)。例如，與 NTG 細胞相比，TG 細胞的 miR-200a、miR-200b 和 miR_200c 表達低 2-218 倍。據認為⑶44+CD24_m譜系_細胞是正常乳腺幹細胞或早期祖細胞的對應惡性細胞。 類似地，胚胎癌細胞是生殖細胞產生的惡性細胞，它們共有多能幹細胞的許多特性。因此， 檢驗了 Tera-2胚胎癌細胞的這些miRNA表達。值得注意的是，Tera-2細胞或不表達可檢 測水平的各miRNA，或表達水平正好在可檢測水平(圖1D)。當表達水平與乳腺癌細胞相比 時，Tera-2細胞表達的所有這些miRNA比乳腺癌NTG細胞低至少4倍。miRNA種子序列的 作用是使miRNA指向其mRNA靶標。顯然兩組含有基本上相同種子序列的miRNA (miR-200c/ miR-200b/miR-429miRNA 和 miR-200a/miR-141miRNA)形成了 miR-200c_141 簇和 miR-200b-200a-429簇(圖1C)。鑑於此種相似性和觀察到的表達模式，所有這3簇miRNA 在乳腺癌CD44+CD24—M譜系-細胞和Tera-2胚胎癌細胞中的下調對維持癌細胞的幹細胞功 能至關重要。MiRNA表達將正常乳腺發育與乳腺癌幹細胞分化相聯繫.癌細胞與正常組織 幹細胞功能的相似性提示，正常幹細胞自我更新和/或分化途徑的活化可解釋與惡變 相關的許多特性。因此，我們檢驗了早期乳腺幹細胞和祖細胞及更多的分化乳腺上皮 祖細胞中乳腺癌TG細胞和NTG細胞差別表達的miRNA表達。雖然仍然只部分了解小 鼠乳腺上皮的細胞體系(cellularhierarchy)，但已知CD24 + CD49f s CD29 s Sca-F小 鼠乳房脂肪墊細胞富含在體內能再生整個乳腺的乳腺幹細胞。我們收集的⑶24 + CD49f髙CD45TD3rCD140aTerll9-細胞(MRU)富含乳腺幹細胞，收集的CD24髙CD49f低 ⑶45_CD31TD140a_Terll9_細胞(MaCFC)富含更加分化的乳腺上皮祖細胞(圖2A)。我們發 現與MaCFC相比，在人乳腺癌TG細胞中下調的所有這三簇miRNA在小鼠MRU細胞中也下調 (圖2B)。這證明在乳腺癌TG細胞與NTG細胞之間差別表達的這3簇miRNA是正常乳腺細 胞發育途徑的關鍵組分。MiR-200c 向 S0X2.通過 TargetScan 4. 2 預測 miR_200bc/429 的潛在分子靴 標。在潛在的靶標中，我們關注S0X2，因為它具有正統靶標標誌性的關鍵保守核苷酸並且 已知它是調節其它類型幹細胞(包括胚胎幹細胞)自我更新和分化所必須。通過螢光素酶 報導試驗評價了 miR-200c調節S0X2的3，UTR能力。採用不表達miR_200c和miR-429和 僅表達可檢測水平miR-200b的HEK293T細胞。將S0X2的3，UTR靶位點克隆入pGL3_對 照載體中螢光素酶小基因的下遊。用PGL3螢光素酶載體、pRL-TK Renilla螢光素酶載體 和miR-200c前體RNA共轉染HEK293T細胞。我們觀察到對於S0X2，螢光素酶活性被抑制了 60% (圖3B)；而且，miRNA-200bc/429種子區的突變消除了 miRNA抑制S0X2表達的能力， 從而證明該靶序列對S0X2的特異性(圖3A和3B)。還檢驗了 miR-200c調節內源性S0X2蛋白的能力。為此，我們用表達miR-200c的 慢病毒感染Tera-2細胞。用流式細胞術收集被感染的細胞。蛋白質印跡顯示表達miR-200c 的細胞中S0X2蛋白表達降低(圖3C)。相反，陰性對照-miR-30a和miR-183不調節S0X2蛋白表達。隨後我們檢測了收集自人原髮乳腺癌樣品的致瘤性CD44+CD24_m譜系_細胞(TG 細胞)和NTG細胞中的S0X2表達。如圖3D所示，乳腺癌NTG細胞的S0X2蛋白表達明顯低 於TG細胞。MiR-200c和miR-183體外抑制癌細胞生長.觀察到相同的miRNA簇在正常乳腺 幹細胞、致瘤性⑶44+⑶24" 譜系_乳腺癌細胞和胚胎癌細胞中下調，暗示這些miRNA是幹 細胞關鍵功能，例如自我更新和/或分化的調節劑。實際上，近年業已證明miR-200家族 的miRNA通過抑制ZEBl和ZEB2 (E-鈣粘蛋白的轉錄阻抑物)表達而防止了 EMT (上皮向間 充質的過渡)。EMT是幹細胞的一種特性，與正常和癌症幹細胞相關聯。為測定這些miRNA 的一些表達如何影響細胞，我們用表達miR-200c或miR-183的慢病毒載體感染細胞。被 miR-200c或miR-183慢病毒感染的細胞的形態提示它們已分化(圖4A)。實際上，用抗-神 經元特異性III類微管蛋白(Tuj-I)抗體染色顯示被miR-200c感染的Tera-2細胞優先表 達有絲分裂後早期神經元的標記Tujl抗原，提示該miRNA誘導了神經分化(圖4B)。我們發現被miR-200c或miR-183慢病毒感染，但不是被對照慢病毒感染的Tera_2 細胞顯示生長遲滯(圖4C)。miR-200c導致的生長遲滯強於miR-183，反映為所觀察到的神 經發育強度(圖4B和4C)。小鼠MMTV-Wnt-I乳腺腫瘤由腔上皮和肌上皮細胞及擴增的乳 腺幹細胞庫組成。我們用表達miR-200c或miR-183的慢病毒感染MMTV-Wnt-I鼠乳腺癌細 胞。被miR-183或miR-200c感染細胞的集落形成幾乎受到完全抑制，與對照慢病毒感染的 細胞相比，miR-200c的集落數降低96%, miR-183降低94% (圖5A)。正常乳腺幹細胞/祖細胞(MRU，乳腺再生單位)和MMTV-Wnt-I乳腺癌幹細胞，是 肌上皮細胞細胞角蛋白CK14和上皮細胞細胞角蛋白CK8/18雙表型表達細胞。成熟上皮細 胞表達CK8/18或CK19但不表達CK14。肌上皮細胞表達CK14但不表達CK8/18或CK19。 對照病毒感染的乳腺癌細胞形成了大集落並表達CK14和CK8/18，偶有細胞表達CK19 (圖 5B)，而被表達miR-183或miR-200c的病毒感染的細胞僅形成顯示CK14水平低的小細胞聚 集體(圖5B)。這些結果顯示miR-183和miR-200c感染的乳腺癌細胞喪失了祖細胞的表 型，miR-183和miR-200c的表達誘導了乳腺癌幹細胞的體外分化。miR-200c和miR-183抑制胚胎癌細胞的致瘤性.為測定miR_200c和miR-183對體 內癌細胞生長影響的意義，用表達miR-200c或miR-183的慢病毒或對照慢病毒感染Tera-2 胚胎癌細胞，通過流式細胞術收集被感染的細胞。然後將被感染的Tera-2細胞皮下注射入 免疫缺陷N0D/SCID小鼠。兩個月後，我們觀察到注射被對照慢病毒感染的50，000個Tera_2 細胞的3/3隻小鼠明顯形成了腫瘤，而接受miR-200c感染和miR-183感染的Tera_2細胞 的3隻小鼠無一形成腫瘤(圖6)。本文報導的結果證明miR-200c-141、miR-200b-200a-429 和 miR-183-96_182 在 正常乳腺幹細胞、人乳腺癌幹細胞和胚胎癌細胞中下調，S0X2表達受miR-200c調節。S0X2 是HMG-結構域蛋白家族的一員，與0CT4形成的複合物可結合DNA、調節轉錄並指導胚胎幹 細胞和一些譜系的特異性幹細胞(例如神經幹細胞)的自我更新和分化。在本文中，我們 觀察到miR-200c和miR-183表達還抑制了胚胎幹細胞的體外生長、誘導它們的神經分化、 消除它們的體內腫瘤形成能力並抑制乳腺癌細胞的體外集落生成性能。因此，我們關於差 別miRNA表達的數據提供了癌症幹細胞與胚胎幹細胞之間的分子聯繫，以及對許多患者的 腫瘤中CD44+CD24Vis譜系_乳腺癌細胞亞群顯示致瘤性增加的分子解釋。
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我們的分析揭示有5種差異表達的miRNA下調、它們共有相同的種子序列、尚未繪 制不同染色體上的兩簇圖譜。這些miRNA家族的功能性豐餘度可能反映了通過確保單一 突變不會干擾它們靶標的調節從而維持幹細胞穩態和防止腫瘤的可靠機制。miRNA可調節 S0X2引起了人們的興趣。實際上，S0X2與0CT4不僅為ESC的自我更新和維持多能性所必 須，而且是體細胞重新編程誘生多能幹細胞(iPSC)的核心因子。考慮到這些觀察以及報導 的S0X2與乳腺癌的聯繫，構成癌症幹細胞和胚胎幹細胞自我更新和分化基礎的是共有廣 泛的調節基因網絡。這些研究描述的miRNA模式無疑指出了可能有許多其它因素使致命癌症與正 常幹細胞功能相聯繫。預測程序，例如TargetscaM. 2提示可能有受miRNA-200c-141、 miR-200b-200a-429和miR-183-96_182調節的許多其它基因在功能上對於幹細胞至關重要。我們篩選中鑑定到的其它miRNA可能對致瘤性也至關重要。例如，我們的數據 分析還表明，乳腺癌幹細胞的miR-155表達比其它癌細胞要高。值得注意的是，最初將 miR-155鑑定為是B細胞淋巴瘤的致癌BIC基因座的產物，其高水平表達與肺腺癌患者預後 差相關。當血液系統持續表達miR155時，觀察到異常增殖和脊髓發育不良。因此，miR-155 表達增加也是乳腺癌幹細胞增殖比其它非致瘤性對應細胞更快的標誌。EMT是一種廣泛分布的發育程序，可調節許多組織和器官的細胞遷移，與正常和惡 性乳腺幹細胞功能相關。近年的研究顯示在⑶44+⑶譜系-乳腺癌細胞中，包括SNAI2 在內的EMT途徑諸組分表達最高。我們在此證明，在人乳腺致瘤性⑶44+⑶譜系_細 胞中miR-200家族miRNA受到強烈抑制。miRNA的miR-200家族抑制了用作EMT誘導物的 ZEB 1和ZEB2的翻譯。miR-200家族miRNA靶向ZEBl和ZEB2的3，UTR中多個位點，抑制 ZEBl和ZEB2上調E-鈣粘蛋白的表達而抑制EMT。總之這些發現證明miR-200家族miRNA 通過調控正常和惡性乳腺癌細胞中的EMT程序而成為幹細胞功能的重要調節劑。小結，本發明的發現提供了正常乳腺幹細胞/祖細胞、⑶44+CD24_/is譜系_乳 腺癌細胞與胚胎癌細胞之間的強效分子聯繫。人乳腺癌細胞亞組和正常乳腺幹細胞中 miR-200a、miR-200b、miR-200c和miR-141顯著下調以及miR_200c能調節自我更新基因的 事實，提示正常幹細胞和CD44+CD24_^譜系_乳腺癌細胞共有調節幹細胞功能(例如自我更 新和EMT)的分子機制。實驗步驟細胞培養.將人胚胎腎臟(HEK) 293T細胞維持在含10% FBSU00U/mL青黴素、100 μ g/mL鏈 黴素和250ng/mL兩性黴素B(英傑公司(Invitrogen))的Dulbecco改進Eagle培養基 (DMEM)中，5% CO2和37°C下培養。人胚胎癌細胞系Tera-2 (HTB-106)購自ATCC，在含100 單位/毫升青黴素G、100 μ g/ml鏈黴素和250ng/ml兩性黴素B和補加15%胎牛血清的改 進McCoy培養基(英傑公司)中生長，5% CO2和371下培養。製備單細胞懸液和流式細胞檢測.獲得史丹福大學研究倫理委員會(Research Ethics Boards at Stanford University)和加利福尼亞州希望癌症中心城市(City of Hope Cancer Center in California)批准，原發性乳腺癌標本得自知情同意患者。用機 械方法解剖分離腫瘤標本，與200U/ml LiberaseBlendzyme 2 (羅氏公司(Roche)) —起培育。如前文所述進行細胞染色和流式細胞檢測。將用機械方法解剖分離的小鼠正常乳腺標 本與200U/ml LiberaseBlendzyme 4(羅氏公司)一起培育。如前文所述進行細胞染色和 流式細胞檢測。將胚胎癌細胞移植入N0D/SCID小鼠.用1_3 %異氟烷麻醉N0D/SCID小鼠(傑 克遜實驗室(Jackson laboratory) )0將胚胎癌細胞懸浮於Matrigel (BD生物科學公司 (BD Biosciences))，皮下注射入N0D/SCID小鼠。在史丹福大學實驗動物管理行政委員會 (Administrative Panel on Laboratory AnimalCare of Stanford University)批准下進 行所有實驗。多重實時PCR試驗.採用前文描述的BD FACSAria分選儀分離11組⑶44+CD24" 譜系_致瘤性和其餘譜系非_致瘤性人乳腺癌細胞。通過多重實時PCR進行miRNA模式 分析。對於RNA製備，將100個致瘤性CD44+CD24-/ 譜系_人乳腺癌細胞和其它非-致瘤性 譜系-癌細胞作雙重分選進入Trizol (英傑公司)，按照生產商的方案提取RNA。糖原(英 傑公司)用作沉澱運載體。如前文所述進行RT、前-PCR和多重實時PCR。簡言之，用466 組第二鏈合成引物進行多重逆轉錄反應。然後用466組正向引物和通用反向引物進行多重 前-PCR反應。將多重前-PCR產物稀釋8倍，等份加入384孔反應平板，分別檢測各miRNA 的豐餘度。各引物和探針含有為各miRNA專門指定的郵編序列(zip-coded sequences)以 提高各反應的特異性，因此甚至miRNA中的微小序列差異也能放大和檢測到。該方案專用 於檢測成熟miRNA並且可靠，因為RT-PCR和微陣列的miRNA檢測值相一致。結果按小的核 RNA (C/D盒96A和C/D盒84)表達標準化。兩群細胞之間miRNA表達的差異計算為；ACt = 標準化Ct (致瘤性細胞)-標準化Ct (非致瘤性細胞)。質粒載體和誘變.用PCR擴增pGEM-T-Easy載體(普羅邁格公司(Promega))的 多個克隆位點，將其插入到PGL3對照載體(普羅邁格公司)的XbaI位點(pGL3-MC)。用 HEK293T細胞的cDNA作為模板，以PCR擴增S0X2 3，UTR的553bp片段(對應於NM_003106. 2 的1620-2172位置)，將其克隆入pGEM-T-Easy載體中。將S0X2 3，肌1 產物克隆在？61^-]\ 載體螢光素酶基因的3』端。測序所有產物。用斯特拉塔基因公司的快變定點誘變試劑盒 (QuikChange Site-Directed Mutagenesis kit, Stratagene) ^h S0X2 白勺 3' UTR ft/^m 定的miR-200c靶序列突變。螢光素酶報導基因分析.轉染前一天，將HEK293T細胞以每孔IXlO5個細胞 接種48-孔板。按照生產商使用說明書，用脂質轉染胺(Lipofectamine) 2000 (英傑公 司)進行所有轉染。用含有人S0X2的3，UTR的320ng pGL3螢光素酶表達構建物、40ng pRL-TK Renilla螢光素酶載體(普羅邁格公司)和50nM hsa-miR-200c前體(安畢公司 (Ambion))轉染細胞。轉染後48小時，裂解細胞，用普羅邁格公司的雙-螢光素酶報導試驗 系統(Dual-LuciferaseIteporter Assay System)檢測螢光素酶活性，報導基因試驗系統按 Renilla螢光素酶活性標準化。所有實驗一式兩份進行，合併三次獨立實驗的數據。慢病毒產生.用HEK293T或MCF7細胞的cDNA作為模板，以PCR克隆miR_200c和 miR-183的序列，包括莖環結構和側接基因組序列的上遊和下遊200-300鹼基對。將產物克 隆入pLentiLox 3. 7載體的HpaI和XhoI位點。為產生對照載體，通過XbaI和HpaI消化 除去U6啟動子序列，與Klenow酶一起培育並連接。如Tiscornia等.(2006). Nat Protoc 1，241 -245所述產生了慢病毒。
蛋白質印跡.用表達miRNA的慢病毒感染Tera-2細胞，以流式細胞術收集被感染 的細胞。如上所述通過流式細胞術收集人乳腺癌細胞。用SDS樣品緩衝液(50mM Tris-HCl pH 6. 8、2% SDS、10%甘油、5mM EDTA、0. 02 %溴酚藍、3 % β -巰基乙醇)裂解收集的細 胞。用SDS-8%聚丙烯醯胺凝膠電泳分離樣品後轉移至聚偏(二)氟乙烯濾膜(阿瑪西 亞公司(Amersham))上。用0. 05%吐溫20/PBS配製的5%脫脂奶封閉後，培育濾膜與 1 2000 (對於原發性乳腺癌樣品作1 1000稀釋)稀釋的抗-S0X2多克隆抗體(米利 波公司(Millipore))或1 2000稀釋的抗-β-肌動蛋白抗體(聖克魯茲生物技術公司 (Santa Cruz Biotech))。然後加入1 10，000稀釋的過氧化物酶-偶聯的驢抗-兔或綿 羊抗-小鼠IgG抗體(阿瑪西亞公司)，用聖克魯茲生物技術公司的蛋白質印跡魯米諾試劑 顯色。乳腺癌細胞集落形成試驗.用200U/ml Liberase Blendzyme 2(羅氏公司)消 化小鼠MMTV-Wntl腫瘤，如(Cho等.，2008Stem Cells 26，364-371)所述解剖分離。用 抗-CD31、CD45和CD140a抗體染色細胞，用流式細胞術去除譜系陽性細胞。通過自旋感染 (spin 丨1^6(^丨011)2小時，然後371在補加了5%85六、2%熱滅活卩85、1 50 B27、20ng/mL EGF、20ng/mL bFGF、10 μ g/mL 胰島素和 10 μ g/mL 肝素的 DMEM/F12 中培育 2 小時，用 20M0I 表達miRNA的慢病毒感染15，000個細胞。用相同培養基洗滌被感染的細胞兩次，然後用含 5% FBS的Epicult培養基(幹細胞技術公司(Stemcelltechnologies))替換該培養基。將 被感染的細胞接種含30，000個經過輻照的3T3飼養細胞層的24-孔板。接種後24小時， 再次用不含血清的Epicult培養基替換原培養基，5% CO2和37°C下培育細胞6天。免疫螢光.用表達miRNA的慢病毒感染Tera-2細胞，以流式細胞術收集被感染的 細胞。IX IO4個細胞生長在24-孔板的孔中，用PBS (20mM磷酸鉀pH 7. 4,150mM NaCl)洗 滌兩次。用甲醇/丙酮(1 1)固定細胞，用0. 吐溫20/PBS洗滌兩次，在曲通X/ PBS中培育30分鐘。用PBS配製的4%山羊血清封閉細胞，與第一抗體(1 750稀釋的 抗-Tujl單克隆抗體(康萬斯公司(Covance)))培育後，再用0. 吐溫20/PBS洗滌三次， 然後用1 300稀釋的Alexa Fluor 488-偶聯抗-小鼠IgG抗體(英傑公司)染色。採 用BD法瑪金公司BrDU流式試劑盒(BrDU Flow Kits, BD Pharmingen)的固定液染色乳腺 癌細胞。用PBS配製的4%山羊血清封閉細胞，與第一抗體(1 200稀釋的兔抗-細胞角 蛋白14(康萬斯公司)，大鼠抗-細胞角蛋白19和大鼠抗-細胞角蛋白8/18抗體(開發 研究雜交瘤庫(Developmental StudiesHybridoma Bank), DSHB)的 1 200 稀釋液)一起 培育後，再用0. 吐溫20/PBS洗滌三次，然後用1 200稀釋的Alexa Fluor 488-偶聯 抗-大鼠IgG抗體和1 200稀釋的Alexa Fluor 594-偶聯抗-兔IgG抗體(英傑公司) 染色。用螢光顯微鏡(Leica DMI 6000B)觀察著色細胞。實施例5miR-200抑制正常乳腺過度生長如圖7所示，miR-200抑制正常乳腺幹細胞。用表達miR-200c的慢病毒或對照慢 病毒感染50，000個小鼠正常乳腺細胞後，將其注射入斷奶年齡小鼠的清潔乳房脂肪墊中。 注射後6周，分析表達GFP的乳腺樹(mammarytree)的生長。圖7說明對照慢病毒感染的 乳腺細胞形成了表達GFP的乳腺樹，如2/5分支形成所示。相反，GFP表達(表明miR-200c 表達)形成了 0/5分支。
還發現miR-200c和miR-183抑制了人乳腺癌生長。分離人乳腺異種移植腫瘤的 10，000個致瘤性癌症(TG)細胞，用表達miRNA的慢病毒或對照慢病毒感染後注射入NOD/ SCID小鼠的乳房脂肪墊中。注射後16周分析腫瘤發生率。在對照動物中，4/5隻動物有 腫瘤，而表達miR-200c細胞(注射的動物)中，1/5有腫瘤；表達miR-183細胞(注射的動 物)中，0/2有腫瘤。
權利要求
一種鑑定癌症幹細胞的方法，包括使樣品與至少一種選自以下miRNA的特異性試劑接觸miR 214；miR 127；miR 142 3p；miR 199a；miR 409 3p；miR 125b；miR 146b；miR 199b；miR 222；miR 299 5p；miR 132；miR 221；miR 31；miR 432；miR 495；miR 150；miR 155；miR 338；miR 34b；miR 212；miR 146a；miR 126；miR 223；miR 130b；miR 196b；miR 521；miR 429；miR 193b；miR 183；miR 96；miR 200a；miR 200c；miR 141；miR 182；miR 200a；miR 200b；其中與非致瘤性細胞相比，癌症幹細胞表達所述至少一種miRNA的水平發生改變。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，通過原位雜交定量測定miRNA表達。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，通過實時聚合酶鏈式反應進行定量測定。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述患者是人。
5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述人正經歷癌症治療。
6.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，該方法還包括使樣品與受所述miRNA調節的 蛋白質的特異性試劑接觸，其中與非致瘤性細胞相比，癌症幹細胞表達所述蛋白質的水平發生改變。
7.一種篩選有效抵禦CSC的候選化療劑的方法，該方法包括使所述藥劑與CSC接觸，和測定所述藥劑改變至少一種選自以下miRNA胞內水平的效果miR-214 ；miR-127 ； miR-142-3p ；miR-199a；miR-409-3p ；miR-125b ；miR-146b ；miR-199b ；miR-222 ； miR-299-5p ；miR-132 ；miR-221 ；miR-31 ；miR-432 ；miR-495 ；miR-150 ；miR-155 ；miR-338 ； miR-34b ；miR-212 ；miR_146a ；miR-126 ；miR-223 ；miR_130b ；miR_196b ；miR-521 ；miR-429 ； miR-193b ；miR-183 ；miR-96 ；miR-200a ；miR-200c ；miR-141 ；miR-182 ；miR-200a ； miR-200bo
8.一種改變癌症幹細胞致瘤性的方法，該方法包括改變所述細胞中表達的微小RNA活性，其選自miR-214 ；miR-127 ；miR-142-3p ； miR-199a ；miR-409-3p ；miR-125b ；miR-146b ；miR-199b ；miR-222 ；miR-299-5p ；miR-132 ； miR-221 ；miR-31 ；miR-432 ；miR-495 ；miR-150 ；miR-155 ；miR-338 ；miR-34b ；miR-212 ； miR-146a ；miR-126 ；miR-223 ；miR-130b ；miR-196b ；miR-521 ；miR-429 ；miR-193b ； miR-183 ；miR-96 ；miR-200a ；miR-200c ；miR-141 ；miR-182 ；miR-200a ；禾口 miR_200b。
9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述微小RNA選自miR-200c、miR-141、 miR-200b、miR-200a、miR-429、miR-182、miR-96 和 miR-183，其中所述方法包括上調活性。
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述藥劑包含選自以下的miRNA基因序列 miR-200c、miR-141、miR-200b、miR-200a、miR-429、miR-182、miR-96 和 miR-183，該序列操 作性連接於在所述細胞中有活性的啟動子。
11.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，所述改變步驟在體外進行。
12.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，所述改變步驟在體內進行。
13.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，所述癌症幹細胞是乳腺癌幹細胞。
14.如權利要求13所述的方法，其特徵在於，所述乳腺癌幹細胞是CD44+CD24-/ 譜系。
15.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述改變步驟包括給予所述細胞降低所述細胞中所述miRNA水平的藥劑。
16.如權利要求15所述的方法，其特徵在於，所述藥物是反義寡核苷酸。
全文摘要
本文提供乳腺癌幹細胞(BCSC)的微小RNA標記。所述標記是與正常對應細胞相比，在BCSC中差別表達的多核苷酸。所述標記的應用包括用作治療性幹預的靶標；用作藥物開發和乳腺癌及BCSC細胞群體相關診斷或預後方法的靶標。與正常乳腺上皮細胞或並非癌症幹細胞的癌症細胞相比，BCSC具有某些miRNA表達較低的表型。
文檔編號C12Q1/68GK101981206SQ200980112473
公開日2011年2月23日 申請日期2009年1月30日 優先權日2008年2月1日
發明者M·克拉克, Y·西莫諾 申請人:利蘭·斯坦福青年大學託管委員會